JP3257119B2 - プロティンジスルフィドイソメラーゼ活性物質およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プロティンジスルフィ
ドイソメラーゼ（以下「ＰＤＩ」と略記する）活性物質
およびその製造方法に関する。より具体的には、フミコ
ーラ（Ｈumicola ）属に属する微生物により産生される
高耐熱性ＰＤＩ活性物質およびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般的に、ＰＤＩはタンパク質中のジス
ルフィド交換を触媒する作用を有するので、例えば、大
腸菌や枯草菌などの原核細胞を宿主として生産される組
み換え型タンパク質のリフォールディングへの適用が考
えられている。ここで、リフォールディングとは、誤っ
たジスルフィド結合のかかりかたをしていることにより
本来の生理活性を示さないタンパク質を正しいジスルフ
ィド結合にかけ直すことにより活性型に変換することを
いう。

【０００３】従来、上記のようなジスルフィド結合の不
備による不活性型組み換えタンパク質のリフォールディ
ングには、化学的な酸化還元反応を利用する方法（特開
平１−１３１１９５号公報）やＰＤＩを用いる方法（特
開昭６３−２９４７９６号公報）がすでに知られてい
る。ＰＤＩは生体内で実際にタンパク質のジスルフィド
結合形成に働いている酵素と考えられているので、それ
を生体外での反応に利用しようとする発想はきわめて合
理的である。

【０００４】ＰＤＩの存在は哺乳動物の各組織に幅広く
分布しており、とくにジスルフィド結合を有するタンパ
ク質の合成や分泌が盛んな臓器（肝臓、膵臓、脾臓、リ
ンパ組織など）で活性が高いことが知られている（Ｈil
lson, Ｄ．Ａ.,Ｌambert, Ｎ.,Ｆreedman,Ｒ．Ｂ.,Ｍet
hods in Ｅnzymology , １０７，２８１−２９４，１９
８４）。しかし最近になり、哺乳動物以外にも緑藻（Ｋ
aska, Ｄ．Ｄ.,Ｋivirikko, Ｋ，Ｉ.,Ｍyllylae,Ｒ．：
Ｂiochemical Ｊournal，２６８，６３−６８、１９９
０）や酵母（Ｍizunaga,Ｔ．，Ｋatakura,Ｙ.,Ｍiura,
Ｔ.,Ｍarugama.Ｙ．Ｊournal of Ｂiochemistry , １０
８，８４６〜８５１，１９９０）にその存在が知られる
ようになってきた。

【０００５】ＰＤＩを組み換えタンパク質のリフォール
ディングに用いるにあたり、安定的かつ大量にＰＤＩを
得ることが必要となる。そのための方法として、ウシＰ
ＤＩの遺伝子をクローニングし、大腸菌等の宿主に形質
転換し、こうして得られた形質転換体を培養して培養物
よりＰＤＩを採取する方法も知られている（特開昭６４
−２００８６号公報）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＰＤＩ
をリフォールディングに用いるに際して、安定供給が可
能になればすべての問題点が解決されるわけではなく、
反応に用いるＰＤＩの性質が重要となる。

【０００７】今までに発見されたＰＤＩは哺乳動物由来
のため、熱に対する安定性が悪いという欠点があった。
また酵母ＰＤＩはウシＰＤＩよりもさらに耐熱性に乏し
いとの報告もある（上記Ｍizunaga ら、参照) 。一般的
に、耐熱性の高いタンパク質はその他の物理化学的安定
性が高いとされており、従来のＰＤＩよりもより耐熱性
の高いＰＤＩが求められていた。従って、本発明の目的
は従来知られているＰＤＩよりもさらに安定性の高いＰ
ＤＩを提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、カビがＰ
ＤＩ活性物質を産生することは知られていないが、酵母
および哺乳動物にかかる活性物質が存在することと、酵
母から哺乳動物への進化系列とを考慮してカビに注目し
た。とりわけ、カビの中でも高温で生育可能なカビを対
象としＰＤＩ活性物質の産生能の有無について調べてき
た。その結果、フミコーラ（Ｈumicola)属に属する一菌
株がＰＤＩ活性物質を産生し、そしてこの物質（タンパ
ク質）はウシＰＤＩと比較したところ耐熱性にすぐれ
（すなわち、作用適温の上限が高い）、かつ、リフォー
ルディング反応に際して一般的に添加が必要とされるス
ルフヒドリル基含有還元剤、例えばジチオスレイトール
（以下、「ＤＴＴ」と略記する）に対し幅広い濃度耐性
を有することを見い出し本発明を完成した。

【０００９】従って、本発明によれば、高耐熱性のプロ
ティンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）活性物質が
提供される。

【００１０】本発明のPDI活性物質は、 Ａ）タンパク質中のジスルフィド交換を触媒する作用を
有し、 Ｂ）リボヌクレアーゼＡを基質とし、 Ｃ）作用適温が20℃〜70℃にあり、 Ｄ）温度安定性は、pH7.5にて30分間加熱した場合、60
℃以下では不活性化せず、80℃にて最大活性の50％が維
持され、90℃にて最大活性の30％が維持され、 Ｅ）作用pHは７〜10であり、至適pHは９であり、 Ｆ）安定pHが6〜9にあり、そして Ｇ）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定
したときの分子量が約60,000〜62,000である、ことによ
り特徴付けられる。かかるPDI活性物質は、上述のよう
に作用適温の上限が高く、DTTに対して幅広い濃度耐性
を持っているため、組み換えタンパク質をリフォールデ
ィングするに際し、既知のPDI活性物質より広い温度範
囲とDTT濃度範囲を設定することができるので操作性の
点で有利である。

【００１１】このようなＰＤＩ活性物質は、その取得源
や製造方法により限定されるものでないが、例えばもう
一つの本発明として提供されるフミコーラ属に属する微
生物を使用する後述の製造方法によって効率よく製造す
ることができる。例えば、フミコーラ・インソレンス
（Ｈumicola insolens）から生産されうるＰＤＩ活性物
質は、添付配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列
を有し、上記特性に加え、さらに次のような性質を併せ
もつ。

【００１２】Ｆ）ｐＨ、温度による失活条件：３０分間
の処理時間ではｐＨ６〜９で安定であるが、ｐＨ５で７
０％に、ｐＨ１０で４０％に活性が低下する。 Ｇ）阻害、活性化および安定化：Ｎ−エチルマレイミド
１ｍＭにさらすと完全に失活する。バシトラシンに対し
ては０．２ｍｇ／ｍＬで安定であるが、２ｍｇ／ｍＬに
なると２０％に活性が低下する。

【００１３】以上は、フミコーラ・インソレンスの培養
菌体をアルミナを加えて摩砕し、中性抽出し、次いで、
遠心分離後、抽出液をＤＥＡＥ−セルロースによりイオ
ン交換クロマトグラフィーにかけ、さらに活性分画をコ
ンカナバリンＡアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製して得たものである。また、活性物質の力価の測
定は、ウシ膵臓由来リボヌクレアーゼＡ（ＲＮase −
Ａ）のジスルフィド結合をいったん還元開裂させた後、
再度結合させるときに元とは異なる位置で結合させ、リ
ボヌクレアーゼの活性が失われるようにする（スクラン
ブル化）。こうして、スクランブル化したリボヌクレア
ーゼＡ（以下、「ＳＣ−ＲＮase Ａ」と略記する）を基
質として、ＤＴＴ存在下で活性物質を作用させ、リフォ
ールディングの結果活性化されたＲＮase −Ａによるリ
ボ核酸の分解を測定する。このさいの吸光度（Ａ₂₆₀ ）
の増加をもってＰＤＩ活性物質の活性を決定する方法に
従った。

【００１４】さらに、本発明の活性物質は、より具体的
には次の３種の反応を触媒することが確認された。 ａ）溶存酸素または酸化型グルタチオンの存在下で、タ
ンパク質中のスルフヒドリル基（−ＳＨ）をジスルフィ
ド（−Ｓ−Ｓ−）結合に酸化する（酸化反応）。 ｂ）ＤＴＴまたは還元型グルタチオンの存在下で、タン
パク質中のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を交換
する（異性化反応、リフォールディング反応）。 ｃ）ＤＴＴまたは還元型グルタチオンの存在下で、タン
パク質中のジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元
する（還元反応）。

【００１５】従って、本発明のＰＤＩ活性物質は、これ
らの反応を伴ういずれの反応にも用いることができる
が、実用上最も期待されるのはｂ）の異性化反応であ
る。近年、分子内にジスルフィド結合を有するタンパク
質を遺伝子工学技術を用いて大量生産することが行われ
ている。このような生産に際し、宿主として大腸菌等の
原核細胞を使用したときは、正しいジスルフィド結合が
形成されずそのために不活性型のタンパク質が生産され
るケースがある。ＰＤＩ活性物質はそのようなタンパク
質に作用して天然型の正しいジスルフィド結合を形成さ
せ、その結果、処理対象とするタンパク質本来の生理活
性を回復せしめることができるからである。かかる処理
の対象となるタンパク質としては、分子内にジスルフィ
ド結合をもち、かつその結合が生理活性の発現に必須な
ものであって、例えば、リボヌクレアーゼＡ、インスリ
ン、アプロチニン、ヒト成長ホルモンおよびインターフ
ェロン（α，β、γ）等が挙げられる。

【００１６】上述のように、本発明のＰＤＩ活性物質
は、既知のＰＤＩに比し、耐熱性に優れているのに加
え、上記異性化反応を行う場合に共存するＤＴＴまたは
還元型グルタチオンに対して有効濃度範囲が広く、各種
応用面で有利に使用することができる。

【００１７】本発明はまた、上記ＰＤＩ活性物質の製造
方法、すなわち、フミコーラ属に属する微生物を栄養培
地で培養し、培養物からＰＤＩ活性物質を採取すること
を特徴とする高耐熱性ＰＤＩ活性物質の製造方法も提供
する。

【００１８】本発明で使用する微生物は、フミコーラ属
に属し、上記高耐熱性ＰＤＩ活性物質の産生能を有する
ものであれば、その種を問うことなく使用することがで
きるが、本発明者らにより熊本県の地獄谷温泉近くの源
泉近くの土壌より単離され、フミコーラ・インソレンス
（Ｈumicola insolens）ＫＡＳＩと同定され、工業技術
院微生物工業技術研究所に平成４年４月２日付で寄託さ
れた微工研菌寄第１２９１１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９
１１）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され
た微工研条寄第４２３９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３
９）の菌株を使用するのが好ましい。なお、ＦＥＲＭ
ＢＰ−４２３９菌株は、それをマルトエキス寒天平板培
地、ポテトデキストロース寒天平板培地およびＹｐＳｓ
寒天平板培地に接種し、２５，３７，４３または５０
℃、３〜１４日間培養後、生育したカビ集落の色調、組
織及び分生子形成構造等の観察を行ったところ、下記の
ような菌学的性状を示し、これらをＤ．Ｇ．Ｃooney お
よびＲ．Ｅmersonの、“Ｔhermophilic Ｆungi”，７２
〜７９頁（１９６４）（Ｗ．Ｈ．ＦＲＥＥＭＡＮ ＡＮ
Ｄ ＣＯＭＰＡＮＹ発行）を参照にＨumicola insolens
と同定されたものである。

【００１９】 ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３９菌株の性状 ─────────────────────────── 項 目 性 状（YpSs寒天平板培地） ─────────────────────────── 生 育 速 度 集落の直径３〜４cm（３７℃，３日） ５０℃での生育 生育する 集落表面の色 白色〜灰褐色 分生子形成方法 菌糸の中間、先端及び菌糸からの 短い分枝上に形成 単独又は連鎖 分生子の形態 亜球形〜楕円形〜フラスコ形 ───────────────────────────

【００２０】この菌株の培養に使用される栄養培地は、
通常、真菌類の培養に使用されている培地が使用でき、
それらの固体培地及び液体培地が同様に使用できるが、
菌体を採取する観点からは液体培地が好ましい。具体的
な培地としては、麦芽エキス培地、合成コール培地、バ
レイショ・ブドウ糖培地及びツァペック培地が挙げられ
る。培養条件は、培養温度３０〜５０℃（なお、上記菌
株の最高生育温度は５５℃にある）にて、培養期間３〜
６日間と設定するのが好ましい。

【００２１】こうして得られる培養物からの菌体の抽出
には、ｐＨを６〜９とした各種の塩類緩衝液が使用でき
る。なお、当該カビ菌体中にはＰＤＩ活性物質を分解す
る作用をもつプロテアーゼが共存するため、ＰＤＩ活性
物質の採取に際して適当なプロテアーゼインヒビターを
添加しておくことが望ましい。使用に適するインヒビタ
ーとしては、セリンプロテアーゼインヒビター、酸性プ
ロテアーゼインヒビター、金属プロテアーゼインヒビタ
ーが挙げられる。また、菌体を抽出するさいには、菌体
を破砕するための助剤としてアルミナを用いることが望
ましい。

【００２２】抽出、破砕された菌体処理物の中から、目
的とするＰＤＩ活性物質を精製分離するための方法とし
ては、通常、菌体処理物からタンパク質の単離に使用さ
れる精製法を用いることが可能である。具体的には、塩
析法、有機溶媒沈殿法、限外濾過法、等電点沈殿法など
が利用でき、また、本発明ＰＤＩ活性物質は、熱に安定
であるため、その活性が失活しない条件での熱処理法も
用いることができる。さらなる精製法として、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー等を使用することができ
る。こうして得られた本発明のＰＤＩ活性物質の特性は
上述したとおりである。

【００２３】本発明の方法は、哺乳動物の組織を使用す
る方法に比べ、培養が容易で、かつ大量に菌体を処理す
ることができるので有利である。

【００２４】

【実施例】以下、具体例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでな
い。

【００２５】例１：培養 ポテトデキストロース寒天培地上に生育したフミコーラ
・インソレンス（Ｈumicola insolens）ＫＡＳＩ（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４２３９）を１白金耳とり、麦芽エキス液
体培地を入れたシャーレに播種した。５０℃、４〜６日
間培養の後、培地表面に生育したカビ菌体をガーゼ上に
集め、次いで水洗いして菌体に付着した培地成分を除去
した。

【００２６】例２：カビ菌体からのＰＤＩの抽出と精製 例１で得たカビ菌体２０ｇに対し、１０倍量の抽出液
（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７、１０ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸、１ｍＭフェニルメチルスルホン
酸フルオリド、１ｍＭトシルリジンクロロメチルケト
ン、５０μｇ／ｍｌアプロチニン、５０μｇ／ｍｌ大豆
トリプシンインヒビター含有）を加え、適当量のアルミ
ナを加え乳鉢中で摩砕抽出した。１×１０⁴ ｇ、１０分
間の遠心分離後、上清液をとり、２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ７．５、１０ｍＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）で平衡化させたＤＥＡＥ−セルロース
（カラム容量１０ｍｌ、流速２０ｍｌ／ｈ）に添加し、
次いで溶出した。同緩衝液で素通り画分を溶出した後、
同緩衝液に０．５ＭＮａＣｌを添加した液による直線濃
度勾配溶出を行った。

【００２７】ＰＤＩ活性を含む分画を集め、２０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液、０．５Ｍ食塩、ｐＨ７．５にて平衡
化したコンカナバリンＡ−セファロース（カラム容量１
ｍｌ、流速１０ｍｌ／ｈ）に添加した。同緩衝液にて素
通り画分を溶出後、０．５Ｍα−メチルマンノシドを含
む同緩衝液にて溶出した。ＰＤＩ活性はこの０．５Ｍα
−メチルマンノシドによる溶出画分に認められ、２０ｇ
のカビ菌体よりＰＤＩ約２０μｇを得た。

【００２８】さらに、このＰＤＩ活性画分を逆相モード
による高速液体クロマトグラフィーにて精製を行った。
すなわち、ブチル基をポリマーベースに結合させた逆相
用カラム（Ｃ４Ｐ−５０、旭化成）をあらかじめ１０ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７にて平衡化させ、そこ
にＰＤＩ活性を含むコンカナバリンＡ−セファロース溶
出液を添加した。同緩衝液にて素通り画分を溶出させた
のち、アセトニトリル濃度を直線的に増加させてＰＤＩ
活性物質を溶出した。ここまでの精製で得られたＰＤＩ
活性物質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて分
析したところ、本物質は１本のバンドを示し、純品であ
ることがわかった。その分子量は、同時に泳動した分子
量既知のマーカーの泳動度から６０，０００〜６２，０
００と計算された。以上により、２０ｇのカビ菌体から
最終的に１２μｇの純品のＰＤＩ活性物を得た。

【００２９】こうして得られた純品のＰＤＩ活性物を既
知のタンパク質アミノ酸組成分析（例えば、R. L. Henr
ikson, S.C. Meredith, Anal. Biochem., 136 65(198
4)）に従って組成分析した。すなわち、得られたＰＤＩ
活性物質は同一のサブユニット２個からなる２量体で産
生されることが推定される。得られたタンパク質を、ま
ず、６Ｎ塩酸中にて１１０℃２４時間加水分解したのち
ウォーターズ社製アミノ酸組成分析用ピコタグシステム
にて分析した。システィンについてはあらかじめカビＰ
ＤＩを過ギ酸酸化したのち６Ｎ塩酸で加水分解し、シス
ティン酸として定量した。得られたアミノ酸組成値を第
１表に示す。

【００３０】 表 １ ＰＤＩ活性物質のアミノ酸組成 ───────────────────────── １分子当たりの残基数 アミノ酸 ────────────── 実験値 理論値 ───────────────────────── Ａｓｐ／Ａｓｎ ４４．２ ４６ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ ６８．０ ６６ Ｈｉｓ ４．５ ５ Ａｒｇ ７．５ ７ Ｌｙｓ ５２．３ ５１ Ｃｙｓ ５．７ ６ Ｇｌｙ ２６．３ ２５ Ｓｅｒ ２２．９ ２４ Ｔｈｒ ３０．８ ３２ Ｔｙｒ １８．７ １７ Ａｌａ ６１．４ ６３ Ｖａｌ ３２．１ ３４ Ｌｅｕ ２７．９ ２９ Ｉｌｅ ２６．４ ２７ Ｍｅｔ １．７ ２ Ｐｈｅ ２８．０ ２６ Ｐｒｏ ２５．１ ２３ Ｔｒｐ １．８ ２ ─────────────────────────

【００３１】次に、常法に従い、気相式自動アミノ末端
アミノ酸配列分析機（アプライドバイオシステムズ社製
４７３Ａ型、米国）を用いてＮ末端のアミノ酸配列分析
を行い、そしてヒドラジン分解法（Ｊ．Ｂiochem. 59,
170(1966))によりＣ末端のアミノ酸を決定して、上記Ｐ
ＤＩ活性物質が添付配列表の配列番号１に示される配列
をもつことを確認した。

【００３２】この配列によれば、アミノ酸番号２９〜３
４、３６４〜３６９の２箇所にＰＤＩの活性部位と考え
られる部位が存在し、これらの配列は他起源（ヒト、ウ
シ、ラット、酵母、など）のＰＤＩとも共通している。
また、Ｃ末端側の４８２−４８５には細胞内小器官であ
る粗面小胞体への残留シグナルがある。従って、カビＰ
ＤＩは粗面小胞体に結合して存在すると考えられる。こ
の点も他起源ＰＤＩと共通する。またさらに、上記のよ
うな共通性のある部分もあるが、カビＰＤＩの配列は他
起源のＰＤＩとは全体として異なっており、これが新規
なＰＤＩであることを証明するものである。

【００３３】例３：ＰＤＩ活性測定法 ウシ膵臓由来リボヌクレアーゼＡ（ＲＮase ）をスクラ
ンブル化し、不活性化したものを、ＰＤＩ活性物質の基
質に用いた。スクランブル化については、文献（Ｈills
on, Ｄ．Ａ.,Ｌambert, Ｎ.,Ｆreedman,Ｒ．Ｂ.,Ｍetho
ds in Ｅnzymology,１０７，２８１〜２９５，１９８４
を参照）に従った。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ７．５、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
中でＳＣ−ＲＮase ５μＭ、ジチオスレイトール５μＭ
を添加し、ＰＤＩを加えて３０℃３０分間反応させた。
反応前と反応後よりそれぞれ５μｌをとり、リボ核酸
（０．１ｍｇ／ｍｌ）４９５μｌと合わせ、分解される
リボ核酸の量を２６０ｎｍにおける吸光度の上昇で測定
した。この吸光度の１分間当りの増加率をもってＰＤＩ
の活性とした。

【００３４】例４：ＰＤＩ活性物質の性状 （ａ）ＰＤＩ活性物質の作用 上記の同様の方法で、ニワトリ卵白由来リゾチームとウ
シ膵臓由来アプロチニンをスクランブル化したものに対
し、カビＰＤＩを作用させた。その結果ＲＮase と同様
にリゾチーム及びアプロチニン活性の回復がみとめられ
た。

【００３５】（ｂ）温度安定性 本発明のＰＤＩ活性物質と、ウシＰＤＩを、リン酸緩衝
液ｐＨ７．５中で３０℃〜９０℃にて３０分間加温し、
その後残存するＰＤＩ活性を測定した。結果を図１に示
す。なお、図中活性は全く加熱しなかったものを１００
％として表示している。図１から本発明のＰＤＩ活性物
質は、ウシＰＤＩに比べてより高い耐熱性を示した。

【００３６】（ｃ）温度依存性 ＳＣ−ＲＮase を対象とし、本発明のＰＤＩ活性物質と
ウシＰＤＩのリフォールディング反応における温度依存
性をしらべた。結果を図２に示す。いずれも３０℃にお
ける反応時の活性を１００％とした。図２より、本発明
のＰＤＩ活性物質は、５０℃以上における高温側でウシ
ＰＤＩよりも反応性に優れることが判明した。

【００３７】（ｄ）ｐＨ安定性 本発明のＰＤＩ活性物質とウシＰＤＩをｐＨ４〜１２の
ブリットン−ロビンソン緩衝液中で３０℃３０分間放置
し、その後残存活性を測定した。活性はｐＨ７．５で４
℃にて保存した各ＰＤＩの活性を１００％として表示し
た。結果を図３に示す。図３から、本発明のＰＤＩ活性
物質は、ウシＰＤＩに比べ弱酸性側でやや安定性が高い
傾向がみとめられた。

【００３８】（ｅ）ｐＨ依存性 ＳＣ−ＲＮase を対象とし、本発明のＰＤＩ活性物質と
ウシＰＤＩのリフォールディング時のｐＨを変化させて
活性を調べた。活性はいずれもｐＨ９が最大であったの
で、その活性を１００％とする相対活性で表示した。結
果を図４に示す。本発明のＰＤＩ活性物質は、ウシＰＤ
Ｉに比べＳＣ−ＲＮase に対してアルカリ性側で活性が
高く、酸性側でその活性がやや低い傾向がみとめられ
た。

【００３９】（ｆ）ジチオスレイトール濃度の影響 ＰＤＩをリフォールディング反応に用いる場合、ジチオ
スレイトールもくしは還元型グルタチオンといったＳＨ
還元剤を添加する必要がある。そこで、本発明ＰＤＩ活
性物質とウシＰＤＩ各４０ｎｇについてジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）の濃度による活性の変化を調べた結果を
図５に示す。活性は、それぞれ最大活性を１００％とす
る相対活性で表示した。図５より、ウシＰＤＩはＤＴＴ
１ｍＭに至適濃度をもち、濃度が上昇するにつれて活性
が低下するが、本発明のＰＤＩ活性物質は１〜５０ｍＭ
という広い濃度範囲で安定な活性を示すことが判明し
た。

【００４０】（ｇ）バシトラシン濃度の影響 ウシＰＤＩと酵母ＰＤＩはバチルス・スブチルス由来の
抗生物質であるバシトラシンによって阻害をうけること
が知られている（Ｍizunaga,Ｔ．，Ｋitakura,Ｙ.,Ｍiu
ra, Ｔ.,Ｍarugama.Ｙ．Ｊournal of Ｂiochemislry,１
０８，８４６〜８５１，１９９０参照）。そこで、本発
明ＰＤＩ活性物質についてもバシトラシンの影響をしら
べた。その結果を図６に示す。図６より本発明のＰＤＩ
活性物質は、ウシＰＤＩに比べてバシトラシンに対する
感受性が高いことが判明した。

【００４１】（ｈ）室温長期安定性 本発明のＰＤＩ活性物質と、ウシＰＤＩを、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％ア
ジ化ナトリウム中にて、室温下３３日間放置し、適当な
間かくでＰＤＩ活性を測定して長期安定性を調べた。結
果を図７に示す。なお図中活性は、初日の活性を１００
％として表示している。この結果より、初日の９０％以
上の活性を示す日数はウシＰＤＩが３日であるのに対
し、本発明ＰＤＩは２０日以上であった。さらに、ウシ
ＰＤＩは１５日で完全に活性が失われたが、本発明のＰ
ＤＩは３０日以上にわたって活性が残存した。以上によ
り本発明ＰＤＩはウシＰＤＩよりも室温下での長期安定
性にすぐれることが判明した。

【００４２】

【発明の効果】本発明によれば、高耐熱性プロティンジ
スルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）活性物質及びその効
率のよい製造方法が提供される。本発明のＰＤＩ活性物
質は、作用適温が従来のものに比し高く、また高温（例
えば、５０℃以上）で反応性にすぐれ、さらにＤＴＴの
広い濃度範囲で安定な活性を示すので、特に、一定のタ
ンパク質のリフォールディングに有利に使用することが
できる。また、かかるＰＤＩ活性物質は、高温で生育可
能なフミコーラ・インソレンス（Ｈumicola insolens）
の培養により有利に製造することができる。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４８５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ser Asp Val Val Gln Leu Lys Lys Asp Thr Phe Asp Asp Phe Ile 1 5 10 15 Lys Thr Asn Asp Leu Val Leu Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys 20 25 30 Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Glu Glu Ala Ala Thr 35 40 45 Thr Leu Lys Glu Lys Asn Ile Lys Leu Ala Lys Val Asp Cys Thr 50 55 60 Glu Glu Thr Asp Leu Cys Gln Gln His Gly Val Glu Gly Tyr Pro 65 70 75 Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Leu Asp Asn Val Ser Pro Tyr Lys 80 85 90 Gly Gln Arg Lys Ala Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Met Ile Lys Gln 95 100 105 Ser Leu Pro Ala Val Ser Glu Val Thr Lys Asp Asn Leu Glu Glu 110 115 120 Phe Lys Lys Ala Asp Lys Ala Val Leu Val Ala Tyr Val Asp Ala 125 130 135 Ser Asp Lys Ala Ser Ser Glu Val Phe Thr Gln Val Ala Glu Lys 140 145 150 Leu Arg Asp Asn Tyr Pro Phe Gly Ser Ser Ser Asp Ala Ala Leu 155 160 165 Ala Glu Ala Glu Gly Val Lys Ala Pro Ala Ile Val Leu Tyr Lys 170 175 180 Asp Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Phe Ser Glu Lys Phe Glu Val 185 190 195 Glu Ala Ile Glu Lys Phe Ala Lys Thr Gly Ala Thr Pro Leu Ile 200 205 210 Gly Glu Ile Gly Pro Glu Thr Tyr Ser Asp Tyr Met Ser Ala Gly 215 220 225 Ile Pro Leu Ala Tyr Ile Phe Ala Glu Thr Ala Glu Glu Arg Lys 230 235 240 Glu Leu Ser Asp Lys Leu Lys Pro Ile Ala Glu Ala Gln Arg Gly 245 250 255 Val Ile Asn Phe Gly Thr Ile Asp Ala Lys Ala Phe Gly Ala His 260 265 270 Ala Gly Asn Leu Asn Leu Lys Thr Asp Lys Phe Pro Ala Phe Ala 275 280 285 Ile Gln Glu Val Ala Lys Asn Gln Lys Phe Pro Phe Asp Gln Glu 290 295 300 Lys Glu Ile Thr Phe Glu Ala Ile Lys Ala Phe Val Asp Asp Phe 305 310 315 Val Ala Gly Lys Ile Glu Pro Ser Ile Lys Ser Glu Pro Ile Pro 320 325 330 Glu Lys Gln Glu Gly Pro Val Thr Val Val Val Ala Lys Asn Tyr 335 340 345 Asn Glu Ile Val Leu Asp Asp Thr Lys Asp Val Leu Ile Glu Phe 350 355 360 Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Lys Tyr 365 370 375 Glu Glu Leu Gly Ala Leu Tyr Ala Lys Ser Glu Phe Lys Asp Arg 380 385 390 Val Val Ile Ala Lys Val Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Asp 395 400 405 Glu Ile Gln Gly Phe Pro Thr Ile Lys Leu Tyr Pro Ala Gly Ala 410 415 420 Lys Gly Gln Pro Val Thr Tyr Ser Gly Ser Arg Thr Val Glu Asp 425 430 435 Leu Ile Lys Phe Ile Ala Glu Asn Gly Lys Tyr Lys Ala Ala Ile 440 445 450 Ser Glu Asp Ala Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr Glu Thr Thr Thr 455 460 465 Glu Thr Ala Thr Lys Ser Glu Glu Ala Ala Lys Glu Thr Ala Thr 470 475 480 Glu His Asp Glu Leu 485

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例のＰＤＩ活性物質の温度安定
性を示すグラフである。

【図２】本発明の一実施例のＰＤＩ活性物質のリフォー
ルディング反応における活性の温度依存性を示すグラフ
である。

【図３】本発明の一実施例のＰＤＩ活性物質のｐＨ安定
性を示すグラフである。

【図４】本発明の一実施例のＰＤＩ活性物質のリフォー
ルディング反応における活性のｐＨ依存性を示すグラフ
である。

【図５】本発明の一実施例のＰＤＩ活性物質のＤＴＴ濃
度変化による活性の変化を示すグラフである。

【図６】本発明の一実施例のＰＤＩ活性物質のバシトラ
シンに対する感受性を示すグラフである。

【図７】本発明の一実施例のＰＤＩ活性物質の室温長期
安定性をウシＰＤＩと対比して示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 出木場 千絵 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 星野 文彦 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａ）タンパク質中のジスルフィド交換を
   触媒する作用を有し、 Ｂ）リボヌクレアーゼＡを基質とし、 Ｃ）作用適温が20℃〜70℃にあり、 Ｄ）温度安定性は、pH7.5にて30分間加熱した場合、60
   ℃以下では不活性化せず、80℃にて最大活性の50％が維
   持され、90℃にて最大活性の30％が維持され、 Ｅ）作用pHは７〜10であり、至適pHは９であり、 Ｆ）安定pHが6〜9にあり、そして Ｇ）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定
   したときの分子量が約60,000〜62,000である、フミコー
   ラ（Humicola）属由来の高耐熱性プロティンジスルフィ
   ドイソメラーゼ活性物質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１で示される請求項１
   に記載の高耐熱性プロティンジスルフィドイソメラーゼ
   活性物質。
3. 【請求項３】 請求項１記載の活性物質産生能を有する
   フミコーラ（Ｈumicola ）属に属する微生物を栄養培地
   で培養し、培養物から前記活性物質を採取することを特
   徴とする高耐熱性プロティンジスルフィドイソメラーゼ
   活性物質の製造方法。