JPH01104168A - Ｃ−末端α−アミド化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は組換ＤＮＡ技術によって得られるアフリカッメ
ガエル−Ωμ四μＩｓ　　１ａｅｖｉｓ）由来のＣ−末
端α−アミド化酵素及びその前駆体、これらをコードす
るＤＮＡ、このＤＮＡを含有するプラスミド、このプラ
スミドにより形質転換された宿主細胞、この宿主細胞を
用いる前記酵素又はその前駆体の製造方法、並びにこの
酵素を用いるＣ−末端α−アミド化ペプチド又は蛋白質
の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

−ａに、真核細胞において、ある種のペプチドまたは蛋
白質はメツセンジーＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）から翻訳さ
れた後、細胞内酵素により、さらに修飾（ポスト・トラ
ンスレーショナル・モディフィケイション）され、天然
型のペプチドまたは蛋白質に成ることが知られている。

しかしながら、現在、組換ＤＮＡ　（γ−ＤＮＡ）技術
によって真核細胞由来ペプチドまたは蛋白質を生産する
宿主として広く用いられている大腸菌のような原核細胞
は、ｍＲＮＡ翻訳後のペプチドまたは蛋白質の修飾を行
なうことができない。

この真核細胞特有なペプチドまたは蛋白質の修飾の一つ
に、ペプチドまたは蛋白質のカルボキシル基末端（Ｃ−
末端）α位がアミド化（−Ｃ０ＯＨ基を−ＣＯＮＨ，基
へ変換すること）される修飾反応がある。すでに、多く
の真核細胞由来、生理活性ペプチドまたは蛋白質にこの
ような修飾が起っていることが知られており、例えば、
カエル体皮よりＣ−末端αアミド化ペプチドとしてＴ　
ＲＨ（ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｎｌｌｚ）及びセル
レイン（Ｃａｅｒｕｌｅｉｎ）　（ｐＧｌｕ−０ｉｌｌ Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−’
Ｍｅｔ−八５ｐ−へｈｅ−Ｎｔｌｚ）が単離され、これ
らのペプチドの前駆体構造の一部についても、ｃＤＮＡ
の解析から明らかになっている。

一方、−ａにこれらアミド化ベブヂドの生合成機構はま
ずアミド化ペプチド前駆体がｍＲＮＡより翻訳された後
、Ｃ−末端α−アミド化酵素により、Ｃ−末端α−アミ
ドペプチド前駆体のＣ−末端α−位がアミド化されるこ
とが判ってきている。なお、この反応におけるＣ−末端
α−アミド化酵素の基質となるＣ−末端α−アミドペプ
チド前駆体とは一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ　　（式中、Ｒは
ペプチドまたは蛋白質のＮ−末端部分の任意のアミノ酸
配列であり、ＸはＣ二末端α−アミド化される任意のア
ミノ酸残基を示しＧｌｙはグリシン残基を示す）で表さ
れるペプチド及び蛋白質である。

さらに、しばしばこの修飾はこれらペプチドまたは蛋白
質の生理活性に必須であることが知られている。−例を
示せば、ヒト・カルシトニンの場合、天然型のＣ−末端
プロリンアミド残基をプロリン残基に変換すると、生理
活性が１６００分の１にも減少する。

近年、真核細胞由来ペプチドまたは蛋白質のＣ−末端α
−アミド化の機構を明らかにすることの重要性に加えて
、大腸菌などの原核細胞を宿主と一アミド化酵素が注目
され、この酵素の精製・物理化学的解析が試みられてい
る。１９８２年、Ｂｒａｄｂｕｒｙらにより、この酵素
が、ブタ下垂体中に存在することが報告された。彼らは
、基質として合成ペプチドＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
を用い、これがＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｎｌ１ｇに変換さ
れること、及びＣ−末端のＧｕｙがアミドの窒素（Ｎ）
の供与体として必須であることを示した（Ｂｒａｄｂｕ
ｒｙ、　Ａ、Ｆ、等；Ｎａｔｕｒｅ、　２９Ｂ　、６８
６　６８８゜１９８２）。Ｅｉｐｐｅｒらは、この酵素
活性がラット下垂体の前葉、中葉および後葉に存在して
いることを報告し、この酵素の最大酵素活性を得るため
には、分子状酸素の外に、銅イオン（Ｃｕ”　）とアス
コルビン酸が必要であると報告した（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳ、８０．５１４４−５１４８．１９８３
）。又、この報告も含め、種々の組織から、ペプチド薫
たは蛋白質のＣ−末端α−アミド化酵素の精製が試みら
れていたが、単一で純粋な状態にまで精製された酵素が
得られた例はこれまでに報告されていない（Ｈｕｓａｉ
ｎ。

■９等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ、１５２．２２７−２
８１，１９８３　；　Ｋｉｚｅｒ。

Ｊ、Ｓ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ｔｌＳ、８１＋　３２２８　３２３２゜１９８４　；　
Ｍｕｒｔｈｙ、Ａ、Ｓ、Ｎ、等、Ｊ、Ｂｉｏｄ、Ｃｈｅ
ｍ、２６１．１８１５−１８２２．１９８６等）。

最近Ｍｉｚｕｎｏ等らはアフリカッメガエル−αμｙＩ
ａｅｖｉｓ）の体皮より、Ｃ−末端α−アミド化酵素を
単一で純粋な状態まで精製することに成功した（Ｍｉｚ
ｕｎｏ、　Ｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ。

１３７．９８４−９９１．１９８６、および特願昭６ｌ
−１３１０８９）。

しかし、このような方法で単一で純粋な状態にまで精製
した酵素でも、酵素の工業的コストが高く、Ｃ−末端α
−アミド化ペプチドまたは蛋白質の大量生産に適用する
ことはできない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は組換ＤＮＡ技術により得られるＣ−末
端α−アミド化酵素、および該酵素の組換ＤＮＡ技術に
よる工業的製造法を提供することを最終目的とす２もの
である。

〔問題点を解決するための手段〕

従って、本発明は、アフリカッメガエル由来のＣ−末端
α−アミド化酵素又はその前駆体をコードしているＤＮ
Ａを含有しこれを発現せしめることができるプラスミド
により形質転換された宿主細胞を培養することにより該
酵素を生成せしめ、これを採取することを特徴とするＣ
−末端α−アミド化酵素又はその前駆体の製造方法；こ
の方法により製造される該酵素及びその前駆体；並びに
該酵素の使用方法としての、組換ＤＮＡ技術により生産
されるアフリカッメガエル７１ａｅｖｉｓ）由来のＣ−
末端α−アミド化酵素を、Ｃ−末端にグリシン残基を有
するペプチド又は蛋白質に作用せしめることを特徴とす
る、該グリシン残基を有しないＣ−末端α−アミド化ペ
プチド又は蛋白質の製造方法を提供するものであり、さ
らにこれらの前提となる前記酵素又はその前駆体をコー
ドするＤＮＡ、このＤＮＡを含有するプラスミド、及び
このプラスミドにより形質転換された宿主細胞を提供す
るものである。

〔具体的な説明〕

本発明者らは、アフリカッメガエルハ叩亜…１ａｅｖｉ
ｓ）の体皮より、Ｃ−末端α−アミド化酵素を単一で純
粋な状態まで精製し、この酵素のアミノ酸配列の一部を
明らかにした。さらにこの酵素の部分アミノ酸配列を基
に、ＤＮＡプローブ（ρｒｏｂｅ）を作製、このＤＮＡ
プローブを用い、アフリカッメガエル体皮より作製した
ｃＤＮパライブラリ−をスクリーニングすることにより
、Ｃ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡの単一クローンを
得ることに成功した。又このｃＤＮＡ塩基配列を明らか
にすることにより、アフリカッメガエル体皮由来Ｃ−末
端α−アミド化酵素の全アミノ酸−次配列（第２図参照
）及び前駆体（プレ体第３図、プレプロ体第４図参照）
の構造を明らかにした。次に、このｃＤＮＡを大腸菌内
で大量に発現させることに成功し、本酵素を大量かつ安
価に供給する方法を開発した。

一方、前記のごとく、カエルの体皮にはＣ−末端α−ア
ミド化ペプチドとして少なくともＴＲＨ及びセレインが
存在することが知られており、これが前記酵素一種のみ
で生合成されているかは明らかではない。いいかえれば
前記酵素以外にも生体内には同様な活性を示す酵素が存
在しており、個々のＣ−末端α−アミド化ペプチド又は
蛋白質は、各々、別々のＣ−末端α−アミド化酵素によ
り生合成されている可能性があり、Ｃ−末端α−アミド
化酵素にも多様性があることが考えられる。

そこで、前記のＣ−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡを
プローブとして使用し、アフリカッメガエル由来のｍＲ
ＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーを再スクリー
ニングすることにより、前記のＣ−末端α−アミド化酵
素と同様の活性を有するがしかしそのアミノ酸配列が明
らかに異なる酵素を見出し、前記と同様にしてその発現
に成功した。

さらに、このようにして製造した酵素を用い、グリシン
残基をＣ−末端とするペプチドまたは蛋白質を基質とし
て、Ｃ−末端α−アミド化ペプチドまたは蛋白質を生成
させる技術を開発した。

本発明におけるＣ−末端α−アミド化酵素とは、式Ｒ−
Ｘ−Ｇｕｙで表わされるペプチドまたは蛋白質（式中、
Ｒはペプチドまたは蛋白質のＮ−末端部分の任意のアミ
ノ酸配列であり、ＸはＣ−末端α−アミド化されるアミ
ノ酸残基であり、Ｇｌｙはグリシン残基を示す。以下同
じ）をアミド化、すなわち式Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨｚ（式中
Ｒはペプチドまたは蛋白質のＮ−末端部分の任意のアミ
ノ酸配列であり、Ｘ−Ｃ０ＮＨ，はＣ−末端α−カルボ
キシル基がアミド化されたアミノ酸残基を示す。以下同
じ）に変換する酵素をいう。

また、アフリカッメガエル由来のＣ−末端α−アミド化
酵素とは、前記の活性を有しアフリカッメガエル中に存
在する酵素、及び前記の活性が失われない程度に天然酵
素のアミノ酸が、置き換え、追加、又は除去により変更
されているものを意味する。

以下本発明を具体的に説明する。

アフリカッメガエルの体皮よりＭｉｚｕｎｏ等の方法（
Ｍｉｚｕｎｏ、Ｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ。

１３７．９８４−９９１．１９８６）に準じＣ−末端α
−アミド化酵素を均一な状態に精製する（以下、この酵
素をＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅという）。すなわち、
この体皮を適当な緩衝液を用いて洗浄した後物理的手段
を用いて破砕して酵素を溶出させ、この溶出液から常法
に従い酵素を回収・精製する。次にこの酵素をトリプシ
ンで分解し、得られるペプチド断片を逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分画精製する。次に
各トリブチイックフラグメントのアミノ酸配列をプロテ
インシークエンサーを用いて決定する。一方、Ｎａｔｉ
ｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのＮ−末端アミノ酸配列については
、精製した酵素をそのままプロテインシークエンサーに
供することにより決定する（第５図参照）。

（２）Ｃ−−−ｒ５α−アミド　・′ｃＤＮＡのｆ′ｊ
ｔアフリカッメガエルの体皮より、常法に従い、全ＲＮ
Ａを調製、続いて、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロースカラ
ムを用い、ｐｏｌｙ　（Ａ）ＲＮＡを調製する。次に、
ここで得られたｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを用い、Ｇｕｂｌ
ｅｒ、等の方法（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、及びＨｏｆｆｍ
ａｎ、Ｂ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ　２５，２６３．１９８３）
に従い、ｃＤＮＡを作製、続いてこのｃＤＮＡを大腸菌
に１２株由来Ｄｌ１１にトランスフェクションすること
によりアフリカッメガエルの体皮由来のｃＤＮＡライブ
ラリーを作製する。次に、ここで得られたｃＤＮＡライ
ブラリーにより目的とするＣ−末端α−アミド化酵素ｃ
ＤＮＡを単離する為に、本酵素の部分アミノ酸配列（例
えばＴ−１１，７−３０、第５図参照）を基に、このア
ミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ混合
プローブ（例えばＹＳＯ１２。

ＹＳＯ１３、ＹＳＯ１５など、第６図参照）として作製
する。次に、各ＤＮＡ混合プローブの５′末端を〔γ−
”Ｐ）ＡＴＰ／Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼを用い放
射標識した後、このＤＮＡ混合プローブを用い、前記、
大腸菌に１２株由来ＤＩｌｌのｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングすることにより、／ｐＸＡ４５７を得る
ことができる。

さらに、このＣ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡを含む
プラスミドのＤＮＡフラグメント、例えば第１図に示す
ｐＸＡ４５７の塩基配列５４番目のＣから７９５番目の
ＧまでのＰｖｕＩｒＤＮＡフラグメントを〔α−３２Ｐ
）ＣＴＰを用いニックトランスレーションで放射標識し
、このようにして調製したＤＮＡプローブを用い、前記
、大腸菌に１２株由来０１１１のｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、前記のものとは異る
単一なＣ−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡクローン、
例えばＤＩ　１　／ｐＸＡ７９９を得ることができる。

（３）Ｃ−ｒα−アミ゛　　　ｃＤＮＡの”得られた単
一クローンより常法に従いプラスミド、例えばｐＸＡ４
５７を単離し、種々の制限酵素で切断して、ｃＤＮＡの
制限酵素地図を作成する（第７図（ａ）参照）。次に、
このｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を決定する為に、まず種
々の制限酵素で切断したｃＤＮＡ断片をＭ１３ファージ
にサブクローニングし、各クローンのｃＤＮＡ部分のＤ
ＮＡ塩基配列をＳａｎｇｅｒ等の方法（Ｓａｎｇｅｒ　
Ｆ、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、３４．５４６３−５４６７（Ｉ９７７））
により決定する（第７図（ｂ）参照）。

このｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、このｃＤＮＡ
には、１）塩基配列第１位から始まり、１２００位で終
る一個の長いオープンリーディングフレームが存在し、
２）このオープンリーディングフレームで予測されるア
ミノ酸の一次配列は、Ｎ−末端のＭｅｔ−＾１ａ−Ｓｅ
ｒで始まりＣ−末端の５ｅｒ−八１ａ−Ｖａｌで終る４
００アミノ酸残基より構成されており、そして３）この
オープンリーディングフレームで予測されるアミノ酸−
次配列は、前記したＮａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅの部分ア
ミノ酸配列（第５図の各トリブチツクフラグメントのア
ミノ酸配列）をすべて含んでいることが明らかになった
。これらの結果よりｐＸＡ４５７は本酵素のｃＤＮＡの
蛋白質翻訳部分を完全に含んでいるプラスミドであった
。次に、すでにＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのＮ−末端
アミノ酸配列は５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐであることが本酵素の蛋白質レベルでの解析から明ら
かになっており（第５図参照）、このアミノ酸配列は、
ｃＤＮＡから予想されるＮ−末端、Ｍｅｔ（−３７）（
数字は、第１図において、塩基配列番号１１２〜１１４
に対応するＳｅｔを１番目とした時の３′末端側へのア
ミノ酸配列番号を示し、数字の前に−がある時は塩基配
列番号１０９〜１１１に対応する＾ｒｇを一１番とした
時の５′末端側へのアミノ酸配列番号を示す。以下同じ
）から数えて３８番目、つまり、５ｅｒ（Ｉ）以後のア
ミノ酸配列に対応していることが判った。したがって、
ｃＤＮＡが予測されるＮ−末端のＭｅｔ（−３７）から
３７番目のＡｒｇ（−１）までのアミノ酸配列は他の多
くの分？ｊｌ　（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）蛋白質でその存
在及び機能が明らかにされている蛋白質の膜分泌に必要
なシグナルシーフェンス（ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ）様機能をはたしていることが予測される（第１図
下線部参照）。

ごれより、Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのＮ−末端は、
まずＭｅｔ（−３７）から翻訳された後シグナルベプチ
ターゼ又は他のプロセッシング酵素によりＭｅｔ（３７
）からＡｒｇ（−１）までの３７個のアミノ酸より成る
ペプチド部分が切断されて生ずることが判った。

一方、ｃＤＮＡの解析から予測されるＮａｔｉｖｅ　ｅ
ｎｚｙｍｅのＣ−末端アミノ酸配列は一５ｅｒ−＾１ａ
−Ｖａｌ−ＯＨであるが、Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ
の蛋白質レベルでのＣ−末端アミノ酸配列は決定されて
いなかった。そこで本発明者らは、Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎ
ｚｙｍｅのＣ−末端構造を明らかにする為に以下に述べ
る解析と実験を１〒なった。

まず、Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのＮ−末端アミノ酸
配列が５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒであることが決定されて
いるので本酵素のＣ−末端がｃＤＮＡから予測される５
ｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＯＨであれば、Ｎａｔｉｖｅ　
ｅｎｚｙｍｅのアミノ酸−次配列から予測される理論分
子ｆｆｉ　（ＭＷ）は４０１１４となり、アフリカッメ
ガエルより単離精製したＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅの
ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによる分子量約３９０００と比較し
、やや分子量が大きい。

又、Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのアミノ酸組成は第１
表に示すごとく決定されており、これをｃＤＮＡから予
測される理論アミノ酸組成と比較するとＮａｔｉｖｅｅ
ｎｚｙｍｅはグルタミン酸残基が４〜５個、ロイシン残
基が３個分、理論値に比較して少ないことが判った。一
方、ｃＤＮＡから予測される木酢ずのＣ−末端近傍のア
ミノ酸配列中にはＬｙｓ（３４４）−Ａｒｇ（３４５）
配列が存在しており、このアミノ酸配列は、すでに多く
の生理活性ペプチドの前駆体からＭａ　ｔｕｒｅｐｅｐ
ｔｉｄｅが生成される際、ある種のプロセッシング酵素
（プロテアーゼ）認識部位となっており、この部位が切
断されることにより、前駆体から成熟ペプチドが生合成
からることが知られていることから、Ｎａｔｉｖｅ　ｅ
ｎｚｙｍｅにおいてもｃＤＮＡで予測されるＣ−末端近
傍のＬｙｓ　（３４４）　−Ａｒｇ　（３４５）配列間
が切断されることによりＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅが
生じている可能性が高い。この可能性はさらに、もし、
ｃＤＮＡから予測される本酵素のＣ−末端近傍Ｉ）アミ
ノ酸組成値がよりＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのアミノ
酸組成値に近くなる。２）理論ＭＷ値がＮａｔｉｖｅ　
ｅｎｚｙｍｅの実測値とほぼ一致する。３　）　Ｎａｔ
ｉｖｅ　ｅｎｚｙｎ＋ｅのトリブチツクフラグメントＴ
−９のアミノ酸配列がＩｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＯＨであり
、＾５ｎ（３３７）−Ｔｈｒ（３３８）−ＧＩｙ（３３
９）−Ｌｅｕ（３４０）−Ｇｌｎ（３４１）−Ｇ　Ｉｎ
　（３４２）　−Ｐｒｏ　（３４３）　−Ｌｙｓ　（３
４４）に相当することが確認されている事実などからも
うらずけされる。

そこで、本発明者らはこの可能性を実験的に証明する為
に、まず、１）本酵素のｃＤＮＡ上、ｃＤＮＡ（Ｉ１２
〜１２００）　（数字は第１図におけるｃＤＮＡ塩基配
列番号を示す）と、ｃＤＮＡ（Ｉ１２〜１１４３）にコ
ードされている蛋白質をそれぞれ大腸菌内で発現させ、
２）大腸菌内で発現させたおのおのの蛋白質とＮａｔｉ
ｖｅ　ｅｎｚｙｍｅとのＭＷをＳＯ３−ＰＡＧＥを用い
比較検討し、３）大腸菌内で発現させたおのおのの蛋白
質をＳＤＳ　−ＰＡＧＩＩ！で分離し、さらに目的蛋白
質をゲルよりそれぞれ単離し、これらの蛋白質のアミノ
酸組成を測定し、これらの値をＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙ
ｍｅのアミノ酸組成値と比較検討した。その結果は、後
記実施例９に示すようにＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅの
アミノ酸−次配列とｐＸＡ４５７ｃＯＮＡ（Ｉ１２〜１
１４３）にコードされているアミノ酸−次配列は同一の
ものであることを強く示唆するものであった＝（第１表
、第１４図（ｂ）参照）。

同様にして、最初のｃＤＮＡをプローブとして得られた
第２の単一なりローンからも、プラスミド、例えばｐＸ
Ａ７９９を単離し、ｃＤＮＡの制限酵素地図を作成して
そのｃＤＮＡ部分の塩基配列を決定する。その結果を第
１６−１図〜第１６−３図に示す。この配列を解析した
結果、次のことがわかった。

１）まず、このｃＤＮＡは第１６−１図〜第１６−３図
に示す塩基番号１から始まり２６２５までの領域に、８
７５アミノ酸残基より成る蛋白質をコードする長いオー
プンリーディングフレームが存在していることが判った
。尚、このオープンリーディングフレームにおいて、ｃ
ＤＮＡの５′末端−１８から−１６に蛋白質の翻訳終止
コドンＴＡＡが存在することから、第１６−１図の塩基
配列番号１から３にコードされているメチオニンが、こ
の蛋白質の翻訳開始コドンである。

２）第１９図に示す様に、ｐＸ八へ９９のＤＮＡにコー
ドされている蛋白質のアミノ酸−次配列を、ｐＸ八へ５
７のｃＤＮＡにコードされるＣ−末端α−アミド化酵素
プレプロ体のアミノ酸−次配列と比較すると、ｐＸＡ７
９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質のＮ−末端部
分（アミノ酸配列番号−３７から３５０）はｐＸＡ４５
７と非常に似ていることが判る。尚、注目すべき点は、
このアミノ酸−次配列ホモロジーは、ｐＸＡ４５７のｃ
ＤＮＡにコードされているＣ−末端α−アミド化酵素前
駆体のプロセッシング（前駆体のＮ−末端、Ｃ−末端の
切断）部位においても保持されていることである。

３）しかし本発明におけるｐＸＡ７９９のｃＤＮＡによ
りコードされている蛋白質が最初に得たｐＸＡ４５７の
ｃＤＮＡにコードされている蛋白質と最も異なる点は、
ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質のＮ
−末端部分はｐＸＡ４５７のｃＤＮＡにコードされてい
る蛋白質のそれと非常に類似しているが、Ｃ−末端部分
の構造は全く異る（ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡには３′末
端側に長いリーディングフレームが存在する）ことであ
る。

４）このＣ−末端部分の構造は、アミノ酸−次配列の解
析から、次の様に予測される。まず、ｐＸ八へ９９のｃ
ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列にはＡｓｎ−Ｘ
−５ｅｔ配列（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）が３ケ
所見い出され（第１６−２〜１６−３図におけるアミノ
酸配列番号４２６−４２８．６２３−６２５゜７０４−
７０６）、このアミノ酸配列はすでに多くの糖蛋白質の
解析からＮ−グリコシデージョン部位であることが判っ
ていることから、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされ
ている蛋白質も、生体内ではこの位置でＮ−グリコシデ
ージョンされている可能性が高い。

５）さらに、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡによりコードされ
るアミノ酸配列のアミノ酸配列番号７２７−７４８には
疎水性アミノ酸が連なる領域が存在し、しかも、この領
域の直後に塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン残基）
が存在している。これと同様な構造は、すでにレセプタ
ーをはじめとする多くの膜蛋白質において、これらの蛋
白質が生体膜を通過する領域（ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａ
ｎ　ｄｏｍａｉｎ）で見い出されていることから、ｐＸ
Ａ７９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質は生体内
で膜蛋白質として存在している可能性が高い。

以上述べた、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ解析、及びこれに
コードされている蛋白質のアミノ酸−次配列の解析結果
を総合すると、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされる
蛋白質は、前記ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡにコードされて
いるＣ−末端α−アミド化酵素とは明らかにその構造が
異なることが判った。しかし、現在までのところ、ｐＸ
Ａ７９９のｃＤＮＡから予測される蛋白質はアフリカッ
メガエルから単離、精製されていない。したがって、ｐ
ＸＡ７９９のｃＤＮＡから予測される蛋白質の生合成機
構（Ｎ−末端及びＣ−末端の切断、糖鎖の付加の存無）
、この蛋白質の生体内での存在場所、および、この蛋白
質の機能（Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を有している
か）、などの点については不明である。そこで本発明者
らはこれらの点を明らかにする目的で、後記、実施例で
示すごとく、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡを用い、このｃＤ
ＮＡにコードされている蛋白質及び、その誘導体を大腸
菌で発現させ、この様にして得た個々の蛋白質のＣ−末
端α−アミド化酵素活性を測定した。

さらに詳しくは、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの解析の結果
を、ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡの解析の結果及びこれに対
応する天然由来酵素のＮ−末端アミノ酸配列の結果と対
応させて検討した場合“、第１６−１図に示すアミノ酸
配列番号−３９から−１のペプチドは酵素蛋白質が生合
成される過程で分泌に必要なシグナルペプチドであり、
生合成の過程で−１のアミノ酸と１のアミノ酸との間で
切断されるものと予想される。

従って、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡによりコードされてい
る蛋白質に対応する成熟蛋白質は第１６−１図中のアミ
ノ酸番号１から始まり、Ｎ−末端はＨ−５ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−・・・である。

しかし、この蛋白質のＣ−末端部分に関する生合成機構
において、１１！鎖の付加、Ｃ−末端部分での切断反応
などの翻訳後修飾の有無、及び、これらの反応により生
成された蛋白質がＣ−末端α−アミド化酵素活性にどの
ように関与しているかは不明であった。この点について
は、まずｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされている蛋
白質を微生物（特に大腸菌）内で発現させるにあたり、
Ｎ−末端は第１６−１図に示すアミノ酸番号１、すなわ
ち１ｌ−５ｅｔ−Ｌｅｕ−５ｅｔ−Ａｓｎ−Δｓｐ−”
・に固定し、Ｃ−末端をｐＸＡ７９９のｃＤＮＡから明
らかにされたアミノ酸番号８３６、すなわち−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｖａ　１−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−０１１ま
での蛋白質の発現、続いてＣ−末端部分のアミノ酸配列
を削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）　Ｌｔた蛋白質（ｐＸＡ７
９９蛋白質誘導体）を種々発現させることにより確認す
る。第２０図にこれらの蛋白質の略図及びこれらを発現
させる為に用いたプラスミド名を記す。尚、ｐＸＡ７９
９のｃＤＮＡにコードされているρＸＡ７９９蛋白質誘
導体については、発現プラスミド構築の際にマルチクロ
ーニングサイトを導入するためにこれらのＣ−末端アミ
ノ酸配列がｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ山来でｌ−場合があ
り、これらについては個々の誘導体についてアミノ酸配
列が異なっている部分を示した。

（４）Ｃ−ｉα−アミド　　；の９゛　　包での■ ｐＸＡ４５７にコードされているＣ−末端α−アミド化
酵素を宿主細胞（例えば大腸菌）内で発現させる為に発
現ベクター（例えば、ｐｔｒｐＸＡＳＴ８及びｐ　ｔｒ
ｐＸＤＡＳＴ８）を作製する。この発現ベクター系は、
いずれもｃＤＮＡが宿主細胞（例えば大腸菌）トリプト
ファン・オペロン（プロモーター、オペレーター及びト
リプトファンリーダーペプタイドのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌ
ｇａｒｎｏ　シーフェンス）支配下に発現されるようデ
ザインされている。次に宿主細胞（例えば大腸菌Ｗ３１
１０）へ形質転換し、目的とする発現菌（例えばＷ３１
１０／　ｐｔｒｐＸＡＳＴ８　、及び−３１１０／ｐｔ
ｒｐＸＤＡＳＴ８）を得る。

また、ｐＸＡ７９９由来ｃＤＮ＾にコードされているＣ
−末端α−アミド化酵素を発現させる場合も発現ベクタ
ー（例えば、ｐＵＣＰＬＣＩ７９９Ｄｒａ　Ｉ　。

ｐＵＣＰＬＣＩ７９９Ｂｇｌ　ＩＩ　、　ｐＵＣＰＬＣ
Ｉ７９９ＲＶｐＵＣＰＬＣＩ７９９ｓａｌ　Ｉ　、　ｐ
ＵＣＰＬＣＩ７９９ＢｓｔＥ　ｎ　’　。

ｐＵＣＰＬＣＩ７９９ＢｓｔＥ　ＩＩｓ、　ｐｔｒｐΔ
７９９、および、ｐｔｒｐ７９９−４５７Δ等）を作製
する。これらの発現ベクター系は、ｐＸＡ７９９のｃＤ
ＮＡにコードされている蛋白質及び、この誘導体蛋白質
がλファージ由来ＰＬプルモーター（ｐＵＣＰＬＣＩシ
リーズ）か大腸菌トリプトファンプロモーター（ｐｔｒ
ｐシリーズ）支配下に発現されるようデザインされてい
る。次にこれらの発現ベクターを宿主細胞（例えば大腸
菌Ｗ３１１０）へ形質転換し、目的とする発現菌（例え
ば、Ｗ３１１０／　Ｉ）ＵＣＰｔＣＩ７９９Ｄｒａ　Ｉ
　、　Ｗ３１１０／　ｐＵＣＰＬＣＩ７９９Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ。

Ｗ３Ｌ１０／ｐＵＣＰＬＣＩ７９９ＲＶ　Ｊ３１１０／
ｐＵｃＰ、、ｃＩ７９９ｓａｌ　Ｉ　。

Ｗ３１１０／ｐＵＣＰＬＣＩ７９９ＢｓｔＥ　ｎ”、　
Ｗ３１１０／ｐ［ＩｃＰｔｃＩ７９９ＢｓｔＥ　１１’
、Ｗ３１１０／ｐｔｒｐΔ７９９およびＷ３１１０／　
ｐｔｒｐ７９９−４５７Δ）を得る。

次に、これらの株菌及びＷ３１１０を培養、集菌後、各
菌株の全蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法（以下ＳＯＳ　−ＰＡＧＥという）で解析した結
果、Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ８　、及びＷ３１１
０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８は対照のＷ３１１０の全蛋白
質に比べそれぞれ分子量約４０にと分子量約３８Ｋを示
す特異的な蛋白質を発現していることが判った。又、他
の菌株も目的の蛋白質を発現していることがわかった。

このようにして発現された蛋白質は通常用いられる破砕
法（超音波処理又はフレンチプレス破砕法）でいずれも
大部分が沈澱画分に回収される。

（５）ｊ！！Ｊ蓬目１ｑ謂淀 組換宿主細胞においＩ発現させた蛋白質がＣ。

末端α−アミド化酵素であることの確認、およびＣ−末
端α−アミド化酵素を基質に作用させた時のアミド化ペ
プチドまたは蛋白質の生成の確認をするために、Ｃ−末
端α−アミド化酵素活性を測定する。測定には、特に大
腸菌で発現させた場合、菌体破砕後、大部分は沈澱画分
に回収されるので、この沈澱画分を６Ｍ塩酸グアニジン
で可溶化した後、塩酸グアニジン溶液で透析して調製し
た試料を用いる。

一般にＲ−Ｘ−Ｇｕｙで表わされる基質または発現した
アミド化ペプチドおよび蛋白質を用い、これがＲ−Ｘ−
ＣＯＮＨ，に変換する反応（例えば合成基質（”’　Ｉ
　）−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙが（Ｉ２５１）−
＾Ｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ，に変換する反応）により
測定することができる。

すなわち、まず標識基質（標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ）をトリ
ス塩酸バッファー中で被験酵素液と反応させる。

これにトリス塩酸バッファーと酢酸エチルを加え、混合
後、遠心分離して有機溶媒層と水層を分離する。ここで
未反応標識基質（標識標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ）の大部分が
水層に、アミド化された標識基質（Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＩＩ
ｚ）が有機溶媒層に移行するために両者を容易に分離す
ることができる。Ｃ−末端アミド化生成物への変換率は
、総放射能活性に対する有機溶媒層の放射能活性の比か
ら求めることができる。測定法において、１時間当り、
ｌ　ｐｍｏｌの標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（基質）が標識Ｒ−
Ｘ−ＣＯＮＩ＋□に５０％変換する酵素活性を１ユニツ
トと定義する。被験酵素液として、アフリカッメガエル
体皮の粗抽出物を用いた場合ノ酢酸エチル層の放射能活
性は、マイクロボンダパックＣ−１８（μＢｏｎｄａｐ
ａｋ　Ｃ４Ｂ、Ｗａｔｅｒｓ社）の逆相１１ＰＬｃを用
いて溶出した両分について測定する。

溶出は１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐｌ！４．０）　（
７）、１０〜５０％ＣＩｈＣＮ直線濃度勾配で行なう。

放射能活性のピークは、同じ条件で溶出されるＲ−Ｘ−
ＣＯＮｌｈ構造をもつ標準ペプチドと同一の位置に現わ
れ、標識Ｒ−Ｘ−Ｇｕｙが標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に変
換され、発現した蛋白質がＣ−末端α−アミド化酵素活
性をもっことが確認できる。

尚、本発明の実施例においては、Ｃ−末端α−アミド化
酵素の基質として合成基質を用いているが、これに限ら
ずＲ−Ｘ−Ｇｌｙの構造をもつペプチドまたは蛋白質で
あれば天然由来の、または組換ＤＮＡ技術により生成さ
れたペプチドまたは蛋白質であっても構わない。すなわ
ち、本発明におけるＣ−末端α−アミド化酵素をＲ−Ｘ
−Ｇｌｙの構造をとるペプチドまたは蛋白質に作用させ
れば、ペプチドまたは蛋白質の生理活性に重要であるＣ
−末端α−カルボキシル基をアミド化する手段として非
常に有効であり、生理活性物質の製造が容易になる。

本発明はアフリカッメガエルの体皮由来のＣ−末端α−
アミド化酵素のｃＤＮＡ構造を明らかにしたが、すでに
他の多くの動物組織にも同様な活性をもつ酵素の存在が
指摘されている。しかしいずれもアフリカッメガエルの
酵素と同様、酵素活性発現にＣｕ〜イオンが必須である
こと、ジチオスレイトールなどのチオール化合物により
反応が阻害されること、アスコルビン酸が存在しないと
酵素活性が低下すること、および分子酸素の存在が必須
であることから、このＣ−末端α−アミド化酵素の活性
部位構造（ａｃｔｉｖｅ　ｄｏｍａｉｎ）のアミノ酸配
列は保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅ）ことが予測さ
れる。

したがって、ここで得られたｃＤＮＡをブローフ゛とし
て、他の動物組織のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡから、本
発明におけるＣ−末端α−アミド化酵素と同様な酵素を
単離できる。

なお、この発明の方法と同様にして、他の動物組織のｐ
ｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡより作製したｃＤＮＡライブラリー
、又はゲノｔライブラリーから新規Ｃ−末端α−アミド
化酵素ｃＤＮＡを得ることができる。また、本発明にお
いてはこのようにして得た、Ｃ−末端α−アミド化酵素
ｃＤＮＡを用い、このｃＤＮＡにコードされている蛋白
質及び種々の誘導体の大量生産方法の一つとして、組織
ＤＮＡ技術を用いた大腸菌内で大量発現きせる方法を示
したが、本発明におけるｃＤＮ＾を用いれば、他の宿主
細胞、例えば酵母や動物細胞を用いて前記した同様な蛋
白質を大量生産させることができる。さらに、本発明の
実施例に示す、新規Ｃ−末端α−アミド化酵素の種々の
誘導体は、いずれもＣ−末端α−アミド化活性を示すこ
とから、本発明で示した方法で取得したｃＤＮＡを用い
れば、ｃＤＮＡ上にコードされている蛋白質そのものを
、遺伝子操作で種々の宿主細胞で発現しなくても、これ
らの誘導体例えば、Ｃ−末端変換体、アミノ酸置換体等
作製し；これらの蛋白質を用いて一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ
で示されるペプチド又は蛋白質をＲ−Ｘ−ＣＯＮＨ２に
変換することができる。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

アフリカッメガエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素
の精製は、Ｍｉｚｕｎｏ、に等の方法に従って実施した
（Ｍｉｚｕｎｏ、に等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　１３７．９８４−９９１．１９８６）
　、すなわち、酵素溶出液を遠心分離して不溶物を除去
し、得られた上清に硫酸アンモニウムを添加し、８０％
飽和として酵素を塩析した後、遠心分離により沈澱物と
して回収した。この沈澱を適当な溶媒に溶解して透析後
、ＤＥＡＥセルロースＤＥ　−５２カラムクロマトグラ
フイーのリン酸ナトリウムバッファー直線濃度勾配で溶
出した。次に溶出液の活性画分をアフィジェルブルー力
ラムによるアフィニティークロマトグラフィーにおいて
ＮａＣ１直線濃度勾配により溶出した。活性画分をセフ
ァクリルＳ−３００でゲル濾過した後、ヒドロキシルア
パタイトにより精製すると２つの活性画分を得られた。

このうち、主活性画分をさらにバイパフォーマンスヒド
ロキシルアパタイトで精製した後、５ｕｐｅｒｏｓｅ１
２によりゲル濾過して、Ｃ−末端アミド化酵素の最終精
製品が得られた。

この酵素は上記文献でＡＨ−１と命名されているが本特
許においてはこのものをＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅと
記す。

（Ｉ）　Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚ　ｍｅのＮ−ｒアミノ　
西　１の■ Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのＮ−末端アミノ酸配列は
Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ　１２　ｎをＡｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒａｓ社プロテインシークエンサ
ー４７０Ａに供し、自動エドマン分解法により行なった
。この結果、ＮａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅのＮ−末端アミ
ノ酸配列は５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−＾ｓｎ−Ａｓｐ−
Ｘ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−と決定された（第５図参照）、なお
、Ｘはフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸と
して検出できなかったことからＣｙｓ残基と推定される
。

Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ　４　Ｏｎを２０ｍの５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・１１（Ｊ　　（ｐＨ８，０）　−２
ｍＭ　ＣａＣｌ２に溶液に溶し、０．５μｇのトリプシ
ンを加え３７℃２時間反応した後、さらに０．５　ｎの
トリプシンを加え３７℃２０時間反応させることにより
Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅをトリプシン分解した。次
の反応液をＣｈｅｍｃｏｓｏｒｂ　３０ＤＳ−１１カラ
ム（ケムコ社製８．０Ｘ７５ｉ＋ｓ）を用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、Ｎａｔｉｖｅ
ｅｎｚｙｍｅのトリプシン分解で生じたトリブチツクフ
ラグメントを０．１％ＴＦＡと０．１％ＴＦＡ−６０％
ＣｌｌｆｆＣＮを用いたＣＨ，ＣＮの直線濃度勾配で溶
出、分離した。この様な方法で分離、精製したトリブチ
ツクフラグメントの内Ｔ−４，７−６，７−８。

Ｔ−１１，７−９、Ｔ−１０，７−１８，７−２２，７
−２３，７−２４，Ｔ−３０，Ｔ−３５，Ｔ−３９，Ｔ
−４５゜１４個のトリブチツクフラグメントのアミノ酸
配列をＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのＮ−末端アミノ酸
配列を決定したのと同様な方法を用いて決定した（第５
図参照）。

（３）　Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚ　ｍｅのアミノ　。

Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｎ＋ｅのアミノ酸分析は、Ｎａ
ｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅ約１０■を、減圧封管中、６Ｎ塩
酸１１０℃２４時間反応させた後、日立８３５−５０型
アミノ酸分析機を用いて行なった。この結果を表第１表
に示す。

（Ｉ）全３擾しり引乱製 １６匹のアフリカッメガエルより体皮６４ｇを取り、体
皮２ｇにつきＰＣ９’（フェノール：ＣＨＣｌｚ：イソ
アミルアルコール＝２４　：　２４　：　１　（Ｉ０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　・ＨＣｌｐＨ９，０、０，１Ｍ　ＮａＣ
１、５ｍＭ　ＥＤＴＡで飽和）〕ＩＯ−とＮＥＴＳ溶液
（Ｉ００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・Ｉ（（Ｊ　ｐＨ９，０。

１００ｍＭ　ＮａＣ１、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　　、　５
％ＥＤＳ）　１０　ｍ７を加え、ポリトロンを用い、細
胞を破壊し、１０分間室温放置後、さらにポリトロン処
理を行った。次に３　Ｋｒｐｍ、３０分間室温遠心を行
った後、水層を分取し、同量のＣＩＡＡ　（ＣＩＩＣ＃
　、　：イソアミルアルコール＝４９：１）を加え、撹
拌後、３　Ｋｒｐｍ、３０分間室温で遠心を行った。遠
心後水層を分取し、ＣＩＡＡ処理をくり返した。得られ
た水層に２倍量のエタノールを加え、−２０℃にて一夜
エタノール沈澱を行った。３　Ｋｒｐｍ、３０分間、４
℃で遠心後、上清を除去し、エタノール沈澱を８０％エ
タノール溶液で洗った後、真空上沈澱を乾燥した。この
沈澱に体皮２ｇにつき２−のグアニジンチオシアネート
溶液（４，２Ｍグアニジンチオシアネート０．１Ｍ酢酸
ナトリウム、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ５，０）を加え
、溶解した。５Ｗ４０ＴＩ遠心管に４ｍＺのＣｓＣβ溶
液（５Ｍ　Ｃ５ＣＡ　、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、５ｍ
ＭＥＤＴＡｐｌ＋　５．０　）を入れ、さらにエタノー
ル沈澱を？容かしたグアニジンチオシアネート溶液を重
層し、３３Ｋｒｐｍ、　１５時間、２５℃で遠心を行っ
た。遠心後、遠心管の最低部にＲＮＡ画分を得た。ＲＮ
Ａａ：澱物に８０％エタノールを加えＲＮＡ沈澱物を洗
った後、５００ＩのＥＴＳ溶液（Ｉ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
＝　ＨＣＩｔ　ｐＨ？、　５　、　ＬＯｍＭ　ＥＤＴＡ
　　、　０．５％５Ｏ３）を加え、溶解した。

これに４００ＩＪ１のフェノール（０，１Ｍ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌｐＨ８，０で飽和）を加え、撹拌後ＩＱＸｒ
ｐｍ、５分間遠心を行った。水層を分取し、同量のエー
テルを加え、撹拌後３　Ｋｒｐｍ、１分間遠心を行いエ
ーテル層を除去した。水層に１／１　（ｌの２Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐｆ１５．　Ｏ）　、２倍量のエタノールを
加え、＝８０℃にて３０分間エタノール沈澱を行った。

１３Ｋｒｐｍ、１０分間４℃にて遠心を行い、上清を除
去後、８０％エタノールで沈澱を洗った。真空乾燥後、
適当量の滅菌蒸留水を加え、エタノール沈澱物を溶解し
た。この方法により、アフリカッメガエル体皮６４ｇか
ら１６．５■の全ＲＮＡを調製した。

（２）オニ」旺肺幻λ既製 オリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖ
ｅＲｅｓｅａｒｃｂ＋　Ｉｎｃ、）　０．５　ｇをカラ
ムにつめ、１０ｍ１の滅菌蒸留水、１０−の０．　Ｉ　
Ｍ　Ｎａ０Ｉ＋　／　５　ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡでカラムを
洗いさらに溶出液がｐＨ７，０以下になるように滅菌蒸
留水でカラムを洗った。１０ｒｎ１の１×負荷緩衝液（
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・ＩＩＣｊ！　ｐＨ７，６、０，
５ＭＮａＣ４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　　、　０．１％５Ｄ
Ｓ）でカラムを平衡化した。全ＲＮ　Ａ　ｔａ度が３ｔ
ｔｇ／ｌｔｌになるように滅菌蒸留水を加え３ｍｌとし
たものを６５℃、５分間処理し、直ちに、水中に入れ、
室温に戻した。これに３−の２×負荷緩衝液（４０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７，６、１，０Ｍ　Ｎａ（Ｊ　
、　２ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．２％５ＯＳ）を加え、
全量を６ｍｔとした。これをオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムにかけた。非吸着画分を６５℃、５分間処理し、
再びカラムにかけた。その後、カラムを４ｍＪの１×負
荷緩衝液、４ａｔＺの（０，１ＭＮａＣｌ１）ｌｘ負荷
緩衝液で洗い、４−の溶出緩衝液（Ｉ０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ　−Ｈｅｌ　ｐＨ７，５、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　、
　　０．０５％５ＤＳ）でｐｏｌｙ（八）ＲＮＡを溶出
した。溶出画分に１／１０量の２Ｍ酢酸ナトリウム及び
２倍量のエタノールを加えてエタノール沈澱を行いポリ
（Ａ）ＲＮＡを調製した。９■の全ＲＮＡより７４Ｊ１
１１のポリ（Ａ）ＲＮＡが得られた。

Ｉｆ！Ｊｌ　　ｃＤＮＡ　＋　イ’　”　ｌ−の　１（
Ｉ）副■■立盟 アマジャム社ｃＤＮＡ合成システムキットを用いアフリ
カッメガエル体皮のポリ（Ａ）ＲＮ八へ硝より二重４３
（ｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡ合成システムキットの
最終反応物に１０ＪＩｌの０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ
８，０）及び１０ｍの１０％ＳＯ３を加え、さらに１２
０ＩのＰＯ２を加え、攪拌後、１０Ｋｒｐｍ、　５分間
、室温で遠心を行った。水槽１２０μｌに１２０１１１
の４Ｍ酢酸アンモニウム及び４８０Ｉのエタノールを加
えて一８０℃３０分間エタノール沈澱を行った。遠心後
、エタノール沈澱を８０％エタノール沈澱を洗い、真空
乾燥を行い、そして１Ｏｔｔｌの滅菌蒸留水にエタノー
ル沈澱を溶解した。これに２１１１の１０×力コジレー
ト溶液（Ｉ，４Ｍカコジル酸ナトリウム、０．３Ｍ　　
ＴｒｉｓｉｌＣ４ｐＨ６，８）　、２ｐ！の１　ｍＭ　
ｄＣＴＰ　。

２１Ｉ！のｌ　ｍＭ　ＤＴＴ、及び２μ！の１０ｍＭ　
ＣｏＣ１１ｚを加え、ターミナルデオキシトランスフェ
ラーゼ（）７／Ｌ／７シア社）　　１０ｕｎｉｔを加え
、３７℃、１０分間反応を行った。反応液に２１Ｊ１の
ｏ：２５ＭＥＤＴＡ　ｐＨ８，０とＩＩの１０％ＳＤＳ
を加え、さらに２３μ！のＰＣ９を加え、攪拌後、１３
Ｋｒｐｍ、５分間、遠心を行った。水槽を分取し、１０
ｊ１１の１ｘＴＥ（Ｉ００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！
　ｐＨ７，５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）をＰＣ９層に加え再
抽出を行った。水槽３２ｍに３２μｌの４Ｍ酢酸ナトリ
ウム、１２８１１１のエタノールを加え一８０’０３０
分間沈澱を行った。１３Ｋｒｐｍにて１５分間、４℃で
遠心を行い、上清を除去後、５０ｐ！の１×ＴＥを加え
、エタノール沈澱を溶かし、５０μ１０４Ｍ１１Ｆアン
モニウム及び２００Ｉ１１のエタノールを加え、−８０
℃にして一夜エタノール沈澱を行った。１３Ｋｒｐｍに
て１５分間、４℃で遠心後、エタノール沈澱物を８０％
エタノールで洗い、そして乾燥後４０ｔｔｌの滅菌蒸留
水を加えて溶解した。これに１２０ｄの５×アニール緩
衝液（０，５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！　。

５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７，５、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ　）　０．６ｔｒｇのｄＧ−ｔａｉｌｅｄ　ｐ
ＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅｏｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　
Ｉａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ　：　ｄｇ　−ｔａｉｌｅ
ｄ　ｐＢＲ３２２＋　Ｐｓｔ　Ｉ　　ｃｕｔ）及び４３
７μｌの滅菌蒸留水を加えて、６５℃にて５分間、４４
℃にて２時間、そしてその後水浴中で一夜放置し、ｐＢ
Ｒ３２２ベクターとアニーリングを行った。

（２）　　　ＤＨｌへのン′云 大腸菌に１２株由来Ｄ１１１株（Ｆ−、ｒｅｃＡ１＋ａ
ｎｄ　ＡＩ＋ｇｙｒＡ９［１ｉ、ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ
１７，５ｕｐＥ４４．ｒｅｌＡ１３．　　λ−）　をＲ
ｂ（Ｊ’法（細胞工学、叢、魚３　、　ｐ９７１９８３
年）で処理し、コンピテントセルを調製した。２００μ
ｌのコンピテントセルに２０μｌのアニーリング反応液
を加え、氷中３０分間静置し、その後３７℃２分間熱処
理をし、直ちに水中にもどした。これに８００ＩＪ１の
ψ培地（ＢａｃｔｏＹｅａｒｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　５　
ｇ　５Ｂａｃｔ。

Ｔｒｙｐｔｏｎｅ２０ｇ、　Ｍｇ５０４５　ｇ、全ｆｆ
１ｌ　ｐ　、ｐ１１７．６）を加え３７℃にて６０分間
培養を行った。培養後、１ｍＺの８０％グリセリンを加
え、液体窒素で高速凍結を行い、−８０℃にて国体を保
存した。この方法でアフリカッメガエル体皮ｃＤＮＡラ
イブラリー７．５Ｘ１０’を作製した。

８Ｍ３Ｌ、Ｃ−ｒα−アミドヒ　：ｃＤＮＡの゛ｃＤＮ
ＡライブラリーよりＣ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡ
を単離するために、まずＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅの
トリブチツクフラグメントＴｆｆ６とＴ１１の部分アミ
ノ酸配列に対応するＹＳＯ１２、ＹＳＯ１３、及びＹＳ
Ｏ１５と命名した混合ＤＮＡプローブ（いずれも１７ｍ
ｅｒ。

３２混合物）を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社３８〇八ＤＮＡ合成機を用い合成した（第６図参照
）。次に、各混合ＤＮＡプローブｌ　ｐｍｏｌを［７−
”Ｐ）ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理す
ることにより、各ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅの５′水酸基に（
＋２　ｐ　）を導入した。

（２）コロニーハイブリダイゼーション−８０℃に保存
されたｃＤＮＡライブラリーを溶解し、普通栄養寒天培
地（５硝／ｆｄテトラサイタリン）に拡げ（Ｉ０００コ
ロニー／プレート）３７℃−夜培養した。コロニーの上
にニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
　＆　５ｃｈｕｅ１１社製）を置き５分間放置した。こ
のニトロセルロースフィルターを別の新しい普通栄養寒
天培地（５ｕｇ　／　Ｉａｌのテトラサイクリンを含む
）の上にコロニー面を上にして乗せ、３７℃で８時間培
養した。次にこのニトロセルロースフィルターを別の新
しい普通栄養寒天培地（Ｉ７０ｘｒ／ｍ！のクロラムフ
ェニコールを含む）の上にコロニー面を上にして３７℃
にて終夜放置した。次にニトロセルロースフィルターを
アルカリ変性液（０，Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ、１，５Ｍ　Ｎ
ａ（Ｊ　）の上に１０分間置き、次に中和液（０，５Ｍ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！ｐＨ７、５、１，５Ｍ　ＮａＣ
ｊ２　）上に１０分間置いた。その後、２ＸＳＳＣ溶液
（２０ＸＳＳＣ：　ＮａＣ１１７５，３ｇ、クエン酸三
ナトリウム８８．２ｇ全量１１）でニトロセルロースフ
ィルターをすすぎ、そして風乾した。減圧下、８０℃１
２０分間熱処理を行った。コロニーハイブリダイゼーシ
ョンはＷ、　１．Ｗｏｏｄ等の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８２．１５８
５−１５８８．１９８５）に従って行った。すなわち、
ニトロセルロースフィルターをビニール袋にバックして
、５ｔｎｌのプレハイブリダイゼーション液（３ＸＳＳ
Ｃ，５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）　、５　
Ｘデンハート液（Ｉ×デンハート：アルブミン、ポリビ
ニルピロリドン、Ｆｉｃｏｌｌ、各々０．２ｍｇ／＋ｎ
ｊ）、サケ精子ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７
℃にて３時間ブレハイブリダイゼーションを行った。

次に１枚のニトロセルロースフィルターあたり、前記合
成混合ＤＮＡプローブを各々、１００万ｃｐｍ入れて、
ハイブリダイゼーションを３７℃にて一夜行った。次に
３ＸＳＳＣにより４℃で２回フィルターを洗い、塩化テ
トラメチルアンモニウム液（３，０Ｍ塩化テトラメチル
アンモニウム、５０ｍＭＴｒｉｓ　　−ＨＣｌ　　（ｐ
Ｈ８，０）、２　ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１　　％ＳＯ
５）　　を加え、３７℃にて３０分ずつ２回、さらに５
２℃にて３０分間ずつ２回ニトロセルロースフィルター
を洗った。風乾後、オートラジオグラフィーを−８０℃
１昼夜行った。この様にして約４０万個のｃＤＮパライ
フ゛ラリ−をスクリーニングしてプローブとハイブリダ
イズするクローンが得られた。これはＤＩ　１　／ｐＸ
Ａ４５７と命名され、工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研条寄第１３６７号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３６７
）として寄託されている。

二ノど一力Ｕ旭し工５ユ　Ｘへ４５７フ゛−スミドの”
　　びｃＤＮＡの声大腸菌ＤＨ１／ｐＸ４４５７株より
、常法に従いプラスミドを分離・精製した。得られたｐ
ＸＡ４５７を種々の制限酵素で切断し、ｐＢＲ３２２の
Ｐｓｔ　Ｉ切断部位に挿入されたｃＤＮＡの制限酵素地
図を作成した。それを第７図中の（ａ）に示す。ｃＤＮ
Ａの長さは約２．７ｋｂであった。次にこのｃＤＮＡの
ＤＮＡ塩基配列を決定する為、Ｍ１３ファージに種々の
制限酵素切断断片をクローニングし、Ｔａｋａｒａ　Ｄ
ＮＡ配列決定キットを用い、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅ
ｒ、Ｆ、等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ＋Ｕ、Ｓ、八、　３４．５４６３−５
４６７（Ｉ９７７））でそのＤＮＡ塩基配列を決定した
。ＤＮＡの塩基配列を決定する為の方向性を第７図中の
（ｂ）に示した。

ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列と、この塩基
配列から予想されるアミノ酸配列を第１図に示す。

ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡ（Ｉ１２〜１２００）によりコー
ドされている蛋白質（ＸＡ）を大腸菌内で発現させる為
に、以下示す方法でＸＡ発現ベクターｐｔｒｐＸＡＳＴ
８とＸＡ発現菌株、Ｗ３１１０／ｐｔｒｐχＡＳＴ８の
作製を行った。

（Ｉ）　ＵＣ１８ＸＡ（ＥｃｏＲＩ　）の　１まず、ｐ
ＸＡ４５７のｃＤＮＡ部分（Ｐｓｔｒフラグメント）を
Ｍ１３ｍｐ１９（宝酒造社製）のＰｓｔＩサイトにクロ
ーニングすることによりＭ１３ＸＡ４５７を作製した。

次に、Ｍ１３ＸＡ４５７と化学合成りＮＡ　：５　　’
　　ＧＴＣＡＴＴ　　ＧＧＡ　　ＡＡＧ　　ＴＧＡ　　
ＣＡＴ　　ＧＡＡ　　ＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＡ　ＣＣ
Ｔ　ＣＴＴ　３　’を用い、Ｍｏｒｉｎａｇａらの方法
（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２　、６３６　６３
９．１９８４）に従ってインビトロ変異誘発（ｉｎｖｉ
ｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行ないｐＸＡ４５
７（７）ｃＤＮＡ（Ｉ０３〜ＩＬ２）の　５　’　　Ｔ
ＣＴ　　ＡＣＣＡＧＡ　　３　’の塩基配列を５　’　
ＧＡＡ　ＴＴＣＡＴＧ　３　’に変換しくすなわち、ｃ
ＤＮＡ（Ｉ１２〜１１４）によりコードされているＳｅ
ｒ残基の直前に制限酸素ＥｃｏＲＩサイトＧＡＡ　ＴＴ
ＣとＭｅｔコドン、ＡＴＧを導入した）　、Ｍ１３ＸＡ
４５７（ＥｃｏＲＩ　）を作製した。次に、Ｍ１３ＸＡ
４５７　（ＥｃｏＲＩ　）ＲＦ（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ　Ｆｏｒｍ）をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、Ｅｃ
ｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ　　ＤＮＡフラグメントをｐＵｃ
１８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉサイト
へクローニングすることにより目的とするＩ）ＵＣ１８
ＸＡ（ＥｃｏＲＩ　）を得た（第８図参照）。

（２）蛙」■鉦虹旦作製 ｐｔｒｐＧＩＦｓ　ｃｔ　（ｐｔｒｐＧＩＰｓ　ａによ
って形質転換された大腸菌−＾８０２／ｐｔｒｐＧＩＦ
ｓαは工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
８５０３（ＦＥＲＭ　Ｐ−８５０３）として寄託されて
いる）　ＥｃｏＲＩと５ａｌｌで切断、トリプファンオ
ペロンを含むＤＮＡフラグメント（第９図における、Ａ
フラグメント）を回収、またｐＵｃ１８ＸＡをＨｃｏＲ
ＩとＨｈａｌで切断ＥｃｏＲＩ　−Ｈｈａｌ　ＤＮＡフ
ラグメント（第９図における、Ｂフラグメント）を得々
。次に、ここで得られたＡ。

８両ＤＮＡフラグメントと化学合成りＮＡリンカ−： ＨｈａＩ　　　　５ａｌＩ ５’　　　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　　　　　３’３’
　　ＧＣＧ　ＴＣＡ　ＣＡＣＴＣＡ　ＧＣＴ　　３’を
Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、目的とするｐｔｒ
ｐＸＡｓＴ４を作製した。（第９図参照）（３）ｔｒＸ
ＡＳＴ８と−３１１０ｔｒ　ＸＡＳＴ８の−＋１ｐｔｒ
ｐＸＡＳＴ４をＥｃｏＲＩと５ａｌＩで切断し、Ｅｃｏ
Ｒ１−５ａｌＴＤＮＡフラグメント（第１０図における
、フラグメントＣ）を得た。また、Ｉ］Ｔ４．ＴＮＦＳ
Ｔ８ｒｏｐ−（このプラスミドの構築材料となるｐＢＲ
３２２−ＰＬ−Ｔ４−ｈＴＮＦはＤＳＭ３１７５として
寄託されている。特願昭６０−２１７７４０参照）を５
ａｌＩとＢａｍ１ｌ　Ｉで切断し、Ｓａｄ　Ｉ　−Ｂａ
ｍｌｌ　Ｉ　　ＤＮＡフラグメント（第１Ｏ図における
フラグメントＤ）を得た。さらにｐｔｒｐＧＩＦｓαを
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、ＩＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ａｍｌｌ　Ｉ　　ＤＮＡフラグメント（第１０図におけ
るフラグメントＥ）を得た。この様にして得たＤＮＡ、
フラグメントＣ，Ｄ、及びＥをＴ４　ＤＮＡリガーゼで
結合し、大腸菌株Ｗ３１１０に形質転換することにより
、目的とするＸＡ大腸菌発現ベクターｐｔｒｐＸＡＳＴ
８とＸＡ発現菌株Ｗ３１１０／　ｐｔｒｐＸＡＳＴ８を
作製した（第１０図参照）。

立型 ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡ（Ｉ１２〜１１４３）によりコー
ドされている蛋白質（ＸＤＡ）を大腸菌内で発現させる
為に以下に示す方法でＸＤＡ発現ベクターｐ　ｔｒｐＸ
ＤＡＳＴ８とＸＤＡ発現菌Ｗ３１１０／　ＰｔｒｐＸＤ
ＡＳＴ８の作製を行なった。

（Ｉ）ＤＮＡリンカ−（Ｆ）の入ｈ ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡ　（Ｉ１４１〜１１４３）により
コードされているＬｙｓの直後に翻訳停止コドン（ＴＧ
Ａ）および５ａｌｌサイトを導入する為に、以下に示す
４種のＤＮＡフラグメント■〜■を化学合成した。

■　５　’　　　ＧＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡ　　ＣＡＧ
　　ＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＧＣＣＴＧ八Ｇへ’ ■　５　′　　八ＡＧ　　ＡＡＴ　　ＡＣＡ　　ＧＧＡ
　　ＣＴＴ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　　ＣＣＴ　　ＡＡへ
へＧＡ　Ｇ　３　’ ■　５　　’　　　ＧＴＡ　　ＴＴＣＴＴＣＴＣＡ　　
ＧＧＣＴＣＡ　　ＧＣＴ　　ＴＣＴ　　ＧＴへへＧＧＴ
Ｇ３’ ■　５　’　　　ＴＣＧ　　ＡＣＴ　　ＣＡＴ　　ＴＴ
Ａ　　ＧＧＣＴＧＣＴＧＡ　　ＡＧＴ　　ＣＣＴ３′ 次にフラグメント■と■の５′末端にＡＴＰとＴ４ポリ
ヌクレオタイドキナーゼを用いリン酸基を４人した後、
■と■のＤＮＡフラグメントを加え、ＴａＤＮＡリガー
ゼで処理することにより■と■及び■と■のＤＮＡフラ
グメントが結合したＤＮＡリンカ−（Ｆ）を合成した（
第１１図参照）。

（２）８■■旦旦■作盟 ｐｔｒｐＸＡＳＴ４をＢｓｔＥＩ［と５ａｌｌで切断し
、ＢｓｔＥＩＩ−３ａｌＩＤＮＡフラグメント（第１２
図における、Ｇフラグメント）を得た。このＤＮＡフラ
グメントＧと前記したＤＮＡリンカ−Ｆを７４ＤＮＡＩ
Ｊガーゼで結合し、目的とするｐｔｒｐＸＤＡＳＴ４を
得た（第１２図参照）。

（３）ｔｒＸＤＡＳＴ８　　び−３１１０ｔｒ　ＸＤＡ
ＳＴ８の　１１ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ４を［！ｃｏＲＴと
５ａｌＩで切断し、ＥｃｏＲＥ−３ａｌｌＤＮＡフラグ
メント（第１３図における、Ｈフラグメント）を得た。

また、ｐＴａＴＮＦＳＴ８ｒｏｐ−を５ａｌｌとＢａｍ
ＨＩで切断し、Ｓａｔ　Ｉ　−ＢａｍＨｒ　ＤＮＡフラ
グメント（第１３図における、■フラグメント）を得た
。さらにｐｔｒｐＧＩＦｓ　ａをＥｃｏＲＴとＢａｍＨ
Ｉで切断し、ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｒ＠ｎ　Ｉ　　ＤＮＡ
フラグメント（第１３図における、Ｊフラグメント）を
得た。次に、ここで得られたＨ、Ｉ、及びＪの３種のＤ
ＮＡフラグメントをＴ、ＤＮＡリガーゼで結合し、これ
を大腸菌株Ｗ３１１０に形質転換することにより、目的
とするＸＤＡ大腸菌株発現ベクターｐ　ｔｒｐＸＤＡｓ
Ｔ８とＸＤＡ発現菌株−３１１０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ
８を作製した（第工３図会ｗｉ）。

ＩＬＩＩ　　ＸＡ　　びＸＤＡ（７）　　！’　　　で
（７）？ＸＡ発現菌Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＡｓＴ８　
、及びＸＤＡ発現菌Ｗ３１１０／　ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ
８をそれぞれＬブロス（ポリペプトン１０ｇ、塩化ナト
リウム５　ｇ　Ｙｅａｒｔｅｘｔｒａｃｔ５　ｇを水１
１に溶かした培地）にアンピシリン５０パ／−を含んだ
培地で一晩培養した。

次にこの培養液を２０倍量のＭ９（０，５％リン酸−水
素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．５
％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム）にカザ
ミノ酸、インドールアクリル酸（以下ＩＡＡと略す）と
アンピシリン濃度が各々０．２％、５ｎ／ｖｄ　、　５
０屑／−になるように調整した培地へ接種し、３７℃７
時間培養した。一方、対照の宿主Ｗ３１１０は上記培地
からアンピシリンのみを除いた培地で同様に培養した。

次に、それぞれの菌体を遠心集菌後、各菌体の全蛋白質
をＬａｅｍｍｌｉ、Ｕ、Ｋ。

らの方法に従って（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　２２７　＋６８０−６８５．１９７０）　ＳＯ
５−ＰＡＧＥで解析した。この結果を第１４図（ａ）に
、示す。Ｗ３１１０／　ｐｔｒｐＸＡｓＴ８由来の蛋白
質及び日１１０／　ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８由来の蛋白質
は対照であるＷ３１１０由来の蛋白質に比べそれぞれ分
子量約４０Ｋ、及び分子量約３８Ｋを示す特異的な蛋白
質ＸＡ、及びＸＤＡを発現しζいた。一方、これらの蛋
白質はいずれも、菌体をＰＢＳ（−）（０，８％塩化ナ
トリウム、０．０２％塩化カリウム、０．１５％リン酸
−水素ナトリウム、０．０２％リン酸二水素カリウム）
に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕後、ｌＯＫｒｐｍ１
分間遠心処理することにより大部分が沈澱画分に回収さ
れた。

（Ｉ）分玉１勿ル較 前記実施例８で培養した一３１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ
８、及びＷ３１１０／　ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８を集菌後
、菌体をそれぞれＰＢＳ　（−）に懸濁し、超音波処理
で菌体を破砕し、そして１０Ｋｒｐｍで１分間遠心処理
して沈澱画分を調整した（この処理で大部分のＸＡ及び
ＸＤＡは沈澱画分に移行し、宿主Ｗ３１１０由来の多く
の蛋白質は上清分画へ移行する）。このようにして濃縮
したＸＡ蛋白質及びＸＤＡ蛋白質並びにＮａｔｉｖｅ　
ｅｎｚｙｍｅの分子量をＳＯＳ　−ＰＡＧＥを用い比較
検討したところ、ＸＤＡは完全にＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚ
ｙｍｅと同一な分子量を示した（第１４図（ｂ）参照）
。

（２）アミノ　■゛　の　六 前記方法で濃縮したＸＡ、及びＸＤＡをＳＯＳ　−ＰＡ
ＧＥで分離した後、ＸＡ、及びＸＤＡに対応する蛋白質
バンドをゲルより切り出し、各蛋白質をＴＢＳ（Ｉ０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｊ！　ｐＨ７，０、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｊ！　）を用いてゲルより抽出
した。抽出液は、真空遠心乾燥機を用いて乾固後、０．
１％ＳＤＳに溶解し、０．１％ＳＤＳ溶液に対し１晩透
析した。

透析後のサンプルを一旦、真空遠心乾燥機で乾固後、少
量の水に溶解し、メタノールを加えることによりＸＡ、
及びＸＤＡを沈澱させ、アミノ酸分析サンプルとした。

アミノ酸分析はＸＡ、及びＸＤＡ約１０！！ｇを減圧封
管中６Ｎ塩酸で１１０℃７２時間反応させた後、日立８
３５−５０型アミノ酸分析機にて行なった。この結果を
第１表に示す。

第１表 この表においてＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ、ＸＡ、及
びＸＤＡのフェニルアラニン残基を１０個として他の各
アミノ酸組成を比較すると、アスパラギン酸残基、グル
タミン酸残基、バリン残基、イソロイシン残基、ロイシ
ン残基およびアルギニン残基数がＮａｔｉｖｅｅｎｚｙ
ｍｅとＸＤＡとでよく一致していた。これらの結果は、
いずれもＸＤＡがＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅと同一で
あることを強く示唆している。すなわち、ＸＤＡとＸＡ
はどちらもＣ−末端α−アミド化酵素活性を有している
ことから、ｃＤＮＡから導きだした本酵素（プレプロ体
）のＣ−末端部分（少なくともＡｒｇ　（３４５）　〜
Ｖａ　１　（３６３）まで）は活性には必須ではないと
考えられる。したがって、アフリカッメガエル体皮由来
Ｃ−末端α−アミド化酵素の生合成は、まず、４００ア
ミノ酸より構成される前駆体（ｐｒｅｐｒ。

体）として発現し、この後、Ｎ−末端部分の切断（Ａｒ
ｇ−５ｅｒ間の切断）、およびＣ−末端部分の切断（お
そら＜　Ｌｙｓ（３４４）−Ａｒｇ（３４５）間の切断
）がおき、Ｎａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅが生じると考え
られる。

去止血刊、ＸＡＸＤＡのＣ−−一〇″′α−アミドヒ　
−二造立 Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＣＡＳＴ８　　、　　　Ｗ３１１
０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８、　及び対照としてのＷ３１
１０を前記した方法で培養し、この内、培養液２０ｍ７
を集菌し、２００ＩのＰＢＳ（−）に菌体を懸濁し、そ
して超音波処理により菌体を破砕した。次に、遠心分離
により沈澱画分を回収し、この沈澱画分を６Ｍ塩酸グア
ニジン２５０μ！で可溶化した後、この溶液を順次１時
間ずつ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・ＩＩ（Ｊ　　（ｐＨ７゜
Ｑ　）　　、５０ｍ　Ｃｕ５Ｏａを含む６Ｍ塩酸グアニ
ジン、４Ｍ塩酸グアニジン、２Ｍ塩酸グアニジン、ＯＭ
塩酸グアニジン溶液各２００　ｍｌに透析した。このよ
うにして透析したサンプルを遠心分離して生じた沈澱を
分離し、上清液を用いて酵素活性を測定した。

活性の測定は、Ｍｔｚｕｎｏ等の方法（Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ
，１３７。

９８４−９９１．１９８６）に従い、下記のごとく行な
った。

すなわち、前記した方法で調製したサンプル１２．５μ
！、２５１ｄ及び５０ｍにそれぞれ蒸留水を加えて全量
１００μｌとする。これに、１０ｍＭＮ−エチルマレイ
ミド２５μ！、１０ｍＭアスコルビン酸２５μｌ、２０
０団硫Ｍ銅２５ｍ、２０曙／ｄカタラーゼ１．２５ｐＬ
１％Ｌｕｂｒｏｌ　２５　ｐｉ、　　（”’　Ｉ　）　
−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　２　ｐｍｏｌ（Ｉ７
万ｃｐｍ）およびＩ　ＭＴｒｉｓ　−１１（Ｊ！（ｐＨ
７、０）　５０　ｔｄを加え、３７℃で１５時間反応さ
せた。反応後、反応液にｌ　ＭＴｒｉｓ　・ｌＩＣｌ１
（ｐＨ７、０）７５０１１１と酢酸エチル２ｍＺを加え
、混合、遠心分離する。次に、酢酸エチル層１ｎｔ／を
分取し、それと残りの溶液の放射能をガンマ−カウンタ
ーを用いて測定することにより、酢酸エチル層へ移行し
た放射能を割合を求める。なお、この方法で、Ｃ−末端
アミド化されたＣ　Ｉ２５Ｔ　）　−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−ＣＯＮＨｚは特異的に、酢酸エチル層へ移行する
ことは液体クロマトグラフィー及びガンマ・カウンター
による測定により確認されている。

活性測定の結果を第１５図に示す。Ｗ３１１０のみでは
、活性はないが、ＸＡおよび、ＸＤＡでは上清液量に比
例して活性が増加し、確かにＣ−末端α−アミド化酵素
活性を有していることが確認された。

また、この酵素活性をｌｎ＋７培養当りに換算すると、
ＸＡでは１５ｍＵ、ＸＤＡでは１１ｍ［Ｊとなった。

１崖１−．　　夫Ｃ−＝−蛇α−アミド　　−、のＤＮ
人二華離（２） （Ｉ）ＤＮＡプローブの　−１ アフリカッメガエル由来のｃＤＮＡライブラリーより新
規Ｃ−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡを単離するため
に、まずｐＸＡ４５７を制限酵素ＰｖｕＩｒで完全に切
断し、約０．７４ｋｂのＤＮＡフラグメント（第１−１
−１−２図においてｐＸＡ４５７のｃＤＮＡ塩基番号５
４から７９５番目までのＤＮＡフラグメント：以下、こ
れをＰ　ｖｕ　Ｕ　ＤＮＡフラグメントと略す）を単離
した。

次に、このＰ　ｖｕ　Ｉｆ　ＤＮＡフラグメントを（α
　３２ｐ）ＣＴＰを用いてニックトランスレーションし
て放射標識する。

（２）コロニーハイ−ｔｍイゼーション−８０℃に保存
されたｃＤＮＡライブラリーを溶解し、普通栄養寒天培
地（５硝／−テトラサイタリンを含む）に拡げ、３７℃
−夜培養した。コロニーの上にニトロセルロースフィル
ター（Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ＆　５ｃｈｎｅ１１社製）を
置き５分間放置した。次にこのニトロセルロースフィル
ターを別の新しい普通栄養寒天培地（５ｎ／ｍ７テトラ
サイタリンを含む）の上にのせ、３７℃で８時間おいた
。次に、このニトロセルロースフィルターを別の新しい
普通栄養寒天培地（Ｉ７０ｇ／−クロラムフェニコール
を含む）の上にのせ、３７℃にて終夜放置した。次にこ
のニトロセルロースフィルターをアルカリ変性液（０，
１Ｍ　Ｎａ０ＩＩ　、　１．５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ　）の上
に１０分間置き、次に中和液（０，５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−
ｔｌＣ１ｐｌ！　７．５　。

１、５　Ｍ　ＮａＣ１）上に１０分間置いた。その後、
２ＸＳＳＣ溶液＜　２　Ｑ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　ＣＮａＣ１１
７５，３ｇ、りエン酸三ナトリウム８８．２ｇ　　全ｆ
ｆ１ｌ　ｌ＞でニトロセルロースフィルターをすすぎ、
風乾後、減圧下８０℃、１２０分間熱処理を行なった。

このようにして調製したニトロセルロースフィルターを
用い、以下に示す条件で、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。すなわち、２枚のニトロセルロースフ
ィルターをビニール袋にパックして５ｒｎｌのプレハイ
ブリダイゼーション液〔３ｘＳＳＣ，５０％ホルムアミ
ド、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ（ｐＨ７，５＞　、
０．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｌ　ｘデンハート液（Ｉ
×デンハート：アルブミン、ポリビニルピロリドン、Ｆ
ｉｃｏｌｌ、、各々０．２　ｍｇ／　ｍ７）　、サケ精
子ＤＮＡ２０μｇ／ｍ７）を加え、３７℃にて３時間プ
レハイブリダイゼーションを行った。

次に２枚のニトロセルロースフィルターあたり、前記Ｐ
　ｖｕ　Ｕ　ＤＮＡプローブを各々５６万ｃｐｍ　％及
び前記プレハイブリダイゼーション溶液０．５　ｍｌを
用い、３７℃にて一部ハイブリダイゼーションを行った
。次にこのフィルターを０．１％ＳＤＳを含む３ｘＳＳ
Ｃ溶液で３７℃、３０分間、２回洗浄後、さらに０．１
％ＳＤＳを含む０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ溶液で５０°
Ｃ１３０分間、２回洗浄した。この様にして調製したフ
ィルターを風乾後、オートラジオグラフィーを−８０℃
１昼夜行った。この様にして約２０万個のｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることによりＰｖｕＩｒＤ
Ｎ八ブローフへとハイフ゛リダイズするクローンが３個
得られた。これらをそれぞれ、　ＤＩｌ　　１　　／ｐ
ＸＡ７４７　　、Ｄｌｌ　１　　／ｐＸＡ７５０　　、
ＤＩｌ　　１　　／ｐＸＡ７９９と命名した。この内、
ＤＨ１／ｐχ八７へ９が以後に述べる解析から新規Ｃ−
末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡを含んだクローンである
ことが判った。

なお、この菌株は工業技術院微生物工業、扶’＋１１研
究所に微工研条寄第　ｌりれ　号（ＦＩＥＲＭ　ＢＰ　
／夕８乙）として寄託されている。

まず大腸菌Ｄｌｌ　１　／　ｐＸＡ７４７　、　ＤＩ　
１　／　ｐＸＡ７５０　、　ＤＩ目／ρＸＡ７９９株よ
り常法に従いそれぞれのプラスミドを分４ｓ　ｇＪ１製
した。次に、これらのプラスミドを各種の制限酵素で切
断することにより、これらプラスミドに含まれるｃＤＮ
Ａの制限酵素地図を作成した。すなわち、ここで用いた
制限酵素はＰｓｔｌ。

Ｋｐｎｌ　、Ｈ４ｎｃＵ　、　ＰｖｕＩＩ　、　Ａｃｃ
ｌ、及びｆ！ｃｏＲＶを用いた。この結果、ｐＸＡ７４
７とｐＸＡ７５０プラスミドについては、これらに含ま
れるｃＤＮＡの制限酵素地図は、先に得たｐＸＡ４５７
とほぼ同じであったことから、ｐＸＡ４５７と同じｃＤ
Ｎ＾の一部を含んだプラスミドであることが判った。し
かしｐＸＡ７９９を解析した結果、ｐＸＡ７９９は約３
．４ｋｂのｃＤＮＡを持ち、しかも、このｃＤＮＡの制
限酵素地図はｐＸＡ４５７のｃＤＮＡ制限酵素地図とは
明らかに異なっていた（第１７図参照）。この結果は、
ｐＸＡ７９９はｐＸＡ４５７とは異なルｃＤＮＡを含ん
でいること、すなわち、ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡにコー
ドされていたＣ−末端アルファアミド酵素とは異なる新
しいタイプのＣ−末端アルファアミド化酵素のｃＤＮＡ
を含んでいる可能性が極めて高いことを示している。そ
こで、本発明者らは、次にこのｃＤＮＡの塩基配列を以
下に示す方法で明らかにした。まず、ｐＸＡ７９９のｃ
ＤＮ＾部分を種々の制限酵素で切断し、このＤＮＡ断片
をＭ１３ファージにそれぞれサブクローニングする。次
に、個々のＤＮＡ断片の塩基配列を、Ｔａｋａｒａ　Ｄ
ＮＡ配列決定キット（宝酒造社製）を用い、ジデオキシ
法（Ｓａｎ−ａｒ、Ｆ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、３４．５４６３−５
４６７（Ｉ９７７））でそのＤＮＡ塩基配列を決定した
（第１−１〜１−４図参照）。第１８図に、ＤＮＡ塩基
配列を決定した各ＤＮＡフラグメントと塩基配列決定の
方向性を示す。

（Ｉ）　　ＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　　の　１（第２
１図参照）このプラスミドはｐＸＡ７９９のｃＤＮ八に
コードされている蛋白質のうち、第１６図におけるアミ
ノ酸配列番号（以下この実施例において、アミノ酸配列
番号は第１６図によるものとする。）■以後の蛋白質を
大腸菌内で発現させるのに必要なプラスミドである。ｐ
ＸＡ７９９と化学合成りＮＡ：５’ＧＴＣＡＴＴ　　Ｇ
Ｇ八　＾ＡＧ　　ＴＧＡ　　ＣＡＴ　　ＧＡＡ　　ＴＴ
ＣＴＴＣＣＴＣＡＴＡ　　ＣＣＴＣＴＴ３’を用い、Ｍ
ｏｒｉｎａｇａ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇ
ｙ２，６３６　６３９．１９８４）に従ってｉｎ　ｖｉ
ｔｒ。

ｍｕ　ｔａｇｅｎｅｓ　ｉｓを行い、ｐＸＡ７９９のｃ
ＤＮＡ塩基配列番号（以下、この実施例において塩基配
列番号は第１６図によるものとする。）１０９〜１１７
の５　’　ＴＣＡＡＣＣＡＧＡ　　３’塩基配列を５　
’　ＧＡＡ　ＴＴＣＡＴＧ　　３　’に変換した、すな
わちｃＤＮＡ塩基配列番号１１８〜１２０にコードされ
ているＳｅｒ残基の直前に制限酵素ＥｃｏＲＩサイト（
ＧＡＡＴＴＣ）とＭｅｔコード（ＡＴＧ）を導入したｐ
ＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ　）を作製した。

（２）堕ＣＰ　ＣＩ９作製（第２２図参照）このプラス
ミドは、目的遺伝子をλフアージ由来のＰＬプロモータ
ー支配下に発現させる為に必要なプラスミドである。す
なわち、ＰＬプロモーターの下流に位置するポリリンカ
ーサイトのＥｃｏＲ１サイトに、ＥｃｏＲＩサイト、開
始コドン（ＡＴＧ）を有する遺伝子を導入すれば、この
遺伝子にコードされている蛋白質を大腸菌内で直接発現
することができる。又、このプラスミドは、たとえ、目
的遺伝子の中に終止コドンが存在しない場合でも、後述
する、化学合成りＮＡリンカ−サイトのいずれかのリー
ディングフレームで翻訳が終了するようにデザインされ
たプラスミドである。

まずｐＵｃ−ＰＬ−ｔｒｐａ（特願昭６２−１６６７１
０参照＞３μｇを５ｐｈ１２０Ｕを用いて切断後、さら
に旧ｎｄｍｌｕｎｉｔ　（以下ＩＵと略す）を用いて部
分切断することにより目的のＳ　ｐｈ　Ｉ　−１１ｉｎ
ｄ　ｍフラグメント（これをＥフラグメントとする）を
分離した。次に、このＥフラグメントと、化学合成りＮ
Ａリンカー：をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、
目的とするｐＵＣＰｔＣＩを作製した。

（３）　　ＵＣＰ　Ｃｌ７９９Ｄｒａ　Ｉ　　びＷ３１
１０　　ＵＣＰ　Ｃｌ７９９Ｄｒａ　Ｉの作製（第２３
図参照） このプラスミド及び組換体は第１６図においてｐＸＡ７
９９のｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列番号Ｉ
から８３６までのアミノ酸−次配列を持つ蛋白質（これ
を７９９Ｄｒａ　Ｉとする）を大腸菌内で発現させる為
に作製した。ｐＵＣＰＬＣＩ　　３１１ｇをＥｃｏＲＩ
　２０　Ｕ　。

Ｓｍａ１２０Ｕを用い切断、ＥｃｏＲＩ　−Ｓｍａ　Ｉ
フラグメント（これをＦフラグメントとする）を分離し
た。

次にｐＸＡ７９９　ＥｃｏＲＩ　３　ｔｒｙをＨｃｏＲ
Ｉ　２０Ｕ％　Ｄｒａ　Ｉ２０Ｕを用い切断、ＥｃｏＲ
Ｉ　−Ｄｒａ　Ｉフラグメント（これをＧフラグメント
とする）を分離した。このＦ　、　Ｇ、両フラグメント
をＴ、ＤＮＡリガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１
１０に導入することにより、組換体Ｗ３１１０／　ｐＵ
ＣＰＬＣＩ７９９Ｄｒａ　Ｉ及びプラスミドｐＵＣＰＬ
ＣＩ７９９Ｄｒａ　Ｉを作製した。

（４）　　ＵＣＰＬＣＩ７９９Ｂ　Ｉ　ＩＩ　　びＷ３
１１０　　ＵＣＰＬＣＩ７９９−駐止１１■Ｙ説（第２
４図参照） このプラスミド及び組換体は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
にコードされているアミノ酸配列番号ｌから６９２まで
のアミノ酸−次配列をＮ−末端に、これにひき続くＣ−
末端は発現プラスミド由来のＬｅｕ残基が付加した蛋白
質（これを７９９８ｇ１　ＩＩとする）を大腸菌内で発
現させる為に作製した。ｐｕｃｐＬｃ■３　ｎをＥｃｏ
Ｒｒ　２０　ＵとＢａｍ１ｌ　Ｉ　２０　Ｕを用い切断
し、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメント（これをＨ
フラグメントとする）を分離した。一方、ｐＸＡ７９９
　（ＥｃｏＲｒ　）　３　ｔｒｇをＥｃｏＲＩ　２０　
ＵとＢｇｌｌ１２０Ｕを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ−Ｂ
ｇＩＩＩフラグメント（これを１フラグメントとする）
を分離した。次に、このＨ，１両フラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導
入することにより、組換体Ｗ３１１０／　ｐＵＣＰＬＣ
Ｉ７９９８ｇＩ　ｎ及びプラスミ）’ｐＵｃＰＬＣ７９
９ＢｇＩ　ｎを作製した。

（５）　ＵＣＰ　Ｃｌ７９９ＲＶ　び１１３１１０　　
ＵＣＰＬＣＩ７９９ＲＶ少立盟（第２５図参照） このプラスミド及び組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮ八に
コードされているアミノ酸配列番号１から５５１までの
アミノ酸−次配列をＮ−末端に、これにひきつづくＣ−
末端は発現プラスミド由来のＭｅｔ−Ｇｌｙ−１１ｅ−
Ｌｅｕが付加した蛋白質（これを７９９ＲＶとする）を
大腸菌内で発現させる為に作製した。

ｐＵｃＰｔ、ｃＩ　　３ｎをＥｃｏＲＩ　２０　ＵとＳ
ｍａＩ２０Ｕを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ　−Ｓｍａ　
Ｉフラグメント（これをＪフラグメントとする）を分離
した。一方ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ　）をＥｃｏＲＩ
　２０　Ｕを用いて切断後、ＥｃｏＲＶＩＵを用いて部
分切断し、目的のＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＶフラグメン
ト（これをにフラグメントとする）を分離した。次に、
この様にして得たＪ、に両フラグメントをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導入する
ことにより組換体Ｗ３１１０／　ｐＵＣＰＬＣＩ７９９
ＲＶ及びプラスミドｐＵＣＰＬＣＩ７９９ＲＶを作製し
た。

（６）　　ＵＣＰ　Ｃｌ７９９Ｓａｌ　Ｉ　　びＷ３１
１０／　ＵＣＰ　Ｃｌ７９９旦虹上■作盟（第２６図参
照） このプラスミド、及び組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
にコードされているアミノ酸配列番号１から４９９まで
のアミノ酸−次配列をＮ−末端に、これにひき’ｈｌ＜
ｃ−末端は発現プラスミド由来のＬｅｕ−Ｇｉｎ−へＩ
ａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ４１ｅ−八ｓｎが付加した蛋白質（
これを７９９Ｓａｌ　Ｔとする）を大腸菌内で発現させ
る為に作製した。

ｐＵｃＰＬｃ１７９９８ｇｌ　ＩＩ　３　Ｎを５ａｌ１
２０Ｕを用いて切断し、大きなりＮＡフラグメント（こ
れをＬフラグメントとする）を分離、このＤＮＡフラグ
メントをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いふたたび分子内で
再結合させ、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導入すること
により、組換体−３１１０／　ｐＵＣＰＬＣＩ７９９ｓ
ａｌ　ｒ及びラスミドｐＵＣＰＬＣＩ７９９ｓａｌ　ｒ
を作製した。

（７）　ＵＣＰ　Ｃ４７９９ＢｓｔＥ　ＩＩ　Ｌ　　び
−３１１０／　ＵＣＰ　Ｃ７９９ハ旦↓ヒ勿作盟（第２
７図参照） このプラスミド及び組換体は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
にコードされているアミノ酸配列番号１から３２９まで
のアミノ酸−次配列をＮ−末端に、これにひき続くＣ−
末端は、発現プラスミド由来のＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−
旧Ｓ−へｌａが付加した蛋白質（これを７９９８ｓ　ｔ
Ｅ　■’とする）を大腸菌内で発現させる為に作製した
。

ｐｌＪｃｒ’ＬｃＩ　　３ｔｔｇをεｃｏＲｒ２０Ｕと
Ｓｍａ１２０Ｕを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ　−Ｓｍａ
　Ｉフラグメント（これをＭフラグメントとする）を分
離した。一方、ｐＸＡ７９９　（ＨｃｏＲＩ　）をＢｓ
ｔＥＩＩＩＵを用いて部分切断後、Ｔ、ＤＮＡポリメラ
ーゼとｄＮＴＰを用いてｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄをフ
ィルインした後、ＥｃｏＲＩ　２０　Ｕを用いて、切断
し目的のＥｃｏＲＩ　−ＢｓｔＥ　ｎ　Ｌフラグメント
（これをＮフラグメントとする）を分離した。

次にこの様にして得たＭ、Ｎ両フラグメントをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導入
することにより組換体Ｗ３１１０／１）ＵＣＰＬＣＩ７
９９ＢＳ　ｔＥ　Ｉｆ　Ｌ及びブラスミＦ　ｐＵＣＰＬ
ＣＩ７９９ＢｓｔＥＩｒＬを作製した。

（８）　ＵＣＰ　Ｃｌ７９９ＢｓｔＥ　Ｉｆ　”　　び
Ｗ３１１０　　ＵＣＰ　Ｃ１７９９Ｂｓ　ｔＥ　ＩＴ　
”の　＋（第２８図参照）このプラスミド、及び、組換
体はｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされているアミノ
酸配列番号１から２９８までのアミノ酸−次配列をＮ−
末端に、これにひき続くＣ−末端は、発現プラスミド由
来のＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ
−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａが付加した
蛋白質（これを７９９８ｓｔＥ　Ｕ　’とする）を大腸
菌内で発現させる為に作製した。

ｐＵｃＰＩ、ＬＣｌ　３　ｔｔｇをＥｃｏＲＩ　２０　
ＵとＳｍａＩ２０Ｕを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ　−Ｓ
ｍａ　Ｉフラグメント（これを０フラグメントとする）
を分離した。一方、ｐＸ八へ９９（ＥｃｏＲｒ　）をＢ
ｓｔＥＩｒ２０Ｕを用いて部分切断後、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼとｄＮＴＰを用いてＣｏｈｅｓ　ｉ　ｖｅｅｎ
ｄをフィルインした後、ＥｃｏＲＴ　２０　Ｕを用いて
切断し目的のＥｃｏＲＩ　−ＢｓｔＥ　Ｉｆ　’フィル
インフラグメント（これをＰフラグメントとする）を分
離した。

次に、この様にして得た０、２両フラグメントを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に
導入することにより組換体−３１１０／１）ＵＣＰＬＣ
Ｉ７９９ＢＳ　ｔＥ　Ｉｆ　’及びプラスミドｐＵＣＰ
ＬＣＩ７９９ＢｓＴＥ■３を作製した。

（９）　　ＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｔ　Ｉ　
）の　−＋ｌ　（第２９図参照） このプラスミドはｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされ
ている蛋白質のうち、アミノ酸配列番号ｌから３４６ま
での蛋白質を大腸菌内で発現させるのに必要なプラスミ
ドである。

ｐＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　）と化学合成りＮＡ　：
５　’　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　　ＣＣＴ　　ＡＡＡ　　
ＴＡＧ　　ＧＴＣＧＡＣＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＴＡＴ
ＴＡＡＡＴ３’を用いｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓを行いｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ塩基配列番号
１１５６−１１６４の５　’　ＣＧＧＧＡＧ　ＧＡＧ　
　３　’を５　’　ＴＡＧ　ＧＴＣＧＡＣ３’に変換し
た、すなわち、ｃＤＮＡ塩基番号１１５３−１１５５に
コードされているＬｙｓ残基の直後に翻訳終止コドン（
Ｔ　Ａ　Ｇ）と制限酵素Ｓａｌ　Ｉサイト（ＧＴＣＧＡ
Ｃ）を導入したｐＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ
　ｌ　）プラスミドを作製した。

（Ｉ０）ｔｒΔ７９９　　び讐３１１０／ｌｒΔ７９９
の乍１（第３０図参照） このプラスミド及び組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮＡに
コードされている蛋白質のアミノ酸配列番号１から３４
６までのアミノ酸−次配列をもつ蛋白質を（これをΔ７
９９とする）大腸菌トリプトファンプロモーター支配下
に発現させる為に作製した。

まず、ｐｔｒｐＧＩＦｓα（このプラスミドは、トリプ
トファンオペロン支配下に、ヒト・ガンマ−インターフ
ェロンとアルファ・ネオ・エンドルフィンのキメラ蛋白
質を発現できるようにデザインされたプラスミドである
。特願昭６２−１０７７８７）をＥｃｏＲＩと５ａｌＩ
で切断、トリプトファンオペロンを含むＤＮＡフラグメ
ント（これをＡフラグメントとする）を分離する。一方
、ｐＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　）をＥ
ｃｏＲＩと５ａｌＩを用い切断、目的のＥｃｏＲＩ　−
３ａｌｌＤＮ八フラグメント（これをＢフラグメントと
する）を分離する。次に、Ａ、８両ＤＮＡフラグメント
をＴ、ＤＮＡリガーゼを用い結合し、これを大腸菌株Ｗ
３１１０に導入することにより組換体Ｗ３１１０／ｐｔ
ｒｐΔ７９９及びプラスミドｐｔｒｐΔ７９９を作製し
た。

（Ｉ１）　ｔｒ　７９９−４５７Δび−３１１０ｔｒ　
７９９−４５７ユヘ９］１殴（第３１図参照） このプラスミド及び組換体はｐＸ＾７９９のｃＤＮＡに
コードされている蛋白質のアミノ酸配列番号１から３２
９までのアミノ酸−次配列をＮ−末端に、これにひき続
くＣ−末端はｐＸＡ４５７のｃＤＮＡにコードされてい
るアミノ酸番号３６４から３８１までのアミノ酸−次配
列（第１−３図参照）を持つ蛋白１ｔ（これを７９９−
４５７Δとする）を大腸菌内で発現させる為に作製した
。

まず、ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８　３　ｔｎｔをＥｃｏＲＩ
　２０　ＵとＢｓｔＥＩＩ２０Ｕを用いて切断し、Ｅｃ
ｏＲＩ　−Ｂｓ　ｔＥ　［［フラグメント（これをＣフ
ラグメントとする）を分離した。

一方、ｐＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　）をＥｃｏＲｒ　
２０　Ｕを用いて切断後、ＢｓｔＥＩＩ　Ｉ　Ｕを用い
て、部分切断し、目的のＥｃｏＲｒ　−ＢｓｔＥ　ＩＩ
フラグメント（これをＤフラグメントとする）を分離し
た。次にこの様にして得たＣ、Ｄ両フラグメントをＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に
導入することにより、組換休日１１０／ｐｔｒｐ７９９
−４５７Δ及びプラスミド−３１１０／　ｐｔｒｐ７９
９−４５７Δを作製した。

実施例１３で示した方法により作製した、多くの大腸菌
、組換体を下記に示す方法を用い、個々に培養すること
により目的の蛋白質を発現させた。

尚ここでは発現プラスミドの種類の観点から具体例とし
て以下の２例を示すが、他の組換体についてもこれと同
様な培養方法を用いることにより、目的蛋白質を得るこ
とができる。

（Ｉ）　７９９Ｄｒａ　Ｉの　　　　でのＷ３１１０／
　ｐＵｃＰｔｃ！７９９Ｄｒｉ　Ｉをアンピシリン５０
ｎ／ｒｎｌを含有するスーパーブロース（酵母エキス２
４ｇ、）リブトン１２ｇ、グリセリン５ｄ１１Ｍリン酸
バッフｙ　−（ｐＨ７，６）１００ｍｊを水に熔かして
ＩＩｌに調整した培地）で、３２℃、−中復培養した。

次に、この菌体を、アンピシリン５０ｇ／ｆｎｌを含有
するスーパーブロースに、菌体濃度が６６０ｎａ＋で０
．０１００／１ｍｌになるように接種し、３２℃で菌体
濃度が６６０ｎｍで０．３　Ｏｎ／−に達するまで培養
する。この時点で培養温度を４２℃にシフトさせ、さら
に、菌体濃度が２０Ｄ／艷に達するまで培養した。尚、
実施例１３で示した発現プラスミドのｐＣＵＰＬＣｌシ
リーズを含有する組換体の培養は、この培養方法と同一
条件で行なった。

（２）Δ７９９の　Ｖ　　での Ｗ３１１０／ｐｔｒｐΔ７９９をアンピシリン５０ｘ／
ｍｊを含有するスーパーブロース培地で３７℃−中復培
養した。次に、この培養液を、２０倍量のカザアミノ酸
０．２％、インドールアクリル酸５ｇ／ｍ１、アンピシ
リン５０ｇ／ｍｊをそれぞれ含有するＭ９培地（０，５
％リン酸−水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリ
ウム、０．５％塩化ナトリウム、０、１％塩化アンモニ
ウム）に接種し、３７℃、７時間、培養した。尚、これ
と同様の培養は、実施例１３で作製した、７９９−４５
７Δ生産菌−３１１０／ρｔｒｐ　７９９−４５７Δで
も用いた。

次に、上記した方法を用いて培養した組換体を、それぞ
れ遠心分離で集菌後、各菌体の全蛋白質をＬａｅｌｌｌ
ｍｌｉ、Ｕ、に、の方法に従って（Ｌａｅｍｍｌ　ｔ、
　Ｕ、’Ｋ。

Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０−６８５．１９７０）　　
５Ｏ５−ＰＡＧＥで解析することにより、目的蛋白質が
発現されていることを確認した。一方、これらの蛋白質
はいずれも、菌体をＰＢＳ　（−）（０，８％塩化ナト
リウム、０．０２％塩化カリウム、０．１５％リン酸−
水素ナトリウム、０．０２％リン酸二水素カリウム）に
懸濁し、超音波処理で菌体を破砕後、１１００００ｒｐ
／　ｍｉｎ　、遠心処理すると大部分が沈澱画分に回収
された。

１施五１５．　　Ｃ−「α−アミ゛　　、′　の：１実
施例１４で培養した菌体００６６０で１０００を集菌し
、これを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳ（−）２００
Ｉ１１に懸濁、超音波処理により菌体を破砕した。次に
、遠心分離により沈澱画分を回収し、この沈澱画分を６
Ｍ塩酸グアニジン５００ｐｆｆｉで可溶化した後、この
溶液を順次１時間ずつ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ　
　（ｐＨ７，０）と５０ｍ　ＣｕＳＯ４を含む４Ｍ塩酸
グアニジン、及び１０ｍＭＴｒｉｓ　・ＨＣｌ（ｐＨ７
，０）と５０禮Ｃｕ５Ｏｎを含む２Ｍ塩酸グアニジン溶
液各２００ｄに透析したサンプルを用いて以下に示す酵
素活性を測定した。

第２表に、測定した各蛋白質の活性値を示す。

なお実施例１０で用いたＸＡの値も参考に示す。

第２表 この表から明らかなように、（Ｉ）　ｐＸＡ７９９のｃ
ＤＮＡにコードされている蛋白質はペプチドＣ−末端α
−アミド化酵素活性を持っている。又、（２）この酵素
活性発現にはｐＸ＾７９９のｃＤＮＡにコードされてい
る全アミノ酸−次配列をもつ蛋白質（７９９Ｄｒａ　Ｉ
　）が必ずしも必要ではなく、特に７９９Ｄｒａ　Ｉの
Ｃ−末端部分は重要ではない。実際、本発明における７
９９Ｄｒａ　ＩのＣ−末端部分を欠失した誘導体蛋白質
（例えば、７９９８ｇ１　ＩＩ　、　７９９ＲＶ　、　
７９９Ｓａｌ　Ｉ　、Δ７９９゜７９９−４５７Δ及び
７９９ＢｓｔＥＩＩ　Ｌ）はＣ−末端α−アミド化酵素
活性を示している。しかし、（３）７９９ＢｓｔＥＩＩ
”はこの活性を示さないことから、少なくても、ｐＸ＾
７９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質のアミノ酸
配列番号１から３２９までのアミノ酸−次配列に規定さ
れる蛋白質がＣ−末端α−アミド化酵素活性に必要であ
る。さらに、（４）表２表に示す、７９９Ｄｒａ　Ｉを
はじめとする、各種誘導体の酵素活性の値は、これらの
蛋白質を、大腸菌内で発現させ、実施例１４の方法に従
って調製したサンプルを発現菌体あたりに換算した値を
示しである。

したがって、この値から、ただちに個々の蛋白質■あた
りの比活性を求めることはできない。これは個々の菌体
あたりの発現蛋白’ｒｔｔが異るためである。

〔発明の効果〕

本発明では上記のようにアフリカッメガエル体皮よりＣ
−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡを単離、その構造を
明らかにし、さらに組換宿主細胞において大量に発現さ
せることに成功した。本発明におけるｃＤＮＡを用いれ
ば、宿主細胞は単に大腸菌のみならず他の宿主細胞、例
えば酵母または他の真核細胞においても大量に発現させ
うる。この酵素を工業的に製造し、ペプチドまたは蛋白
質の生理活性に重要であるＣ−末端α−カルボキシル基
のアミド化に用いれば、生理活性物質の製造が効率的に
行え、かつ容易になる。さらに、酵素の基質としてのペ
プチドまたは蛋白質は、合成した基質だけでなく、天然
由来の、まｈは組換ＤＮＡ技術によるものでもよ（、Ｒ
−Ｘ−Ｇｕｙの構造をもつものであればどんなものでも
用うることができる。

【図面の簡単な説明】

第１−１図〜第１−４図は、ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡの全
塩基配列とこのｃＤＮＡコードされているアミノ酸配列
を示す。 第２−１図〜第２−３図はＣ−末端α−アミド化酵素の
アミノ酸配列を示す。 第３−１図〜第３−３図はプレＣ−末端α−アミド化酵
素のアミノ酸配列を示す。 第４−１図〜第４−３図はプレプロＣ−末端α−アミド
化酵素のアミノ酸配列を示す。 第５図はＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのＮ−末端（Ｎ　
−ｔｅｒｍ）およびＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅのトリ
ブチツクフラグメント（Ｔ−）のアミノ酸配列を示す。 第６図はＣ−末端α−アミド化酵素（ＸｅｎｏｐｕｓＩ
ａｅｖｉｓ体皮由来）　ｃＤＮＡの単離に用いたＤＮＡ
混合プローブ（ＹＳＯ１２、ＹＳＯ１３、及びＹＳＯ１
５）のデザインを示すものである。 第７図はｐＸＡ４５７ｃＤＮへの制限酵素地図（ａ）及
びｃＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー（ｂ）を示す。 第８図はｐＵｃ１８ＸＡ（ＥｃｏＲＩ　）プラスミドの
構築を示す。 第９図はｐｔｒｐＸＡＳＴ４プラスミドの構築を示す。 第１０図はＸＡ発現プラスミドｐｔｒｐＸＡＳＴ８の構
築を示す。 第１１図はＤＮＡリンカ−Ｆのデザインを示す。 第１２図はｐ　ｔｒｐＸＡＳＴ４プラスミドの構築を示
す。 第１３図はＸＤＡ発現プラスｉドｐｔｒｐＸＡＳＴ８の
構築を示す。 第１４図中、（ａ）はＷ３１１０．　Ｗ３１１０／　ｐ
ｔｒｐＸＡＳＴ８および一３１１０／　ｐｔｒｐＸＤＡ
ＳＴ８の全蛋白質のＳＯＳ　−ＰＡＧＥによる分析を、
（ｂ）はχＡ、χＤＡおよびＮａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍ
ｅのＳＤＳ　−ＰＡＧＥによる分子量の比較分析を示す
ものである。 第１５図はＸＡ、及びＸＤＡのＣ−末端α−アミド化酵
素活性の測定結果を示す。 第１６−１図〜第１６−３図は、ｐχ八へ９９のｃＤＮ
Ａの塩基配列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ
酸配列を示す。 第１７図は、ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡとｐＸＡ７９９の
ｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第１８図は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配列の決定
のためのストラテジーを示す。 第１９図は、ｐＸＡ４５７とｐＸＡ７９９のｃＤＮＡに
コードされている蛋白質のアミノ酸−次配列の比較を示
す。 第２０図は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされてい
る蛋白質およびその誘導体とこれらに対応する発現プラ
スミドを示す。 第２１図は、ｐＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　）の作製を
示す。 第２２図は、ｐｌＪｃＰｔｃＩの作製を示す。 第２３図は、ｐＬＩｃＰＬＣＩ７９９Ｄｒａ　Ｉの作製
を示す。 第２４図は、ｐＵｃＰＬｃ１７９９８ｇＩ　ｎの作製を
示す。 第２５図は、ｐｔｌｃＰＬＣＩ７９９ＲＶの作製を示す
。 第２６図は、ｐＵＣＰＬＣＩ７９９ｓａｌ　Ｉの作製を
示す。 第２７図は、ｐＵｃＰＬｃ！７９９ＢｓｔＥＩＩ　Ｌの
作製を示す。 第２８図は、ｐｌＪｃＰｔｃＴ７９９ＢｓｔＥ　ＩＩ　
’の作製を示す。 第２９図は、ｐＸＡ７９９　（ＥｃｏＲＩ　−３ａｔ　
Ｉ　）の作製を示す。 第３０図は、ｐｔｒｐΔ７９９の作製を示す。 第３１図は、ｐｔｒｐ７９９−４５９Δの作製を示す。 八ｒＣＴＡＴ　（’：Ａｆ’ｌ”’＾＾　７０丁　＾ρ
ハ　＾ｒ＾ＴＩ”八　／’Ｔ丁　Ｔ／’ｎ　　　１’）
ｎＭｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　
　Ｓｅｒ　　ＡｓｐＧｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ第１−１図 Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ ＣＧＧ　　ＣＣＣＧＴＴ　　　１５０ Ａｒ９　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ ＴＡＴ　　ＡＣＴ　　ＣＴＡ　　　＋８０Ｔｙｒ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｌｅｕ ＡＣＴ　　ＣＣＧ　　ＡＣＡ　　　２１０Ｔｈｒ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｔｈｒ ＡＡＧ　　ＴＣＴ　　ＴＡＣ２４０ Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ ＧＣＣＴＡＴ　　ＧＴＡ　　　２７０ Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ ＡＡＴ　　ＡＴＧ　　ＧＡＴ　　　３００Ａｓｎ　　Ｍ
ｅｔ　　Ａｓｐ ＴＴＴ　　ＧＧＡ　　ＴＧＣ３３０ Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ ＧＡＴ　　ＴＡＣＴＧＧ　　　３６０ Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ ＧＡＣＴＧＴ　　ＡＧＴ　　ＧＣＧ　　ＧＧＡＡｓｐ　
　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　ＧｌｙＴＣＣＡＧＴ
　　ＡＴＡ　　ＡＴＧ　　ＴＡＴＳｅｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｉｌｅ　　Ｍｅｔ　　ＴｙｒＧＣＡ　　ＣＣＡ　　ＣＣ
ＣＡＣＣＡＡＡＡｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ
　　ＬｙｓＧＧＣＴＴＴ　　ＣＧＴ　　ＧＴＴ　　ＧＧ
ＡＧｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ａｒａ　　Ｖａｌ　　ＧｌｙＡ
ＧＡ　　ＴＡＴ　　ＴＴＴ　　ＧＴＧ　　ＣＴＴＡｒ９
　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｔ　　ＬｅｕＡＡＴ　　Ｇ
ＴＧ　　ＡＡＡ　　ＧＣＡ　　ＴＴＣＡｓｎ　　Ｖａｌ
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　ＡＴＡ　　ＣＣＴ　　ＴＣＴ　　ＴＣＣＡＣＴＡｓｎ
　　ｌＪｅ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ
第４−１図 Ｖａｌ　　Ｉｈｒ　　ｌ’ｒｏ　　ＴｈｒＴＧＣＡＡＧ
　　ＴＣＴ　　ＴＡＣ２４０Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅ
ｒ　　ＴｙｒＧＡＡ　　ＧＣＣＴＡＴ　　ＧＴＡ　　　
２７０Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ｖａ１ＧＣＣＡ
ＡＴ　　ＡＴＧ　　ＧＡＴ　　　３００ＡＩａ　　Ａｓ
ｎ　　Ｍｅｔ　　ＡｓｐＣＴＡ　　ＴＴＴ　　ＧＧＡ　
　ＴＧＣ３３０Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　ｃＪａｙ　　Ｃｙｓ
ＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＴＡＣＴＧＧ　　　３６０Ａｓｐ
　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　ＴｒｐＴＧＣＡＴＧ　　ＧＡ
ＣＡＡＡ　　　３９０Ｃｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　
ＬｙｓＴＣＣＡＧＴ　　ＡＴＡ　　ＡＴＧ　　ＴＡＴＳ
ｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｍｅｔ　　ＴｙｒＧＣＡ
　　ＣＣＡ　　ＣＣＣＡＣＣＡＡＡＡｌａ　　Ｐｒｏ　
　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　ＬｙｓＧＧＣＴＴＴ　　ＣＧＴ
　　ＧＴＴ　　ＧＧＡＧＩｙ　　Ｐｈｅ　　Ａｒａ　　
Ｖａｌ　　ＧｌｙＡＧＡ　　ＴＡＴ　　ＴＴＴ　　ＧＴ
Ｇ　　ＣＴＴ、Ａｒｇ　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　
　ＬｅｕＡＡＴ　　ＧＴＧ　　ＡＡＡ　　ＧＣＡ　　Ｔ
ＴＣＡｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ａｉａ　　Ｐｈｅ
ＧＡＴ　　ＴＧＣＡＣＧ　　ＧＧＧ　　ＧＴＧＡｓｐ　
　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　ＶａｌＧＣＣＴＧＧ
　　ＧＣＡ　　ＡＡＧ　　ＡＡＴ　　　４２０ＡＩａ　
　Ｔｒｐ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　ＡｓｎＣＴＴ　　Ｃ
ＣＡ　　ＧＡＡ　　ＧＧＡ　　ＧＴＴ　　　４５０Ｌｅ
ｕ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｖａ１ＧＧＧ　
　ＡＡＡ　　ＴＣＡ　　ＧＧＣＡＧＴ　　　４８０Ｇｌ
ｙ　　Ｌｙｓ’Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ・　　１６
０ ＣＡＡ　　ＧＴＴ　　ＣＡＣＴＡＴ　　ＧＧＡ　　　５
１０Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｈｉｓ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ
ＣＡＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＣＡＴ　　ＡＡＡ　　
　５４０Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　）Ｉｉｓ　　
ＬｙｓＡＣＡ　　ＧＴＡ　　ＣＧＡ　　ＧＴＡ　　ＡＣ
Ａ　　　５７０Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　Ｖａｌ　
　ＴｈｒＣＡＡ　　ＡＴＴ　　ＧＣＡ　　ＧＧＣＡＴＴ
　　　６００Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　ＧＩｎ　
　Ｐｒ。 ＴＡＴ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＴＣＴＴｙｒ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｍｅｔ　　５ｅｒＣＣＡ　　ＣＣＴ
　　ＧＧＧ　　ＧＡＡ　　ＧＡＧＰｒｏ　　Ｐｒｏ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　ＧｌｕＡＴＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣ
ＴＡＣ ｌｉｅ　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　ＴｙｒＣＡ
ＣＣＣＡ　　ＴＴＴ　　ＧＣＣＴＡＣＨｉｓ　　Ｐｒｏ
　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　ＴｙｒＣＡＧ　　ＴＴＧ　　
ＧＧＧ　　ＣＡＧ　　ＧＴＣＧｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌ
ｙ　　ＧＪｎ　　ＶａＪ第４ Ｇｌｒ＋　　ＩＪｅ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｈｅ２０
０　　　　′ ＧＴＧ　　ＧＡＣＡＣＴ　　ＧＴＴ　　ＡＴＴ　　　６
３０Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　ｌｌｅ
ＧＣＡ　　ＧＴＴ　　ＡＡＴ　　ＴＣＴ　　ＧＡＴ　　
　６６０Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｓｐＡＡＣＡＧＧ　　ＣＣＧ　　ＡＣＡ　　ＡＴＡ　　
　６９０Ａｓｎ　　Ａｒ９　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌ
ｅＡＧＡ　　ＧＴＣＣＡＣＡＣＴ　　ＣＡＴ　　　７２
０Ａｒ９　Ｖａｌ　　）ｌｉｓ　　Ｔｈｒ　　ｌ−１ｉ
ｓＧＴＡ　　ＡＧＴ　　ＧＧＡ　　丁ＴＴ　　ＡＧＡ　
　　７５０Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　
ＡｒｇＴＧＧ　　ＴＣＴ　　ＴＴＡ　　ＡＴＴ　　ＧＧ
Ｔ　　　７８０Ｔｒｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　ｌｉｅ
　　Ｇｌｙ２６〇 −２図 ＡＧＡ　　ＣＡＡ　　ＡＧＣＣＣＡ　　ＣＡＧ　　ＣＴ
ＧＡｒｐ　　ＧＩｎ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ　
　Ｌｅｕ↑ＡＣＣＣＴ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　　ＣＡＴ　Ｃ
ＣＡＴｙｒ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｈｉｓ
　　Ｐｒ。 ＣＣＴ　　ＧＧＧ　　ＧＡＴ　　ＡＴＴ　　ＡＴＡ　　
ＧＣＡＰｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　ＩＩｅ　　ｌｉ
ｅ　　ＡｌａＴＴＣＡＣＴ　　ＧＧＴ　　ＡＡＡ　　Ｇ
ＧＣＡＧＧＰｈｅ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　
Ｇｌｙ　　Ａｒ９ＴＡＴ　　ＡＴＴ　　ＧＧＴ　　ＧＧ
ＣＡＣＡ　　ＴＣＴＴｙｒ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒＴＧＴ　　ＡＡＴ　　ＴＴＡ
　　ＴＡＣＡＴＣＡＴＧＣｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　
　Ｔｙｒ　　ｌｉｅ　　ＭｅｔＧＣＧ　　ＧＣＣＣＡＴ
　　ＧＣＴ　　ＡＣＧ　　ＴＣＡＡｌａ　　Ａｌａ　　
Ｈｉｓ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒＧＴＡ　　ＣＡ
Ｇ　　ＡＣＧ　　ＧＧＴ　　ＧＡＡ　　ＣＣＡＶａｌ　
　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒ。 ＣＣＡ　　ＣＡＧ　　ＧＣＡ　　ＴＴＴ　　　８１０Ｐ
ｒｏ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　ＰｈｅＧＴＡ　　ＧＡＧ
　　ＡＴＴ　　ＡＧＣ８４０ＶａＩ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌ
ｅ　　ＳｅｒＡＣＣＡＧＧ　　ＴＧＴ　　ＣＴＧ　　　
８７０Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ ＡＣＧ　　ＴＣＡ　　ＧＣＡ　　ＡＣＡ　　　９００Ｔ
ｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　ＴｈｒＡＡＣＧＡＴ　　
ＧＡＡ　　ＡＴＧ　　　９３０Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ
　Ｍｅｔ ＴＡＴ　　ＴＡＣＡＴＧ　　ＧＡＴ　　　９６０Ｔｙｒ
　　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ ３２０′ ＴＡＣＡＴＧ　　ＡＣＣＴＧＴ　　　９９０Ｔｙｒ　　
Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　　Ｃｙ・ｓＡＡＧ　　ＴＴＡ　　ＴＴ
Ｔ　　ＣＡＡ　　１０２０Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ
　　ＧｌｎＡＡＣＡＴＣＣＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＴＴ　
　ＧＣＡ　　ＡＡＡｓｎ　　ｌｉｅ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌ
ｕ　　ｌｉｅ　　Ａｌａ　　ＡｓＣ０Ｔ　　ＧＴＡ　　
ＡＧＣＣＣＴ　　ＧＡＣＡＴＧ　　ＡＴＰｒｏ　　Ｖａ
Ｉ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ｍｅ
ＧＧＡ　　ＣＡＴ　　ＧＧＴ　　ＣＡＣＣＡＣＣＡＴ　
　ＡＣＧｌｙ　　Ｈｉｓ　　Ｇｌｙ　　）Ｉｉｓ　　）
Ｉｉｓ　　Ｈｉｓ　　ＴｈＣＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ
　　ＡＡＴ　　ＡＣＡ　　ＧＧＡ　　ＣＴＰｒｏ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌ
ｅＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ　
　ＧＡＡ　　ＧＴＬｙｓ　　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ
　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　ＶａＧＧＴ　　ＣＴＣＡＴＴ
　　ＡＣＣＴＴＡ　　ＧＧＧ　　ＧＡＧｌｙ　　Ｌｅｕ
　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｓ図 汀ＧＴＴ　ＣＣＣＡＴＴ　１０５０ ｎ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ Ｇ　　ＡＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＧ　　１０８０ｔ　　
Ｍｅｔ　　Ｍｅｔ　　Ｍｅｔ ＧＣＧ Ａ　　ＧＡＡ　　ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　１１１０ｒ　　
Ｇｌｕ　　ＡＩａ　　Ｇｌｕ Ｔ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　　ＣＣＴ　　１１４０ｕ　　
ＧＩｎ　　Ｇｉｎ　　Ｐｒ。 Ａ　　ＴＴＡ　　ＧＡＴ　　ＣＡＧ　　１１７０Ｉ　　
Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｎ Ｔ　　ＡＧＣＧＣＡ　　ＧＴＧ　　１２００ｐ　　Ｓｅ
ｒ　　Ａｌａ　　Ｖａ１ ＤＮＡ混合グローブ Ｔ−３０−−−Ａｓｐ ｍＲＮＡ　　　　　　　　　　　　　５’　ＧＡＵＹＳ
Ｏ１２３’ＣＴＡ ＤＮＡ ＹＳＯ１３３’　ＣＴＡ Ｔ−１１Ｍｅ↑ ｍＲＮＡ　　　　　　　　　　　　　、　５’ＡＬＪＧ
−Ａｓｐ　−ＧＬｕ　−ＡＬａ　−Ｔｙｒ　−ＶａＬ　
　−−−ＧＡＵ　　ＧＡＡ　　ＧＣＵ　　ＵＡＵ　　Ｇ
ＵＵ３’ＧＣＣＣ Ａ　　　　　　　　　　　Ａ Ｇ　　　　　　　　　　　Ｇ ＣＴＡ　　ＣＴＴ　　ＣＧＡ　　ＡＴＡ　　ＣＡ５’Ｃ
ＧＧ ＣＴＡ　　ＣＴＴ　　ＣＧＴ　　ＡＴＡ　　ＣＡ５’Ｃ
ＣＧ −Ｍｅｔ　　−Ｇｊｙ−Ｈａｓ　−Ｇｔｙ−ＨＩＳ　−
−−ＡＵＧ　　ＧＧＵ　　ＣＡＵ　　ＧＧＵ　　ＣＡＵ
３’ｃｃｃ Ａ　　　　　　　　　　　Ａ Ｇ　　　　　　　　　　　Ｇ ｃＤＮＡ　　　　　　ＹＳＯ１５３’ＴＡＣＴｌ第６１ にＣＣＣＡ　　ＧＴＡ　　ＣＣＡ　　ＧＴ５’ＧＧ Ｔ　　　　　　　　　　　Ｔ ＣＣ 図 ］　　　２　　３　　−　　　七。 ＜　Ｑ　） ＋　　　　２３４　　　５ （？）） 第１４１図 ３−Ｗ３１　Ｔｏ／ｐｔｒｐＸＡｓＴ８４−Ｗ３１１０
／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８４−Ｗ３＋ＩＯ／ｐｔｒｐＸＤ
ＡＳＴ８ＧＧＣＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴ
ＣＡＡＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＧ−ＧＩｙＳｅｒＡｒａＴ
ｙｒＰ）ｉｅＶａｌＬｅｕＧＩｎＶａｌＨｉｓＴｙｒＧ
Ｉ＞ＣＡＴＡＡＡＧＡＴＴＧＣＡＣＡＧＧＧＧＴＧＡＣ
ＴＧＴＡＣＧＧＡＴＡＡＣ７ＨｉｓＬｙｓＡｓｐＣｙｓ
ＴｈｒＧＩｙＶａｌＴｈｒＶａｌＡｒｇｌ　ＩｅＴｈ＋
ＧＧＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＣＡ
ＡＣＡＣＴＧＴＴＧＴコＧＩｙＩ　ＩｅＴｙｒＬｅｕＳ
ｅｒＭｅｆＳｅｒＬｅｕＡｓｎＴｈｒＶａＩＶａｌＴＣ
ＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡ
ＣＣＡＡＣＧＡＴ／５ｅｒＡｓｐ　Ｉ　１ｅＡｌ　ａＣ
ｙｓＬｅｕＴｙｒＡｓｎＡｒｇＰｒｏＴｈｒ　Ｉ　Ｉｔ
ＡＣＴＣＡＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＡ
ＧＣＧＧＣＴＴＴＡＧ／ＴｈｒＨｉｓＧＩｎＬｅｕＧＩ
ｙＧＩｎＶａｌＶａｌＳｅｒＧＩｙＰｈｅＡｒｃＡＴＴ
ＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣ
ＡＧＧＣＧＴＴ１１　ＩｅＧＩｙＡｒ９ＧＩｎＳｅｒＰ
ｒｏＧＩｎＬｅｕＰｒｏＧＩｎＡＩａＰｈｔＡＴＴＡＧ
ＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧ
ＴＧＴＣＴ（Ｉ　ＩｅＳｅｒＰｒｏＧＩｙＡｓｐｌ　Ｉ
ｅｌ　ＩｅＡＩａＴｈｒＡｒａＣｙｓＬｅｔ第１６−１
図 ｒＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＡＡＡ
　　５４０１ＡｓｐＶａＩＬ’ｙｓＡＩａＰｈｅＧＩｎ
ＡｓｐＬｙｓ＼ＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡ
ＡＴＴＧＣＡ　　　６００・ＰｒｏＧｌｕＬｙｓＧＩｎ
ＰｒｏＬｅｕＩ　ＩｅＡＩａｒＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＡ
ＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＡＡＴ　　　６６０！ＰｒｏＰｒ
ｏＧｌｙＧＩｎＧＩｕＶａｌＶａｌＡｓｎ＼ＣＡＣＣＣ
ＡＴＴＴＧＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴ　　　７２０
ｉＨｉｓＰｒｏＰｈｅＡＩａＴｙｒＡｒｇＶａｌＨｉｓ
＼ＧＴＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＣＴＴＴＡ
　　　７８０ａＶａｌＡｒ９ＨｉｓＧＩｙＬｙｓＴｒｐ
ＴｈｒＬｅｕｒＴＡＣＣＣＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＣＣＡ
ＴＴＡＧＡＧ　　　８４０＊ＴｙｒＰｒｏＶａｌＧｌｕ
ＨｉｓＰｒｏＬｅｕＧｌｕ３ＴＴＣＡＣＴＧＧＴＡＡＡ
ＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＧ　　　９００」ＰｈｅＴｈｒ
ＧＩｙＬｙｓＧｌｙＡｒ９ＭｅｔＳｅｒ（ｎ 又 ω シ　　　：）−Ｉｒ！Ｊ６１１ −　　−　　　　　　　−　　−　　　　　〇］−−山
　　山　　　　　Ｅ−４日　　　　ｎ工　　工　　　　
）工　工　　　く　く　　　エ　エ　　飯ｒＮｏ’ｔ　
　　　　　　　　ｒＮｃｙｓ　　　　　　　　　ｒ’−
０’１ｔ、ｎ　　　　ｃｙ’ｓ　　　　　　　　　ｔｎ
　　　　Ｏ’ｌ　　　　　　　　　Ｌｌ）（：へｐ、Ｉ
　　　　Ｑ　　　　　　　　Ｑ　　　Ｑ　　　　　　　
　μａＱＣｎ の 工 ω 〇 口 ≧ えっ ミ 綜 第２９回 ｓｔＩ 手続補正書（自発） 昭和６３年９月６　日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第３０６８６７号 ２、発明の名称 Ｃ−末端α−アミド化酵素 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　（Ｉ９０）サントリー株式会社 氏名松尾壽之 ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号ンｒ
７＼ ５、補正の対象 （Ｉ）　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄（２）　
　明細書の「図面の簡単な説明」の欄（３）図面 ６、補正の内容 （Ｉ）■　明細書第７９頁第４〜６行目「（このプラス
ミドの・・・参照）」を「〔このプラスミドは１）ＰＬ
Ｔ４ＴＮＰＳＴ８　（微工研条寄第９０６号として寄託
されている）とρＢＲ３２２とから構築される。特開昭
６２−７７３２４参照〕ｊに補正する。 ■　同第９６頁第３行目「（特願昭６２−１６６７１０
参照）」を削除する。 ど ■　同第９６真下から第９行目と８行目との間に次の記
載を加入する。 ｒなお、プラスミドｐｕｃ−ｐＬ−ｔｒｐ　ａは、第３
２図に示すようにして造成されたものである。即ち、マ
ルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ
　５ｉｔｅ：ＭＣ３）をもつプラスミドｐｕｃ　１９　
（宝酒造社製）に、λｃｌ　８５７フアージＤＮＡ　（
宝酒造社製）のレプレッサーｃＩＮ域を挿入したｐＵｃ
−ｃＩプラス、ミドを造成し、次に、これにＰＬプロモ
ーターを導入するため、既に構築していたＴ　　ｈＡＮ
Ｐ遺伝子発現用プラスミドｐＳ２２４−３（特開昭６０
−２６２５９２、発明の名称“新規ＤＮＡおよびその用
途”に開示）のＡａｔ　Ｕ　−ＩＥｃｏＲＩ断片（Ｐｔ
プロモーター領域を含む）を挿入してプラスミドＩ）Ｕ
Ｃ−ＰＬを造成し、さらにこのプラスミドに、粘着末端
にＡｖａＩとＳａｌ■切断部位をもつ化学合成ｔｒｐ　
ａターミネータ−（５’　−ＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＣ
ＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’
３’　−ＧＴＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＣ−５’　）を挿入して得ら
れたプラスミドである。」（２）明細四第１１３頁第１
９行目の次に、下記の記載を加入する。 「第３２図は、Ｉ）ＤＣ−ＰＬ−ｔｒｐａの作製を示す
。」（３）第３２図を追加する。 ７、　添付書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換ＤＮＡ技術により生産されるアフリカツメガエ
   ル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）由来のＣ−末端α−
   アミド化酵素及びその前駆体。 ２、次のアミノ酸配列（ I ）： 【アミノ酸配列があります】 〔式中、Ａは存在しないか、又は次のアミノ酸配列（I
   I）： 【アミノ酸配列があります】 を示し；そしてＢは存在しないか、又は次のアミノ酸配
   列（III）： 【アミノ酸配列があります】 を示す〕 を有する特許請求の範囲第１項に記載のＣ−末端α−ア
   ミド化酵素及びその前駆体。 ３、前記アミノ酸配列（ I ）（式中、Ａ及びＢは存在
   しない）を有する特許請求の範囲第２項に記載のＣ−末
   端α−アミド化酵素。 ４、前記アミノ酸配列（ I ）〔式中Ａはアミノ酸配列
   （II）を示し、そしてＢはアミノ酸配列（III）を示す
   〕を有する特許請求の範囲第２項に記載のプレプロＣ−
   末端α−アミド化酵素。 ５、前記アミノ酸配列（ I ）〔式中、Ａは存在せず、
   そしてＢはアミノ酸配列（III）を示す〕を有する特許
   請求の範囲第２項記載のプレＣ−末端α−アミド化酵素
   。 ６、次のアミノ酸配列（IV）： 【アミノ酸配列があります】 〔式中、Ｃはアミノ酸配列（Ｖ）： 【アミノ酸配列があります】 または次のアミノ酸配列（VI）： 【アミノ酸配列があります】 を示す。但し、式（VI）中ＸはＡｌａまたはＰｒｏであ
   り、ＹはＴｈｒまたはＬｙｓであり、ＺはＡｌａまたは
   Ｇｌｙであり、そしてＤは存在しないか、または次のア
   ミノ酸配列群： （VII）：【アミノ酸配列があります】　 （VIII）：【アミノ酸配列があります】 （IX）：【アミノ酸配列があります】　 （Ｘ）：【アミノ酸配列があります】 のうち、いずれかひとつのアミノ酸配列を示す〕を有す
   る特許請求の範囲第１項に記載のＣ−末端α−アミド化
   酵素。 ７、前記アミノ酸配列（IV）〔この配列中、Ｃは前記ア
   ミノ酸配列（VI）を示し、そしてアミノ酸配列（VI）中
   、ＸはＡｌａ、ＹはＴｈｒ、ＺはＡｌａを示し、そして
   Ｄは前記アミノ酸配列（VII）を示す〕を有する特許請
   求の範囲第６項記載のＣ−末端α−アミド化酵素。 ８、前記アミノ酸配列（IV）〔この配列中、Ｃは前記ア
   ミノ酸配列（VI）を示し、そしてアミノ酸配列（VI）中
   、ＸはＡｌａ、ＹはＴｈｒ、ＺはＡｌａを示し、そして
   Ｄは前記アミノ酸配列（VIII）を示す〕を有する特許請
   求の範囲第６項記載のＣ−末端α−アミド化酵素。 ９、前記アミノ酸配列（IV）〔この配列中、Ｃは前記ア
   ミノ酸配列（VI）を示し、そしてアミノ酸配列（VI）中
   、ＸはＡｌａ、ＹはＴｈｒ、ＺはＡｌａを示し、そして
   Ｄは前記アミノ酸配列（IX）を示す〕 を有する特許請求の範囲第６項記載のＣ−末端α−アミ
   ド化酵素。 １０、前記アミノ酸配列（IV）〔この配列中、Ｃは前記
   アミノ酸配列（VI）を示し、そしてアミノ酸配列（VI）
   中、ＸはＡｌａ、ＹはＴｈｒ、ＺはＡｌａを示し、そし
   てＤは前記アミノ酸配列（Ｘ）を示す〕 を有する特許請求の範囲第６項記載のＣ−末端α−アミ
   ド化酵素。 １１、前記アミノ酸配列（IV）〔この配列中、Ｃは前記
   アミノ酸配列（VI）を示し、そしてアミノ酸配列（VI）
   中、ＸはＡｌａ、ＹはＴｈｒ、ＺはＡｌａを示し、そし
   てＤは存在しない〕 を有する特許請求の範囲第６項記載のＣ−末端α−アミ
   ド化酵素。 １２、前記アミノ酸配列（IV）〔この配列中、Ｃは前記
   アミノ酸配列（VI）を示し、そしてアミノ酸配列（VI）
   中、ＸはＰｒｏ、ＹはＬｙｓ、ＺはＧｌｙを示し、かつ
   Ｄは存在しない〕 を有する特許請求の範囲第６項記載のＣ−末端α−アミ
   ド化酵素。 １３、前記アミノ酸配列（IV）〔この配列中、Ｃは前記
   アミノ酸配列（Ｖ）を示す〕を有する特許請求の範囲第
   ６項記載のＣ−末端α−アミド化酵素。 １４、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉ
   ｓ）由来のＣ−末端α−アミド化酵素又はその前駆体を
   コードするＤＮＡ。 １５、次のアミノ酸配列（ I ）： 【アミノ酸配列があります】 〔式中、Ａは存在しないか、又は次のアミノ酸配列（I
   I）： 【アミノ酸配列があります】 を示し；そしてＢは存在しないか、又は次のアミノ酸配
   列（III）： 【アミノ酸配列があります】 を示す〕 を有するＣ−末端α−アミド化酵素又はその前駆体をコ
   ードする特許請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ。 １６、次の塩基配列（Ｘ I ）： 【塩基配列があります】 〔式中、Ｘは存在しないか、又は次の塩基配列（ＸII）
   ： 【塩基配列があります】 を示し；そしてＹは存在しないか、又は次の塩基配列（
   ＸIII）： 【塩基配列があります】 を示す〕 を有する特許請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ。 １７、次の塩基配列（ＸIV）： 【塩基配列があります】 〔式中、Ｅは塩基配列（ＸＶ）： 【塩基配列があります】 または、次の塩基配列（ＸVI）： 【塩基配列があります】 但し、式（ＸVI）中、ＬはＧＣＴまたはＣＣＴであり、
   ＭはＡＣＧまたはＡＧＧであり、ＮはＧＣＡまたはＧＧ
   Ａであり、そして、Ｆは存在しないか、または次の塩基
   配列群： （ＸVII）：【塩基配列があります】 （ＸVIII）：【塩基配列があります】 （ＸIX）：【塩基配列があります】 （ＸＸ）：【塩基配列があります】 のうち、いずれかひとつの塩基配列を示す〕を有する特
   許請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ。 １８、前記塩基配列（ＸIV）（この配列中、Ｅは前記塩
   基配列（ＸVI）を示し、そして塩基配列（ＸVI）中、Ｌ
   はＧＣＴ、ＭはＡＣＧ、ＮはＧＣＡを示し、そしてＦは
   前記塩基配列（ＸVII）を示す）を有する特許請求の範
   囲第１７項記載のＤＮＡ。 １９、前記塩基配列（ＸIV）（この配列中、Ｅは前記塩
   基配列（ＸVI）を示し、そして塩基配列（ＸVI）中、Ｌ
   はＧＣＴ、ＭはＡＣＧ、、ＮはＧＣＡを示し、そしてＦ
   は前記塩基配列（ＸVIII）を示す）を有する特許請求の
   範囲第１７項記載のＤＮＡ。 ２０、前記塩基配列（ＸIV）（この配列中、Ｅは前記塩
   基配列（ＸVI）を示し、そして塩基配列（ＸVI）中、Ｌ
   はＧＣＴ、ＭはＡＣＧ、ＮはＧＣＡを示し、そしてＦは
   前記塩基配列（ＸIX）を示す）を有する特許請求の範囲
   第１７項記載のＤＮＡ。 ２１、前記塩基配列（ＸIV）（この配列中、Ｅは前記塩
   基配列（ＸVI）を示し、そして塩基配列（ＸVI）中、Ｌ
   はＧＣＴ、ＭはＡＣＧ、ＮはＧＣＡを示し、そしてＦは
   前記塩基配列（ＸＸ）を示す）を有する特許請求の範囲
   第１７項記載のＤＮＡ。 ２２、前記塩基配列（ＸIV）（この配列中、Ｅは前記塩
   基配列（ＸVI）を示し、そして塩基配列（ＸVI）中、Ｌ
   はＧＣＴ、ＭはＡＣＧ、ＮはＧＣＡを示し、そしてＦは
   存在しない）を有する特許請求の範囲第１７項記載のＤ
   ＮＡ。 ２３、前記塩基配列（ＸIV）（この配列中、Ｅは前記塩
   基配列（ＸVI）を示し、そして塩基配列（ＸVI）中、Ｌ
   はＣＣＴ、ＭはＡＡＧ、ＮはＧＧＡを示し、そしてＦは
   存在しない）を有する特許請求の範囲第１７項記載のＤ
   ＮＡ。 ２４、前記塩基配列（ＸIV）（この配列中、Ｅは前記塩
   基配列（ＸＶ）を示す）を有する特許請求の範囲第１７
   項記載のＤＮＡ。 ２５、アフリカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化
   酵素又はその前駆体をコードするＤＮＡを含有するプラ
   スミド。 ２６、ｐｔｒｐＸＡＳＴ８である特許請求の範囲第２５
   項に記載のプラスミド。 ２７、ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８である特許請求の範囲第２
   ５項に記載のプラスミド。 ２８、ｐＸＡ４５７である特許請求の範囲第２５項に記
   載のプラスミド。 ２９、ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９Ｄｒａ I である特許請
   求の範囲第２５項記載のプラスミド。 ３０、ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９ＢｇｌIIである特許請求
   の範囲第２５項記載のプラスミド。 ３１、ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９ＲＶである特許請求の範
   囲第２５項記載のプラスミド。 ３２、ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９Ｓａｌ I である特許請
   求の範囲第２５項記載のプラスミド。 ３３、ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９ＢｓｔＥII＾Ｌである特
   許請求の範囲第２５項記載のプラスミド。 ３４、ｐｔｒｐΔ７９９である特許請求の範囲第２５項
   記載のプラスミド。 ３５、ｐｔｒｐ７９９−４５７Δである特許請求の範囲
   第２５項記載のプラスミド。 ３６、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉ
   ｓ）由来のＣ−末端α−アミド化酵素又はその前駆体を
   コードするＤＮＡを含有するプラスミドにより形質転換
   された組換宿主。 ３７、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＸＡ４５７ＳＢＭ２９１である特許
   請求の範囲第３６項に記載の組換宿主。 ３８、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ８である特許請
   求の範囲第３６項に記載の組換宿主。 ３９、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８である特許
   請求の範囲第３６項に記載の組換宿主。 ４０、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９Ｄｒａ
   I である特許請求の範囲第３６項記載の組換宿主。 ４１、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９ＢｇｌI
   Iである特許請求の範囲第３６項記載の組換宿主。 ４２、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９ＲＶであ
   る特許請求の範囲第３６項記載の組換宿主。 ４３、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９Ｓａｌ
   I である特許請求の範囲第３６項記載の組換宿主。 ４４、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐＵＣＰ＿ＬＣＩ７９９ＢｓｔＥ
   II＾Ｌである特許請求の範囲第３６項記載の組換宿主。 ４５、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐｔｒｐΔ７９９である特許請求
   の範囲第３６項記載の組換宿主。 ４６、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０／ｐｔｒｐ７９９−４５７Δである
   特許請求の範囲第３６項記載の組換宿主。 ４７、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉ
   ｓ）由来のＣ−末端α−アミド化酵素又はその前駆体を
   コードしているＤＮＡを含有しこれを発現せしめること
   ができるプラスミドにより形質転換された宿主細胞を培
   養することにより該酵素又はその前駆体を生成せしめ、
   これを採取することを特徴とするＣ−末端α−アミド化
   酵素又はその前駆体の製造方法。 ４８、宿主細胞が大腸菌である特許請求の範囲第４７項
   に記載の方法。 ４９、組換ＤＮＡ技術により生産されるアフリカツメガ
   エル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）由来のＣ−末端α
   −アミド化酵素を、Ｃ−末端にグリシン残基を有するペ
   プチド又は蛋白質に作用せしめることを特徴とする、該
   グリシン残基を有しないα−アミド化ペプチド又は蛋白
   質の製造方法。