JP2650856B2

JP2650856B2 - Ｃ−末端アミド化酵素の製造方法

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Publication number: JP2650856B2
Application number: JP6158285A
Authority: JP
Inventors: 正治田中; 和廣大末; 浩二孫田
Original assignee: SANTORII KK
Current assignee: SANTORII KK
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1997-09-10
Anticipated expiration: 2012-09-10
Also published as: JPH07163340A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ−末端α−アミド化
酵素又はその誘導体の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、真核細胞において、ある種のペ
プチドまたは蛋白質はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）から翻訳された後、細胞内酵素により、さらに修飾
（ポスト・トランスレーショナル・モディフィケーショ
ン）され、天然型のペプチドまたは蛋白質が生ずること
が知られている。しかしながら、現在遺伝子操作によっ
て、真核細胞由来ペプチドまたは蛋白質を生産する宿主
として広く用いられている大腸菌のような原核細胞で
は、ｍＲＮＡ翻訳後のペプチドまたは蛋白質の修飾をお
こなうことができない。

【０００３】この真核細胞特有なペプチドまたは蛋白質
の修飾の一つに、ペプチドまたは蛋白質のカルボキシル
基末端（Ｃ−末端）α位がアミド化（−ＣＯＯＨ基を−
ＣＯＮＨ₂基へ変換すること) される修飾反応がある。
すでにこの修飾は、真核細胞由来の多くの生理活性ペプ
チドまたは蛋白質に起こっていることが知られており、
又、しばしばこの修飾はこれらペプチドまたは蛋白質の
生理活性作用発現に必須であることが知られている。一
例を示せば、ヒト・カルシトニンの場合、天然型のＣ−
末端プロリンアミド残基をプロリン残基に変換すると、
生理活性が１６００分の１にも減少することが知られて
いる。

【０００４】近年、真核細胞由来のＣ−末端α−位がア
ミド化されたペプチドまたは蛋白質（以後アミド化ペプ
チドと略す）の生合成機構を明らかにすることの重要性
に加え、遺伝子操作を用いてアミド化ペプチドを大量生
産する手段としても、真核細胞特有なアミド化ペプチド
の詳細な生合成機構に関する研究がなされてきた。ま
ず、多くのアミド化ペプチドのｃＤＮＡの解析から、こ
れらアミド化ペプチドの前駆体構造が明らかにされた。

【０００５】この結果アミド化ペプチドの共通の前駆体
構造は、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＣ−末端α
−アミド化される任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙは
グリシン残基を示し、そしてＲはペプチドの残りの部分
を示す）であることが推定された。一方、このアミド化
ペプチド前駆体をアミド化ペプチドに変換する（Ｒ−Ｘ
−Ｇｌｙ→Ｒ−Ｘ−ＮＨ₂)酵素（Ｃ−末端α−アミド化
酵素）については、１９８２年Bradburyらにより初めて
報告された。すなわち彼らは、合成基質Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖ
ａｌ−ＧｌｙをＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＮＨ₂に変換する
酵素活性が、ブタ、下垂体中に存在することを示し、さ
らに基質のＣ−末端グリシン残基がアミドの窒素（Ｎ）
の供与体として必須であることを示した(Bradbury,A.F.
等；Nature,298,686−688,1982) 。

【０００６】次に、Eipperらは、この酵素活性がラット
下垂体の前葉・中葉及び後葉に存在していることを報告
し、この酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状酵
素のほかに、銅イオン（Ｃｕ²⁺) とアスコルビン酸が必
要であることを報告した（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,8
0, 5144−5148,1983)。さらに、最近では種々の組織から、Ｃ−末端α−アミド
化酵素の精製が試みられており、まずMizuno等はアフリ
カツメガエル（Xenopus laevis) の体皮より、Ｃ−末端
α−アミド化酵素を単一で純粋な状態まで精製すること
に成功し（Mizuno,K等、Biochem.Biophys.Res.Commun.1
37,984−991,1986. 及び特開昭６２−２８９１８４）、
又、本発明者らにより、この酵素のｃＤＮＡクローニン
グが成された。

【０００７】この結果、この酵素の全アミノ酸配列が明
らかにされ、さらにカエルには少なくとも種類の異なる
２種類の酵素が存在していることも明らかにされた(Miz
uno,K 等、Biochem.Biophys.Res.Commun.148,546−552,
1987.Ohsue,K等、Biochem.Biophys.Res.Commun.150,127
5 −1281,1988.及び特開平１−１０４１６８）。一方、
Eipperらは、牛脳下垂体由来のＣ−末端α−アミド化酵
素のｃＤＮＡクローニングを行い、牛脳下垂体由来のＣ
−末端α−アミド化酵素は前者（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）
とはアミノ酸配列上明らかに異なる酵素であることを明
らかにした(Eipper,B.等Mol.Endo.1,777−790,1987) 。

【０００８】これらの研究により現在までに、真核細胞
ではＣ−末端α−アミド化酵素が複数存在していること
が明らかにされてきた。このことは、個々のＣ−末端α
−アミド化酵素がそれぞれ異なる基質特異性を示す、言
い換えれば、生体内において個々のアミド化ペプチドの
生合成に関し、それぞれ固有のＣ−末端α−アミド化酵
素が存在している可能性を示しているが、現在までのと
ころ、この問題に関する詳細については明らかにされて
いない。以上述べた様に、現在までに解明されてきた真
核細胞のアミド化ペプチド生合成機構を考えれば、以下
に示す方法を用いてアミド化ペプチドを大量生産するこ
とが可能と思われる。

【０００９】すなわち、まず、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで
示されるアミド化ペプチド前駆体を遺伝子操作を用いて
大腸菌などの原核細胞で大量発現させ、大量かつ安価に
製造する方法を見いだし、次に、真核細胞由来のＣ−末
端α−アミド化酵素を何らかの方法で十分量確保し、さ
らに、in vitroでアミド化ペプチド前駆体と、Ｃ−末端
α−アミド化酵素とを用いて、アミド化ペプチドを生産
する至適反応条件を確立することができれば、アミド化
ペプチドを大量かつ安価に製造することが可能と思われ
る。事実、現在までに、この考え方に基づき、アミド化
ペプチドを製造しようとする試みが、数多くなされてき
た。

【００１０】まず第一に、アミド化ペプチド前駆体の製
造に関しては、大腸菌を用いた遺伝子操作による製造が
数多く報告されている。例えば、ベネット、アラン、デ
ビット等は、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）蛋白質の活性部分とヒト・カルシト
ニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）の融合タンパクを大腸菌
で発現した後、ヒト・カルシトニン前駆体を生産する方
法について報告している（特表昭６０−５０１３９
１）。

【００１１】しかし、この方法では融合蛋白質４４mgか
らヒト・カルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）が約
１．１〜２．０mgしか得られず、ｈＣＴ−Ｇｌｙの生産
系としては効率よい方法とは言えない。一方、本発明者
らは、β−ガラクトシターゼ由来の蛋白とヒト・カルシ
トニン前駆体構造を含むペプチド（ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）との融合タンパクを大腸菌を用
いて発現させ、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇを極めて効率よく生産する方法について報告している
（特開平１−１０９９９）。

【００１２】しかし、このペプチドは、そのままではＣ
−末端α−アミド化酵素の基質とはならず、何らかの方
法でｈＣＴ−Ｇｌｙへ変換する必要がある。第二に、Ｃ
−末端α−アミド化酵素の選択及び量の確保に関して
は、イートン、マイケル等による、ブタ下垂体より部分
的に精製したＣ−末端α−アミド化酵素を用いてヒト・
カルシトニンを製造した例（特表昭６３−５０１５４
１）がある。

【００１３】しかし、この方法も含め、天然の組織及び
細胞から目的とするＣ−末端α−アミド化酵素を十分量
得ることは困難であり、コストも高く、実際、産業上ア
ミド化ペプチドを大量に生産するには実用的でないと考
えられる。この点に関し、本発明者らは、カエル体皮由
来のＣ−末端α−アミド化酵素及びこの誘導体を遺伝子
操作を用い、大腸菌内で大量に発現させ、この酵素を大
量に確保する方法を開発した（特開平１−１０４１６
８）。

【００１４】しかしながら、大腸菌内で発現させたカエ
ル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体
は、カエル体皮より精製した酵素に比べ比活性が低く、
アミド化ペプチドを大量生産するのに用いるためには、
現在、より比活性の高い酵素の供給方法が望まれてい
る。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、より
比活性の高いＣ−末端α−アミド化酵素の製造方法を提
供しようとするものである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、比活性の
高いＣ−末端α−アミド化酵素をいかにして十分量確保
するかに関する解決策としては、本発明者等が報告した
アフリカツメガエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵
素及びその誘導体を遺伝子操作し、動物細胞で発現させ
ることにより、比活性の高いＣ−末端α−アミド化酵素
を十分量生産できることを見いだした。

【００１７】従って本発明は、Ｘｅｎｏｐｕｓ由来のＣ
−末端α−アミド化酵素又はその誘導体に対応する遺伝
子を動物細胞へ導入し、この細胞を培養することによ
り、培養上清中より実用化しうるに十分量のＣ−末端α
−アミド化酵素を得ることを特徴とするＣ−末端α−ア
ミド化酵素の製造方法を提供しようとするものである。

【００１８】

【具体的な説明】

（１）ヒト・カルシトニン前駆体及び他のアミド化ペプ
チド前駆体の製造方法本発明者らは、以前ヒト・カルシトニン前駆体構造を含
むペプチド（ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
又はＨＰＣＴ）を極めて効率よく、しかも大量に得る方
法を報告した（特開平１−１０９９９）。しかしなが
ら、このペプチドは、直接、Ｃ−末端α−アミド化酵素
の基質とはなりえない。したがって、ヒト・カルシトニ
ン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）を得るためには、何らかの
方法を用いて、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇのＣ−末端部分に存在するＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを
除去しなければならない。

【００１９】本発明者等は、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−ＡｒｇをカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）
で処理すれば、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇから目的とするヒト・カルシトニン前駆体（ｈＣＴ−
Ｇｌｙ）が、極めて効率よく得られることを見いだし
た。

【００２０】なお、本発明の実施例には、ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡｒｇをＣｐＢを用いてｈＣＴ−
Ｇｌｙを製造する方法について具体的に述べるが、この
方法は、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（式中、Ｒ，Ｘ、及びＧ
ｌｙは前記の意味を有する）で示されるアミド化ペプチ
ド前駆体の製造方法として、一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｂ
（式中、Ｒ，Ｘ，Ｇｌｙ、及びＢは前記の意味を有す
る）で示されるアミド化ペプチド前駆体構造を含むペプ
チドを、まず、化学合成又は遺伝子操作で大腸菌などの
原核細胞で大量かつ安価に製造し、次にこれをＣｐＢで
処理すれば、目的とするアミド化ペプチド前駆体（Ｒ−
Ｘ−Ｇｌｙ）が容易に得ることができることを示してい
る。

【００２１】本発明におけるアミド化ペプチドの製造法
の有用性は、従来の技術（特表昭６０−５０１３９１）
に報告されているような、アミド化ペプチド前駆体（Ｒ
−Ｘ−Ｇｌｙ）を融合蛋白法を用いて、直接大腸菌内で
発現させ製造する方法に比べ、以下に述べる点において
優れている。ヒト・カルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ）を例に具体的に示せば、このペプチドは、リジン残
基とアスパラギン酸残基をそれぞれ一残基含む、全体と
して３３アミノ酸残基から成るペプチドで、ペプチド全
体としてｐＩ（等電点）は中性付近を示す。

【００２２】従って、このペプチドを融合蛋白質として
大腸菌などで発現させ、この融合蛋白質を、適当なプロ
テアーゼを用いてｈＣＴ−Ｇｌｙを回収する場合に、ｈ
ＣＴ−ＧｌｙをｈＣＴ−Ｇｌｙの相手方蛋白質、ならび
に相手方蛋白質より生ずるペプチドフラグメントと分離
することが必要となるが、ｈＣＴ−ＧｌｙのｐＩが中性
付近を示す為に、簡単なイオン交換クロマトグラフィー
などの分離操作でｈＣＴ−Ｇｌｙを完全に精製すること
が困難である。

【００２３】一方、先に本発明者らにより開発された様
に（特開平１−１０９９９）ｈＣＴ−ＧｌｙのＣ−末端
にＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを付加したペプチド（ｈＣＴ
−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）はこのペプチド全
体としてｐＩは塩基性を示し、簡単なイオン交換クロマ
トグラフィーを行うことにより、容易に精製することが
できる。さらに、このようにして精製したｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡｒｇをＣｐＢで処理すれば、目
的のアミド化ペプチド前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）は、こ
の反応で副生すると考えられるｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、及び原料のｈＣ
Ｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇからは簡単なイオ
ン交換クロマトグラフィー、または逆相クロマトグラフ
ィーなどを用い簡単に精製することができる。

【００２４】次に、この方法の第二の利点としては、本
発明者等により開発された（特開平１−１０９９９）系
において、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ生
産に用いたのと基本的には同一な発現プラスミッドを用
い、ｈＣＴ−Ｇｌｙを発現したところ、ｈＣＴ−Ｇｌｙ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの場合に比べ、ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙとβ−ガラクトシターゼの部分構造を含む融合タンパ
クの生産性が、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇのそれに比べ、著しく減少すると言うまったく予測し
得ない事実を見いだした。

【００２５】又、このキメラ蛋白質の生産性の減少は、
ｈＣＴ−ＧｌｙのＣ−末端に塩基性アミノ酸残基、例え
ばＡｒｇ残基を付加したｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、さら
にはｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇなどでは
ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇと同じくらい
の生産性を示すと言うまったく新しい事実を発見した。
従って、これらの実験事実を考え合わせると、本発明で
示すアミド化ペプチドの新規製造法が、従来法に比べい
かに優れているかが判る。

【００２６】（２）Ｃ−末端α−アミド化酵素の製造法すでに本発明者らは、カエル体皮由来のＣ−末端α−ア
ミド化酵素、及びこの誘導体を遺伝子操作を用い、大腸
菌内で大量に発現させ、この酵素を大量に発現させるこ
とに成功している（特開平１−１０４１６８）。しか
し、この方法で発現したＣ−末端α−アミド化酵素及び
その誘導体は、大腸菌内でそのほとんどが変性（蛋白質
のアミノ酸配列は同一であるが、二次・三次構造が異な
る）しており、Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を示さな
い。

【００２７】従って、この様な方法で製造した不活性な
酵素は、何らかの方法を用いて活性型に変換する（rena
turation) ことが必要となる。前記記載の発明において
は、この問題を解決するために、大腸菌で発現させた酵
素を尿素またはグアニジン塩酸塩などの変性剤で処理し
た後、renaturationさせることにより部分的にこの問題
を解決した。しかし、この方法でもこれらの酵素活性は
天然より精製したＣ−末端α−アミド化酵素の比活性に
は及ばないことが判った。

【００２８】本発明者らは、この原因の一つが、カエル
体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びこの誘導体に
複数個存在しているシステイン残基（カエル体皮由来の
Ｃ−末端α−アミド化酵素の一つは分子内に１０個のシ
ステイン残基を有している）が、大腸菌内でこの酵素を
発現した場合、天然型と同様なシスチン結合（Ｓ−Ｓ結
合）を形成することができないと考えた。そこで、本発
明者らは、大腸菌で発現した酵素を前記した変性剤に加
え、還元剤（例えば、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタ
ノール）などで処理した後、様々な方法を用いて酸化さ
せることにより、renaturationを試みたが、酵素活性を
高めることはできなかった。

【００２９】そこで、本発明者らは、この問題を解決す
る新たな手段として、先に得た、カエル体皮由来のＣ−
末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡを用い、２種類（カエル
体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体）
のＣ−末端α−アミド化酵素を動物細胞で発現させるこ
とにより、酵素活性の高いＣ−末端α−アミド化酵素
を、大量に得ることを計画した。

【００３０】すなわち、まず、カエル体皮由来のＣ−末
端α−アミド化酵素（ＸＡ４５７）としては、特開平１
−１０４１６８の第１−１図〜第１−３図に記載されて
いるｐＸＡ４５７ｃＤＮＡにコードされているアミノ酸
配列１から４００番目までのアミノ酸一次配列をコード
するｃＤＮＡを、一方、その誘導体（ＸＡ７９９Ｂｇ
ｌII）としては、特開平１−１０４１６８の第１６−１
図〜第１６−３図に記載されているｐＸＡ７９９ｃＤ
ＮＡにコードされているアミノ酸配列−３９から６９２
番目までのアミノ酸一次配列をＮ−末端に、これにひき
続くＣ−末端がロイシン残基が付加したアミノ酸配列を
コードする遺伝子を、それぞれＳＶ４０プロモーター支
配下、動物細胞内で発現されるようにデザインしたプラ
スミッド（このプラスミッドをそれぞれｐＫＤＰＸＡ４
５７及びｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIとする）を作製
する。

【００３１】次にこれらのプラスミッドを常法に従い、
それぞれＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来
細胞）へ導入し、目的遺伝子が導入された細胞（この細
胞をそれぞれＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ４５７−α及びＣＨ
Ｏ／ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌII−αとする）を得
た。次に、このようにして得た細胞をメトトレキセート
（ＭＴＸ）濃度を順次上昇させた培地で培養することに
より導入遺伝子が増幅された細胞株を得た。

【００３２】最終的には、ｐＫＤＰＸＡ７９９Ｂｇｌ
IIを導入した細胞集団から、クローニング操作を行うこ
とにより、大量のＣ−末端α−アミド化酵素活性（２０
００unit／ml) を培養上清中へ分泌するＣ−末端α−ア
ミド化酵素（これをＸＡ７９９ＢｇｌIIとする）生産
株ＣＨＯ／１０Ｃを樹立することができた。さらに、本
発明者らは、前記培養上清中に分泌されたＣ−末端α−
アミド化酵素は、この培養液を硫安（硫酸アンモニウ
ム）で処理すれば、特異的にこの酵素を沈澱させること
ができることを見いだした。以上の結果、本発明者ら
は、実用化しうるに十分量のＣ−末端α−アミド化酵素
を製造する方法を確立することができた。

【００３３】（３）in vitroにおけるアミド化反応の至
適反応条件の設定すでに述べた様に、真核細胞においては、種類の明らか
に異なるＣ−末端α−アミド化酵素が存在していること
が判っているが、これらの酵素の基質特異性に関する詳
細については、判っていない。一方、一般にこれらの酵
素は、最大酵素活性を示すためには、分子状酵素、銅イ
オン（Ｃｕ²⁺) 、アスコルビン酸及びカタラーゼが必要
であることが、主に合成基質（例えばＤ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ）を用いた実験より判っており、また、個々
に部分精製、または完全に精製された、Ｃ−末端α−ア
ミド化酵素についての至適pHについても報告されてお
り、それぞれの酵素について異なった至適pHが存在して
いることも判っている。

【００３４】さらに、特表昭６３−５０１５４１で報告
されているように、ヒト・カルシトニン前駆体を、ブタ
・下垂体より部分的に精製したＣ−末端α−アミド化酵
素でヒト・カルシトニンを製造する場合、この酵素の至
適反応条件ではヒト・カルシトニン前駆体の溶解度が低
く、目的とするヒト・カルシトニンを得られないという
例もある。従って、これらの事実を考え合わせると、in
vitroでアミド化ペプチド前駆体とＣ−末端α−アミド
化酵素を用いて、目的とするアミド化ペプチドを効率よ
く得るためには、個々の、アミド化ペプチド前駆体及び
Ｃ−末端α−アミド化酵素を用いて、in vitroにおける
アミド化反応の至適反応条件を設定することが重要とな
る。

【００３５】そこで、本発明者等は、まず本発明で製造
した、ヒト・カルシトニン前駆体（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）
と、Ｃ−末端α−アミド化酵素（ＸＡ７９９ＢｇｌI
I）を用いて、ヒト・カルシトニンをin vitroで製造す
る場合の、至適反応条件、すなわち、ａ）アスコルビン
酸濃度、ｂ）カタラーゼ濃度、ｃ）銅イオン（Ｃｕ²⁺)
濃度、ｄ）緩衝液の種類・濃度・pH、及びｅ）基質（ｈ
ＣＴ−Ｇｌｙ）濃度について個々の至適条件を検討し
た。

【００３６】この結果、ａ）アスコルビン酸濃度は１〜
７mMで反応は効率よく進んだが、さらに濃度が高い（２
０mM）と反応効率が逆に低下した。ｂ）カタラーゼ濃度
は、１μｇ／ml以上の濃度があればよいことが判った。
ｃ）銅イオン濃度は、０，１，１０μＭと濃度が高くな
るにつれて反応効率が高まるが１０μＭ以上の濃度で
は、反応効率が変わらなかった。ｄ）緩衝液の種類、濃
度、及びpHに関しては、酢酸アンモニウム、１０mM、pH
６〜７が良いことが判った。さらに、ｅ）基質濃度に関
しては、５mg／mlまで基質濃度を高めることができるこ
とが判った。

【００３７】なお、本発明で見いだしたin vitroでのア
ミド化反応条件を用いれば、特表昭６３−５０１５４１
に報告されているような、ヒト・カルシトニン前駆体
（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）の溶解度が悪く、アミド化反応が効
率よくおこらないと言う問題は、起こらず、ヒト・カル
シトニンを効率よく得ることができた。次に、この様に
して求めた反応条件を基に、実際、ヒト・カルシトニン
前駆体とＣ−末端α−アミド化酵素（ＸＡ７９９Ｂｇ
ｌII）を用い、ヒト・カルシトニン（ｈＣＴ）をin vit
roで効率よく、安価に製造する方法を見いだした。

【００３８】

【発明の効果】本発明では、第一に、前記Ｒ−Ｘ−Ｇｌ
ｙ−Ｂで表わされる原料ペプチド又は蛋白質例えばヒト
・カルシトニン前駆体構造を含むペプチドｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを、カルボキシペプチター
ゼＢ（ＣｐＢ）により、効率よく、前記Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ
で表わされる前駆体、例えばヒト・カルシトニン前駆体
ｈＣＴ−Ｇｌｙに変換することができる。

【００３９】第二に、前記した方法で製造した前駆体Ｒ
−Ｘ−Ｇｌｙと、Ｃ−末端α−アミド化酵素とを用い、
in vitroで、目的とするＣ−末端アミド化ペプチドＲ−
Ｘ−ＮＨ₂を製造することができる。第三に、カエル体
皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素及びその誘導体に対
応する遺伝子を遺伝子操作を用い、動物細胞（ＣＨＯ
ｃｅｌｌ）で発現させることにより、実用化しうるに十
分量のＣ−末端α−アミド化酵素を製造することができ
る。この結果、産業上有用なＣ−末端がアミド化された
生理活性ペプチドを大量しかも安価に製造することがで
きる。次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明
する。

【００４０】実施例１．ヒト・カルシトニン前駆体
（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）の製造法ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（このペプチ
ドは特願昭６３−４９７２８の１１頁に記載されている
ＨＰＣＴと同一化合物であり、この物の製造に関しては
上記特許出願明細書に記載の方法を用いて製造できる）
２８０mgを、まず、０．１Ｎ酢酸３０mlに完全に溶か
し、次に、この溶液にＴｒｉｓ・ＨＣｌ（pH８．０）３
０mlと水を加え、全体として２３０ml（pH７．８）の反
応溶液を作製する。次に、この反応溶液にカルボキシペ
プチターゼＢ（Ｓｉｇｍａ社より購入）５６０μｇを加
え、３７℃で３０分間反応させた。

【００４１】この反応の進行は、反応液の一部をＹＭＣ
ＰａｃｋｅｄカラムＡ−３０２（０．４６cm×１５cm
・山村化学研究所）を用いた高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）に供し、目的とするｈＣＴ−Ｇｌｙ、反
応中間体のｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、ｈＣＴ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、及び原料のｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
と０．１％ＴＦＡ−５０％ＣＨ３ＣＮを用いた直線濃度
勾配で溶出させ解析した。この結果、上記反応は３７℃
３０分間で完全に終了していることが判った（図１参
照）。

【００４２】ｈＣＴ−Ｇｌｙの単離は、上記反応液をＹ
ＭＣＰａｃｋｅｄカラムＤ−ＯＤＳ−５（２cm×２５
cm・山村化学研究所）を用いたＨＰＬＣに供し、つづい
て、ｈＣＴ−Ｇｌｙを０．１％ＴＦＡ−５０％ＣＨ３Ｃ
Ｎで溶出させた。次に、溶出画分を集め、凍結乾燥する
ことにより、最終的にｈＣＴ−Ｇｌｙを２３５mg得た。
このようにして得たｈＣＴ−Ｇｌｙの同定は、一部を６
Ｎ塩酸で２４時間加水分解した後のアミノ酸分析値（日
立製作所製８３５−２０型アミノ酸分析機を用いた）が
理論値とよく一致すること、さらには、Protein Sequen
cer(Applied Biosystems社製 470A Protein Sequencer)
を用いてアミノ酸配列を決定することによって行った。

【００４３】なお、以下にｈＣＴ−Ｇｌｙのアミノ酸分
析の結果を示す。ただし（）内は理論値。Ａｓｘ２．８３（３），Ｔｈｒ４．５１（５），Ｓ
ｅｒ０．９１（１），Ｇｌｘ１．９４（２），Ｐｒ
ｏ２．０４（２），Ｇｌｙ４．８３（５），Ａｌａ
１．７８（２），Ｖａｌ０．９８（１），Ｍｅｔ
０．９７（１），Ｉｌｅ０．９５（１），Ｌｅｕ
２．００（２），Ｔｙｒ０．９５（１），Ｐｈｅ
２．８９（３），Ｌｙｓ０．９９（１），Ｈｉｓ
０．９７（１）．

【００４４】実施例２．Ｃ−末端α−アミド化酵素の製造法（１）動物細胞発現プラスミッドｐＫＤＰＸＡ４５７及
びｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIの作製（図２参照）ｐＫＤＰＸＡ４５７及びｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌII
は、それぞれ、本発明者らによりクローニングされたア
フリカツメガエル体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素
ｃＤＮＡの内、特開平１−１０４１６８の第１−１図〜
第３−３図に記載されているｐＸＡ４５７中のｃＤＮＡ
にコードされているアミノ酸配列１から４００番目まで
のアミノ酸配列を持つ蛋白と、特開平１−１０４１６８
の第１６−１図〜第１６−３図に記載されているｐＸＡ
７９９中のｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列−
３９から６９２までのアミノ酸一次配列をＮ−末端に、
これに引き続くＣ−末端にロイシン残基が付加した蛋白
を動物細胞で発現させるようにデザインされたプラスミ
ッドである。

【００４５】すなわち、上記プラスミッドはいずれも、
目的とする蛋白（Ｃ−末端α−アミド化酵素）に対応す
るｃＤＮＡ遺伝子が、動物細胞内でＳＶ４０（Simian V
irus40)アーリープロモーターの支配下転写され、しか
も転写後、真核細胞でｍＲＮＡが生成するために必要と
考えられているスプライシング及びｐｏｌｙＡの付加
を行わせるために、ＳＶ４０プロモーターと、対応する
ｃＤＮＡ遺伝子の５′末端の間にはウサギβグロビン遺
伝子由来のイントロンが、また、ｃＤＮＡの３′末端に
はウサギβグロビン遺伝子由来のｐｏｌｙＡ付加シグ
ナルが付加してある。

【００４６】さらに、これらのプラスミッドは上記遺伝
子以外に動物細胞へ目的遺伝子を導入した後、目的遺伝
子が増幅した細胞をクローン化するのに利用されるｄｈ
ｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子がＳＶ４０のアーリ
ープロモーター支配下に発現されるようにデザインされ
ている。なお、本発明で用いたプラスミッドｐＫＤＰＸ
Ａ４５７、及びｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIで形質転
換した大腸菌は、それぞれＥ．ＣｏｌｉＳＢＭ３０
０、及びＥ．ＣｏｌｉＳＢＭ３０１と命名され、工
業技術院生命工学工業技術研究所に、微工研菌寄第２２
３５号（ＦＥＲＭＰ−２２３５）、及び微工研菌寄第
２２３６号（ＦＥＲＭＰ−２２３６）として、寄託さ
れている。

【００４７】（２）ｐＫＤＰＸＡ４５７又はｐＫＤＰＸ
Ａ７９９ＢｇｌIIのＣＨＯ細胞への導入ｐＫＤＰＸＡ４５７とｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIを
それぞれdihydrofolate reductase遺伝子（ｄｈｆｒ）
の欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ
（以下ＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞と略す。なお、この細胞
はＣＨＯｄｈｆｒ (^-) ＣｅｌｌＳＢＭ３０６と命
名され、工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条
寄第２２４１号（ＦＥＲＭＢＰ−２２４１）として寄
託されている。）(Hanaka,S.等Mol.Cell.Biol.7 2578−
2587,1987)にリン酸カルシウム共沈法を用いて導入し
た。

【００４８】すなわち、まず、核酸を含むMinimum Esse
ntial Medium(MEM)Alpha Medium(ＧＩＢＣＯ、α⁺ＭＥ
Ｍ培地）に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Flow La
b.)と抗生物質としてペニシリンＧ（５０Ｕ／ml）とス
トレプトマイシン５０μｇ／mlを含む培地で継代培養し
たＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞を遺伝子導入１２時間前に８
０cm²のＴフラスコ（Ｔ８０，Ｎｕｎｃ）あたり１．６
×１０⁶細胞／３０ml／Ｔ８０になるようにまき直し、
さらに遺伝子導入４時間前に、新しいα⁺ＭＥＭ培地
（１０％ＦＢＳ、抗生物質を含む）３０mlで培地交換し
た。

【００４９】一方、プラスミッドｐＫＤＰＸＡ４５７及
びｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIをそれぞれ１０μｇあ
たり２４０μｌの滅菌精製水に溶解し、等量のＢｕｆｆ
ｅｒＡ（０．５ＭＣａＣｌ₂，０．１ＭＨＥＰＥ
Ｓ）を加え、混合し、１０分間室温で放置した後、この
混合液に、ＢｕｆｆｅｒＢ（０．２８ＭＮａＣｌ，
０．０５ＭＨＥＰＥＳ，０．７５mM ＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄，０．７５mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄)を４８０μｌ加え、V
ortex Mixerで数秒撹拌後、室温で２０〜３０分放置す
ることにより、プラスミッドを含むリン酸カルシウムゲ
ルを形成させた。

【００５０】次に、この様にして得られた、プラスミッ
ドを含むリン酸カルシウムゲル９６０μｌを前記した方
法で調製したＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞（１．６×１０⁶
細胞／３０ml／Ｔ８０）に加え、４時間放置した。次に
この細胞をＦＢＳを含まない新しいα⁺ＭＥＭ培地１０
mlで一回洗浄した後、１０％ＦＢＳを含むα⁺ＭＥＭ培
地：グリセロール＝４：１の混液をＴ８０フラスコあた
り５mlを加え、正確に１分後、吸収除去し、再び１０％
ＦＢＳを含むα⁺ＭＥＭ培地３０mlを加え、５％ＣＯ₂
存在下で、３７℃で培養した。

【００５１】次に、この細胞を４日間培養した後、０．
２５％トリプシン液（千葉血清）で細胞を剥離し、この
細胞をもう一度、核酸を含まないMEM Medium（α^-ＭＥ
Ｍ）１０％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ^d，ＨＡＺＥＬＴ
ＯＮ）を加えた培地で１．６×１０⁶細胞／３０ml／Ｔ
８０になるようにまきなおした。つづいて、この細胞を
１０日間培養した後、この培地で生存している細胞を目
的のプラスミッドが導入された細胞（ｐＫＤＰＸＡ４５
７を導入した細胞をＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ４５７−α、
ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIを導入した細胞をＣＨＯ
／ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌII−αとする）として以
下の実験に用いた。

【００５２】（３）遺伝子増幅上記方法で得た細胞ＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ４５７−αと
ＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌII−αに含まれる
遺伝子（ｐＫＤＰＸＡ４５７またはｐＫＤＰＸＡ７９９
ＢｇｌII）を増幅させるために、上記細胞を、それぞ
れメトトレキセート（ＭＴＸ，Ｓｉｇｍａ）濃度を３０
nM、１００nM、３００nM、１０００nMと順次上昇させた
培地で培養し、各段階でＭＴＸ耐性を示す細胞を得た。

【００５３】次に、このようにして得た１０００nM Ｍ
ＴＸ耐性を獲得した細胞（この細胞をそれぞれＣＨＯ／
ｐＫＤＰＸＡ４５７−１及びＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ７９
９ＢｇｌII−１とする）をそれぞれ１．６×１０⁶細胞
／３０ml／Ｔ８０になるようにまきなおし、５％ＣＯ₂
存在下、４日間、３７℃で培養した。

【００５４】次に、これらの培養液の一部を取り、Ｃ−
末端α−アミド化酵素活性を合成基質〔¹²⁵Ｉ〕−Ａｃ
−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを用いて測定した（Ｃ−末端
α−アミド化酵素活性の測定方法及びunitの定義につい
ては本発明者らによる特願昭６２−３０６８６７に詳細
に記載してある）。この結果、ＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ４
５７−１、ＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌII−１
の培養液中にそれぞれ、１unit及び３１０unitの酵素活
性があることが判った。

【００５５】（４）Ｃ−末端α−アミド化酵素高生産株の樹立上記実験より、ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIを導入し
た細胞の方が、ｐＫＤＰＸＡ４５７を導入した細胞より
高い酵素活性を示すことが判ったので、本発明者らは、
さらに高い、Ｃ−末端α−アミド化酵素生産株を樹立す
る為に、前記実施例２−（３）で得た、ＭＴＸ１００
nM耐性株ＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌIIについ
て、限界希釈法により、クローニングを行った。すなわ
ち、９６穴平底プレート（corning)にＭＴＸ１００nM
耐性ＣＨＯ／ｐＫＤＰＸＡ７９９ＢｇｌII細胞が、平均
３個、１．５個、０．７５個、又は０．３７５個／well
になるようにまき、これらの細胞を１０％ＦＢＳを含む
α^-ＭＥＭ培地１００μｌ／wellで一週間培養した。

【００５６】一週間後、顕微鏡下に単一のコロニーを形
成して増殖してきたと認められる３０wellに１００μｌ
のα^-ＭＥＭ培地を加え、さらに一週間培養した。これ
ら３０の細胞について、細胞をまいてから二週間後、培
養上清の酵素活性を測定した。この結果、ＣＨＯ／９Ｃ
と名付けた細胞が、これらの細胞の内で最も高い酵素活
性（９１０unit／ml）を示すことが判った。次に、最も
高い酵素活性を示したＣＨＯ／９Ｃを、さらにＭＴＸ濃
度を０．１，０．３，１，３，１０，３０μＭと、順次
上昇させながら培養し、それぞれ各段階のＭＴＸ耐性株
を得た。

【００５７】この様にして得たＭＴＸ耐性株をそれぞれ
１０％ＦＢＳを含むα^-ＭＥＭ培地を用いて、１．６×
１０⁶細胞／３０ml／Ｔ８０の条件で４日間培養した
後、培養上清中の酵素活性を測定した結果、ＭＴＸ３
μＭ耐性株が、最も高い酵素活性値（２８６０unit／m
l）を示すことが判った。本発明者らは、このようにし
て得られたＭＴＸ３μＭ耐性株９Ｃ株から、さらに高
生産株を樹立するために、この細胞株より、前記した方
法を用いてクローニングを行った。この結果、最終的に
は、２０００unit／ml以上のＣ−末端α−アミド化酵素
活性を示すＣＨＯ株（この生産株をＣＨＯ／１０Ｃとす
る）を樹立することができた。

【００５８】（５）カエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド
化酵素誘導体（ＸＡ７９９ＢｇｌII）生産株の培養実施例２−（４）で得たカエル体皮由来Ｃ−末端α−ア
ミド化酵素誘導体生産株ＣＨＯ／１０Ｃを用いて、以下
に示す方法でカエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素
誘導体の生産を行った。すなわち、ＣＨＯ／１０Ｃ、１
×１０⁷細胞と１０％ＦＢＳを含むα^-ＭＥＭ培地５０
０mlを１８５０cm²のRoller Bottle(Falcon）に入れ３
７℃条件下一週間培養した。

【００５９】次に、この細胞を順次新しい１０％ＦＢＳ
を含むα^-ＭＥＭ、３％ＦＢＳを含むα^-ＭＥＭ及び１
％ＦＢＳを含むα^-ＭＥＭ培地で３７℃、２４時間培養
した。最終的には１％ＦＢＳを含むα^-ＭＥＭ培地で２
４時間培養した培養上清を回収し、以下の実験に用い
た。なお、ここで得られた培養上清は、約４０００unit
／mlの酵素活性を示し、この様にして得たＣ−末端α−
アミド化酵素を以後ＸＡ７９９ＢｇｌIIとする。

【００６０】（６）ＸＡ７９９ＢｇｌIIの精製実施例３−（５）で得られた培養上清１ｌに、最終硫酸
アンモニウム濃度が４５％になるように硫酸アンモニウ
ムを加え、生じた沈澱を遠心分離で集め、この沈澱を５
mM Tris・HCl Buffer（pH７．０）２０mlに溶かした。
次に、このようにして得た各画分の酵素活性を合成基質
を用いて測定したところ、ほとんどすべての酵素活性が
沈澱画分に回収されることが判った。さらに、各画分を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析したところ図３に示すよ
うに、この沈澱画分は培地由来の多くの蛋白質（主にＢ
ＳＡ）が除かれていることが判った。以後、この様にし
て得たＸＡ７９９ＢｇｌIIを用い、in vitroでのアミ
ド化反応の条件を検討した。

【００６１】実施例３． in vitroにおけるアミド化反応の条件検討実施例１で製造したｈＣＴ−Ｇｌｙと実施例２−（６）
で精製したＸＡ７９９ＢｇｌIIを用いて、in vitroにお
けるアミド化反応の至適条件を検討した。反応は、反応
液１mlを３７℃でインキュベートし、０．５，１，２及
び４時間後に５０μｌをサンプリングし、これに９５０
μｌの５Ｎ酢酸に加え、このうち２０μｌをＣ１８−Ｈ
ＰＬＣ（カラム：ＹＭＣＡ−３０２４．６×１５０
mm緩衝液：１０％酢酸アンモニウムをベースにアセトニ
トリル濃度を２４％から４５％まで１８分の直線勾配で
上げる）に適用し、ｈＣＴ−Ｇｌｙの残量と新しく生じ
たｈＣＴの量を調べた。尚、反応条件は、合成基質〔
¹²⁵Ｉ〕Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ→〔¹²⁵Ｉ〕Ａ
ｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の条件（特願昭６２−３０
６８６７）をもとに、（１）アスコルビン酸、（２）カ
タラーゼ、（３）硫酸銅、（４）緩衝液（pH）、（５）
緩衝液（濃度）、（６）ｈＣＴ−Ｇｌｙ濃度について検
討した。

【００６２】（１）アスコルビン酸濃度の検討（図４参照）０，１．０，３．５，７，２０mMのアスコルビン酸濃度
でのアミド化効率を調べた。他の組成は以下に示した。２．５mg／ml ｈＣＴ−Ｇｌｙ１００mM トリス塩酸（pH７．０）２５μｌ／ml カタラーゼ７０μＭ硫酸銅１８６０Ｕ／ml ＸＡ７９９ＢｇｌII

【００６３】反応１時間後の変換率（１００ｘｈＣＴ／
ｈＣＴ＋ｈＣＴ−Ｇｌｙ）を図４に示した。アスコルビ
ン酸非存在下では、全く反応が進まず、１〜７mMでは、
効率よく反応が進んだ。しかし、さらに濃度を上げると
き（２０mM）、変換率は低下した。

【００６４】（２）カタラーゼ濃度の検討（図５参照）０．２，１，２，２５，１２５μｇ／mlのカタラーゼ濃
度でのアミド化効率を調べた。他の組成は以下に示す。２．５mg／ml ｈＣＴ−Ｇｌｙ１００mM トリス塩酸（pH７．０）３．５mM アスコルビン酸７０μＭ硫酸銅１５００Ｕ／ml ＸＡ７９９ＢｇｌII反応１時間後
の変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣＴ−Ｇｌｙ）
は、６０〜７５％とほぼ変らなかったが（図５）、１μ
ｇ／ml以上では、２時間で変換率が１００％なのに比
べ、０．２μｇ／mlでは４時間でも９３％であった。

【００６５】（３）硫酸銅（Ｃｕ²⁺イオン）濃度の検討（図６参照）０，１，１０，７０，１５０μＭの硫酸銅濃度でのアミ
ド化効率を調べた。他の組成は以下に示す。２．５mg／ml ｈＣＴ−Ｇｌｙ１００mM トリス塩酸（pH７．０）２５μｇ／ml カタラーゼ３．５mM アスコルビン酸１５００Ｕ／ml ＸＡ７９９ＢｇｌII 反応１時間後の変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣ
Ｔ−Ｇｌｙ）を図６に示した。硫酸銅の濃度が、０，
１，１０μＭと増えるに従いアミド化効率は良くなる
が、それ以上では変らなかった。

【００６６】（４）緩衝液（pH）の検討（図７参照）１００mM トリス塩酸（pH７．０，７．５，８．０，
８．５）１００mM ＭＯＰＳ（pH６．５，７．０，７．５，８．
０）１００mM 酢酸アンモニウム（pH６．０，６．５，７．
０）の１１種類の緩衝液についてアミド化効率を調べた。他
の組成は以下に示す。

【００６７】２．５mg／ml ｈＣＴ−Ｇｌｙ２０μｇ／ml カタラーゼ２．０mM アスコルビン酸１０μＭ硫酸銅１０００Ｕ／ml ＸＡ７９９ＢｇｌII 反応１時間後の変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣ
Ｔ−Ｇｌｙ）を図７に示す。至適pHは６〜７であること
がわかった。また、酢酸アンモニウムを用いた場合に反
応速度が速かった。

【００６８】（５）緩衝液（濃度）の検討（図８参照）１０，５０及び１００mMの酢酸アンモニウム濃度でのア
ミド化効率を調べた。他の組成は以下に示す。２．５mg／ml ｈＣＴ−Ｇｌｙ２０μｇ／ml カタラーゼ１０μＭ硫酸銅２．０mM アスコルビン酸１０００Ｕ／ml ＸＡ７９９ＢｇｌII 反応１時間後の変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣ
Ｔ−Ｇｌｙ）を図８に示す。変換率は緩衝液の濃度によ
らず、ほぼ８０％で同じだが、低いほうが若干高かっ
た。

【００６９】（６）基質（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）濃度の検討（図９参照）２．５及び５mg／mlのｈＣＴ−Ｇｌｙ濃度でのアミド化
効率を調べた。他の組成は以下に示す。１０mM 酢酸アンモニウム（pH６．０）２０μｇ／ml カタラーゼ１０μＭ硫酸銅２．０mM アスコルビン酸１０００Ｕ／ml ＸＡ７９９ＢｇｌII

【００７０】経過時間のそれぞれのｈＣＴ−Ｇｌｙ濃度
での変換率（１００ｘｈＣＴ／ｈＣＴ＋ｈＣＴ−Ｇｌ
ｙ）を図９に示す。２．５mg／mlでは２時間で、５mg／
mlでは４時間で、すべてアミド化される。ＸＡ７９９
ＢｇｌIIの濃度が同じなのでｈＣＴ−Ｇｌｙ当りのＸＡ
７９９ＢｇｌIIの量はｈＣＴ−Ｇｌｙ濃度５mg／mlで
は２．５mg／mlの半分になる。

【００７１】実施例４．ｈＣＴの製造（図１０参照）以上の条件検討をもとにｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応
を行い、ｈＣＴの製造を行った。アミド化反応の条件は
以下に示す。２．５mg／ml ｈＣＴ−Ｇｌｙ１０mM 酢酸アンモニウム（pH６．０）２０μｇ／ml カタラーゼ１０μＭ硫酸銅２．０mM アスコルビン酸１０００Ｕ／ml ＸＡ７９９ＢｇｌII 反応前、反応後０．５時間、及び２時間のＣ１８−ＨＰ
ＬＣのチャートを第１０図に示す。

【００７２】時間経過に伴い、ｈＣＴ−Ｇｌｙのピーク
（１１．８分）が減少し、ｈＣＴのピーク（１２．９
分）が増えるのがわかる。反応２時間後、このサンプル
をＣ１８−ＨＰＬＣに供し、ｈＣＴを分離、精製した。
この結果、ｈＣＴが９３．５％の収率で得られることが
判った。なお、収率は、分取したｈＣＴをアミノ酸分析
することにより求めた。

【００７３】実施例５．ｈＣＴの同定実施例４で製造した、ヒト・カルシトニン（ｈＣＴ）の
同定は以下に示す方法で行った。すなわち、１）本発明
で製造したｈＣＴはＨＰＬＣ（実施例３に記載した条
件）での溶出位置が、化学合成で製造されたヒト・カル
シトニン（ペプチド研究所より入手）と完全に一致し
た。２）アミノ酸分析の結果は、下記に示す値を示し、
理論値（）とよく一致した。

【００７４】Ａｓｘ２．９９（３），Ｔｈｒ４．７
２（５），Ｓｅｒ０．９１（１），Ｇｌｘ２．００
（２），Ｐｒｏ１．９７（２），Ｇｌｙ３．９６
（４），Ａｌａ１．９７（２），Ｖａｌ１．００
（１），Ｍｅｔ０．９８（１），Ｉｌｅ０．９７
（１），Ｌｅｕ２．００（２），Ｔｙｒ１．０２
（１），Ｐｈｅ２．９５（３），Ｌｙｓ１．００
（１），Ｈｉｓ０．９７（１）．

【００７５】３）アミノ酸配列はＣ−末端のＰｒｏ−Ｎ
Ｈ₂を除く全アミノ酸配列を確認できた。４）ｈＣＴの
Ｃ−末端、Ｐｒｏ−ＮＨ₂の最終構造は、ｈＣＴをLysy
1 Endopeptidase(和光純薬工業株式会社）で処理するこ
とにより得られるＣ−末端ペプチドフラグメント（ｈＣ
Ｔ〔１９−３２〕）をＨＰＬＣを用いて単離し（ｈＣＴ
は１８位にリジン残基が１残基存在している）、このも
のの分子量をFast AtomBombartment(FAB)質量分析で測
定したところ、分子量が理論値と一致することから、ｈ
ＣＴのＣ−末端Ｐｒｏ−ＮＨ₂であることが確認され
た。以上の結果より、本発明で述べた方法により製造し
たｈＣＴの構造は、ヒト・カルシトニンと同一であるこ
とを確認できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｈＣＴ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇをＣｐＢで処理して得たｈＣＴ−ＧｌｙのＣ１８Ｈ
ＰＬＣによる溶出パターンを示す図である。

【図２】図２は、動物細胞でＣ−末端α−アミド化酵素
（ＸＡ４５７，ＸＡ７９９ＢｇｌII）発現するための
プラスミッドの構造を示す図である。

【図３】図３は、硫酸アンモニウム沈澱によるＸＡ７９
９ＢｇｌIIの精製を示す電気泳動の写真である。

【図４】図４は、ＸＡ７９９ＢｇｌIIによるin vitro
でのｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応に対するアスコルビ
ン酸濃度の影響を示す図である。

【図５】図５は、ＸＡ７９９ＢｇｌIIによるin vitro
でのｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応に対するカタラーゼ
濃度の影響を示す図である。

【図６】図６は、ＸＡ７９９ＢｇｌIIによるin vitro
でのｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応に対する銅イオン濃
度の影響を示す図である。

【図７】図７は、ＸＡ７９９ＢｇｌIIによるin vitro
でのｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応に対する緩衝液（p
H）の影響を示す図である。

【図８】図８は、ＸＡ７９９ＢｇｌIIによるin vitro
でのｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応に対する緩衝液濃度
の影響を示す図である。

【図９】図９は、ＸＡ７９９ＢｇｌIIによるin vitro
でのｈＣＴ−Ｇｌｙのアミド化反応に対する基質（ｈＣ
Ｔ−Ｇｌｙ）濃度の影響を示す図である。

【図１０】図１０は、ＸＡ７９９ＢｇｌIIによるin v
itroでのｈＣＴ−Ｇｌｙ→ｈＣＴ変換反応の０分、３０
分、及び２時間後のサンプルのＣ１８ＨＰＬＣのチャー
トを示す図である。

フロントページの続き (72)発明者大末和廣大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者孫田浩二大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ−末端アミド化酵素及びその誘導体の
製造方法において、以下のアミノ酸配列：【化１】【化２】【化３】【化４】【化５】の内、少なくとも第６位のＣｙｓから第３２９位のＨｉ
ｓまでのアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている
ＤＮＡを有し、これを発現することができるプラスミド
により形質転換された動物細胞を培養することにより、
該蛋白質を生成し、それを採取することを特徴とする方
法。