JPS6387980A - プラスミドベクタ−、菌株、及びそれを用いてペプシノ−ゲンを生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡという）
の組換え技術により、形質転換されたバチルス・プレビ
ス菌株をつくり、この菌株を培養してペプシノーゲンを
生産する方法に関するものである。また、この発明は、
上記形質転換されたバチルス・プレビス菌株を対象とす
るものであり、さらにこの発明は、上記、菌株を得るた
めに、バチルス・プレビスの細胞に導入すべき形質転換
用プラスミドベクターをも対象とするものである。

（従来波Ｗｌ） 原核生物を用いて、ＤＮＡの組換え技術により遺伝子を
発現しようとする場合に、最も重要なことは、宿主の選
択とその宿主に適したベクターの選択とである。細菌中
で桿菌に属するバチルス・プレビスは、プロテアーゼ活
性に乏しく、それから分泌された蛋白質は比較的安定で
あるから、宿主とするには適している。ところがバチル
ス・プレビスにおいては、ベクターとするに適したプラ
スミドが開発されていなかった。そのために、バチルス
・プレビスを宿主として利用しようとの試みは、今まで
余りなされなかった。

この発明者らは、バチルス・プレビスをＪ１Ｆ転換して
新たな菌株を作り、この菌株の培養によって有用な蛋白
質を能率よく生産しようと企てた。

そのタメに、この発明者らは、バチルス・プレビスに導
入するに適したプラスミドベクターを開発すべく鋭意努
力した。その過程で、この発明者らは、バチルス・プレ
ビスの中にはプロモーター活性を示す遺伝子を有するも
のが存在することを見出し、これをＤＮＡとして出願し
、特開昭６０−５８０７３号公報により公知にした。し
がし、この公報が開示しているプラスミドｐＮＴ１００
は、こｉｔ−バチルス・プレビスに導入しても、蛋白質
を能率よく生産させるに至らなかった。

また、この発明者らは、プラスミドｐＵＢ１１０が、バ
チルス・プレビスの形質転換用に適していることを見出
した。プラスミドｐＵＢ　１、Ｏは、スタフィロコッカ
ス・アウレウスに由来するものであって、バチルス・ズ
ブチルスを宿主とするのに広く利用されている。このプ
ラスミドｐＵＢ１１０に外来遺伝子の７ラグメントを挿
入して得られたプラスミドベクターは、これをバチルス
・プレビスの細胞に導入すると、外来遺伝子の情報をよ
く発現することを見出した。そこで、この発明者らは、
これらの知見をバチルス・プレビスの形質転換方法とし
て特許出願をし、これを特開昭６０−５８０７４号とし
て開示した。しかし、この方法によっても、蛋白質を能
率よく生産するには至らなかった。

（発明が解決しようとする問題点） この発明者らは、これらの発明を基礎とし、バチルス・
プレビスの細胞内に遺伝子を導入して発現させるのにさ
らに好適なプラスミドベクターを開発すべく、鋭意研究
を進めた。その結果、特定の塩基配列を含んだプラスミ
ドの特定位置に、他の動物細胞に由来する構造遺伝子を
結合させてプラスミドベクターとすると、これをバチル
ス・プレビスの細胞内に導入したとき、他の生物に由来
する遺伝子を一層よく発現させ得ることを見出した。す
なわち、プラスミドベクターが好適なものであるために
は、その構造式が、５′がわを上流に、３′がわを下流
に書き連ねられたとき、ＭＮＯＡＣＰよりなる塩基配列
（ａ）、ＱＲＳＷＸＹよりなる塩基配列（ｂ）、バチル
ス・プレビスの細胞内でリポソーム結合部位として機能
する塩基配列（ｃ）、及びバチルス・プレビスの細胞内
で翻訳開始フドンとして機能する塩基配列（ｄ）の４種
の塩基配列を上流より下流に向ってこの順序に含むもの
でなければならないことを見出した。そこでは、他の物
に由来する構造遺伝子として、バチルス・リケニホルミ
ス５８４株から得られたα−アミラーゼ遺伝子を実際に
用いただけであったが、この発明者らは、この知見をバ
チルス・プレビスを用いる遺伝子の発現方法として既に
出願した（特願昭６１−４７２７３号）。上記塩基配列
（ａ）及び（ｂ）のうちで、ＭはＧ又はＴＳＮはＣ，Ｔ
又はＡ、ＯはＡＳＣ又はＴＳＰはＴ又はＧ、ＱはＴ又は
ＡＳＲはＴ又はＡｌＳはＴ、Ｃ又はＡ、ＷはＡ又はＧ、
ＸはＡ又はＣ１及びＹはＴ又はＧを表わし、さらにＡは
アデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを
表わす（以下、同じ）。

この発明者らは、上に述べた知見をさらに拡張して、バ
チルス・プレビスを使用してペプシノーゲンを生産しよ
うと企てた。ペプシノーゲンは蛋白質の消化酵素ペプシ
ンの前駆体である。従って、ペプシノーゲンは医薬品と
して価値の高いものであり、また生化学用の試薬として
も重要なものである。ペプシノーゲンは、今までは動物
体内から直接抽出して製造せざるを得なかった。そこで
、この発明者らは、バチルス・プレビスによりペプシノ
ーゲンを工業的に能率よく生産すべく研究を進めた。

Ｃ問題を解決するための手段） この発明者らは、研究の結果、上述の塩基配列（ａ）な
いし（ｄ）をこの順序に含んだプラスミドの下流に、他
の動物細胞に由来するペプシノーゲン遺伝子を導入し、
これをプラスミドベクターとしてバチルス・プレビスの
細胞内に導入すると、バチルス・プレビスがペプシノー
ゲンを能率よく生産するに至ることを確認した。この発
明は、このような確認に基づいてなされたものである。

この発明は、上流から下流に順次、Ｍ　Ｎ　ＯＡ　ＣＰ
よりなる塩基配列（ａ）、ＱＲＳＷＸＹよりなる塩基配
列（ｂ）、シヤインダルガルノ塩基配列（ｃ）、翻訳開
始フドンとしてのＡＴＧ又はＴＴＧの塩基配列（ｄ）を
含むプラスミドの、塩基配列（ｄ）より下流位置に、他
の動物細胞より得られたペプシノーゲン遺伝子を挿入し
てこれをプラスミドベクターとし、このプラスミドベク
ターをバチルス・プレビス菌の細胞内に導入し、得られ
た形質転換菌株を培養し、こうして得られた生産物を培
養物から分離し、生産物を精製することを特徴とする、
ペプシノーゲンの生産方法である。ここで、ＭＳＮ、　
ＯｌＰ、　Ｑ。

Ｒ５５ＳＷＳＸ及びＹは前述のとおりのものである。

上で用いられるペプシノーゲン遺伝子とは、例えばブタ
の胃から抽出したｍＲＮＡから逆転写することによって
得られたブタペプシノーゲン遺伝子に相補的なりＮＡを
含むものである〔塚越規弘、安藤義浩、鵜高重三、市原
慶和、高橋健治：日本農芸化学会講演要旨集、Ｐ４３３
（１９８５））。

このペプシノーゲン遺伝子は、制限酵素により切断して
、切断フラグメントとして用いる。

また、この発明は、上記の方法に使用される形質転換菌
株、及びプラスミドベクターをも含むものである。

この発明では、バチルス・プレビス菌を導入すべきプラ
スミドベクターが基本をなしているから、まずプラスミ
ドベクターについて述べる。

この発明のプラスミドベクターは、前述のように、特定
の塩基配列を含んだプラスミドに、他の動物細胞より得
られたペプシノーゲン遺伝子のフラグメントを挿入して
得られたものである。ここで、特定の塩基配列を含んだ
プラスミドとは、前述のようにＤＮＡの構造式が、　デ
オキシリボーズの５′がわを上流に、８′がわを下流に
書き連ねられたとき、上流から下流に向って順次に、Ｍ
ＮＯＡＣＰよりなる塩基配列（ａ）、ＱＲ５Ｗ’ＸＹよ
りなる塩基配列（ｂ）、シヤインダルガルノ配列（ｃ）
、及び翻訳開始コドンとしてのＡＴＧ又はＴＴＧの塩基
配列（ｄ）の、４種の塩基配列をこの順序に含んだプラ
スミドを意味している。また、ペプシノーゲン遺伝子の
７ラグメントとは、例えば前述のようにブタのペプシノ
ーゲン遺伝子たるプラスミドｐＡＳＩ〔塚越規弘ら：日
本農芸化学講演要旨集Ｐ、４３３（１９８５）　〕を制
限酵素Ｈｉｎｄｌ［とＥｃｏＲＩとにより切断された約
１２００塩基（ヌクレオチド）（以下、Ｌ２Ｋｂ、ｐ、
と略す）の長さの７ラグメントである。上記フラグメン
トを挿入すべき位置は、塩基配列（ｄ）の下流でなけれ
ばならない。

この発明は、プラスミドとして、上述の塩基配列（ａ）
ないし（ｄ）を含んだものを用いることを特徴としてい
るが、バチルス・プレビスに導入すべきプラスミドとし
て、このような塩基配列を規定したことは全く目新しい
ことである。今までは、バチルス・プレビスに導入すべ
きプラスミドベクターが、具体的にどのような塩基配列
を持たなければならないかについて、殆んど何も知られ
ていなかった。ところが、この発明は、ペプシノーゲン
を能率よく生産させるためには、バチルス・プレビスに
導入すべきプラスミドベクターに塩基配列（ａ）ないし
（ｄ）の・４種の塩基配列を特定の順序に含ませなけれ
ばならない、と規定した点で目新しくまた有用なものと
なっている。

これら４種の塩基配列のうちでも、塩基配列（ａ）、！
：　（ｂ）　トは、バチルス・プレビスの細胞内でプラ
スミドにプロモーター活性を与える、という点で、とく
に意義を持っている。塩基配列（ａ）と（ｂ）とを含む
プラスミドが、バチルス・プレビスの細胞内でプロモー
ター活性を示すことは、特願昭６１−４７２７３号の明
細書中で詳しく説明されている。

そこでは、バチルス・プレビス４７の遺伝子をスタフィ
ロコッカス・アウレウスに由来するプラスミドｐＨＷＩ
に導入してプラスミドｐＣＷＰＩを作り、このプラスミ
ドｐｃＷＰＩをバチルス・プレビス４７の細胞内に導入
して行った実験によって詳しく説明されている。この発
明は、この事実をペプシノーゲンの生産に応用すること
を目的としたものであるから、塩基配列（ａ）と（ｂ）
とが一般的にプロモーター活性を与えることの説明はこ
こでは省略する。

この発明は、前述のプラスミドｐｃＷＰＩのように、塩
基配列（ａ）ないし（ｄ）を含むプラスミドを使用する
のである。このうち、塩基配列（ａ）は、８６通りの配
列を含むが、そのうち好適なものは、ＧＣＡＡＣＴ、Ｔ
ＴＣＡＣＧ及びＴＡＴＡＣＴの３種の塩基配列であり、
塩基配列（ｂ）は、９６通りの塩基配列を含んでいるが
、好適なものはＴＴＴＡＡＴ。

ＴＡＣＡＣＴＳＡＡＡＧＣＧの８種の塩基配列である。

これら好適な塩基配列の場合には、塩基配列（ａ）と塩
基配列（ｂ）との間に１７の塩基対が存在することが好
ましかったが、１５−２０塩基対であってもよい。

このようなプロモーター活性を有する塩基配列（ａ）及
び（ｂ）の支配下に、蛋白合成を行な匂せるためには、
その下流にシヤインダルガルノ配列（ｃ）と翻訳開始コ
ドンが配置される必要がある。シヤインダルガルノ配列
は、リポソームと結合すべき部位である。また、翻訳開
始コドンとしての塩基は、塩基配列（ｃ）の下流にあっ
て翻訳開始コドンとして機能するＡＴＧ又はＴＴＧの塩
基配列である。このほか、プラスミドは、そのほかの塩
基配列、例えばシグナルペプチドに対応するシグナル塩
基配列を含んでいる。

バチルス・プレビスとしては、とくに特定の菌株を用い
る必要はない。バチルス・プレビスの中では、バチルス
・プレビス４７　　ＦＥＲＭ−Ｐ７２２４及び同４８１
ＦＥＲＭ−Ｐ７５８１が好適である。

他の動物細胞に由来するペプシノーゲン遺伝子としては
、各種の動物細胞を使用することができる。好適なのは
前述のように、ブタのペプシノーゲン遺伝子である。

プラスミドにペプシノーゲン遺伝子の７ラグメントを挿
入する方法は、従来用いられて来た方法がそのまま適用
できる。例えば、一方で、ベクターを制限酵素により切
断して開環させ、電気泳動法によって所望の部分を選び
、両端を調整しておき、他方でペプシノーゲン遺伝子を
制限酵素で切断して、′ｗ１気泳動法により所望の７ラ
グメントを取り出し、これを末端調整してのち、前者と
後者とを混合してＤＮＡＩＪガーゼを用いて結合し、閉
環させてプラスミドとするのである。

また、こうして得られたプラスミドをベクターとしてバ
チルス・プレビスの細胞内に導入する方法も、従来用い
られて来た方法をそのまま適用することができる。例え
ば、バチルス・プレビスの細胞を高滲透圧液に浮遊させ
、これにリゾチームを作用させて細胞壁のない裸の細胞
（プロトプラスト）を作り、これにポリエチレングリフ
ールを用いて上述のプラスミドベクターを導入すること
ができる。また、実施例中で詳しく述べるようにアルカ
リ性トリス塩酸緩衝液により処理して、細胞の表層蛋白
質を除去したのち、これにポリエチレングリコールを用
いてプラスミドベクターを導入すること・もてきる。

（作用効果） こうして得られた形質転換菌株は、普通の方法で容易に
培養できる。またこの形質転換菌株はペプシノーゲンを
菌体外に大量に生産する能力を有している◇しかも、こ
うして得られたペプシノーゲンは宿主のプロテアーゼ活
性が少ないため分解されない。従って、この菌株の培養
により容易に（実施例） 次に実施例により、この発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ この実施例では、塩基配列（ａ）ないし（ｄ）を含むプ
ラスミドとしてプラスミドｐＮＵ１００を使用し、ペプ
シ／−ゲン遺伝子としてブタのものを用いた。

しかし、プラスミドｐＮＵ１００は、公然知られたもの
でないので、まずその作製方法から説明する。

（１）　　プラスミドｐＮＵ１００の作製プラスミドｐ
ＮＵ１００は、第１図に示すように、プラスミドｐｃＷ
ＰＩとプラスミドｐＨＴｌから、下記の順序に従って作
られた。

プラスミドｐｃＷＰＩは、バチルス・プレビスの分子量
１５万蛋白質遺伝子を導入したプラスミドである。プラ
スミドｐＣＷＰＩの１５万蛋白質遺伝子の５′側領域を
まずＡｌｕＩ−ＡｌｕＩで切断してのち、アクリルアミ
ドゲル電気泳動法により、転写プロモーター、シヤイン
ダルガルノ配列、シグナル配列を含む６００　ｂ、ｐ、
　（塩基対）のものを単離し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによ
りＢａｍＨＩリンカ−を連結した。このＢａｍＨＩリン
カ−を連結したＡｔｕｌ−Ａ１ｕＩ断片は、その塩基配
列を調べると、第２図に示すように配列されていること
がわかった◇ 他方で、プラスミドｐＨＴｌから次のようなもう一つの
断片を作った。プラスミドｐＨＴｌは、スタフィロコッ
カス・アウレウスに由来するプラスミドｐＵＢ１１０　
（Ｔ、　Ｊ、　Ｇｒｙｃｚａｎ　、　Ｓ、　Ｃｏｎｔｅ
ｎｔｅａｎｄ　Ｄ、　Ｄｕｂｕａｎ　：　Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、＋　８４．３１８−３２９（１９７８）
　）と、プラスミドｐＨＷＩ　（５−Ｈｉｒｏｎｏｕｃ
ｈｉ　ａｎｄ　Ｂ、Ｗｅｉｌｓｂｌｕｍ　：　Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１５０　、８０４−８１４　（１
９８２）　）とを結合させたものであって、バチルス・
ズブチリス全宿主とするベクターとして使用できるもの
である。そこで、まず、プラスミドｐＵＢ１１０の複製
開始点、カナマイシン耐性遺伝子及びエリスロマイシン
耐性遺伝子を有するプラスミドｐＨＴｌ　　（特開昭ｅ
ｏ−５８０７４）　ｔｔＢａｍＨＩ及びＢｇｌ■で切断
し、５′末端のリン酸基をバクチリアル・アルカリン・
ホスファターゼ処理により除いて、これをもう一つの断
片とした。

上記２つの断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結した
。こうして得られたプラスミドＤＮＡをバチルス・プレ
ビス４７−５に、後述するＴｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ、　ｗ、ｌ　Ｙａｍａｇａｔａ＋　Ｈ，ｒ
Ｙａｍａｇａｔａ、　Ｋ、　、　Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ
　＋Ｎ、＋　Ｕｄａｋａ　＋Ｓ、、　：　Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、＋　１５６　＋　１１３０−１１３４（
１９８３））により導入し、エリスロマイシン耐性によ
り形質転換株を選択し、このプラスミドをｐＮｏ１００
　とした。

プラスミドｐＮＵ１００はペプシノーゲン遺伝子を含ま
ないので、この発明の直接のプラスミドではないが、こ
こでｐＮＵ１００ｔバチルス・プレビス４７−５の菌体
に導入する場合を例に取ってＴｒｉｓ−ＰＥＧ法を説明
する。まず、Ｔ２培地（１％ポリペプトン、０．５％肉
エキス、０．２％酵母エキス、１％グルコース、０．０
１％ウラシル、ｐＨ７，０）に前培養したバチルス・プ
レビス４７−５の菌液を新しいＴ２２培地ｍｌに１００
分の１希釈し、８７°Ｃで振とう培養を行ない、対数増
殖後期（０，Ｄ。

６６０ｎｍ＝Ｌ９）に達したとき、菌体を遠心（３，０
００ｇ、５分、室温）によって集め、５０　ｍ　Ｍのト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）５ｍｌにより洗浄したの
ち、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に懸濁
し、８７°Ｃで振とうした。６０分後、菌体を遠心（３
，０００ｇ、５分、室温）によって集め、０．５ｍｌの
ＴＰ培地（０，９５３％　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４，０，４２
６％　Ｎａ　ｚＨＰｏ、　、０．５％肉エキス、１％ポ
リペプトン、０．２％酵母エキス、１％グルコース）に
懸濁した。これにＤＮＡ溶液（この場合にはｐＮＵ１０
０の溶液）とＴＰ培地の１：ｌ混合液を加えてさらに混
合した。次いで、４０％ポリエチレングリコール溶液（
０，９５３％　ＫＨ２ＰＯ，−０，４２６％　Ｎａ２Ｈ
ＰＯ，，４０％（Ｗ／Ｖ　”）ポリエチレングリコール
、ＰＥＧ６０００）１５ｍｌを加えて攪拌し、８７℃で
１０分分間上うした。その後、遠心（８，０００ｇ、５
分、室温）により菌体を集め、２０ｍＭ　ＭｇＣ（ｂを
添加したＴ２培地１ｍＡに懸濁した。８７℃で８０分間
振とうした後、エリスロマイシンを０．１μｇ／ｍｌに
なるように加え、さらに１２０分間振とうしたのち、形
質転換菌株選択用の寒天培地（０，５％肉エキス、１％
ポリペプトン、０．２％酵母エキス、１％グルコース、
０．０１％ウラシル、１０μｇ／ｍｌエリスｔ１２Ｙイ
シン、ｐＨ７，０）に０．１ｍ＃づつ散布した。８７℃
で２４時間培養してエリスロマイシン耐性菌株を得た。

これが形質転換菌株であって、このようにして形質転換
菌株を作るのがＴｒｉｓ−ＰＥＧ法である。

プラスミドｐＮＵ１００は、これをＢｉｒｎｂｏｉｍ−
Ｄｏｌｙ法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｊ、　Ｄｏ
ｌｙ　：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５−．７１５１
３−１５２３（１９７９））により検出すると、Ａｌｕ
Ｉ−ＡｌｕＩの６００ｂ、ｐ、断片が、プラスミドｐＨ
ＴｌのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ　切断部位に第１図の矢
印で示した方向に挿入されていた。

またＡｌｕＩ−Ａ１ｕＩ断片は、第２図に示したような
塩基配列を持つものであり、塩基配列（ａ）ないし（ｄ
）をすべて含んでいた。また、プラスミドｐＮＵ１００
は、プラスミドｐＵＢ１１０の複製開始点を含み、Ｂａ
ｍＨＩの切断部位を分子量１５万蛋白質のシグナル配列
切断点の下流２７ｂ、ｐ、の位置に含み、異種遺伝子の
挿入により異種遺伝子の発現分泌が可能なものと認めら
れた。

（２）　　プラスミドｐＮＵ１００へのペプシノーゲン
遺伝子の挿入 ペプシノーゲン遺伝子としては、前述のように、ブタの
ペプシノーゲン遺伝子を用い、第３図に示すように下記
の手順に従って、ペプシノーゲン遺伝子をプラスミドｐ
ＮＵ１００に挿入した。

まず、プラスミドｐＮＵ１００を常法によりＢａｍＨｌ
により切断し、両末端を７４ＤＮＡポリメラーゼラージ
フラグメントにより両末端を平滑にした。

この平滑にしたＤＮＡに予め５′末端をリン酸化した５
ａｌＩリンカ−を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し
た。こうして５ａ１１リンカ−を結合したＤＮＡを常法
により５ａｌＩにより消化し、セファデックスＧ−１５
０カラムクロマトによりプラスミドｐＮＵ１００とリン
カ−ＤＮＡ断片とに分けた。

ペプシノーゲン遺伝子は、プラスミドｐＡＳＩより得た
。すなわち、ｐＡＳＩを常法により制限酵素Ｈｉｎｄ　
ｍ及びＥｃｏＲＩで切断し、ペプシノーゲン遺伝子を含
むＨｉｎｄｌｌ［−ＥｃｏＲＩ　７ラグメント（約１２
００ｂ１．）をポリアクリルアミドゲル使用の電気泳動
により単離した。このＤＮＡフラグメントの両末端を７
４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼラージフラグメントにより
平滑化したのち、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼによりＳａｌ■
リンカ−を連結した。５ａｌＩにより消化後、セファデ
ックスＧ１５０カラムクロマトにより１２００ｂ、ｐ、
フラグメントを分離回収した。

その後、５ａｌＩリンカ−を付与したプラスミドｐＮＵ
１００と、ペプシノーゲン遺伝子を含む１２００ｂ、　
ｐ、フラグメントとをＴ４　ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶
解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。

こうして連結したＤＮＡをバチルス・プレビス４７−５
に前述のＴｒｉｓ−ＰＥＧ法により導入し、エリスロマ
イシン耐性により多数の形質転換菌株を得た。

これらのエリスロマイシン耐性菌株の中がらペプシノー
ゲンを発現する株をペプシノーゲンに対する抗体と、プ
ロティンＡ・ホースラディツシュ・パーオキシダーゼ・
フンシュゲート（Ｅ−Ｙラボラドリース）を用いるエン
ザイム・イムノアッセイ法ＣＰ。

Ｂｕｃｋｌ　ａｎｄ　Ｅ、　Ｚｅｈｅｌｅｉｎ　：　Ｇ
ｅｎｅ　＋　１６　＋　　１４９（１９８１））により
選択し、ペプシノーゲン全発現する菌株を得て、この発
現菌株を５ｓ１ｏｏと名付けた。

上述のペプシノーゲン発現菌株を泪いて、前記のＢｉｒ
ｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙ法によってプラスミドの検出を行
ない、第２図に示したようなプラスミドｐｓｓ１００の
制限酵素切断地図を得た。また、プラスミドｐｓｓ１０
０において本来の分子量１５万蛋白遺伝子とペプシノー
ゲン遺伝子との結合状態及び塩基配列を検討するために
、次のような実験を試みた。まず、プラスミドｐｓｓ１
００の制限酵素ＨｐａＩ−ＰｓｔＩによる７ラグメント
（３８０ｂ、ｐ−）をＭ１３ディデオキシ、チェイン、
ターミネーション法（Ｊｏａｃｈｉｍ　Ｍｅｓｓｉｎｇ
　ａｎｄ　ＪｅｆｆｒｅｙＶｉｅｉｒａ　：　Ｇｅｎｅ
＋　１１１Ｌ　２６９−２７６（１９８２）：］（Ｆ−
５ａｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　ａｎｄ　Ａ、
　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ　　：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、＋　　７４　　。

５４６３−５４６７（１９７７）’）によって塩基配列
を決定し、アミノ酸配列を推定した。その結果は、第４
図に示すとおりである。融合遺伝子は、分子量１５万蛋
白質を発現する遺伝子のＮ末端８−アミノ酸に対応する
ＤＮＡの後に、リンカ−ＤＮＡ（７−アミノ酸）を介し
てＮ末端から４アミノ酸を欠いたペプシノーゲン遺伝子
の結合していることが確認できた。

エンザイム・イムノアッセイ法によるペプシノーゲン発
現菌株の選択は、次のようにした。まず、形質転換菌株
の生育した寒天培地に滅菌したニトロセルロースフィル
ターをのせ、３７℃で６時間培養後、菌体の付着したフ
ィルターをクロロホルム蒸気中に１５分間放置した。次
に、Ｓａｌｉｎｅ（５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）、１５０ｍＭＮａｃｌ）−８％牛血清アルブミン
、５　ｍＭ　Ｍｇ　ｃ　１２１４０　ｐ　ｇ／ｍ　ｌの
リゾチーム、１ｉ’ｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素中で一夜
振とうし、菌体を溶解した。その後、５ａｌｉｎｅ　（
５０ｍＭ＋　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１５０
ｍＭ　Ｎａｃｌ）−０，５％牛血清アルブミンで洗浄し
、次いで抗ブタペプシノーゲン血清を含む５ａｌｉｎｓ
　（５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１５
０ｍＭ　Ｎａｃｌ）−３％牛血清アルブミン中で１時間
振とうし、抗体を吸着した。その後、さらに５ａｌｉｎ
ｅ−０，５％牛血清アルブミンで洗浄し、プロティンＡ
・ホースラデイシュ・パーオキシダーゼ・フンシュゲー
トを含む５ａｌｉｎｅ−３％牛血清アルブミンで１時間
振とう吸着させ、次いで５ａｌｉｎｅ−０，５％牛血清
アルブミンで洗浄した。このフィルターを発色試薬（４
−クロロナフトール、Ｈ２Ｏ２）により発色させ、着色
発色によりペプシノーゲンを発現する菌株を検出し、こ
れを５ＳｉＯ２菌株とした。

プラスミドｐｓｓ１００は、プラスミドｐＮＵ１００に
おける分子量１５万の蛋白質発現遺伝子の断片を含み、
その塩基配列を實キサム・ギルバート法（Ａ、Ｍ、Ｍａ
ｘａｍ　ａｎｄ　Ｗ、ＧｉＩｂｅｒｔ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６５　、４４９−５６０（１９８
０）ｌ）により決定するとともに、バチルス・プレビス
から抽出したＲＮＡを用いたＳＬＹツブ法ＣＨ，Ａｉｂ
ａ、　Ｓ。

Ａｄｈｙａ　、　ａｎｄ　Ｂ、　ｄｅＣ，Ｃｒｏｍｂｒ
ｕｇｇｈｅ：　Ｊ　、Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、＋　２５旦、１１９０５−１１９１０（１９
８１））により転写開始位置を決定した。その結果、分
子量１５万の蛋白質発現遺伝子は５′領域は第２図に示
したような構造を有し、そこにＰＩ　、　Ｐ２　。

Ｐａ　、Ｐ４の４個の転写開始部位を含み、それぞれの
転写開始部位の上流に見出された一１０領域および一３
５領域に下記第１表のような塩基配列を持っていた。ま
た、Ｓ１マツプ法の解析から、Ｐ２　、ＰａおよびＰ４
における転写開始は、フンセンサス配列と類似した配列
を有するＰｌに比べて第２表に示すようにはるかに強い
ことが明らかになった。これにより、プラスミドｐｓｓ
１００は塩基配列（ａ）ないし（ｄ）をすべて含んでい
ることが確認された。

（３）プラスミドｐｓｓ１００を導入した形質転換菌株
のペプシノーゲン生産性 プラスミドｐｓｓ１００を導入した形質転換菌株を５０
ｍｊ？のＴ８培地（２％ポリペプトン、０．５％肉エキ
ス、０．４％酵母エキス・１％グルコース・０．０１％
ウラシル、ｐＨ７，０）で８７℃、１６時間振とうして
培養後、遠心分離により菌体を取除き、培養上清を硫安
塩析（７０％飽和）し、４℃に数時間放置したのち、遠
心分離して沈澱全得た。

この沈澱を１ｍＡ’のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に溶解し、同じ緩衝液で１夜透析し、遠心分離して得ら
れた上清をペプシノーゲン溶液とした。

上記ペプシノーゲン溶液のペプシン活性は、Ａｎｓｏｎ
の方法ＣＭ、　Ｌ、　Ａｎｓｏｎ　：　Ｊ、　Ｇｅｎ、
　Ｐｈ１ｓｉｏ１．　＋２２　７９（１９３９））に従
って測定した。すなわち、酸変性ヘモグロビン（２５ｍ
ｇ／ｍＡ’、ｐＨＬｓ　）を基質として上記ペプシノー
ゲン溶液を０．０８ｍ１ｎ］え、８７℃で反応させた。

反応後、０．８ｍｌの５％トリクロロ酢酸を加え、１５
分間氷申に静置した。

その後、遠心分離（１５，ｏｏＯｇ　、１５分、４℃）
し、上清について２８０ｎｍの吸光度を測定することに
よって活性を測定した。ペプシン活性の１ユニツトは、
１時間あたり吸光度２８０ｎｍを０．１増加する量とし
た。各株のペプシン活性を表にして示すと、下記第３表
のとおりとなった。

第３表 ｐｓｓ１００を保持する５ｓｉｏ０菌株の培養上清中に
１３．３　Ｕ／ｍｌの酸性プロテアーゼ活性を検出する
ことができた。また、ペプシ′ノーゲン遺伝子全持たな
いＮＵ１００菌株の培地中には活性は全く検出できなか
った。さらに５５１００　Ｗ株の生産する酸性プロテア
ーゼ活性は、ペプシンの特異的阻害剤ペプスタチンによ
り完全に抑えることができるので、この活性はペプシン
活性であると考えられた。

（４）　５ｓｉｏ０菌株の生産するペプシノーゲンのペ
プシンへの活性化 ブタペプシノーゲン標品（４０にダルトン）は、塩酸酸
性下において、Ｎ末端の４４アミノ酸を自己消化的に切
断し、８５にダルトンのペプシンに変換されるＣ　Ｔ、
Ｇ、　Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ　＋　　Ｓｔａｎｆｏｒ
ｄＭｏｏｒｅ　、　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｈ，５ｔ
ｅｉｎ　：　Ｊ　、　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、、２４１．４９４０−４９５０（１９６６）
：）。５ｓｉｏ０菌株の生産するペプシノーゲンのペプ
シンへの活性化について検討した。

５ｓｉｏ０菌株の培養上清から調製したペプシノーゲン
溶液及びブタペプシノーゲン標品を塩酸酸性下（ｐＨ１
８）において、１５°Ｃで５−２０分間反応させてのち
、２Ｍ）ＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ７５）で中和し、ドデ
シル硫酸ナトリウムを含むトラッキングダイを添加し、
１００℃で１０分間加熱することにより、反応を停止さ
せた。その適当量をＬａｅｍｎｌｉの方法（Ｕ、　Ｋ、
Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　：Ｎａｔｕｒｅ。

２２７．６８０−６８５（１９７０））に従って１０％
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動後ｓ　Ｂｕｒｎｅｔｔｅの方法（Ｗ、Ｎｅａｔ　Ｂ
ｕｒｎｅｔｔｅ：　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
、　１１２　、１９５−２０３　（１９８１））に従っ
て分離されたポリペプチドをニトロセルロースフィルタ
ーに電気的にプロッティングした。

次いで、このニトロセルロースフィルターをブタペプシ
ノーゲンに対する抗体と、プロティンＡ・ホースラディ
ツシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲートを用いるエ
ンザイム・イムノアラ七イ法により処理して、ペプシノ
ーゲン及びペプシンのバンドを検出した。その結果全第
５図に示す。

５ｓｉｏ０菌株の生産したペプシノーゲン（約４０にダ
ルトン）はブタペプシノーゲン標品と同様に５分間で完
全に３５にダルトンのペプシンに変換された。従って５
ＳｉＯ２菌株の生産するペプシノーゲンはペプシンに活
性化可能なもので、正常な機能を保持していることが確
かめられた。

プラスミドｐｓｓｌｏＯを有するバチルス・プレビス４
７（Ｓ８１００）は、工業技術院微生物工業技術研究所
にＦＥＲＭ　　Ｐ−８９７０として寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐｃＷＰＩと同ｐＨＴｌとから同
ｐＮＵ１００が得られる関係と、各プラスミドの制限地
図とを示している。第２図は、プラスミドｐＮＵ１００
における導入部分近傍の塩基配列と、その中の転写開始
部位を示している。第８図は、プラスミドｐＡＳＩと同
ｐＮＵ１００とから同ｐｓｓｌｏＯが得られる関係と、
各プラスミドの制限地図とを示している。第４図は、プ
ラスミドｐＮＵ１００に導入したペプシノーゲン遺伝子
と１５万蛋白質遺伝子の結合部位のＤＮＡ塩基配列とそ
れから推定されるアミノ酸配列を示している。 第５図は、ペプシン及びペプシノーゲンをエンザイム・
イムノアッセイ法により検出したｔ気泳動図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、上流から下流に向つて順次に、ＭＮＯＡＣＰよりな
   る塩基配列（ａ）、ＱＲＳＷＸＹよりなる塩基配列（ｂ
   ）、シヤインダルガルノ配列（ｃ）、及び翻訳開始コド
   ンとしてのＡＴＧ又はＴＴＧの塩基配列（ｄ）を含むプ
   ラスミドの、塩基配列（ｄ）より下流位置に、他の動物
   細胞より得られたペプシノーゲン遺伝子を挿入したこと
   を特徴とするバチルス・ブレピスの形質転換用プラスミ
   ドベクター。但し、ＭはＧ又はＴ、ＮはＣ、Ｔ又はＡ、
   ＯはＡ、Ｃ又はＴ、ＰはＴ又はＧ、ＱはＴ又はＡ、Ｒは
   Ｔ又はＡ、ＳはＴ、Ｃ又はＡ、ＷはＡ又はＧ、ＸはＡ又
   はＣ、及びＹはＴ又はＧを表わし、Ａはアデニン、Ｇは
   グアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを表わす（以下、
   同じ）。 ２、塩基配列（ａ）ないし（ｄ）を含むプラスミドがｐ
   ＮＵ１００であり、他の動物細胞より得られたペプシノ
   ーゲン遺伝子がプラスミドｐＡＳＩであることを特徴と
   する、特許請求の範囲第１項に記載するプラスミドベク
   ター。 ３、プラスミドｐＡＳＩを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＥｃ
   ｏＲＩとにより切断して作つたフラグメントが、プラス
   ミドｐＮＵ１００の制限酵素ＢａｍＨＩによる切断位置
   に挿入されたことを特徴とする、特許請求の範囲第２項
   に記載するプラスミドベクター。 ４、上流から下流に向つて順次に、ＭＮＯＡＣＰよりな
   る塩基配列（ａ）、ＱＲＳＷＸＹよりなる塩基配列（ｂ
   ）、シヤインダルガルノ配列（ｃ）、及び翻訳開始コド
   ンとしてのＡＴＧ又はＴＴＧ塩基配列（ｄ）を含むプラ
   スミドの、塩基配列（ｄ）より下流位置に、他の動物細
   胞より得られたペプシノーゲン遺伝子を挿入したものを
   プラスミドベクターとし、このプラスミドベクターをバ
   チルス・プレビス菌の細胞内に導入して得られた形質転
   換菌株。 ５、塩基配列（ａ）ないし（ｄ）を含むプラスミドがｐ
   ＮＵ１００であり、他の動物細胞より得られたペプシノ
   ーゲン遺伝子がプラスミドｐＡＳＩであることを特徴と
   する、特許請求の範囲第４項に記載する形質転換菌株。 ６、プラスミドｐＡＳＩを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＥｃ
   ｏＲＩとによつて切断して作つたフラグメントが、プラ
   スミドｐＮＵ１００の制限酵素ＢａｍＨＩによる切断位
   置に挿入されたものをプラスミドベクターとすることを
   特徴とする、特許請求の範囲第５項に記載する形質転換
   菌株。 ７、上流から下流に向つて順次に、ＭＮＯＡＣＰよりな
   る塩基配列（ａ）、ＱＲＳＷＸＹよりなる塩基配列（ｂ
   ）、シヤインダルガルノ配列（ｃ）、及び翻訳開始コド
   ンとしてのＡＴＧ又はＴＴＧ塩基配列（ｄ）を含むプラ
   スミドの、塩基配列（ｄ）より下流位置に、他の動物細
   胞より得られたペプシノーゲン遺伝子を挿入して、これ
   をプラスミドベクターとし、このプラスミドベクターを
   バチルス・プレビス菌の細胞内に導入し、得られた形質
   転換菌株を培養し、こうして得られた生産物を培養物か
   ら分離し、生産物を精製することを特徴とする、ペプシ
   ノーゲンの生産方法。 ８、塩基配列（ａ）ないし（ｄ）を含むプラスミドがｐ
   ＮＵ１００であり、他の動物細胞より得られたペプシノ
   ーゲン遺伝子がプラスミドｐＡＳＩであり、プラスミド
   ｐＮＵ１００を制限酵素ＢａｍＨＩによつて切断してお
   き、この切断位置にプラスミドｐＡＳＩを制限酵素Ｈｉ
   ｎｄIIIとＥｃｏＲＩとによつて切断したフラグメント
   を挿入して、これをプラスミドベクターとすることを特
   徴とする、特許請求の範囲第７項に記載するペプシノー
   ゲンの生産方法。