JP2581527B2 - Ｃ−末端α−アミド化酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

Ｃ−末端α−アミド化酵素をコードする遺伝子

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【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換ＤＮＡ技術によって
得られるアフリカツメガエル（Xenopus laevis）由来
のＣ−末端α−アミド化酵素及びその前駆体をコードす
るＤＮＡ、このＤＮＡを含有する発現ベクター、及びこ
の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】一般に、真核細胞において、ある種のペ
プチドまたは蛋白質はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）から翻訳された後、細胞内酵素により、さらに修飾
（ポスト・トランスレーショナル・モディフィケイショ
ン）され、天然型のペプチドまたは蛋白質に成ることが
知られている。しかしながら、現在、組換ＤＮＡ（γ−
ＤＮＡ）技術によって真核細胞由来ペプチドまたは蛋白
質を生産する宿主として広く用いられている大腸菌のよ
うな原核細胞は、ｍＲＮＡ翻訳後のペプチドまたは蛋白
質の修飾を行なうことができない。
【０００３】この真核細胞特有なペプチドまたは蛋白質
の修飾の一つに、ペプチドまたは蛋白質のカルボキシル
基末端（Ｃ−末端）α位がアミド化（−ＣＯＯＨ基を−
ＣＯＮＨ2 基へ変換すること）される修飾反応がある。
すでに、多くの真核細胞由来、生理活性ペプチドまたは
蛋白質にこのような修飾が起っていることが知られてお
り、例えば、カエル体皮よりＣ−末端αアミド化ペプチ
ドとしてＴＲＨ（pGlu-His-Pro-NH2）及びセルレイン
（Ｃａｅｒｕｌｅｉｎ）（pGlu-Gln-Asp-Tyr(SO3H)-Thr
-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2）が単離され、これらのペプ
チドの前駆体構造の一部についても、ｃＤＮＡの解析か
ら明らかになっている。
【０００４】一方、一般にこれらアミド化ペプチドの生
合成機構はまずアミド化ペプチド前駆体がｍＲＮＡより
翻訳された後、Ｃ−末端α−アミド化酵素により、Ｃ−
末端α−アミドペプチド前駆体のＣ−末端α−位がアミ
ド化されることが判ってきている。なお、この反応にお
けるＣ−末端α−アミド化酵素の基質となるＣ−末端α
−アミドペプチド前駆体とは一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（式
中、Ｒはペプチドまたは蛋白質のＮ−末端部分の任意の
アミノ酸配列であり、ＸはＣ−末端α−アミド化される
任意のアミノ酸残基を示しＧｌｙはグリシン残基を示
す）で表されるペプチド及び蛋白質である。
【０００５】さらに、しばしばこの修飾はこれらペプチ
ドまたは蛋白質の生理活性に必須であることが知られて
いる。一例を示せば、ヒト・カルシトニンの場合、天然
型のＣ−末端プロリンアミド残基をプロリン残基に変換
すると、生理活性が１６００分の１にも減少する。
【０００６】近年、真核細胞由来ペプチドまたは蛋白質
のＣ−末端α−アミド化の機構を明らかにすることの重
要性に加えて、大腸菌などの原核細胞を宿主とするペプ
チドまたは蛋白質のＣ−末端α−カルボキシル基をアミ
ド化する手段としても、Ｃ−末端α−アミド化酵素が注
目され、この酵素の精製・物理化学的解析が試みられて
いる。１９８２年、Bradburyらにより、この酵素が、ブ
タ下垂体中に存在することが報告された。彼らは、基質
として合成ペプチドD-Tyr-Val-Gly を用い、これがD-Ty
r-Val-NH2 に変換されること、及びＣ−末端のＧｌｙが
アミドの窒素（Ｎ）の供与体として必須であることを示
した（Bradbury, A.F.等；Nature, 298, 686-688, 1982
）。
【０００７】Eipperらは、この酵素活性がラット下垂体
の前葉、中葉および後葉に存在していることを報告し、
この酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状酸素の
外に、銅イオン（Ｃｕ2+）とアスコルビン酸が必要であ
ると報告した（Proc.Natl.Acad.Sci., US, 80, 5144-5
148, 1983 ）。又、この報告も含め、種々の組織から、
ペプチドまたは蛋白質のＣ−末端α−アミド化酵素の精
製が試みられていたが、単一で純粋な状態にまで精製さ
れた酵素が得られた例はこれまでに報告されていない
（Husain, I,等、FEBS Letter.152 , 227-281, 1983 ；
Kizer, J.S. 等、Proc.Natl.Acad.Sci, US, 81, 3228-3
232, 1984 ；Murthy, A.S.N.等、J.Biod.Chem.261 , 18
15-1822, 1986 等）。
【０００８】最近Mizuno等らはアフリカツメガエル（Xe
nopus laevis）の体皮より、Ｃ−末端α−アミド化酵
素を単一で純粋な状態まで精製することに成功した（Mi
zuno, K 等、Biochem.Biophys.Res.Commun. 137 , 984-
991, 1986 、および特願昭６１−１３１０８９）。しか
し、このような方法で単一で純粋な状態にまで精製した
酵素でも、酵素の工業的コストが高く、Ｃ−末端α−ア
ミド化ペプチドまたは蛋白質の大量生産に適用すること
はできない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は組換
ＤＮＡ技術により得られるＣ−末端α−アミド化酵素、
および該酵素の組換ＤＮＡ技術による工業的製造法を提
供することを最終目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、アフ
リカツメガエル由来のＣ−末端α−アミド化酵素又はそ
の前駆体をコードしているＤＮＡ、このＤＮＡを含有す
る発現ベクター、及びこの発現ベクターにより形質転換
された宿主細胞を提供するものである。
【００１１】
【具体的な説明】本発明者らは、アフリカツメガエル
（Xenopus laevis）の体皮より、Ｃ−末端α−アミド
化酵素を単一で純粋な状態まで精製し、この酵素のアミ
ノ酸配列の一部を明らかにした。さらにこの酵素の部分
アミノ酸配列を基に、ＤＮＡプローブ（ｐｒｏｂｅ）を
作製、このＤＮＡプローブを用い、アフリカツメガエル
体皮より作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることにより、Ｃ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡ
の単一クローンを得ることに成功した。又このｃＤＮＡ
塩基配列を明らかにすることにより、アフリカツメガエ
ル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素の全アミノ酸一次
配列（図６〜図８参照）及び前駆体（プレ体図９〜図１
１、プレプロ体図１２〜図１４参照）の構造を明らかに
した。次に、このｃＤＮＡを大腸菌内で大量に発現させ
ることに成功し、本酵素を大量かつ安価に供給する方法
を開発した。
【００１２】一方、前記のごとく、カエルの体皮にはＣ
−末端α−アミド化ペプチドとして少なくともＴＲＨ及
びセレインが存在することが知られており、これが前記
酵素一種のみで生合成されているかは明らかではない。
いいかえれば前記酵素以外にも生体内には同様な活性を
示す酵素が存在しており、個々のＣ−末端α−アミド化
ペプチド又は蛋白質は、各々、別々のＣ−末端α−アミ
ド化酵素により生合成されている可能性があり、Ｃ−末
端α−アミド化酵素にも多様性があることが考えられ
る。
【００１３】そこで、前記のＣ−末端α−アミド化酵素
のｃＤＮＡをプローブとして使用し、アフリカツメガエ
ル由来のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリー
を再スクリーニングすることにより、前記のＣ−末端α
−アミド化酵素と同様の活性を有するがしかしそのアミ
ノ酸配列が明らかに異なる酵素を見出し、前記と同様に
してその発現に成功した。さらに、このようにして製造
した酵素を用い、グリシン残基をＣ−末端とするペプチ
ドまたは蛋白質を基質として、Ｃ−末端α−アミド化ペ
プチドまたは蛋白質を生成させる技術を開発した。
【００１４】本発明におけるＣ−末端α−アミド化酵素
とは、式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで表わされるペプチドまたは蛋
白質（式中、Ｒはペプチドまたは蛋白質のＮ−末端部分
の任意のアミノ酸配列であり、ＸはＣ−末端α−アミド
化されるアミノ酸残基であり、Ｇｌｙはグリシン残基を
示す。以下同じ）をアミド化、すなわち式Ｒ−Ｘ−ＣＯ
ＮＨ2 （式中Ｒはペプチドまたは蛋白質のＮ−末端部分
の任意のアミノ酸配列であり、Ｘ−ＣＯＮＨ2 はＣ−末
端α−カルボキシル基がアミド化されたアミノ酸残基を
示す。以下同じ）に変換する酵素をいう。
【００１５】また、アフリカツメガエル由来のＣ−末端
α−アミド化酵素とは、前記の活性を有しアフリカツメ
ガエル中に存在する酵素、及び前記の活性が失われない
程度に天然酵素のアミノ酸が、置き換え、追加、又は除
去により変更されているものを意味する。この様な変更
を含むアミノ酸配列を、本発明においては「実質的に同
一」なアミノ酸配列という。本発明はさらに、Ｃ−末端
アミド化に関与する蛋白質の一部分であって、Ｃ−末端
アミド化に関与することができるフラグメントをも包含
する。以下本発明を具体的に説明する。
【００１６】（１）Ｃ−末端α−アミド化酵素の精製お
よび酵素の部分アミノ酸配列の決定 アフリカツメガエルの体皮よりMizuno等の方法（Mizun
o, K et al. Biochem.Biophys.Res.Commun.137 , 984-9
91, 1986 ）に準じＣ−末端α−アミド化酵素を均一な
状態に精製する（以下、この酵素をNative enzyme とい
う）。すなわち、この体皮を適当な緩衝液を用いて洗浄
した後物理的手段を用いて破砕して酵素を溶出させ、こ
の溶出液から常法に従い酵素を回収・精製する。
【００１７】次にこの酵素をトリプシンで分解し、得ら
れるペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）により分画精製する。次に各トリプティッ
クフラグメントのアミノ酸配列をプロテインシークエン
サーを用いて決定する。一方、Native enzyme のＮ−末
端アミノ酸配列については、精製した酵素をそのままプ
ロテインシークエンサーに供することにより決定する
（図１５参照）。
【００１８】（２）Ｃ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡ
の単離 アフリカツメガエルの体皮より、常法に従い、全ＲＮＡ
を調製、続いて、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロースカラム
を用い、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを調製する。次に、ここ
で得られたｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを用い、Gubler. 等の
方法（Gubler,U.及びHoffman, B.J., Gene 25, 263, 19
83 ）に従い、ｃＤＮＡを作製、続いてこのｃＤＮＡを
大腸菌Ｋ１２株由来ＤＨ１にトランスフェクションする
ことによりアフリカツメガエルの体皮由来のｃＤＮＡラ
イブラリーを作製する。
【００１９】次に、ここで得られたｃＤＮＡライブラリ
ーにより目的とするＣ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡ
を単離する為に、本酵素の部分アミノ酸配列（例えばＴ
−１１，Ｔ−３０、図１５参照）を基に、このアミノ酸
配列に対応するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ混合プロー
ブ（例えばＹＳＯ１２，ＹＳＯ１３，ＹＳＯ１５など、
図１６参照）として作製する。次に、各ＤＮＡ混合プロ
ーブの５′末端を〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ／Ｔ4 ポリヌクレ
オチドキナーゼを用い放射標識した後、このＤＮＡ混合
プローブを用い、前記、大腸菌Ｋ１２株由来ＤＨ１のｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、
アフリカツメガエル体皮から精製したＣ−末端α−アミ
ド酵素に対応する単一なｃＤＮＡクローン、例えばＤＨ
１／ｐＸＡ４５７を得ることができる。
【００２０】さらに、このＣ−末端α−アミド化酵素ｃ
ＤＮＡを含むプラスミドのＤＮＡフラグメント、例えば
図１に示すｐＸＡ４５７の塩基配列５４番目のＣから７
９５番目のＧまでのＰｖｕIIＤＮＡフラグメントを〔α
−32Ｐ〕ＣＴＰを用いニックトランスレーションで放射
標識し、このようにして調製したＤＮＡプローブを用
い、前記、大腸菌Ｋ１２株由来ＤＨ１のｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、前記のものと
は異る単一なＣ−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡクロ
ーン、例えばＤＨ１／ｐＸＡ７９９を得ることができ
る。
【００２１】（３）Ｃ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡ
の解析 得られた単一クローンより常法に従いプラスミド、例え
ばｐＸＡ４５７を単離し、種々の制限酵素で切断して、
ｃＤＮＡの制限酵素地図を作成する（図１７（ａ）参
照）。次に、このｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を決定する
為に、まず種々の制限酵素で切断したｃＤＮＡ断片をＭ
１３ファージにサブクローニングし、各クローンのｃＤ
ＮＡ部分のＤＮＡ塩基配列をSanger等の方法（Sanger
F. et al. Proc.Natl.Acad.Sci, U.S.A. 34, 5463-5467
(1977)〕により決定する（図１７（ｂ）参照）。
【００２２】このｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、
このｃＤＮＡには、１）塩基配列第１位から始まり、１
２００位で終る一個の長いオープンリーディングフレー
ムが存在し、２）このオープンリーディングフレームで
予測されるアミノ酸の一次配列は、Ｎ−末端のMet-Ala-
Ser で始まりＣ−末端のSer-Ala-Val で終る４００アミ
ノ酸残基より構成されており、そして３）このオープン
リーディングフレームで予測されるアミノ酸一次配列
は、前記したNative enzyme の部分アミノ酸配列（図１
５の各トリプテックフラグメントのアミノ酸配列）をす
べて含んでいることが明らかになった。
【００２３】これらの結果よりｐＸＡ４５７は本酵素の
ｃＤＮＡの蛋白質翻訳部分を完全に含んでいるプラスミ
ドであった。次に、すでにNative enzyme のＮ−末端ア
ミノ酸配列はSer-Leu-Ser-Asn-Asp であることが本酵素
の蛋白質レベルでの解析から明らかになっており（図１
５参照）、このアミノ酸配列は、ｃＤＮＡから予想され
るＮ−末端、Ｍｅｔ（−３７）（数字は、図１におい
て、塩基配列番号１１２〜１１４に対応するＳｅｒを１
番目とした時の３′末端側へのアミノ酸配列番号を示
し、数字の前に−がある時は塩基配列番号１０９〜１１
１に対応するＡｒｇを−１番とした時の５′末端側への
アミノ酸配列番号を示す。以下同じ）から数えて３８番
目、つまり、Ｓｅｒ（１）以後のアミノ酸配列に対応し
ていることが判った。
【００２４】したがって、ｃＤＮＡが予測されるＮ−末
端のＭｅｔ（−３７）から３７番目のＡｒｇ（−１）ま
でのアミノ酸配列は他の多くの分泌（ｓｅｃｒｅｔｉｏ
ｎ）蛋白質でその存在及び機能が明らかにされている蛋
白質の膜分泌に必要なシグナルシークエンス（signal s
equence ）様機能をはたしていることが予測される（図
１下線部参照）。これより、Native enzyme のＮ−末端
は、まずＭｅｔ（−３７）から翻訳された後シグナルペ
プチターゼ又は他のプロセッシング酵素によりＭｅｔ
（−３７）からＡｒｇ（−１）までの３７個のアミノ酸
より成るペプチド部分が切断されて生ずることが判っ
た。
【００２５】一方、ｃＤＮＡの解析から予測されるNati
ve enzyme のＣ−末端アミノ酸配列は-Ser-Ala-Val-OH
であるが、Native enzyme の蛋白質レベルでのＣ−末端
アミノ酸配列は決定されていなかった。そこで本発明者
らは、Native enzyme のＣ−末端構造を明らかにする為
に以下に述べる解析と実験を行なった。
【００２６】まず、Native enzyme のＮ−末端アミノ酸
配列がSer-Leu-Ser であることが決定されているので本
酵素のＣ−末端がｃＤＮＡから予測されるSer-Ala-Val-
OHであれば、Native enzyme のアミノ酸一次配列から予
測される理論分子量（ＭＷ）は４０１１４となり、アフ
リカツメガエルより単離精製したNative enzyme のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分子量約３９０００と比較し、やや
分子量が大きい。
【００２７】又、Native enzyme のアミノ酸組成は表１
に示すごとく決定されており、これをｃＤＮＡから予測
される理論アミノ酸組成と比較するとNative enzyme は
グルタミン酸残基が４〜５個、ロイシン残基が３個分、
理論値に比較して少ないことが判った。一方、ｃＤＮＡ
から予測される本酵素のＣ−末端近傍のアミノ酸配列中
にはLys(344)-Arg(345) 配列が存在しており、このアミ
ノ酸配列は、すでに多くの生理活性ペプチドの前駆体か
らMature peptideが生成される際、ある種のプロセッシ
ング酵素（プロテアーゼ）認識部位となっており、この
部位が切断されることにより、前駆体から成熟ペプチド
が生合成されることが知られていることから、Native e
nzyme においてもｃＤＮＡで予測されるＣ−末端近傍の
Lys(344)-Arg(345) 配列間が切断されることによりNati
ve enzyme が生じている可能性が高い。
【００２８】この可能性はさらに、もし、ｃＤＮＡから
予測される本酵素のＣ−末端近傍１）アミノ酸組成値が
よりNative enzyme のアミノ酸組成値に近くなる。２）
理論ＭＷ値がNative enzyme の実測値とほぼ一致する。
３）Native enzyme のトリプテックフラグメントＴ−９
のアミノ酸配列がH-Asn-Thr-Gly-Leu-Gln-Gln-Pro-Lys-
OHであり、Asn(337)-Thr(338)-Gly(339)-Leu(340)-Gln
(341)-Gln(342)-Pro(343)-Lys(344) に相当することが
確認されている事実などからも裏付けされる。
【００２９】そこで、本発明者らはこの可能性を実験的
に証明する為に、まず、１）本酵素のｃＤＮＡ上、ｃＤ
ＮＡ（１１２〜１２００）（数字は図１〜図４における
ｃＤＮＡ塩基配列番号を示す）と、ｃＤＮＡ（１１２〜
１１４３）にコードされている蛋白質をそれぞれ大腸菌
内で発現させ、２）大腸菌内で発現させたおのおのの蛋
白質とNative enzyme とのＭＷをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用
い比較検討し、３）大腸菌内で発現させたおのおのの蛋
白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、さらに目的蛋白質を
ゲルよりそれぞれ単離し、これらの蛋白質のアミノ酸組
成を測定し、これらの値をNative enzyme のアミノ酸組
成値と比較検討した。その結果は、後記実施例９に示す
ようにNative enzyme のアミノ酸一次配列とｐＸＡ４５
７ｃＤＮＡ（１１２〜１１４３）にコードされているア
ミノ酸一次配列は同一のものであることを強く示唆する
ものであった（表１、図２４（ｂ）参照）。
【００３０】同様にして、最初のｃＤＮＡをプローブと
して得られた第２の単一なクローンからも、プラスミ
ド、例えばｐＸＡ７９９を単離し、ｃＤＮＡの制限酵素
地図を作成してそのｃＤＮＡ部分の塩基配列を決定す
る。その結果を図２６〜図３２に示す。この配列を解析
した結果、次のことがわかった。
【００３１】１）まず、このｃＤＮＡは図２６〜図３２
に示す塩基番号１から始まり２６２５までの領域に、８
７５アミノ酸残基より成る蛋白質をコードする長いオー
プンリーディングフレームが存在していることが判っ
た。尚、このオープンリーディングフレームにおいて、
ｃＤＮＡの５′末端−１８から−１６に蛋白質の翻訳終
了コドンＴＡＡが存在することから、図２６の塩基配列
番号１から３にコードされているメチオニンが、この蛋
白質の翻訳開始コドンである。
【００３２】２）図３５に示す様に、ｐＸＡ７９９のＤ
ＮＡにコードされている蛋白質のアミノ酸一次配列を、
ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡにコードされるＣ−末端α−ア
ミド化酵素プレプロ体のアミノ酸一次配列と比較する
と、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質
のＮ−末端部分（アミノ酸配列番号−３７から３５０）
はｐＸＡ４５７と非常に似ていることが判る。尚、注目
すべき点は、このアミノ酸一次配列ホモロジーは、ｐＸ
Ａ４５７のｃＤＮＡにコードされているＣ−末端α−ア
ミド化酵素前駆体のプロセッシング（前駆体のＮ−末
端、Ｃ−末端の切断）部位においても保持されているこ
とである。
【００３３】３）しかし本発明におけるｐＸＡ７９９の
ｃＤＮＡによりコードされている蛋白質が最初に得たｐ
ＸＡ４５７のｃＤＮＡにコードされている蛋白質と最も
異なる点は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされてい
る蛋白質のＮ−末端部分はｐＸＡ４５７のｃＤＮＡにコ
ードされている蛋白質のそれと非常に類似しているが、
Ｃ−末端部分の構造は全く異る（ｐＸＡ７９９のｃＤＮ
Ａには３′末端側に長いリーディングフレームが存在す
る）ことである。
【００３４】４）このＣ−末端部分の構造は、アミノ酸
一次配列の解析から、次の様に予測される。まず、ｐＸ
Ａ７９９のｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列に
はAsn-X-Ser 配列（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）が
３ヶ所見い出され（図２９〜図３１におけるアミノ酸配
列番号４２６−４２８，６２３−６２５，７０４−７０
６）、このアミノ酸配列はすでに多くの糖蛋白質の解析
からＮ−グリコシデーション部位であることが判ってい
ることから、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされてい
る蛋白質も、生体内ではこの位置でＮ−グリコシデーシ
ョンされている可能性が高い。
【００３５】５）さらに、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡによ
りコードされるアミノ酸配列のアミノ酸配列番号７２７
−７４８には疎水性アミノ酸が連なる領域が存在し、し
かも、この領域の直後に塩基性アミノ酸（アルギニン、
リジン残基）が存在している。これと同様な構造は、す
でにレセプターをはじめとする多くの膜蛋白質におい
て、これらの蛋白質が生体膜を通過する領域（transmen
bran domain ）で見い出されていることから、ｐＸＡ７
９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質は生体内で膜
蛋白質として存在している可能性が高い。
【００３６】以上述べた、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ解
析、及びこれにコードされている蛋白質のアミノ酸一次
配列の解析結果を総合すると、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
にコードされる蛋白質は、前記ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡ
にコードされているＣ−末端α−アミド化酵素とは明ら
かにその構造が異なることが判った。しかし、現在まで
のところ、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡから予測される蛋白
質はアフリカツメガエルから単離、精製されていない。
【００３７】したがって、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡから
予測される蛋白質の生合成機構（Ｎ−末端及びＣ−末端
の切断、糖鎖の付加の有無）、この蛋白質の生体内での
存在場所、および、この蛋白質の機能（Ｃ−末端α−ア
ミド化酵素活性を有しているか）、などの点については
不明である。そこで本発明者らはこれらの点を明らかに
する目的で、後記、実施例で示すごとく、ｐＸＡ７９９
のｃＤＮＡを用い、このｃＤＮＡにコードされている蛋
白質及び、その誘導体を大腸菌で発現させ、この様にし
て得た個々の蛋白質のＣ−末端α−アミド化酵素活性を
測定した。
【００３８】さらに詳しくは、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
の解析の結果を、ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡの解析の結果
及びこれに対応する天然由来酵素のＮ−末端アミノ酸配
列の結果と対応させて検討した場合、図２６に示すアミ
ノ酸配列番号−３９から−１のペプチドは酵素蛋白質が
生合成される過程で分泌に必要なシグナルペプチドであ
り、生合成の過程で−１のアミノ酸と１のアミノ酸との
間で切断されるものと予想される。従って、ｐＸＡ７９
９のｃＤＮＡによりコードされている蛋白質に対応する
成熟蛋白質は図２６中のアミノ酸番号１から始まり、Ｎ
−末端はH-Ser-Leu-Ser-Asn-Asp-…である。
【００３９】しかし、この蛋白質のＣ−末端部分に関す
る生合成機構において、糖鎖の付加、Ｃ−末端部分での
切断反応などの翻訳後修飾の有無、及び、これらの反応
により生成された蛋白質がＣ−末端α−アミド化酵素活
性にどのように関与しているかは不明であった。この点
については、まずｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされ
ている蛋白質を微生物（特に大腸菌）内で発現させるに
あたり、Ｎ−末端は図２６に示すアミノ酸番号１、すな
わちH-Ser-Leu-Ser-Asn-Asp-…に固定し、Ｃ−末端をｐ
ＸＡ７９９のｃＤＮＡから明らかにされたアミノ酸番号
８３６、すなわち-Pro-Pro-Val-Ser-Ser-Ser-OH までの
蛋白質の発現、続いてＣ−末端部分のアミノ酸配列を削
除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）した蛋白質（ｐＸＡ７９９蛋白
質誘導体）を種々発現させることにより確認する。
【００４０】図３６にこれらの蛋白質の略図及びこれら
を発現させる為に用いたプラスミド名を記す。尚、ｐＸ
Ａ７９９のｃＤＮＡにコードされているｐＸＡ７９９蛋
白質誘導体については、発現プラスミド構築の際にマル
チクローニングサイトを導入するためにこれらのＣ−末
端アミノ酸配列がｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ由来でない場
合があり、これらについては個々の誘導体についてアミ
ノ酸配列が異なっている部分を示した。
【００４１】（４）Ｃ−末端α−アミド化酵素の宿主細
胞での発現 ｐＸＡ４５７にコードされているＣ−末端α−アミド化
酵素を宿主細胞（例えば大腸菌）内で発現させる為に発
現ベクター（例えば、ｐｔｒｐＸＡＳＴ８及びｐｔｒｐ
ＸＤＡＳＴ８）を作製する。この発現ベクター系は、い
ずれもｃＤＮＡが宿主細胞（例えば大腸菌）トリプトフ
ァン・オペロン（プロモーター、オペレーター及びトリ
プトファンリーダーペプタイドのShine-Dalgarnoシーク
エンス）支配下に発現されるようデザインされている。
次に宿主細胞（例えば大腸菌Ｗ３１１０）へ形質転換
し、目的とする発現菌（例えばＷ３１１０／ｐｔｒｐＸ
ＡＳＴ８、及びＷ３１１０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８）を
得る。
【００４２】また、ｐＸＡ７９９由来ｃＤＮＡコードさ
れているＣ−末端α−アミド化酵素を発現させる場合も
発現ベクター（例えば、ｐＵＣＰL ＣＩ７９９Ｄｒａ
Ｉ，ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｇｌII，ｐＵＣＰL ＣＩ７
９９ＲＶ，ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＳａｌＩ，ｐＵＣＰL
ＣＩ７９９ＢｓｔＥIIL ，ｐＵＣＰL ＣＩ７９９Ｂｓｔ
ＥIIS ，ｐｔｒｐΔ７９９、および、ｐｔｒｐ７９９−
４５７Δ等）を作製する。これらの発現ベクター系は、
ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質及
び、この誘導体蛋白質がλファージ由来ＰＬプルモータ
ー（ｐＵＣＰL ＣＩシリーズ）か大腸菌トリプトファン
プロモーター（ｐｔｒｐシリーズ）支配下に発現される
ようデザインされている。
【００４３】次にこれらの発現ベクターを宿主細胞（例
えば大腸菌Ｗ３１１０）へ形質転換し、目的とする発現
菌（例えば、Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９Ｄｒａ
Ｉ，Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｇｌII，Ｗ３
１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＲＶ，Ｗ３１１０／ｐＵ
ＣＰL ＣＩ７９９ＳａｌＩ，Ｗ３１１０／ｐＵＣＰLＣ
Ｉ７９９ＢｓｔＥIIS ，Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７
９９ＢｓｔＥIIL ，Ｗ３１１０／ｐｔｒｐΔ７９９およ
びＷ３１１０／ｐｔｒｐ７９９−４５７Δ）を得る。
【００４４】次に、これらの株菌及びＷ３１１０を培
養、集菌後、各菌株の全蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）
で解析した結果、Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ８、及
びＷ３１１０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８は対照のＷ３１１
０の全蛋白質に比べそれぞれ分子量約４０Ｋと分子量約
３８Ｋを示す特異的な蛋白質を発現していることが判っ
た。又、他の菌株も目的の蛋白質を発現していることが
わかった。このようにして発現された蛋白質は通常用い
られる破砕法（超音波処理又はフレンチプレス破砕法）
でいずれも大部分が沈澱画分に回収される。
【００４５】（５）酵素活性の測定 組換宿主細胞において発現させた蛋白質がＣ−末端α−
アミド化酵素であることの確認、およびＣ−末端α−ア
ミド化酵素を基質に作用させた時のアミド化ペプチドま
たは蛋白質の生成の確認をするために、Ｃ−末端α−ア
ミド化酵素活性を測定する。測定には、特に大腸菌で発
現させた場合、菌体破砕後、大部分は沈澱画分に回収さ
れるので、この沈澱画分を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化
した後、塩酸グアニジン溶液で透析して調製した試料を
用いる。
【００４６】一般にＲ−Ｘ−Ｇｌｙで表わされる基質ま
たは発現したアミド化ペプチドおよび蛋白質を用い、こ
れがＲ−Ｘ−ＣＯＮＨ2 に変換する反応（例えば合成基
質〔125Ｉ〕-Ac-Tyr-Phe-Gly が〔 125Ｉ〕-Ac-Tyr-Phe
-NH2 に変換する反応）により測定することができる。
すなわち、まず標識基質（標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ）をトリ
ス塩酸バッファー中で被験酵素液と反応させる。これに
トリス塩酸バッファーと酢酸エチルを加え、混合後、遠
心分離して有機溶媒層と水層を分離する。
【００４７】ここで未反応標識基質（標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌ
ｙ）の大部分が水層に、アミド化された標識基質（Ｒ−
Ｘ−ＣＯＮＨ2 ）が有機溶媒層に移行するために両者を
容易に分離することができる。Ｃ−末端アミド化生成物
への変換率は、総放射能活性に対する有機溶媒層の放射
能活性の比から求めることができる。測定法において、
１時間当り、１pmolの標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ（基質）が標
識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ2に５０％変換する酵素活性を１ユ
ニットと定義する。
【００４８】被験酵素液として、アフリカツメガエル体
皮の粗抽出物を用いた場合の酢酸エチル層の放射能活性
は、マイクロボンダパックＣ−１８（μBondapak C-18,
Waters 社）の逆相ＨＰＬＣを用いて溶出した画分につ
いて測定する。溶出は１０mMギ酸アンモニウム（pH４．
０）の、１０〜５０％ＣＨ3 ＣＮ直線濃度勾配で行な
う。放射能活性のピークは、同じ条件で溶出されるＲ−
Ｘ−ＣＯＮＨ2 構造をもつ標準ペプチドと同一の位置に
現われ、標識Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙが標識Ｒ−Ｘ−ＣＯＮＨ2
に変換され、発現した蛋白質がＣ−末端α−アミド化酵
素活性をもつことが確認できる。
【００４９】尚、本発明の実施例においては、Ｃ−末端
α−アミド化酵素の基質として合成基質を用いている
が、これに限らずＲ−Ｘ−Ｇｌｙの構造をもつペプチド
または蛋白質であれば天然由来の、または組換ＤＮＡ技
術により生成されたペプチドまたは蛋白質であっても構
わない。すなわち、本発明におけるＣ−末端α−アミド
化酵素をＲ−Ｘ−Ｇｌｙの構造をとるペプチドまたは蛋
白質に作用させれば、ペプチドまたは蛋白質の生理活性
に重要であるＣ−末端α−カルボキシル基をアミド化す
る手段として非常に有効であり、生理活性物質の製造が
容易になる。
【００５０】本発明はアフリカツメガエルの体皮由来の
Ｃ−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡ構造を明らかにし
たが、すでに他の多くの動物組織にも同様な活性をもつ
酵素の存在が指摘されている。しかしいずれもアフリカ
ツメガエルの酵素と同様、酵素活性発現にＣｕ++イオン
が必須であること、ジチオスレイトールなどのチオール
化合物により反応が阻害されること、アスコルビン酸が
存在しないと酵素活性が低下すること、および分子酸素
の存在が必須であることから、このＣ−末端α−アミド
化酵素の活性部位構造（active domain ）のアミノ酸配
列は保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅ）ことが予測さ
れる。したがって、ここで得られたｃＤＮＡをプローブ
として、他の動物組織のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡか
ら、本発明におけるＣ−末端α−アミド化酵素と同様な
酵素を単離できる。
【００５１】なお、この発明の方法と同様にして、他の
動物組織のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡより作製したｃＤＮＡ
ライブラリー、又はゲノムライブラリーから新規Ｃ−末
端α−アミド化酵素ｃＤＮＡを得ることができる。ま
た、本発明においてはこのようにして得た、Ｃ−末端α
−アミド化酵素ｃＤＮＡを用い、このｃＤＮＡにコード
されている蛋白質及び種々の誘導体の大量生産方法の一
つとして、組織ＤＮＡ技術を用いた大腸菌内で大量発現
させる方法を示したが、本発明におけるｃＤＮＡを用い
れば、他の宿主細胞、例えば酵母や動物細胞を用いて前
記した同様な蛋白質を大量生産させることができる。
【００５２】さらに、本発明の実施例に示す、新規Ｃ−
末端α−アミド化酵素の種々の誘導体は、いずれもＣ−
末端α−アミド化活性を示すことから、本発明で示した
方法で取得したｃＤＮＡを用いれば、ｃＤＮＡ上にコー
ドされている蛋白質そのものを、遺伝子操作で種々の宿
主細胞で発現しなくても、これらの誘導体例えば、Ｃ−
末端変換体、アミノ酸置換体等作製し；これらの蛋白質
を用いて一般式Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙで示されるペプチド又は
蛋白質をＲ−Ｘ−ＣＯＮＨ2 に変換することができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
【００５３】実施例１．アフリカツメガエル体皮由来Ｃ
−末端α−アミド化酵素（Native e nzyme ）の部分アミ
ノ酸配列及びアミノ酸組成 アフリカツメガエル体皮由来Ｃ−末端α−アミド化酵素
の精製は、Mizuno.K等の方法に従って実施した（Mizun
o.K等、Biochem, Biophys.Res.Commun.137 , 984-991,
1986 ）。すなわち、酵素溶出液を遠心分離して不溶物
を除去し、得られた上清に硫酸アンモニウムを添加し、
８０％飽和として酵素を塩析した後、遠心分離により沈
澱物として回収した。この沈澱を適当な溶媒に溶解して
透析後、ＤＥＡＥセルロースＤＥ−５２カラムクロマト
グラフィーのリン酸ナトリウムバッファー直線濃度勾配
で溶出した。
【００５４】次に溶出液の活性画分をアフィジェルブル
ーカラムによるアフィニティークロマトグラフィーにお
いてＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。活性画分を
セファクリルＳ−３００でゲル濾過した後、ヒドロキシ
ルアパタイトにより精製すると２つの活性画分を得られ
た。このうち、主活性画分をさらにハイパフォーマンス
ヒドロキシルアパタイトで精製した後、Ｓｕｐｅｒｏｓ
ｅ１２によりゲル濾過して、Ｃ−末端アミド化酵素の最
終精製品が得られた。この酵素は上記文献でＡＥ−Ｉと
命名されているが本特許においてはこのものをNative e
nzyme と記す。
【００５５】（１）Native enzyme のＮ−末端アミノ酸
配列の決定 Native enzyme のＮ−末端アミノ酸配列はNative enzym
e １２μｇをAppliedBiosystems社プロテインシークエ
ンサー４７０Ａに供し、自動エドマン分解法により行な
った。この結果、Native enzyme のＮ−末端アミノ酸配
列はSer-Leu-Ser-Asn-Asp-X-Leu-Gly-Thr-Arg-Pro-Val-
Met-Ser-と決定された（図１５参照）。なお、Ｘはフェ
ニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸として検出で
きなかったことからＣｙｓ残基と推定される。
【００５６】（２）Native enzyme トリプテックフラグ
メントのアミノ酸配列の決定 Native enzyme ４０μｇを２０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ（pH８．０）−２mM ＣａＣｌ2 に溶液に溶
し、０．５μｇのトリプシンを加え３７℃２時間反応し
た後、さらに０．５μｇのトリプシンを加え３７℃２０
時間反応させることによりNative enzyme をトリプシン
分解した。次の反応液をChemcosorb 3 ODS-Hカラム（ケ
ムコ社製８．０×７５mm）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、Native enzyme のトリプ
シン分解で生じたトリプテックフラグメントを０．１％
ＴＦＡと０．１％ＴＦＡ−６０％ＣＨ3 ＣＮを用いたＣ
Ｈ3ＣＮの直線濃度勾配で溶出、分離した。
【００５７】この様な方法で分離、精製したトリプテッ
クフラグメントの内Ｔ−４，Ｔ−６，Ｔ−８，Ｔ−１
１，Ｔ−９，Ｔ−１０，Ｔ−１８，Ｔ−２２，Ｔ−２
３，Ｔ−２４，Ｔ−３０，Ｔ−３５，Ｔ−３９，Ｔ−４
５、１４個のトリプテックフラグメントのアミノ酸配列
をNative enzyme のＮ−末端アミノ酸配列を決定したの
と同様な方法を用いて決定した（図１５参照）。
【００５８】（３）Native enzyme のアミノ酸組成 Native enzyme のアミノ酸分析は、Native enzyme 約１
０μｇを、減圧封管中、６Ｎ塩酸１１０℃２４時間反応
させた後、日立８３５−５０型アミノ酸分析機を用いて
行なった。この結果を表１に示す。
【００５９】実施例２．アフリカツメガエル体皮よりｐ
ｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡの調製 （１）全ＲＮＡの調製 １６匹のアフリカツメガエルより体皮６４ｇを取り、体
皮２ｇにつきＰＣ９〔フェノール：ＣＨＣｌ3 ：イソア
ミルアルコール＝２４：２４：１（１０mM Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ pH９．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴ
Ａで飽和）〕１０mlとＮＥＴＳ溶液（１００mM Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ pH９．０、１００mM ＮａＣｌ、１０mM
ＥＤＴＡ、５％ＥＤＳ）１０mlを加え、ポリトロンを用
い、細胞を破壊し、１０分間室温放置後、さらにポリト
ロン処理を行った。
【００６０】次に３Krpm、３０分間室温遠心を行った
後、水層を分取し、同量のＣＩＡＡ（ＣＨＣｌ3 ：イソ
アミルアルコール＝４９：１）を加え、撹拌後、３Krp
m、３０分間室温で遠心を行った。遠心後水層を分取
し、ＣＩＡＡ処理をくり返した。得られた水層に２倍量
のエタノールを加え、−２０℃にて一夜エタノール沈澱
を行った。３Krpm、３０分間、４℃で遠心後、上清を除
去し、エタノール沈澱を８０％エタノール溶液で洗った
後、真空下沈澱を乾燥した。この沈澱に体皮２ｇにつき
２mlのグアニジンチオシアネート溶液（４．２Ｍグアニ
ジンチオシアネート０．１Ｍ酢酸ナトリウム、５mM Ｅ
ＤＴＡ pH５．０）を加え、溶解した。
【００６１】ＳＷ４０ＴＩ遠心管に４mlのＣｓＣｌ溶液
（５Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、５mM Ｅ
ＤＴＡ pH５．０）を入れ、さらにエタノール沈澱を溶
かしたグアニジンチオシアネート溶液を重層し、３３Kr
pm、１５時間、２５℃で遠心を行った。遠心後、遠心管
の最低部にＲＮＡ画分を得た。ＲＮＡ沈澱物に８０％エ
タノールを加えＲＮＡ沈澱物を洗った後、５００μｌの
ＥＴＳ溶液（１０mMＴｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０
mM ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）を加え、溶解した。こ
れに４００μｌのフェノール（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ pH８．０で飽和）を加え、撹拌後１０Krpm、５分
間遠心を行った。
【００６２】水層を分取し、同量のエーテルを加え、撹
拌後３Krpm、１分間遠心を行いエーテル層を除去した。
水層に１／１０量の２Ｍ酢酸ナトリウム（pH５．０）、
２倍量のエタノールを加え、−８０℃にて３０分間エタ
ノール沈澱を行った。１３Krpm、１０分間４℃にて遠心
を行い、上清を除去後、８０％エタノールで沈澱を洗っ
た。真空乾燥後、適当量の滅菌蒸留水を加え、エタノー
ル沈澱物を溶解した。この方法により、アフリカツメガ
エル体皮６４ｇから１６．５mgの全ＲＮＡを調製した。
【００６３】（２）ポリ（Ａ）ＲＮＡの調製 オリゴ（ｄＴ）セルロース（Collaborative Research,
Inc.）０．５ｇをカラムにつめ、１０mlの滅菌蒸留水、
１０mlの０．１Ｍ ＮａＯＨ／５mM ＥＤＴＡでカラム
を洗いさらに溶出液がpH７．０以下になるように滅菌蒸
留水でカラムを洗った。１０mlの１×負荷緩衝液（２０
mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．６、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）でカラムを平衡
化した。全ＲＮＡ濃度が３μｇ／μｌになるように滅菌
蒸留水を加え３mlとしたものを６５℃、５分間処理し、
直ちに、水中に入れ、室温に戻した。
【００６４】これに３mlの２×負荷緩衝液（４０mM Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．６、１．０Ｍ ＮａＣｌ、２mM
ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ）を加え、全量を６mlとし
た。これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにかけた。
非吸着画分を６５℃、５分間処理し、再びカラムにかけ
た。その後、カラムを４mlの１×負荷緩衝液、４mlの
（０．１Ｍ ＮａＣｌ）１×負荷緩衝液で洗い、４mlの
溶出緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１
mM ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ）でｐｏｌｙ（Ａ）Ｒ
ＮＡを溶出した。溶出画分に１／１０量の２Ｍ酢酸ナト
リウム及び２倍量のエタノールを加えてエタノール沈澱
を行いポリ（Ａ）ＲＮＡを調製した。９mgの全ＲＮＡよ
り７４μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡが得られた。
【００６５】実施例３．ｃＤＮＡライブラリーの作製 （１）ｃＤＮＡの作製 アマシャム社ｃＤＮＡ合成システムキットを用いアフリ
カツメガエル体皮のポリ（Ａ）ＲＮＡ ７μｇより二重
鎖ｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡ合成システムキットの
最終反応物に１０μｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（pH８．
０）及び１０μｌの１０％ＳＤＳを加え、さらに１２０
μｌのＰＣ９を加え、撹拌後、１０Krpm、５分間、室温
で遠心を行った。水槽１２０μｌに１２０μｌの４Ｍ酢
酸アンモニウム及び４８０μｌのエタノールを加えて−
８０℃３０分間エタノール沈澱を行った。
【００６６】遠心後、エタノール沈澱を８０％エタノー
ル沈澱を洗い、真空乾燥を行い、そして１０μｌの滅菌
蒸留水にエタノール沈澱を溶解した。これに２μｌの１
０×カコジレート溶液（１．４Ｍカコジル酸ナトリウ
ム、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH６．８）、２μｌ
の１mM ｄＣＴＰ、２μｌの１mM ＤＴＴ、及び２μｌ
の１０mM ＣｏＣｌ2 を加え、ターミナルデオキシトラ
ンスフェラーゼ（ファルマシア社）１０unitを加え、３
７℃、１０分間反応を行った。反応液に２μｌの０．２
５Ｍ ＥＤＴＡ pH８．０と１μｌの１０％ＳＤＳを加
え、さらに２３μｌのＰＣ９を加え、撹拌後、１３Krp
m、５分間、遠心を行った。
【００６７】水槽を分取し、１０μｌの１×ＴＥ（１０
０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１mM ＥＤＴＡ）
をＰＣ９層に加え再抽出を行った。水槽３２μｌに３２
μｌの４Ｍ酢酸ナトリウム、１２８μｌのエタノールを
加え−８０℃３０分間沈澱を行った。１３Krpmにて１５
分間、４℃で遠心を行い、上清を除去後、５０μｌの１
×ＴＥを加え、エタノール沈澱を溶かし、５０μｌの４
Ｍ酢酸アンモニウム及び２００μｌのエタノールを加
え、−８０℃にして一夜エタノール沈澱を行った。
【００６８】１３Krpmにて１５分間、４℃で遠心後、エ
タノール沈澱物を８０％エタノールで洗い、そして乾燥
後４０μｌの滅菌蒸留水を加えて溶解した。これに１２
０μｌの５×アニール緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５
０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１mM ＥＤＴＡ）
０．６μｇのdG-tailed pBR322（Betheoda Researchlab
oratories：dg-tailed pBR322, Pst Ｉ cut）及び４３
７μｌの滅菌蒸留水を加えて、６５℃にて５分間、４４
℃にて２時間、そしてその後水浴中で一夜放置し、ｐＢ
Ｒ３２２ベクターとアニーリングを行った。
【００６９】（２）大腸菌ＤＨ１への形質転換 大腸菌Ｋ１２株由来ＤＨ１株（Ｆ- , recA1, and A1, g
yrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA13, λ- ）をＲｂ
Ｃｌ法（細胞工学、２，No. ３，ｐ９７ １９８３年）
で処理し、コンピテントセルを調製した。２００μｌの
コンピテントセルに２０μｌのアニーリング反応液を加
え、氷中３０分間静置し、その後３７℃２分間熱処理を
し、直ちに氷中にもどした。これに８００μｌのψ培地
（BactoYeart extract ５ｇ、Bacto Tryptone ２０
ｇ、ＭｇＳＯ4 ５ｇ、全量１ｌ、pH７．６）を加え３７
℃にて６０分間培養を行った。培養後、１mlの８０％グ
リセリンを加え、液体窒素で高速凍結を行い、−８０℃
にて菌体を保存した。この方法でアフリカツメガエル体
皮ｃＤＮＡライブラリー７．５×１０5 を作製した。
【００７０】実施例４．Ｃ−末端α−アミド化酵素ｃＤ
ＮＡの単離 （１）ＤＮＡプローブの作製 ｃＤＮＡライブラリーよりＣ−末端α−アミド化酵素ｃ
ＤＮＡを単離するために、まずNative enzyme のトリプ
テックフラグメントＴ30とＴ11の部分アミノ酸配列に対
応するＹＳＯ１２，ＹＳＯ１３、及びＹＳＯ１５と命名
した混合ＤＮＡプローブ（いずれも１７mer 、３２混合
物）を、Applied Biosystems社３８０ＡＤＮＡ合成機を
用い合成した（図１６参照）。次に、各混合ＤＮＡプロ
ーブ１pmolを〔γ−37Ｐ〕ＡＴＰとＴ4 ポリヌクレオチ
ドキナーゼで処理することにより、各ＤＮＡ ｐｒｏｂ
ｅの５′水酸基に〔32Ｐ〕を導入した。
【００７１】（２）コロニーハイブリダイゼーション −８０℃に保存されたｃＤＮＡライブラリーを溶解し、
普通栄養寒天培地（５μｇ／mlテトラサイクリン）に拡
げ（１０００コロニー／プレート）３７℃一夜培養し
た。コロニーの上にニトロセルロースフィルター（Schl
eicher & Schuell社製）を置き５分間放置した。このニ
トロセルロースフィルターを別の新しい普通栄養寒天培
地（５μｇ／mlのテトラサイクリンを含む）の上にコロ
ニー面を上にして乗せ、３７℃で８時間培養した。
【００７２】次にこのニトロセルロースフィルターを別
の新しい普通栄養寒天培地（１７０μｇ／mlのクロラム
フェニコールを含む）の上にコロニー面を上にして３７
℃にて終夜放置した。次にニトロセルロースフィルター
をアルカリ変性液（０．１ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）の上に１０分間置き、次に中和液（０．５ＭＴｒ
ｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ）上に１
０分間置いた。その後、２×ＳＳＣ溶液（２０×ＳＳ
Ｃ：ＮａＣｌ １７５．３ｇ、クエン酸三ナトリウム８
８．２ｇ全量１ｌ）でニトロセルロースフィルターをす
すぎ、そして風乾した。
【００７３】減圧下、８０℃１２０分間熱処理を行っ
た。コロニーハイブリダイゼーションはW.I.Wood等の方
法（Proc.Natl.Acad.Sci, U.S.A., 82, 1585-1588, 198
5 ）に従って行った。すなわち、ニトロセルロースフィ
ルターをビニール袋にパックして、５mlのプレハイブリ
ダイゼーション液〔３×ＳＳＣ、５０mMリン酸ナトリウ
ム（pH６．８）、５×デンハート液（１×デンハート：
アルブミン、ポリビニルピロリドン、Ｆｉｃｏｌｌ、各
々０．２mg／ml）、サケ精子ＤＮＡ ０．１mg／ml〕を
加え、３７℃にて３時間プレハイブリダイゼーションを
行った。
【００７４】次に１枚のニトロセルロースフィルターあ
たり、前記合成混合ＤＮＡプローブを各々、１００万cp
m 入れて、ハイブリダイゼーションを３７℃にて一夜行
った。次に３×ＳＳＣにより４℃で２回フィルターを洗
い、塩化テトラメチルアンモニウム液〔３．０Ｍ塩化テ
トラメチルアンモニウム、５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（pH８．０）、２mM ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ〕を加
え、３７℃にて３０分ずつ２回、さらに５２℃にて３０
分間ずつ２回ニトロセルロースフィルターを洗った。風
乾後、オートラジオグラフィーを−８０℃１昼夜行っ
た。この様にして約４０万個のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングしてプローブとハイブリダイズするクロ
ーンが得られた。これはＤＨ１／ｐＸＡ４５７と命名さ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条寄第
１３６７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６７）として寄託さ
れている。
【００７５】実施例５．ｐＸＡ４５７プラスミドの解析
及びｃＤＮＡの塩基配列決定 大腸菌ＤＨ１／ｐＸＡ４５７株より、常法に従いプラス
ミドを分離・精製した。得られたｐＸＡ４５７を種々の
制限酵素で切断し、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ切断部位に
挿入されたｃＤＮＡの制限酵素地図を作成した。それを
図１７中の（ａ）に示す。ｃＤＮＡの長さは約２．７kb
であった。次にこのｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を決定す
る為、Ｍ１３ファージに種々の制限酵素切断断片をクロ
ーニングし、Ｔａｋａｒａ ＤＮＡ配列決定キットを用
い、ジデオキシ法〔Sanger.F. 等Proc.Natl.Acad.Sci,
U.S.A.34, 5463-5467 (1977)〕でそのＤＮＡ塩基配列を
決定した。ＤＮＡの塩基配列を決定する為の方向性を図
１７中の（ｂ）に示した。ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡのＤ
ＮＡ塩基配列と、この塩基配列から予想されるアミノ酸
配列を図１〜図５に示す。
【００７６】実施例６．ＸＡ大腸菌発現ベクター、ｐｔ
ｒｐＸＡＳＴ８とＸＡ発現菌株、Ｗ３１１０／ｐｔｒｐ
ＸＡＳＴ８の作製 ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡ（１１２〜１２００）によりコー
ドされている蛋白質（ＸＡ）を大腸菌内で発現させる為
に、以下示す方法でＸＡ発現ベクターｐｔｒｐＸＡＳＴ
８とＸＡ発現菌株、Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ８の
作製を行った。
【００７７】（１）ｐＵＣ１８ＸＡ（ＥｃｏＲＩ）の作
製 まず、ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡ部分（ＰｓｔＩフラグメ
ント）をＭ１３ｍｐ１９（宝酒造社製）のＰｓｔＩサイ
トにクローニングすることによりＭ１３ＸＡ４５７を作
製した。次に、Ｍ１３ＸＡ４５７と化学合成ＤＮＡ：
５′GTC ATT GGAAAG TGA CAT GAA TTC TTC CTC ATA CCT
CTT ３′を用い、Morinagaらの方法（Biotechnology
２, 636-639, 1984 ）に従ってインビトロ変異誘発（in
vitro mutagenesis ）を行ないｐＸＡ４５７のｃＤＮＡ
（１０３〜１１２）の５′TCT ACCAGA ３′の塩基配列
を５′GAA TTC ATG ３′に変換し（すなわち、ｃＤＮＡ
（１１２〜１１４）によりコードされているＳｅｒ残基
の直前に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトGAA TTC とＭｅｔコ
ドン、ＡＴＧを導入した）、Ｍ１３ＸＡ４５７（Ｅｃｏ
ＲＩ）を作製した。
【００７８】次に、Ｍ１３ＸＡ４５７（ＥｃｏＲＩ）Ｒ
Ｆ（Replication Form）をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断
し、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメントをｐＵ
Ｃ１８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩサイトへ
クローニングすることにより目的とするｐＵＣ１８ＸＡ
（ＥｃｏＲＩ）を得た（図１８参照）。
【００７９】（２）ｐｔｒｐＸＡＳＴ４の作製 ｐｔｒｐＧＩＦｓα〔ｐｔｒｐＧＩＦｓαによって形質
転換された大腸菌ＷＡ８０２／ｐｔｒｐＧＩＦｓαは工
業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条寄第８５０
３（ＦＥＲＭ Ｐ−８５０３）として寄託されている〕
ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断、トリプファンオペロンを
含むＤＮＡフラグメント（図１９における、Ａフラグメ
ント）を回収、またｐＵＣ１８ＸＡをＥｃｏＲＩとＨｈ
ａＩで切断ＥｃｏＲＩ−ＨｈａＩ ＤＮＡフラグメント
（図１９における、Ｂフラグメント）を得た。次に、こ
こで得られたＡ，Ｂ両ＤＮＡフラグメントと化学合成Ｄ
ＮＡリンカー：
【００８０】
【化３１】
【００８１】をＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、目
的とするｐｔｒｐＸＡＳＴ４を作製した（図１９参
照）。 （３）ｐｔｒｐＸＡＳＴ８とＷ３１１０／ｐｔｒｐＸＡ
ＳＴ８の作製 ｐｔｒｐＸＡＳＴ４をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩＤＮＡフラグメント（図２０にお
ける、フラグメントＣ）を得た。また、ｐＴ4 ＴＮＦＳ
Ｔ８ｒｏｐ- 〔このプラスミドはｐＰL Ｔ4 ＴＮＦＳＴ
８（微工研条寄第９０６号として寄託されている）とｐ
ＢＲ３２２とから構築される。特開昭６２−７７３２４
参照〕をＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断し、ＳａｌＩ−Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント（図２０におけるフラグ
メントＤ）を得た。
【００８２】さらにｐｔｒｐＧＩＦｓαをＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨＩで切断し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ
フラグメント（図２０におけるフラグメントＥ）を得
た。この様にして得たＤＮＡ、フラグメントＣ，Ｄ、及
びＥをＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合し、大腸菌株Ｗ３１１
０に形質転換することにより、目的とするＸＡ大腸菌発
現ベクターｐｔｒｐＸＡＳＴ８とＸＡ発現菌株Ｗ３１１
０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ８を作製した（図２０参照）。
【００８３】実施例７．ＸＤＡ大腸菌発現ベクターｐｔ
ｒｐＸＤＡＳＴ８とＸＤＡ発現菌Ｗ３１１０／ｐｔｒｐ
ＸＤＡＳＴ８の作製 ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡ（１１２〜１１４３）によりコー
ドされている蛋白質（ＸＤＡ）を大腸菌内で発現させる
為に以下に示す方法でＸＤＡ発現ベクターｐｔｒｐＸＤ
ＡＳＴ８とＸＤＡ発現菌Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＤＡＳ
Ｔ８の作製を行なった。
【００８４】（１）ＤＮＡリンカー（Ｆ）の合成 ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡ（１１４１〜１１４３）によりコ
ードされているＬｙｓの直後に翻訳停止コドン（ＴＧ
Ａ）およびＳａｌＩサイトを導入する為に、以下に示す
４種のＤＮＡフラグメント（１）〜（４）を化学合成し
た。 （１）５′GTC ACC ACC ATA CAG AAG CTG AGC CTG AG ３′ （２）５′AAG AAT ACA GGA CTT CAG CAG CCT AAA TGA G ３′ （３）５′GTA TTC TTC TCA GGC TCA GCT TCT GTA TGG TG ３′ （４）５′TCG ACT CAT TTA GGC TGC TGA AGT CCT ３′ 次にフラグメント（２）と（３）の５′末端にＡＴＰと
Ｔ4 ポリヌクレオタイドキナーゼを用いリン酸基を導入
した後、（１）と（４）のＤＮＡフラグメントを加え、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで処理することにより（１）と
（３）及び（３）と（４）のＤＮＡフラグメントが結合
したＤＮＡリンカー（Ｆ）を合成した（図２１参照）。
【００８５】（２）ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ４の作製 ｐｔｒｐＸＡＳＴ４をＢｓｔＥIIとＳａｌＩで切断し、
ＢｓｔＥII−ＳａｌＩＤＮＡフラグメント（図２２にお
ける、Ｇフラグメント）を得た。このＤＮＡフラグメン
トＧと前記したＤＮＡリンカーＦをＴ4 ＤＮＡリガーゼ
で結合し、目的とするｐｔｒｐＸＤＡＳＴ４を得た（図
２２参照）。
【００８６】（３）ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８及びＷ３１１
０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８の作製 ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ４をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断
し、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント（図２
３における、Ｈフラグメント）を得た。また、ｐＴ4 Ｔ
ＮＦＳＴ８ｒｏｐ- をＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断し、
ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント（図２３に
おける、Ｉフラグメント）を得た。さらにｐｔｒｐＧＩ
ＦｓαをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント（図２３における、
Ｊフラグメント）を得た。次に、ここで得られたＨ，
Ｉ、及びＪの３種のＤＮＡフラグメントをＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に形質転換
することにより、目的とするＸＤＡ大腸菌株発現ベクタ
ーｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８とＸＤＡ発現菌株Ｗ３１１０／
ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８を作製した（図２３参照）。
【００８７】実施例８．ＸＡ及びＸＤＡの大腸菌内での
発現 ＸＡ発現菌Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ８、及びＸＤ
Ａ発現菌Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８をそれぞれ
Ｌブロス（ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
Yeast extract ５ｇを水１ｌに溶かした培地）にアンピ
シリン５０μｇ／mlを含んだ培地で一晩培養した。次に
この培養液を２０倍量のＭ９（０．５％リン酸一水素ナ
トリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．５％塩
化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム）にカザミノ
酸、インドールアクリル酸（以下ＩＡＡと略す）とアン
ピシリン濃度が各々０．２％、５μｇ／ml、５０μｇ／
mlになるように調整した培地へ接種し、３７℃７時間培
養した。
【００８８】一方、対照の宿主Ｗ３１１０は上記培地か
らアンピシリンのみを除いた培地で同様に培養した。次
に、それぞれの菌体を遠心集菌後、各菌体の全蛋白質を
Laemmli, U, K.らの方法に従って（Laemmli, U, K. Nat
ure 227 , 680-685, 1970 ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し
た。この結果を図２４（ａ）に示す。Ｗ３１１０／ｐｔ
ｒｐＸＡＳＴ８由来の蛋白質及びＷ３１１０／ｐｔｒｐ
ＸＤＡＳＴ８由来の蛋白質は対照であるＷ３１１０由来
の蛋白質に比べそれぞれ分子量約４０Ｋ、及び分子量約
３８Ｋを示す特異的な蛋白質ＸＡ、及びＸＤＡを発現し
ていた。一方、これらの蛋白質はいずれも、菌体をＰＢ
Ｓ（−）（０．８％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カ
リウム、０．１５％リン酸一水素ナトリウム、０．０２
％リン酸二水素カリウム）に懸濁し、超音波処理で菌体
を破砕後、１０Krpm １分間遠心処理することにより大
部分が沈澱画分に回収された。
【００８９】実施例９．ＸＡ及びＸＤＡとNative enzym
e との物性比較 （１）分子量の比較 前記実施例８で培養したＷ３１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ
８、及びＷ３１１０／ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８を集菌後、
菌体をそれぞれＰＢＳ（−）に懸濁し、超音波処理で菌
体を破砕し、そして１０Krpmで１分間遠心処理して沈澱
画分を調整した（この処理で大部分のＸＡ及びＸＤＡは
沈澱画分に移行し、宿主Ｗ３１１０由来の多くの蛋白質
は上清分画へ移行する）。このようにして濃縮したＸＡ
蛋白質及びＸＤＡ蛋白質並びにNative enzyme の分子量
をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い比較検討したところ、ＸＤＡ
は完全にNative enzyme と同一な分子量を示した（図２
４（ｂ）参照）。
【００９０】（２）アミノ酸組成比の比較 前記方法で濃縮したＸＡ、及びＸＤＡをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分離した後、ＸＡ、及びＸＤＡに対応する蛋白質バ
ンドをゲルより切り出し、各蛋白質をＴＥＳ（１０mM
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．０、１mM ＥＤＴＡ、０．１
Ｍ ＮａＣｌ）を用いてゲルより抽出した。抽出液は、
真空遠心乾燥機を用いて乾固後、０．１％ＳＤＳに溶解
し、０．１％ＳＤＳ溶液に対し１晩透析した。透析後の
サンプルを一旦、真空遠心乾燥機で乾固後、少量の水に
溶解し、メタノールを加えることによりＸＡ、及びＸＤ
Ａを沈澱させ、アミノ酸分析サンプルとした。アミノ酸
分析はＸＡ、及びＸＤＡ約１０μｇを減圧封管中６Ｎ塩
酸で、１１０℃ ７２時間反応させた後、日立８３５−
５０型アミノ酸分析機にて行なった。この結果を表１に
示す。
【００９１】
【表１】
【００９２】この表において Native enzyme, ＸＡ、及
びＸＤＡのフェニルアラニン残基を１０個として他の各
アミノ酸組成を比較すると、アスパラギン酸残基、グル
タミン酸残基、バリン残基、イソロイシン残基、ロイシ
ン残基およびアルギニン残基数が Native enzymeとＸＤ
Ａとでよく一致していた。これらの結果は、いずれもＸ
ＤＡが Native enzymeと同一であることを強く示唆して
いる。すなわち、ＸＤＡとＸＡはどちらもＣ−末端α−
アミド化酵素活性を有していることから、ｃＤＮＡから
導きだした本酵素（プレプロ体）のＣ−末端部分（少な
くともArg(345)〜Val(363)まで）は活性には必須ではな
いと考えられる。
【００９３】したがって、アフリカツメガエル体皮由来
Ｃ−末端α−アミド化酵素の生合成は、まず、４００ア
ミノ酸より構成される前駆体（ｐｒｅｐｒｏ体）として
発現し、この後、Ｎ−末端部分の切断（Arg-Ser 間の切
断）、およびＣ−末端部分の切断（おそらく Lys(344)-
Arg(345)間の切断）がおき、 Native enzymeが生じると
考えられる。
【００９４】実施例１０．ＸＡ，ＸＤＡのＣ−末端α−
アミド化酵素活性 Ｗ３１１０／ｐｔｒｐＣＡＳＴ８，Ｗ３１１０／ｐｔｒ
ｐＸＤＡＳＴ８、及び対照としてのＷ３１１０を前記し
た方法で培養し、この内、培養液２０mlを集菌し、２０
０μｌのＰＢＳ（−）に菌体を懸濁し、そして超音波処
理により菌体を破砕した。次に、遠心分離により沈澱画
分を回収し、この沈澱画分を６Ｍ塩酸グアニジン２５０
μｌで可溶化した後、この溶液を順次１時間ずつ１０mM
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．０）、５０μＭ ＣｕＳＯ
4 を含む６Ｍ塩酸グアニジン、４Ｍ塩酸グアニジン、２
Ｍ塩酸グアニジン、０Ｍ塩酸グアニジン溶液各２００ml
に透析した。このようにして透析したサンプルを遠心分
離して生じた沈澱を分離し、上清液を用いて酵素活性を
測定した。
【００９５】活性の測定は、Mizuno等の方法 (B.B.R.C.
137 , 984-991, 1986 ）に従い、下記のごとく行なっ
た。すなわち、前記した方法で調製したサンプル１２．
５μｌ，２５μｌ及び５０μｌにそれぞれ蒸留水を加え
て全量１００μｌとする。これに、１０mM Ｎ−エチル
マレイミド２５μｌ、１０mMアスコルビン酸２５μｌ、
２００μＭ硫酸銅２５μｌ、２０mg／mlカタラーゼ１．
２５μｌ、１％Ｌｕｂｒｏｌ ２０μｌ、〔 125Ｉ〕-A
c-Tyr-Phe-Gly ２pmol（１７万cpm ）および１ＭＴｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（pH７．０）５０μｌを加え、３７℃で１５
時間反応させた。
【００９６】反応後、反応液に１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（pH７．０）７５０μｌと酢酸エチル２mlを加え、混
合、遠心分離する。次に、酢酸エチル層１mlを分取し、
それと残りの溶液の放射能をガンマーカウンターを用い
て測定することにより、酢酸エチル層へ移行した放射能
の割合を求める。なお、この方法で、Ｃ−末端アミド化
された〔 125Ｉ〕-Ac-Tyr-Phe-CONH2 は特異的に、酢酸
エチル層へ移行することは液体クロマトグラフィー及び
ガンマ・カウンターによる測定により確認されている。
【００９７】活性測定の結果を図２５に示す。Ｗ３１１
０のみでは、活性はないが、ＸＡおよび、ＸＤＡでは上
清液量に比例して活性が増加し、確かにＣ−末端α−ア
ミド化酵素活性を有していることが確認された。また、
この酵素活性を１ml培養当りに換算すると、ＸＡでは１
５mU、ＸＤＡでは１１mUとなった。
【００９８】実施例１１．新規Ｃ−末端α−アミド化酵
素のＤＮＡの単離（２） （１）ＤＮＡプローブの作製 アフリカツメガエル由来のｃＤＮＡライブラリーより新
規Ｃ−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡを単離するため
に、まずｐＸＡ４５７を制限酵素ＰｖｕIIで完全に切断
し、約０．７４kbのＤＮＡフラグメント（図１〜図３に
おいてｐＸＡ４５７のｃＤＮＡ塩基番号５４から７９５
番目までのＤＮＡフラグメント；以下、これをＰｖｕII
ＤＮＡフラグメントと略す）を単離した。次に、この
ＰｖｕIIＤＮＡフラグメントを〔α−32Ｐ〕ＣＴＰを用
いてニックトランスレーションして放射標識する。
【００９９】（２）コロニーハイブリダイゼーション −８０℃に保存されたｃＤＮＡライブラリーを溶解し、
普通栄養寒天培地（５μｇ／mlテトラサイクリンを含
む）に拡げ、３７℃一夜培養した。コロニーの上にニト
ロセルロースフィルター（Shleicher & Schnell 社製）
を置き５分間放置した。次にこのニトロセルロースフィ
ルターを別の新しい普通栄養寒天培地（５μｇ／mlテト
ラサイクリンを含む）の上にのせ、３７℃で８時間おい
た。
【０１００】次に、このニトロセルロースフィルターを
別の新しい普通栄養寒天培地（１７０μｇ／mlクロラム
フェニコールを含む）の上にのせ、３７℃にて終夜放置
した。次にこのニトロセルロースフィルターをアルカリ
変性液（０．１Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）の
上に１０分間置き、次に中和液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ pH７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ）上に１０分間
置いた。その後、２×ＳＳＣ溶液（２０×ＳＳＣ Ｎａ
Ｃｌ １７５．３ｇ、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇ
全量１ｌ）でニトロセルロースフィルターをすすぎ、
風乾後、減圧下８０℃、１２０分間熱処理を行なった。
【０１０１】このようにして調製したニトロセルロース
フィルターを用い、以下に示す条件で、コロニーハイブ
リダイゼーションを行なった。すなわち、２枚のニトロ
セルロースフィルターをビニール袋にパックして５mlの
プレハイブリダイゼーション液〔３×ＳＳＣ、５０％ホ
ルムアミド、５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．５）、
０．２５mM ＥＤＴＡ、１×デンハート液（１×デンハ
ート：アルブミン、ポリビニルピロリドン、Ｆｉｃｏｌ
ｌ、各々０．２mg／ml）、サケ精子ＤＮＡ ２０μｇ／
ml〕を加え、３７℃にて３時間プレハイブリダイゼーシ
ョンを行った。
【０１０２】次に２枚のニトロセルロースフィルターあ
たり、前記ＰｖｕII ＤＮＡプローブを各々５６万cpm
、及び前記プレハイブリダイゼーション溶液０．５ml
を用い、３７℃にて一夜ハイブリダイゼーションを行っ
た。次にこのフィルターを０．１％ＳＤＳを含む３×Ｓ
ＳＣ溶液で３７℃、３０分間、２回洗浄後、さらに０．
１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液で５０℃、３０分
間、２回洗浄した。この様にして調製したフィルターを
風乾後、オートラジオグラフィーを−８０℃１昼夜行っ
た。
【０１０３】この様にして約２０万個のｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることによりＰｖｕII ＤＮ
Ａプローブとハイブリダイズするクローンが３個得られ
た。これらをそれぞれ、ＤＨ１／ｐＸＡ７４７，ＤＨ１
／ｐＸＡ７５０，ＤＨ１／ｐＸＡ７９９と命名した。こ
の内、ＤＨ１／ｐＸＡ７９９が以後に述べる解析から新
規Ｃ−末端α−アミド化酵素ｃＤＮＡを含んだクローン
であることが判った。なお、この菌株は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研条寄第１５８６号（ＦＥＲＭ
ＢＰ１５８６）として寄託されている。
【０１０４】実施例１２．ｐＸＡ７４７，ｐＸＡ７５
０，ｐＸＡ７９９プラスミドの解析及びｐＸＡ７９９の
ｃＤＮＡ塩基配列決定 まず大腸菌ＤＨ１／ｐＸＡ７４７，ＤＨ１／ｐＸＡ７５
０，ＤＨ１／ｐＸＡ７９９株より常法に従いそれぞれの
プラスミドを分離、調製した。次に、これらのプラスミ
ドを各種の制限酵素で切断することにより、これらプラ
スミドに含まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を作成した。
【０１０５】すなわち、ここで用いた制限酵素はＰｓｔ
Ｉ，ＫｐｎＩ，ＨｉｎｃII，ＰｖｕII，ＡｃｃＩ、及び
ＥｃｏＲＶを用いた。この結果、ｐＸＡ７４７とｐＸＡ
７５０プラスミドについては、これらに含まれるｃＤＮ
Ａの制限酵素地図は、先に得たｐＸＡ４５７とほど同じ
であったことから、ｐＸＡ４５７と同じｃＤＮＡの一部
を含んだプラスミドであることが判った。しかしｐＸＡ
７９９を解析した結果、ｐＸＡ７９９は約３．４kbのｃ
ＤＮＡを持ち、しかも、このｃＤＮＡの制限酵素地図は
ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡ制限酵素地図とは明らかに異な
っていた（図３３参照）。
【０１０６】この結果は、ｐＸＡ７９９はｐＸＡ４５７
とは異なるｃＤＮＡを含んでいること、すなわち、ｐＸ
Ａ４５７のｃＤＮＡにコードされていたＣ−末端アルフ
ァアミド酵素とは異なる新しいタイプのＣ−末端アルフ
ァアミド化酵素のｃＤＮＡを含んでいる可能性が極めて
高いことを示している。そこで、本発明者らは、次にこ
のｃＤＮＡの塩基配列を以下に示す方法で明らかにし
た。
【０１０７】まず、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ部分を種々
の制限酵素で切断し、このＤＮＡ断片をＭ１３ファージ
にそれぞれサブクローニングする。次に、個々のＤＮＡ
断片の塩基配列を、 Takara ＤＮＡ配列決定キット（宝
酒造社製）を用い、ジデオキシ法〔San--ar.F.等、Pro
c.Natl.Acad.Sci, U.S.A.34, 5463-5467 (1977)〕でそ
のＤＮＡ塩基配列を決定した（図１〜図５参照）。図３
４に、ＤＮＡ塩基配列を決定した各ＤＮＡフラグメント
と塩基配列決定の方向性を示す。
【０１０８】実施例１３．ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコ
ードされている蛋白質及びその誘導体の蛋白質発現プラ
スミド、組換体（形質転換体）の作製 （１）ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ）の作製（図３７参
照） このプラスミドはｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされ
ている蛋白質のうち、図２６〜図３２におけるアミノ酸
配列番号（以下この実施例において、アミノ酸配列番号
は図２６〜図３２によるものとする。）１以後の蛋白質
を大腸菌内で発現させるのに必要なプラスミドである。
【０１０９】ｐＸＡ７９９と化学合成ＤＮＡ：５′GTC
ATT GGA AAG TGA CAT GAA TTC TTCCTC ATA CCT CTT
３′を用い、Morinaga等の方法 (Biotechnology ２，63
6-639,1984 ）に従ってin vitro mutagenesisを行い、
ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ塩基配列番号（以下、この実施
例において塩基配列番号は図２６〜図３２によるものと
する。）１０９〜１１７の５′TCA ACC AGA ３′塩基配
列を５′GAA TTC ATG ３′に変換した、すなわちｃＤＮ
Ａ塩基配列番号１１８〜１２０にコードされているＳｅ
ｒ残基の直前に制限酵素ＥｃｏＲＩサイト（GAATTC）と
Ｍｅｔコード（ＡＴＧ）を導入したｐＸＡ７９９（Ｅｃ
ｏＲＩ）を作製した。
【０１１０】（２）ｐＵＣＰL ＣＩの作製（図３８参
照） このプラスミドは、目的遺伝子をλファージ由来のＰL
プロモーター支配下に発現させる為に必要なプラスミド
である。すなわち、ＰL プロモーターの下流に位置する
ポリリンカーサイトのＥｃｏＲＩサイトに、ＥｃｏＲＩ
サイト、開始コドン（ＡＴＧ）を有する遺伝子を導入す
れば、この遺伝子にコードされている蛋白質を大腸菌内
で直接発現することができる。又、このプラスミドは、
たとえ、目的遺伝子の中に終止コドンが存在しない場合
でも、後述する、化学合成ＤＮＡリンカーサイトのいず
れかのリーディングフレームで翻訳が終了するようにデ
ザインされたプラスミドである。まずｐＵＣ−ＰL −ｔ
ｒｐａ ３μｇをＳｐｈＩ ２０Ｕを用いて切断後、さ
らにＨｉｎｄIII １unit（以下１Ｕと略す）を用いて部
分切断することにより目的のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII フ
ラグメント（これをＥフラグメントとする）を分離し
た。次に、このＥフラグメントと、化学合成ＤＮＡリン
カー：
【０１１１】
【化３２】 をＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、目的とするｐＵ
ＣＰL ＣＩを作製した。
【０１１２】なお、プラスミドｐＵＣ−ＰL −ｔｒｐａ
は、図４８に示すようにして造成されたものである。即
ち、マルチクローニングサイト（multi-cloning site：
MCS ）をもつプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）に、
λｃＩ８５７ファージＤＮＡ（宝酒造社製）のレプレッ
サーｃＩ領域を挿入したｐＵＣ−ｃＩプラスミドを造成
し、次に、これにＰL プロモーターを導入するため、既
に構築していたγ−ｈＡＮＰ遺伝子発現用プラスミドｐ
Ｓ２２４−３（特開昭６０−２６２５９２、発明の名称
“新規ＤＮＡおよびその用途”に開示）のＡａｔII−Ｅ
ｃｏＲＩ断片（ＰL プロモーター領域を含む）を挿入し
てプラスミドｐＵＣ−ＰL を造成し、さらにこのプラス
ミドに、粘着末端にＡｖａＩとＳａｌＩ切断部位をもつ
化学合成ｔｒｐ ａターミネーター
【０１１３】
【化３３】 を挿入して得られたプラスミドである。
【０１１４】（３）ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＤｒａＩ及び
Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＤｒａＩの作製（図
３９参照） このプラスミド及び組換体は図２６〜図３２においてｐ
ＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列
番号１から８３６までのアミノ酸一次配列を持つ蛋白質
（これを７９９ＤｒａＩとする）を大腸菌内で発現させ
る為に作製した。
【０１１５】ｐＵＣＰL ＣＩ ３μｇをＥｃｏＲＩ ２
０Ｕ，ＳｍａＩ ２０Ｕを用い切断、ＥｃｏＲＩ−Ｓｍ
ａＩフラグメント（これをＦフラグメントとする）を分
離した。次にｐＸＡ７９９ＥｃｏＲＩ ３μｇをＥｃｏ
ＲＩ ２０Ｕ，ＤｒａＩ ２０Ｕを用い切断、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＤｒａＩフラグメント（これをＧフラグメントとす
る）を分離した。このＦ，Ｇ、両フラグメントをＴ4 Ｄ
ＮＡリガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導
入することにより、組換体Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ
７９９ＤｒａＩ及びプラスミドｐＵＣＰL ＣＩ７９９Ｄ
ｒａＩを作製した。
【０１１６】（４）ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｇｌII及び
Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｇｌIIの作製（図
４０参照） このプラスミド及び組換体は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
にコードされているアミノ酸配列番号１から６９２まで
のアミノ酸一次配列をＮ−末端に、これにひき続くＣ−
末端は発現プラスミド由来のＬｅｕ残基が付加した蛋白
質（これを７９９ＢｇｌIIとする）を大腸菌内で発現さ
せる為に作製した。ｐＵＣＰL ＣＩ ３μｇをＥｃｏＲ
Ｉ ２０ＵとＢａｍＨＩ ２０Ｕを用い切断し、Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（これをＨフラグメント
とする）を分離した。
【０１１７】一方、ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ）３μｇ
をＥｃｏＲＩ ２０ＵとＢｇｌII２０Ｕを用いて切断
し、ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIフラグメント（これをＩフラ
グメントとする）を分離した。次に、このＨ，Ｉ両フラ
グメントをＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合し、これを大腸菌
株Ｗ３１１０に導入することにより、組換体Ｗ３１１０
／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｇｌII及びプラスミドｐＵＣ
ＰL Ｃ７９９ＢｇｌIIを作製した。
【０１１８】（５）ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＲＶ及びＷ３
１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＲＶの作製（図４１参
照） このプラスミド及び組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮＡに
コードされているアミノ酸配列番号１から５５１までの
アミノ酸一次配列をＮ−末端に、これにひき続くＣ−末
端は発現プラスミド由来の Met-Gly-Ile-Leuが付加した
蛋白質（これを７９９ＲＶとする）を大腸菌内で発現さ
せる為に作製した。
【０１１９】ｐＵＣＰL ＣＩ ３μｇをＥｃｏＲＩ ２
０ＵとＳｍａＩ ２０Ｕを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ−
ＳｍａＩフラグメント（これをＪフラグメントとする）
を分離した。一方ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ）をＥｃｏ
ＲＩ ２０Ｕを用いて切断後、ＥｃｏＲＶ １Ｕを用い
て部分切断し、目的のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメ
ント（これをＫフラグメントとする）を分離した。次
に、この様にして得たＪ，Ｋ両フラグメントをＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼで結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導入
することにより組換体Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９
９ＲＶ及びプラスミドｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＲＶを作製
した。
【０１２０】（６）ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＳａｌＩ及び
Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＳａｌＩの作製（図
４２参照） このプラスミド、及び組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
にコードされているアミノ酸配列番号１から４９９まで
のアミノ酸一次配列をＮ−末端に、これにひき続くＣ−
末端は発現プラスミド由来の Leu-Gln-Ala-Cys-Leu-Ile
-Asnが付加した蛋白質（これを７９９ＳａｌＩとする）
を大腸菌内で発現させる為に作製した。
【０１２１】ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｇｌII ３μｇを
ＳａｌＩ ２０Ｕを用いて切断し、大きなＤＮＡフラグ
メント（これをＬフラグメントとする）を分離、このＤ
ＮＡフラグメントをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いふたたび
分子内で再結合させ、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導入
することにより、組換体Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７
９９ＳａｌＩ及びプラスミドｐＵＣＰL ＣＩ７９９Ｓａ
ｌＩを作製した。
【０１２２】（７）ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥIIL
及びＷ３１１０／ｐＵＣＰL Ｃ７９９ＢｓｔＥIIL の作
製（図４３参照） このプラスミド及び組換体は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡ
にコードされているアミノ酸配列番号１から３２９まで
のアミノ酸一次配列をＮ−末端に、これにひき続くＣ−
末端は、発現プラスミド由来の Gly-Asp-Pro-Leu-Glu-S
er-Thr-Cys-Arg-His-Alaが付加した蛋白質（これを７９
９ＢｓｔＥIIL とする）を大腸菌内で発現させる為に作
製した。
【０１２３】ｐＵＣＰL ＣＩ ３μｇをＥｃｏＲＩ ２
０ＵとＳｍａＩ ２０Ｕを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ−
ＳｍａＩフラグメント（これをＭフラグメントとする）
を分離した。一方、ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ）をＢｓ
ｔＥII １Ｕを用いて部分切断後、Ｔ4 ＤＮＡポリメラ
ーゼとｄＮＴＰを用いてcohesive endをフィルインした
後、ＥｃｏＲＩ ２０Ｕを用いて、切断し目的のＥｃｏ
ＲＩ−ＢｓｔＥIIL フラグメント（これをＮフラグメン
トとする）を分離した。次にこの様にして得たＭ，Ｎ両
フラグメントをＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合し、これを大
腸菌株Ｗ３１１０に導入することにより組換体Ｗ３１１
０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥIIL及びプラスミド
ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥIIL を作製した。
【０１２４】（８）ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥIIS
及びＷ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥIIS の
作製（図４４参照） このプラスミド、及び、組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮ
Ａにコードされているアミノ酸配列番号１から２９８ま
でのアミノ酸一次配列をＮ−末端に、これにひき続くＣ
−末端は、発現プラスミド由来の Gly-Asp-Pro-Leu-Glu
-Ser-Thr-Cys-Arg-His-Alaが付加した蛋白質（これを７
９９ＢｓｔＥIIS とする）を大腸菌内で発現させる為に
作製した。
【０１２５】ｐＵＣＰＬL ＣＩ ３μｇをＥｃｏＲＩ
２０ＵとＳｍａＩ ２０Ｕを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ
−ＳｍａＩフラグメント（これをＯフラグメントとす
る）を分離した。一方、ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ）を
ＢｓｔＥII ２０Ｕを用いて部分切断後、Ｔ4 ＤＮＡポ
リメラーゼとｄＮＴＰを用いてcohesive endをフィルイ
ンした後、ＥｃｏＲＩ ２０Ｕを用いて切断し目的のＥ
ｃｏＲＩ−ＢｓｔＥIISフィルインフラグメント（これ
をＰフラグメントとする）を分離した。次にこの様にし
て得たＯ，Ｐ両フラグメントを、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで
結合し、これを大腸菌株Ｗ３１１０に導入することによ
り組換体Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥII
S 及びプラスミドｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓＴＥIIS を
作製した。
【０１２６】（９）ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
Ｉ）の作製（図４５参照） このプラスミドはｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコードされ
ている蛋白質のうち、アミノ酸配列番号１から３４６ま
での蛋白質を大腸菌内で発現させるのに必要なプラスミ
ドである。ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ）と化学合成ＤＮ
Ａ：５′CAG CAG CCT AAA TAG GTC GAC GAA GAA GTA TT
A AAT ３′を用いてin vitro mutagenesisを行いｐＸＡ
７９９のｃＤＮＡ塩基配列番号１１５６−１１６４の
５′CGG GAG GAG ３′を５′TAG GTC GAC ３′に変換し
た、すなわち、ｃＤＮＡ塩基番号１１５３−１１５５に
コードされているＬｙｓ残基の直後に翻訳終止コドン
（ＴＡＧ）と制限酵素ＳａｌＩサイト（GTC GAC ）を導
入したｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ）プラスミ
ドを作製した。
【０１２７】（１０）ｐｔｒｐΔ７９９及びＷ３１１０
／ｐｔｒｐΔ７９９の作製（図４６参照） このプラスミド及び組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮＡに
コードされている蛋白質のアミノ酸配列番号１から３４
６までのアミノ酸一次配列をもつ蛋白質を（これをΔ７
９９とする）大腸菌トリプトファンプロモーター支配下
に発現させる為に作製した。
【０１２８】まず、ｐｔｒｐＧＩＦｓα（このプラスミ
ドは、トリプトファンオペロン支配下に、ヒト・ガンマ
ーインターフェロンとアルファ・ネオ・エンドルフィン
のキメラ蛋白質を発現できるようにデザインされたプラ
スミドである。特願昭６２−１０７７８７）をＥｃｏＲ
ＩとＳａｌＩで切断、トリプトファンオペロンを含むＤ
ＮＡフラグメント（これをＡフラグメントとする）を分
離する。一方、ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ）
をＥｃｏＲＩとＳａｌＩを用い切断、目的のＥｃｏＲＩ
−ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント（これをＢフラグメン
トとする）を分離する。次に、Ａ，Ｂ両ＤＮＡフラグメ
ントをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用い結合し、これを大腸菌
株Ｗ３１１０に導入することにより組換体Ｗ３１１０／
ｐｔｒｐΔ７９９及びプラスミドｐｔｒｐΔ７９９を作
製した。
【０１２９】（１１）ｐｔｒｐ７９９−４５７Δ及びＷ
３１１０／ｐｔｒｐ７９９−４５７Δの作製（図４７参
照） このプラスミド及び組換体はｐＸＡ７９９のｃＤＮＡに
コードされている蛋白質のアミノ酸配列番号１から３２
９までのアミノ酸一次配列をＮ−末端に、これにひき続
くＣ−末端はｐＸＡ４５７のｃＤＮＡにコードされてい
るアミノ酸番号３６４から３８１までのアミノ酸一次配
列（図４参照）を持つ蛋白質（これを７９９−４５７Δ
とする）を大腸菌内で発現させる為に作製した。
【０１３０】まず、ｐｔｒｐＸＤＡＳＴ８ ３μｇをＥ
ｃｏＲＩ ２０ＵとＢｓｔＥII ２０Ｕを用いて切断
し、ＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＥIIフラグメント（これをＣフ
ラグメントとする）を分離した。一方、ｐＸＡ７９９
（ＥｃｏＲＩ）をＥｃｏＲＩ ２０Ｕを用いて切断後、
ＢｓｔＥII １Ｕを用いて、部分切断し、目的のＥｃｏ
ＲＩ−ＢｓｔＥIIフラグメント（これをＤフラグメント
とする）を分離した。次にこの様にして得たＣ，Ｄ両フ
ラグメントをＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合し、これを大腸
菌株Ｗ３１１０に導入することにより、組換体Ｗ３１１
０／ｐｔｒｐ７９９−４５７Δ及びプラスミドＷ３１１
０／ｐｔｒｐ７９９−４５７Δを作製した。
【０１３１】実施例１４．ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコ
ードされている蛋白質及びその誘導体の発現 実施例１３で示した方法により作製した、多くの大腸
菌、組換体を下記に示す方法を用い、個々に培養するこ
とにより目的の蛋白質を発現させた。尚ここでは発現プ
ラスミドの種類の観点から具体例として以下の２例を示
すが、他の組換体についてもこれと同様な培養方法を用
いることにより、目的蛋白質を得ることができる。
【０１３２】（１）７９９ＤｒａＩの大腸菌内での発現 Ｗ３１１０／ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＤｒｉＩをアンピシ
リン５０μｇ／mlを含有するスーパーブロース（酵母エ
キス２４ｇ、トリプトン１２ｇ、グリセリン５ml、１Ｍ
リン酸バッファー（pH７．６）１００mlを水に溶かして
１ｌに調整した培地）で、３２℃、一昼夜培養した。次
に、この菌体を、アンピシリン５０μｇ／mlを含有する
スーパーブロースに、菌体濃度が６６０nmで０．０１OD
／mlになるように接種し、３２℃で菌体濃度が６６０nm
で０．３OD／mlに達するまで培養する。この時点で培養
温度を４２℃にシフトさせ、さらに、菌体濃度が２OD／
mlに達するまで培養した。尚、実施例１３で示した発現
プラスミドのｐＵＣＰL ＣＩシリーズを含有する組換体
の培養は、この培養方法と同一条件で行なった。
【０１３３】（２）Δ７９９の大腸菌内での発現 Ｗ３１１０／ｐｔｒｐΔ７９９をアンピシリン５０μｇ
／mlを含有するスーパーブロース培地で３７℃一昼夜培
養した。次に、この培養液を、２０倍量のカザアミノ酸
０．２％、インドールアクリル酸５μｇ／ml、アンピシ
リン５０μｇ／mlをそれぞれ含有するＭ９培地（０．５
％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリ
ウム、０．５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニ
ウム）に接種し、３７℃、７時間、培養した。尚、これ
と同様の培養は、実施例１３で作製した、７９９−４５
７Δ生産菌Ｗ３１１０／ｐｔｒｐ７９９−４５７Δでも
用いた。
【０１３４】次に、上記した方法を用いて培養した組換
体を、それぞれ遠心分離で集菌後、各菌体の全蛋白質を
Laemmli, U, K.の方法に従って（Laemmli, U, K. Natur
e 227 , 680-685, 1970 ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する
ことにより、目的蛋白質が発現されていることを確認し
た。一方、これらの蛋白質はいずれも、菌体をＰＢＳ
（−）（０．８％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリ
ウム、０．１５％リン酸一水素ナトリウム、０．０２％
リン酸二水素カリウム）に懸濁し、超音波処理で菌体を
破砕後、１００００ rpm／min 、遠心処理すると大部分
が沈澱画分に回収された。
【０１３５】実施例１５．Ｃ−末端α−アミド化酵素活
性の測定 実施例１４で培養した菌体OD６６０で１０ODを集菌し、
これを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳ（−）２００μ
ｌに懸濁、超音波処理により菌体を破砕した。次に、遠
心分離により沈澱画分を回収し、この沈澱画分を６Ｍ塩
酸グアニジン５００μｌで可溶化した後、この溶液を順
次１時間ずつ１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．０）と
５０μＭ ＣｕＳＯ4 を含む４Ｍ塩酸グアニジン、及び
１０mMＴｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．０）と５０μＭ Ｃｕ
ＳＯ4 を含む２Ｍ塩酸グアニジン溶液各２００mlに透析
したサンプルを用いて以下に示す酵素活性を測定した。
表２に、測定した各蛋白質の活性値を示す。なお実施例
１０で用いたＸＡの値も参考に示す。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】この表から明らかなように、（１）ｐＸＡ
７９９のｃＤＮＡにコードされている蛋白質はペプチド
Ｃ−末端α−アミド化酵素活性を持っている。又、
（２）この酵素活性発現にはｐＸＡ７９９のｃＤＮＡに
コードされている全アミノ酸一次配列をもつ蛋白質（７
９９ＤｒａＩ）が必ずしも必要ではなく、特に７９９Ｄ
ｒａＩのＣ−末端部分は重要ではない。実際、本発明に
おける７９９ＤｒａＩのＣ−末端部分を欠失した誘導体
蛋白質（例えば、７９９ＢｇｌII，７９９ＲＶ，７９９
ＳａｌＩ，Δ７９９，７９９−４５７Δ及び７９９Ｂｓ
ｔＥIIL ）はＣ−末端α−アミド化酵素活性を示してい
る。
【０１３８】しかし、（３）７９９ＢｓｔＥIIS はこの
活性を示さないことから、少なくても、ｐＸＡ７９９の
ｃＤＮＡにコードされている蛋白質のアミノ酸配列番号
１から３２９までのアミノ酸一次配列に規定される蛋白
質がＣ−末端α−アミド化酵素活性に必要である。さら
に、（４）表２に示す、７９９ＤｒａＩをはじめとす
る、各種誘導体の酵素活性の値は、これらの蛋白質を、
大腸菌内で発現させ、実施例１４の方法に従って調製し
たサンプルを発現菌体あたりに換算した値を示してあ
る。したがって、この値から、ただちに個々の蛋白質mg
あたりの比活性を求めることはできない。これは個々の
菌体あたりの発現蛋白質量が異るためである。
【０１３９】
【発明の効果】本発明では上記のようにアフリカツメガ
エル体皮よりＣ−末端α−アミド化酵素のｃＤＮＡを単
離、その構造を明らかにし、さらに組換宿主細胞におい
て大量に発現させることに成功した。本発明におけるｃ
ＤＮＡを用いれば、宿主細胞は単に大腸菌のみならず他
の宿主細胞、例えば酵母または他の真核細胞においても
大量に発現させうる。この酵素を工業的に製造し、ペプ
チドまたは蛋白質の生理活性に重要であるＣ−末端α−
カルボキシル基のアミド化に用いれば、生理活性物質の
製造が効率的に行え、かつ容易になる。さらに、酵素の
基質としてのペプチドまたは蛋白質は、合成した基質だ
けでなく、天然由来の、または組換ＤＮＡ技術によるも
のでもよく、Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙの構造をもつものであれば
どんなものでも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡの塩基配列とこ
のｃＤＮＡコードされているアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡの塩基配列とこ
のｃＤＮＡコードされているアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡの塩基配列とこ
のｃＤＮＡコードされているアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡの塩基配列とこ
のｃＤＮＡコードされているアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、ｐＸＡ４５７ｃＤＮＡの塩基配列とこ
のｃＤＮＡコードされているアミノ酸配列を示す。
【図６】図６はＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配
列を示す。
【図７】図７はＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配
列を示す。
【図８】図８はＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ酸配
列を示す。
【図９】図９はプレＣ−末端α−アミド化酵素のアミノ
酸配列を示す。
【図１０】図１０はプレＣ−末端α−アミド化酵素のア
ミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１はプレＣ−末端α−アミド化酵素のア
ミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２はプレプロＣ−末端α−アミド化酵素
のアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３はプレプロＣ−末端α−アミド化酵素
のアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４はプレプロＣ−末端α−アミド化酵素
のアミノ酸配列を示す。
【図１５】図１５は Native enzymeのＮ−末端（Ｎ−ｔ
ｅｒｍ）および Native enzymeのトリプテックフラグメ
ント（Ｔ−）のアミノ酸配列を示す。
【図１６】図１６はＣ−末端α−アミド化酵素（Xenopu
s laevis体皮由来）ｃＤＮＡの単離に用いたＤＮＡ混合
プローブ（ＹＳＯ１２，ＹＳＯ１３、及びＹＳＯ１５）
のデザインを示すものである。
【図１７】図１７はｐＸＡ４５７ｃＤＮＡの制限酵素地
図（ａ）及びｃＤＮＡ塩基配列決定のストラテジー
（ｂ）を示す。
【図１８】図１８はｐＵＣ１８ＸＡ（ＥｃｏＲＩ）プラ
スミドの構築を示す。
【図１９】図１９はｐｔｒｐＸＡＳＴ４プラスミドの構
築を示す。
【図２０】図２０はＸＡ発現プラスミドｐｔｒｐＸＡＳ
Ｔ８の構築を示す。
【図２１】図２１はＤＮＡリンカーＦのデザインを示
す。
【図２２】図２２はｐｔｒｐＸＡＳＴ４プラスミドの構
築を示す。
【図２３】図２３はＸＤＡ発現プラスミドｐｔｒｐＸＡ
ＳＴ８の構築を示す。
【図２４】図２４において、（ａ）はＷ３１１０，Ｗ３
１１０／ｐｔｒｐＸＡＳＴ８およびＷ３１１０／ｐｔｒ
ｐＸＤＡＳＴ８の全蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
析を、（ｂ）はＸＡ，ＸＤＡおよび Native enzymeのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の比較分析を示すものであ
る。
【図２５】図２５はＸＡ、及びＸＤＡのＣ−末端α−ア
ミド化酵素活性の測定結果を示す。
【図２６】図２６は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列を示
す。
【図２７】図２７は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列を示
す。
【図２８】図２８は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列を示
す。
【図２９】図２９は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列を示
す。
【図３０】図３０は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列を示
す。
【図３１】図３１は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列を示
す。
【図３２】図３２は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列とこのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列を示
す。
【図３３】図３３は、ｐＸＡ４５７のｃＤＮＡとｐＸＡ
７９９のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。
【図３４】図３４は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡの塩基配
列の決定のためのストラテジーを示す。
【図３５】図３５は、ｐＸＡ４５７とｐＸＡ７９９のｃ
ＤＮＡにコードされている蛋白質のアミノ酸一次配列の
比較を示す。
【図３６】図３６は、ｐＸＡ７９９のｃＤＮＡにコード
されている蛋白質およびその誘導体とこれらに対応する
発現プラスミドを示す。
【図３７】図３７は、ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ）の作
製を示す。
【図３８】図３８は、ｐＵＣＰL ＣＩの作製を示す。
【図３９】図３９は、ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＤｒａＩの
作製を示す。
【図４０】図４０は、ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｇｌIIの
作製を示す。
【図４１】図４１は、ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＲＶの作製
を示す。
【図４２】図４２は、ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＳａｌＩの
作製を示す。
【図４３】図４３は、ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥII
L の作製を示す。
【図４４】図４４は、ｐＵＣＰL ＣＩ７９９ＢｓｔＥII
S の作製を示す。
【図４５】図４５は、ｐＸＡ７９９（ＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩ）の作製を示す。
【図４６】図４６は、ｐｔｒｐΔ７９９の作製を示す。
【図４７】図４７は、ｐｔｒｐ７９９−４５９Δの作製
を示す。
【図４８】図４８は、ｐＵＣ−ＰL −ｔｒｐａの作製を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 田中 正治 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社 生物医学研究 所内 (72)発明者 水野 健作 宮崎県宮崎郡清武町大字木原450番地 (72)発明者 松尾 壽之 宮崎県宮崎郡清武町大字木原6653番地 (72)発明者 北野 勝彦 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社 生物医学研究 所内 (56)参考文献 ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．Ｒ ＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．，137（３) （1986），Ｐ．984−991

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の式（Ｉ）で示されるペプチド又は
    蛋白質： Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （Ｉ） （式中、Ｘはアミド化されるべき任意のアミノ酸を表
    し、ＧｌｙはＣ末端部のグリシン残基を表し、そしてＲ
    は前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分を表す）を、以
    下の式（II）で示されるＣ末端アミド化ペプチド又はＣ
    末端アミド化蛋白質： Ｒ−Ｘ−ＮＨ2 （II） （式中、Ｘ−ＮＨ2 はアミド化されたＣ末端アミノ酸を
    表し、そしてＲは前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分
    を表す）に変換するアミド化反応に関与する蛋白質であ
    って、以下のアミノ酸配列： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 の内、少なくとも第６位のＣｙｓから第３２９位のＨｉ
    ｓまでのアミノ酸配列を有する蛋白質（但し、前記アミ
    ノ酸配列において、第１位のＳｅｒから第３４６位のＬ
    ｙｓまでのアミノ酸から成り、但しａａ３はＰｈｅであ
    り、ａａ４はＩｌｅであり、ａａ５はＭｅｔであり、ａ
    ａ６はＡｒｇであり、ａａ７はＡｓｎであり、ａａ８は
    Ｖａｌであり、ａａ９はＧｌｎであり、ａａ１０はＶａ
    ｌであり、ａａｌｌはＡｓｐであり、ａａ１２はＩｌｅ
    であり、ａａ１３はＧｌｕであり、ａａ１４はＡｌａで
    あり、ａａ１５はＳｅｒであり、ａａ１６はＶａｌであ
    り、ａａ１７はＴｈｒであり、ａａ１８はＳｅｒであ
    り、ａａ１９はＡｓｎであり、ａａ２０はＧｌｕであ
    り、ａａ２１はＧｌｎであり、ａａ２２は存在せず、ａ
    ａ２３は存在せず、ａａ２５はＨｉｓであり、ａａ２６
    はＨｉｓであり、ａａ２７はＴｈｒであり、ａａ２８は
    Ｇｌｕであり、ａａ２９はＡｌａであり、ａａ３０はＧ
    ｌｕであり、ａａ３１はＰｒｏであり、ａａ３２はＧｌ
    ｕであり、ａａ３３はＬｙｓであり、ａａ３４はＡｓｎ
    であり、ａａ３５はＴｈｒであり、そしてａａ３６はＧ
    ｌｙであるアミノ酸配列を有する蛋白質を除く）をコー
    ドするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 以下の式（Ｉ）で示されるペプチド又は
    蛋白質： Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （Ｉ） （式中、Ｘはアミド化されるべき任意のアミノ酸を表
    し、ＧｌｙはＣ末端部のグリシン残基を表し、そしてＲ
    は前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分を表す）を、以
    下の式（II）で示されるＣ末端アミド化ペプチド又はＣ
    末端アミド化蛋白質： Ｒ−Ｘ−ＮＨ2 （II） （式中、Ｘ−ＮＨ2 はアミド化されたＣ末端アミノ酸を
    表し、そしてＲは前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分
    を表す）に変換するアミド化反応に関与する蛋白質であ
    って、以下のアミノ酸配列： 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 の内、少なくとも第６位のＣｙｓから第３２９位のＨｉ
    ｓまでのアミノ酸配列を有する蛋白質（但し、前記アミ
    ノ酸配列において、第１位のＳｅｒから第３４６位のＬ
    ｙｓまでのアミノ酸から成り、但しａａ３はＰｈｅであ
    り、ａａ４はＩｌｅであり、ａａ５はＭｅｔであり、ａ
    ａ６はＡｒｇであり、ａａ７はＡｓｎであり、ａａ８は
    Ｖａｌであり、ａａ９はＧｌｎであり、ａａ１０はＶａ
    ｌであり、ａａｌｌはＡｓｐであり、ａａ１２はＩｌｅ
    であり、ａａ１３はＧｌｕであり、ａａ１４はＡｌａで
    あり、ａａ１５はＳｅｒであり、ａａ１６はＶａｌであ
    り、ａａ１７はＴｈｒであり、ａａ１８はＳｅｒであ
    り、ａａ１９はＡｓｎであり、ａａ２０はＧｌｕであ
    り、ａａ２１はＧｌｎであり、ａａ２２は存在せず、ａ
    ａ２３は存在せず、ａａ２５はＨｉｓであり、ａａ２６
    はＨｉｓであり、ａａ２７はＴｈｒであり、ａａ２８は
    Ｇｌｕであり、ａａ２９はＡｌａであり、ａａ３０はＧ
    ｌｕであり、ａａ３１はＰｒｏであり、ａａ３２はＧｌ
    ｕであり、ａａ３３はＬｙｓであり、ａａ３４はＡｓｎ
    であり、ａａ３５はＴｈｒであり、そしてａａ３６はＧ
    ｌｙであるアミノ酸配列を有する蛋白質を除く）をコー
    ドするＤＮＡを含んで成る発現ベクター。
  3. 【請求項３】 前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡの
    ５′側上流に、前駆体ペプチドをコードするＤＮＡをさ
    らに含んで成る請求項２に記載の発現ベクター。
  4. 【請求項４】 前記前駆体ペプチドが下記のアミノ酸配
    列： aa59 aa60 Met Ala Ser Leu aa61 Ser Ser aa62 Leu Val Leu Phe Leu -35 -30 -25 aa63 Phe Gln Asn Ser Cys Tyr Cys Phe Arg Ser Pro Leu Ser Val -20 -15 -10 Phe Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Thr Arg -5 -1 （式中、ａａ５９は存在しないか又はＭｅｔを表し、ａ
    ａ６０は存在しないか又はＡｓｐを表し、ａａ６１はＳ
    ｅｒ又はＩｌｅを表し、ａａ６２はＰｈｅ又はＬｅｕを
    表し、ａａ６３はＬｅｕ又はＩｌｅを表す）と実質的に
    同一のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の発現ベ
    クター。
  5. 【請求項５】 以下の式（Ｉ）で示されるペプチド又は
    蛋白質： Ｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （Ｉ） （式中、Ｘはアミド化されるべき任意のアミノ酸を表
    し、ＧｌｙはＣ末端部のグリシン残基を表し、そしてＲ
    は前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分を表す）を、以
    下の式（II）で示されるＣ末端アミド化ペプチド又はＣ
    末端アミド化蛋白質： Ｒ−Ｘ−ＮＨ2 （II） （式中、Ｘ−ＮＨ2 はアミド化されたＣ末端アミノ酸を
    表し、そしてＲは前記ペプチド又は蛋白質の残りの部分
    を表す）に変換するアミド化反応に関与する蛋白質であ
    って、以下のアミノ酸配列： 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 の内、少なくとも第６位のＣｙｓから第３２９位のＨｉ
    ｓまでのアミノ酸配列を有する蛋白質（但し、前記アミ
    ノ酸配列において、第１位のＳｅｒから第３４６位のＬ
    ｙｓまでのアミノ酸から成り、但しａａ３はＰｈｅであ
    り、ａａ４はＩｌｅであり、ａａ５はＭｅｔであり、ａ
    ａ６はＡｒｇであり、ａａ７はＡｓｎであり、ａａ８は
    Ｖａｌであり、ａａ９はＧｌｎであり、ａａ１０はＶａ
    ｌであり、ａａｌｌはＡｓｐであり、ａａ１２はＩｌｅ
    であり、ａａ１３はＧｌｕであり、ａａ１４はＡｌａで
    あり、ａａ１５はＳｅｒであり、ａａ１６はＶａｌであ
    り、ａａ１７はＴｈｒであり、ａａ１８はＳｅｒであ
    り、ａａ１９はＡｓｎであり、ａａ２０はＧｌｕであ
    り、ａａ２１はＧｌｎであり、ａａ２２は存在せず、ａ
    ａ２３は存在せず、ａａ２５はＨｉｓであり、ａａ２６
    はＨｉｓであり、ａａ２７はＴｈｒであり、ａａ２８は
    Ｇｌｕであり、ａａ２９はＡｌａであり、ａａ３０はＧ
    ｌｕであり、ａａ３１はＰｒｏであり、ａａ３２はＧｌ
    ｕであり、ａａ３３はＬｙｓであり、ａａ３４はＡｓｎ
    であり、ａａ３５はＴｈｒであり、そしてａａ３６はＧ
    ｌｙであるアミノ酸配列を有する蛋白質を除く）をコー
    ドするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換
    された原核細胞又は真核細胞から成る群から選択される
    組換え細胞。
  6. 【請求項６】 前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡの
    ５′側上流に、前駆体ペプチドをコードするＤＮＡをさ
    らに含んで成る請求項５に記載の組換え細胞。
  7. 【請求項７】 前記前駆体ペプチドが下記のアミノ酸配
    列： aa59 aa60 Met Ala Ser Leu aa61 Ser Ser aa62 Leu Val Leu Phe Leu -35 -30 -25 aa63 Phe Gln Asn Ser Cys Tyr Cys Phe Arg Ser Pro Leu Ser Val -20 -15 -10 Phe Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Thr Arg -5 -1 （式中、ａａ５９は存在しないか又はＭｅｔを表し、ａ
    ａ６０は存在しないか又はＡｓｐを表し、ａａ６１はＳ
    ｅｒ又はＩｌｅを表し、ａａ６２はＰｈｅ又はＬｅｕを
    表し、ａａ６３はＬｅｕ又はＩｌｅを表す）と実質的に
    同一のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の組換え
    細胞。
  8. 【請求項８】 前記原核細胞が細菌である、請求項５〜
    ７のいずれか１項に記載の組換え細胞。
  9. 【請求項９】 前記細菌が大腸菌である、請求項８に記
    載の組換え細胞。
  10. 【請求項１０】 前記真核細胞が酵母である、請求項５
    〜７のいずれか１項に記載の組換え細胞。
  11. 【請求項１１】 前記真核細胞が動物細胞である、請求
    項５〜７のいずれか１項に記載の組換え細胞。
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