ES2295370T3 - Nueva aminopeptidasa derivada de bacillus licheniformis, gen que codifica la aminopeptidasa, vector de expresion que contiene el gen, transformante y metodo para su preparacion. - Google Patents
Nueva aminopeptidasa derivada de bacillus licheniformis, gen que codifica la aminopeptidasa, vector de expresion que contiene el gen, transformante y metodo para su preparacion. Download PDFInfo
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Abstract
Una aminopeptidasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 1.
Description
Nueva aminopeptidasa derivada de Bacillus
licheniformis, gen que codifica la aminopeptidasa, vector de
expresión que contiene el gen, transformante y método para su
preparación.
La presente invención se refiere a una nueva
aminopeptidasa derivada de Bacillus licheniformis, un gen
que codifica la aminopeptidasa, un vector de expresión que contiene
el gen, un transformante de células transfectado con el vector de
expresión y un proceso para preparación de una proteína de tipo
natural utilizando el mismo. Más particularmente, la presente
invención se refiere a un gen que codifica aminopeptidasa que se ha
clonado y fabricado utilizando la técnica de DNA recombinante, un
vector que expresión que contiene el gen, un transformante de
células transfectado con el vector de expresión y una aminopeptidasa
recombinante que es necesaria para producir la hormona de
crecimiento humana recombinante en una proteína de tipo natural y
puede expresarse con alto rendimiento de manera más estable y
ventajosa, en comparación con los métodos convencionales de
purificación.
Por regla general, las proteínas recombinantes
se fabrican como tipos no naturales cuando se expresan en gran
escala por manipulación de genes en microbios. En detalle, la
mayoría de las proteínas recombinantes que se producen tienen un
iniciador, metionina (MET), en el término amino, que se ha tratado
inadecuadamente. Las proteínas recombinantes que contienen
metionina en el término amino podrían inducir reacciones inmunógenas
o volverse inestables de tal modo que no desempeñen un papel
intrínseco de la proteína, en el caso de ser administradas a
humanos u otros animales. Por esta razón, es muy importante
desarrollar un nuevo método para preparar una proteína recombinante
de este tipo como su proteína de tipo natural (véase Nature, 1987,
326, 315; J. Bacteriol., 1987, 169, 751-757;
Bio/Technology, 1990, 8, 1036-1040; Appl.
Microbiol. Biotechnol., 1991, 36,
211-215).
La hormona del crecimiento humana es una hormona
polipeptídica que tiene 22.125 Da de peso molecular, contiene una
secuencia de Phe-Pro-Thr en el
término amino y está compuesta de 191 aminoácidos secretados por la
glándula hipófisis humana y en su mayor parte se ha aplicado para
tratar el enanismo de hipófisis (véase Raben, M.S., J. Clin.
Endocr., 1958, 18, 901). Hasta ahora, la hormona del crecimiento
humana ha sido extraída y purificada a partir de glándulas
hipófisis de los cadáveres, pero es difícil su consecución para
todos los pacientes debido al suministro limitado. Recientemente,
se han realizado varios estudios relacionados con la expresión y
separación de la hormona de crecimiento humana a partir de
Escherichia coli, levadura y análogos por manipulación
génica. Realmente, la hormona del crecimiento humana producida por
la tecnología de DNA ha sido utilizada para aplicaciones clínicas
(en el caso de Escherichia coli, véase la Publicación de
Patente Coreana No. 89-1244 y No.
87-701; las Patentes Coreanas Expuestas al Público
No. 87-2258 y No. 84-8695; en el
caso de la levadura, véase la publicación de Patente Coreana No.
92-99; y las Publicaciones de Patente Coreana
Expuestas al Público No. 90-9973 y No. 90-
9976).
9976).
No obstante, si se produce una hormona de
crecimiento humana por utilización de la tecnología del DNA
recombinante arriba descrita, un residuo metionina, un codón de
iniciación para la síntesis de proteínas se fija adicionalmente en
el término amino excepto 191 residuos de aminoácidos consistentes en
una hormona de crecimiento humana de tipo natural y se produce por
tanto una hormona de crecimiento humana metionilada que se inicia
por la secuencia de
Met-Phe-Pro-Thr del
término amino y está compuesta de 192 residuos de aminoácidos. La
hormona del crecimiento humana metionilada tiene las mismas
actividades biológicas que la del tipo natural de hormona del
crecimiento humana (Moore, J. A., Endocrinology, 1988, 122,
2920-2926) y no se ha publicado hasta ahora que
provoque efectos secundarios por la presencia de la metionina en el
término amino. Sin embargo, podrían generarse anticuerpos en raras
ocasiones debido a la metionina y se ha informado que se producen en
una mayor proporción que los de la hormona del tipo natural
(Lancet, 1986, 29 de marzo, 697).
Por tanto, existen varios enfoques para producir
una hormona de tipo natural que no contiene la metionina.
Concretamente, la hormona de crecimiento humana se produce por un
método en el cual el término amino se fusiona con el término
carboxi de otra proteína; y se digiere luego por utilización de una
proteasa específica (véase la Solicitud Internacional PCT WO
89/12678; Solicitud de Patente Europea EP 20209; Patente Europea EP
321940); y por otro método que comprende (1) expresar la hormona
del crecimiento dentro de células; (2) digerir la metionina
mientras es secretada por células hospedadoras; y (3) obtener una
hormona del crecimiento humana de tipo natural a partir de un medio
de cultivo (véase la Patentes Europea EP 008882; la Patente de
EE.UU. USP 4.755.465; Patente Japonesa JP 01273591; Solicitud de
Patente Europea EP 306673; Solicitud de Patente Coreana No.
92-10932). Sin embargo, existen ciertas desventajas
en estos métodos arriba ilustrados. Exactamente, se requiere la
construcción complicada de nuevos vectores de expresión y pasos de
transformación de células hospedadoras y, coincidentemente,
optimizar las condiciones de expresión con pruebas adicionales.
Por otra parte, en el caso de que la proteína
exógena producida por utilización de tecnologías de DNA recombinante
incluya un aminoácido extra en el término amino, la aminopeptidasa
puede aprovecharse para eliminar el aminoácido extra y, como
resultado, la proteína exógena que tiene la misma estructura con la
proteína de tipo natural puede producirse fácilmente.
Concretamente, puede utilizarse una aminopeptidasa específica que
corta selectivamente sólo el residuo metionina presente en el
término amino de la hormona del crecimiento humana metionilada
purificada por métodos convencionales con objeto de producir una
hormona de crecimiento humana de tipo natural (véase la Solicitud
de Patente Internacional PCT WO 86/04609 y WO 86/204527 A1).
En la actualidad, se ha demostrado que varias
clases de aminopeptidasas preparan una hormona de crecimiento
humana de tipo natural. En detalle, se consignaron la aminopeptidasa
purificada a partir de Aeromonas proteolytica (véase la
Solicitud de Patente Internacional PCT WO 86/01229; Patente Europea
EP 0489711, A3, BTG Company; Prescott y Wilks, Method in
Enzymology, 1976, 44, 530-543), la aminopeptidasa
purificada a partir de riñón de porcino (véase la Solicitud de
Patente Internacional PCT WO 86/204527 A1; Bio/Technology, 1987, 5,
824-827, Takeda Company), la
dipeptidil-aminopeptidasa purificada a partir de
Dictyostelium discoidium (véase la Patente Europea EP
557076; la Patente de EE.UU. USP 5126249, A1, Eli Lilly Company), y
la aminopeptidasa de Streptomyces thermonitripicam.
Con objeto de conseguir el objeto anterior, la
aminopeptidasa no debe actuar sobre la secuencia de amino-ácidos de
una proteína de tipo natural aunque la misma elimina los residuos de
aminoácidos innecesarios presentes en el término amino de la
proteína recombinante. Es decir, cuando la proteína original tiene
una secuencia de aminoácidos que comienza por
X-Y-Z en el término amino y la
proteína recombinante tiene la secuencia de aminoácidos de
Met-X-Y-Z- que
contiene una metionina adicional en el término amino, la
aminopeptidasa debería cortar únicamente el residuo metionina y no
actuar después sobre otros aminoácidos
(X-Y-Z-) a fin de producir la
proteína recombinante que tenga la misma secuencia de aminoácidos
que la de la proteína de tipo natural. Por esta razón, la
aminopeptidasa que satisface dicho objeto debería ser compatible en
su especificidad de sustrato dependiendo de la proteína diana para
aplicaciones industriales. Aunque la enzima tiene la característica
indicada, es ventajoso que tenga mayores actividades intrínsecas por
sí misma.
En la actualidad, se han extraído y han sido
descritas más de varias decenas de aminopeptidasas de microbios y
análogos. En común, la mayoría de las enzimas precisan iones
metálicos tales como calcio, cinc o análogos a fin de ser
activadas. Estas aminopeptidasas tienen diversas propiedades que
dependen de su peso molecular, sus iones metálicos esenciales, las
condiciones óptimas de la reacción, la especificidad de sustrato,
etcétera con arreglo a los microbios, aunque las mismas tienen
actividades comunes teniendo en cuenta la digestión en residuos de
aminoácidos en el término amino de la proteína (véase FEMS
Microbiol. Rev., 1996, 18, 319-344). Una
aminopeptidasa de este tipo se clasifica como una exopeptidasa y
tiene la propiedad de aislar un aminoácido del término amino de la
proteína sustrato de modo ordenado.
Exactamente, estas aminopeptidasas han sido
comunicadas y separadas, especialmente a partir de Bacillus
sp., por ejemplo Bacillus subtilis (véase Arch. Biochem.
Biophys., 1979, 197, 63-77; Arch. Biochem.
Biophys., 202, 540-545, 1980; J. Biochem., 1994,
107, 603-607; Patente Japonesa JP 03285684,
Diacel-Chem company), Bacillus
stearothermophilus (véase Meth. Enzymol., 1970, 19,
544-552; Biochem. Biophys. Acta, 1976, 438,
212-220; Patente Europea EP 101653, Unitika
company), Bacillus thuringensis (Biokhimiya, 1984, 49,
1899-1907), Bacillus licheniformis (Arch.
Biochem. Biophys., 1978, 186, 383-391; Mikrobiol.
Zh., 1989, 51, 49-52), etcétera.
En las referencias arriba mencionadas, las
aminopeptidasas se purifican y analizan en cuanto sus propiedades
enzimáticas por utilización de leucina-p-nitroanilida, y
varios dipéptidos o análogos como sustrato. Sin embargo, los
oligopéptidos que comienzan por la secuencia
Met-X-Pro en los términos amino o
las proteínas que comienzan por
Met-X-Pro en los términos amino no
se utilizan como sustrato a fin de medir las actividades
enzimáticas. Por esta razón, no se ha comprobado todavía que estas
aminopeptidasas pudieran aplicarse a la eliminación de metionina en
proteínas recombinantes que contengan la secuencia
Met-X-Pro en sus términos amino.
Adicionalmente, las aminopeptidasas derivadas de
Bacillus licheniformis se han ilustrado como sigue. Rodríguez
et al. han purificado la aminopeptidasa derivada de
Bacillus licheniformis ATCC 12759 y han examinado su
propiedad enzimática. Asimismo, los autores de la presente invención
han descrito el método para preparar una hormona de crecimiento
humana de tipo natural utilizando la aminopeptidasa derivada de
Bacillus licheniformis, la caracterización de la
aminopeptidasa purificada en sus propiedades enzimáticas y su
secuencia de aminoácidos en el término amino (Patente Coreana
Expuesta al Público No. 1998-072239). En esta
invención, para producir una proteína de tipo natural en gran
escala por tecnologías de DNA recombinante, los autores de la
presente invención han consignado que la aminopeptidasa podría
eliminar únicamente el residuo metionina en sustratos sintéticos,
oligopéptidos, proteínas y análogos y reconocer la secuencia
específica de aminoácidos Met-X-Pro
(en lo sucesivo, X denota cualquier aminoácido con indiferencia de
su clase) y ser adecuada por tanto para la producción de la hormona
de crecimiento humana de tipo natural (Patente Coreana Expuesta al
Público No. 1998-071239). Estos métodos
convencionales han esclarecido que la aminopeptidasa puede
producirse a partir de Bacillus licheniformis y aprovecharse
para producir una proteína recombinante de tipo natural. Además,
han proporcionado únicamente información acerca de la secuencia de
aminoácidos parcial del término amino y no ha sido determinado
todavía el gen total de la aminopeptidasa.
Por esta razón, los autores de la presente
invención han intentado obtener una nueva aminopeptidasa para
producir una proteína recombinante de tipo natural. Concretamente,
los inventores han clonado un gen de aminopeptidasa derivado de
Bacillus licheniformis, han determinado su secuencia de
nucleótidos y su secuencia de aminoácidos, y expresado el gen de
aminopeptidasa clonado en cepas bacterianas recombinantes.
Posteriormente, se identificó que la proteína recombinante tiene
actividades de aminopeptidasa, es útil para utilización fácil en
otras reacciones enzimáticas y en la preparación de proteínas de
tipo natural. Como consecuencia, se ha completado con éxito la
presente invención.
El objeto de la presente invención es
proporcionar una aminopeptidasa derivada de Bacillus
licheniformis, un gen que codifica la aminopeptidasa, un vector
de expresión que contiene el gen, un transformante celular
transfectado con el vector de expresión y un proceso para preparar
una proteína de tipo natural que utiliza el mismo, que puede
emplearse para fabricar una proteína recombinante y aplicarse
útilmente a otras reacciones enzimáticas.
A fin de conseguir el objetivo arriba descrito,
la presente invención proporciona una aminopeptidasa derivada de
Bacillus licheniformis.
Con exactitud, la aminopeptidasa contiene una de
las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende
la secuencia de aminoácidos con la longitud total de SEQ. ID. NO: 1
o la aminopeptidasa de acuerdo con la reivindicación 2, que
contiene una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del
grupo que comprende las secuencias de aminoácidos defeccionadas
parcialmente en el término amino de la secuencia amino [sic] con la
longitud total de SEQ. ID. NO: 1, entre la alanina de la posición 30
y la alanina de la posición 31, entre la lisina de la posición 39 y
la asparagina de la posición 40, entre la asparagina de la posición
40 y la valina de la posición 41, entre la valina de la posición 41
y la glutamina de la posición 42, o entre la glutamina de la
posición 42 y la lisina de la posición 43.
Por otra parte, la aminopeptidasa contiene una
secuencia de aminoácidos delecionada parcialmente en el término
carboxi, entre la serina de la posición 443 y la tirosina de la
posición 444 de SEQ. ID NO: 1.
Adicionalmente, la presente invención
proporciona un gen que codifica la aminopeptidasa derivada de
Bacillus licheniformis.
Con exactitud, el gen que codifica la
aminopeptidasa contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada
del grupo que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene la
longitud total de SEQ. ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo de secuencias que comprende las secuencias de
nucleótidos defeccionadas en la una o más de las secuencias de
nucleótidos que tiene la longitud total de SEQ. ID NO: 2.
Adicionalmente, la presente invención
proporciona un vector de expresión pLAP132 que contiene el gen que
codifica la aminopeptidasa con la secuencia de nucleótidos que
tiene la longitud total de SEQ. ID. NO: 2.
Además, la presente invención proporciona un
transformante de Escherichia coli XLOLR/LAP132 que se ha
transfectado con el vector de expresión pLAP132 (número de acceso:
KCTC 1000 BP).
Adicionalmente, la presente invención
proporciona un proceso para preparar una proteína de tipo natural
que comprende los pasos siguientes: (1) paso de purificación de las
proteínas recombinantes que contienen la secuencia
Met-X-Pro en el término amino; (2)
paso de adición de dicha aminopeptidasa a dicha mezcla de
purificación; y (3) paso de digestión de la secuencia
Met-X-Pro en el mismo término amino
de la proteína recombinante por utilización de la
aminopeptidasa.
En este momento, X de la secuencia
Met-X-Pro puede ser cualquier clase
de aminoácido.
El anterior y otros objetos, características y
otras ventajas de la presente invención se comprenderán más
claramente a partir de la descripción detallada que sigue, tomada en
conjunción con los dibujos adjuntos, en los cuales:
Fig. 1 representa la determinación de las
secuencias de aminoácidos en fragmentos peptídicos de la
aminopeptidasa obtenida después de tratamiento con tripsina.
Fig. 2 representa el análisis de la
aminopeptidasa derivada de Bacillus licheniformis y expresada
a partir de un transformante de Escherichia coli por
realización de electroforesis en gel
SDS-poliacrilamida.
Fig. 3 representa el análisis de la
aminopeptidasa derivada de Bacillus licheniformis y expresada
a partir de un transformante de Bacillus subtilis por
realización de electroforesis en gel
SDS-poliacrilamida.
Fig. 4 representa el examen de las actividades
enzimáticas en la aminopeptidasa derivada de Bacillus
licheniformis y expresada a partir de un transformante de
Bacillus subtilis esquemáticamente.
En lo que sigue, se ilustrará la presente
invención más claramente como sigue.
La aminopeptidasa de la presente invención se
identifica por tener actividades enzimáticas en un estado
polipeptídico antes de la deleción del péptido señal (la secuencia
compuesta desde el primer aminoácido hasta el aminoácido trigésimo
en SEQ. ID. NO: 1) y después de deleción del péptido señal. Aunque
algunos aminoácidos están cortados en el término amino y en el
término carboxi además de la deleción del péptido señal, las
actividades enzimáticas se mantienen. Por esta razón, la
aminopeptidasa que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID.
NO: 1 así como las aminopeptidasas defeccionadas parcialmente en el
término amino o en el término carboxi de la secuencia de
aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1 pueden estar dentro del alcance de la
presente invención.
Preferiblemente, la aminopeptidasa de la
presente invención contiene la secuencia de aminoácidos delecionada
parcialmente en el término amino, entre la alanina 30ª y la alanina
31ª, entre la lisina 39ª y la asparagina 40ª, entre la asparagina
40ª y la valina 41ª, en la valina 41ª y la glutamina 42ª o entre la
glutamina 42ª y la lisina 43ª de SEQ. ID. NO: 1. Más
preferiblemente, la aminopeptidasa contiene la secuencia de
aminoácidos delecionada parcialmente en el término amino, entre la
alanina 30ª y la alanina 31ª, entre la glutamina 42ª y la lisina
43ª.
Preferiblemente, la aminopeptidasa de la
presente invención contiene la secuencia de aminoácidos delecionada
parcialmente en el término carboxi, entre la serina 443ª y la
tirosina 444ª de SEQ. ID. NO: 1.
Más preferiblemente, la aminopeptidasa contiene
la secuencia de aminoácidos delecionada parcialmente en el término
amino entre la glutamina 42ª y la lisina 43ª de SEQ. ID. NO: 1 y en
el término carboxi, entre la serina 443ª y la tirosina 444ª de SEQ.
ID. NO: 1.
Entretanto, los genes de la presente invención
que codifican la aminopeptidasa derivada de Bacillus
licheniformis pueden incluir el gen que codifica la secuencia
de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1, el gen que codifica la totalidad
de la forma delecionada de la aminopeptidasa arriba mencionada y el
gen de SEQ. ID. NO: 2.
Con objeto de investigar las funciones y
actividades enzimáticas de la aminopeptidasa, se ha realizado el
procedimiento siguiente utilizando la proteína que contiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 1, sus genes y su
polipéptido en una forma delecionada respectivamente.
Con objeto de ilustrar los polipéptidos que
tienen actividades enzimáticas de la aminopeptidasa derivada de
Bacillus licheniformis, se clona un gen que codifica la
aminopeptidasa a partir del DNA cromosómico de Bacillus
licheniformis. Concretamente, para clonación de genes, se
purifican los polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas
de la aminopeptidasa derivada de Bacillus licheniformis, se
digieren con tripsina a fin de recoger cierto número de fragmentos
peptídicos y se determinan luego las secuencias de aminoácidos. La
información de las secuencias de aminoácidos se aprovecha para
sintetizar oligonucleótidos para uso como iniciadores y se
amplifican luego los fragmentos de DNA correspondientes a una parte
del gen de aminopeptidasa. Después de ello, por utilización de
estos fragmentos de DNA para sondas, puede encontrarse el gen de
aminopeptidasa a partir de la genoteca cromosómica derivada de
Bacillus licheniformis.
Los genes de aminopeptidasa observados arriba se
examinan para determinar las secuencias de nucleótidos con el
analizador de secuencias de DNA que se muestra en SEQ. ID. NO: 2, y
se identifica la secuencia de DNA deducida de la información
genética de SEQ. ID. NO: 1 que tiene exactamente la misma secuencia
de aminoácidos de la aminopeptidasa purificada a partir de células
hospedadoras naturales. Como resultado, el polipéptido de
aminopeptidasa obtenido de acuerdo con la presente invención se
escruta utilizando bases de datos para informaciones genéticas y se
identifica este gen [sic] una nueva secuencia de DNA que no ha sido
publicada nunca y tiene una actividad enzimática de la
aminopeptidasa cuando se expresa en microbios recombinantes.
A continuación, la aminopeptidasa madura se
detecta también por estar digerida parcialmente. Con objeto de
investigar la composición de la aminopeptidasa en el término
carboxi, la aminopeptidasa purificada a partir del transformante
bacteriano recombinante y la aminopeptidasa purificada a partir de
células hospedadoras naturales, Bacillus licheniformis, se
examinan para determinar pesos moleculares por espectrometría de
masas. Consiguientemente, en los dos casos citados se comprueba que
se han cortado 6 residuos de aminoácidos del término carboxi.
Se confirma que La aminopeptidasa de acuerdo con
la presente invención ha madurado que la aminopeptidasa se
expresaba en la célula [sic] y posteriormente, se delecionó el
péptido señal en el término amino durante la secreción
extracelular. Además, la aminopeptidasa madurada está también
parcialmente digerida.
Por tanto, el polipéptido de aminopeptidasa de
acuerdo con la presente invención mantiene actividades enzimáticas
con presencia del péptido señal e incluso estando cortado
parcialmente en el término amino o en el término carboxi con
ausencia del péptido señal.
\vskip1.000000\baselineskip
Las realizaciones prácticas y actualmente
preferidas de la presente invención son ilustrativas como se muestra
en los ejemplos siguientes.
Sin embargo, se apreciará que los expertos en la
técnica, una vez considerada la presente descripción, pueden
realizar modificaciones y mejoras dentro del espíritu y alcance de
la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los autores de la presente invención han
realizado el procedimiento que sigue con objeto de purificar la
proteína aminopeptidasa de Bacillus licheniformis.
Se prepararon medios esterilizados que contenían
10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl por
litro se prepararon en matraces y la cepa de Bacillus
licheniformis KCTC 3058 se inoculó a fin de cultivarla para
cultivo de siembra a 40ºC, 120 rpm durante aproximadamente 16 horas.
El caldo del cultivo de siembra arriba obtenido se inoculó
nuevamente en nuevos medios y se cultivó a 40ºC, con agitación a
200-400 rpm, con más de 30 de oxígeno disuelto
[sic]. A continuación, se midieron las concentraciones de glucosa
con intervalos de 1 hora y se completó el cultivo cuando la
actividad de aminopeptidasa alcanzaba más de 35 U/ml. Con objeto de
cultivar las células, se preparó un caldo de cultivo que contenía 2
kg de peptona, 6 kg de extracto de levadura, 4 kg de fosfato de
potasio, 1 kg de NaCl, SAG, 15 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,53
g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,53 g de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,53 g de MnSO_{4}, y 10 kg de glucosa
por cada 200 l de agua destilada en un fermentador de 400 l en un
estado esterilizado. Una vez completado el cultivo, se utilizó una
centrífuga continua para eliminar los residuos celulares y se
recuperaron los sobrenadantes. El sobrenadante arriba obtenido se
concentró con un concentrador y se añadió luego ZnSO_{4} hasta
alcanzar aproximadamente 0,3 mM. Por medio de 3 pasos de
cromatografía en columna, se purificó la aminopeptidasa a partir de
la solución concentrada. Como cromatografía, se utilizaron
sucesivamente SP-Sepharose FF, Sephacryl
S-200, y DEAE-Sepharose FF. Se
identificó que la aminopeptidasa purificada por utilización del
procedimiento anterior tenía más de 95% de pureza cuando se analizó
con la cromatografía de alta presión en fase
inversa.
inversa.
La aminopeptidasa resultante se precipitó por
utilización de ácido tricloroacético al 10% (TCA), se lavó con
acetona y se secó. El precipitado de proteína desecado se disolvió
con urea 8M y bicarbonato de amonio 0,4M y se trató con
ditiotreitol (DTT) y yodoacetamida sucesivamente de tal modo que los
enlaces disulfuro en la aminopeptidasa se escindieron. La muestra
tratada se disolvió de nuevo en agua destilada, se añadieron
aproximadamente 0,05 mg de tripsina por cada 2 mg de aminopeptidasa
y se trató a 37ºC durante aproximadamente 8 horas. La muestra
tratada con tripsina se inyectó en la cromatografía a alta presión
de fase inversa (RP-HPLC) y se recogió para dar
fracciones de los picos peptídicos principales. En la cromatografía
en fase inversa, se adoptó una columna Vydac C18 de fase inversa y
se aplicó un gradiente de concentración lineal utilizando el
disolvente A (agua altamente purificada que contenía 0,05% de ácido
trifluoroacético (TFA)) y disolvente B (agua altamente purificada
que contenía 0,05% de TFA y 80% de acetonitrilo). En este momento,
se realizó el análisis en 0,5 ml/min de velocidad de flujo y se
obtuvo el cromatograma por absorbancia UV a 214 nm. Por este
procedimiento, se obtuvieron más de 10 picos. La muestra de péptido
resultante se analizó por espectrometría de masas respectivamente y
se seleccionaron péptidos compuestos de más de 15 aminoácidos. Se
determinó la secuencia de aminoácidos de la muestra seleccionada
con el analizador de secuencias de aminoácidos. Fig. 1 representaba
la secuencia de aminoácidos del péptido seleccionado por
utilización de un carácter que designa un aminoácido. Cada péptido
se numeró arbitrariamente por orden de acuerdo con el tiempo de
elusión en la cromatografía de fase inversa y se utilizó la parte
de la flecha representada en Fig. 1 para dar información respecto a
la síntesis de los iniciadores de oligonucleótidos. La muestra
designada como T4 entre estas muestras de péptidos se dedujeron que
contenía 2 péptidos diferentes coincidentemente, dado que aparecían
dos aminoácidos coincidentemente en cada ciclo por realización del
análisis de la secuencia de aminoácidos. Además, entre estas
muestras de péptidos, la misma secuencia de aminoácidos está
contenida entre T6 y T9, T11 y T13 y T16 y T17. Exactamente, T4 se
describe en SEQ. ID. NO: 4 y 5, T6 en SEQ. ID. NO: 6, T7 en SEQ. ID.
NO: 7, T9 en SEQ. ID. NO: 8, T11 en SEQ. ID. NO: 9, T13 en SEQ. ID.
NO: 10, T16 en SEQ. ID. NO: 11, T17 en SEQ. ID. NO: 12
respectivamente, como se describe en el Listado de Secuencias
independientemente.
Utilizando la información de péptidos que se
ilustra en el Ejemplo 1 (1-1), se sintetizaron
iniciadores oligonucleotídicos para la PCR de genes de
aminopeptidasa. Exactamente, se utilizaron el iniciador de aguas
arriba 5' (LAP-5) descrito en SEQ. ID. NO: 13 y el
iniciador de aguas abajo 3' (LAP-3) descrito en SEQ.
ID. NO: 14, los cuales se fabricaron utilizando las secuencias de
aminoácidos descritas en SEQ. ID. NO: 15 y SEQ. ID. NO: 16 entre
las secuencias de aminoácidos determinadas en el Ejemplo 1
(1-1). La PCR se realizó 32 veces repetidamente con
el ciclador térmico de DNA; la desnaturalización a 94ºC durante 30
segundos, reasociación a 40ºC durante 45 segundos, y extensión a
72ºC durante 1 minuto, y se utilizó DNA cromosómico de Bacillus
licheniformis como molde. Como resultado, se obtuvo un
fragmento de DNA con un tamaño de aproximadamente 390 pb.
Entretanto, el DNA genómico de Bacillus
licheniformis se preparó aprovechando el método de Murray y
Thompson y se digirió parcialmente con la enzima de restricción
Sau3A y se separó por medio de gel de agarosa al 0,8%, después de
lo cual se aislaron los fragmentos de DNA correspondientes a 2
\sim 3 kb. El fragmento de DNA se ligó en un vector de expresión
\lambda ZAP (Stratagene, LaJolla, EE.UU.) digerido con BamHI y se
añadió a un extracto de empaquetamiento. A continuación, la mezcla
de empaquetamiento se transfirió a E. coli
XL-1 Blue MRF'. Este filtro de genoteca preparado
arriba se escrutó por utilización de un fragmento PCR marcado con
^{32}P y se detectó respecto a clones que contuvieran el gen de
aminopeptidasa. Como resultado, se comprobó que el gen seleccionado
incluía una inserción de DNA que tenía un tamaño de aproximadamente
2,6 kb y se designó clon "LAP 132".
Se analizó la secuencia de nucleótidos de LAP
132, y el resultado se describe en SEQ. ID. NO: 2. En detalle, la
misma estaba compuesta de un codón de iniciación ATG que comenzaba
en el nucleótido 192 y un codón de terminación TAA en 1539 y que
contenía un ORF (marco de lectura abierto) de 1347 pb como se
muestra en SEQ. ID. NO: 2 y en SEQ. ID. NO: 3. Se identificó que el
nucleótido codificaba 449 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos
codificada por la información de la secuencia de nucleótidos arriba
ilustrada, era completamente idéntica al resultado determinado por
el análisis de la secuencia de aminoácidos de los fragmentos
peptídicos derivados de aminopeptidasa arriba purificada. El
dominio del término amino de la aminopeptidasa de acuerdo con la
presente invención contenía residuos de aminoácido hidrófobos
contiguos a residuos de aminoácidos catiónicos, lo que era similar
a la secuencia señal necesaria para la secreción. Así pues, se
dedujo que la aminopeptidasa se digería entre la alanina 30ª y la
alanina 31ª cuando se secretaba. Sin embargo, en la Patente Coreana
Expuesta al Público No. 1998-071239, se describía
que el término amino de la aminopeptidasa comienza principalmente a
partir de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ. ID. NO: 17
y formas de tipo heterogéneo de aminopeptidasas cuyos sitios
escindidos son algo diferentes con la presente invención. Se dedujo
que esta diferencia era provocada por digestión con la otra
proteasa extracelular después que la aminopeptidasa era secretada de
las cepas originales. La aminopeptidasa de acuerdo con la presente
invención se comparó en secuencia de aminoácidos con otra
aminopeptidasa registrada en Genebank utilizando la búsqueda BLAST.
Como resultado, se demostró que había 62% de homología con la
aminopeptidasa derivada de Bacillus subtilis, y 58% de
homología con la aminopeptidasa derivada de Bacillus
halodurans. La aminopeptidasa de acuerdo con la presente
invención se identificó como una nueva aminopeptidasa no publicada
previamente.
Los autores de la presente invención han
transformado el gen de aminopeptidasa "LAP 132", derivado de
Bacillus licheniformis, en la cepa XLOLR de E. coli y
lo han designado "E. coli XLOLR/LAP 132". Los autores
han realizado el depósito en la International Deposit Organization,
la Colección Coreana para Cultivos Tipo (KCTC) del Instituto de
Investigación Coreano de Biociencia y Biotecnología (KRIBB),
República de Corea, el 26 de abril de 2001, y lo han identificado
como número de acceso KCTC 1000 BP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El gen de aminopeptidasa clonado de acuerdo con
la presente invención se subclonó en el vector de expresión
pBK-CMV (Stratagene, EE.UU.) y se designó como
vector de expresión "pLAP32" a fin de ser utilizado como fuente
del gen de aminopeptidasa. A continuación, el fragmento PCR que
tenía aproximadamente un tamaño de 1,2 kb, que contenía una región
codificante de aminopeptidasa se subclonó en el vector pET11a
(Stratagene, EE.UU.) y se designó como vector de expresión
pETLAP45. El vector de expresión se transformó en E. coli
BL21 (DE3) y se utilizó para expresar una proteína de fusión unida
al péptido His-tag. La expresión de aminopeptidasa
en el sistema de expresión arriba descrito se comprobó por
realización de SDS-PAGE. Como se ilustra en Fig. 2,
el peso molecular de la aminopeptidasa se examinó, encontrándose que
alcanzaba aproximadamente 15 kDa en SDS-PAGE y era
idéntico al deducido a partir de su gen. En Fig. 2, la pista M
representaba un marcador estándar de pesos moleculares; la pista 1,
E. coli transformado en el vector de expresión pET11a (que no
inducía la expresión); la pista 2, E. coli transformado en
el vector de expresión pET11a (que inducía la activación del
promotor T7); la pista 3, E. coli transformado en el vector
de expresión pETLAP45 (sin incluir la expresión); y la pista 4,
E. coli transformado en el vector de expresión pETLAP45 (con
inclusión de la activación del promotor T7). La flecha representada
en Fig. 2 designaba la aminopeptidasa.
Los autores de la presente invención han
intentado detectar actividades enzimáticas de aminopeptidasa
secretada por el transformante de E. coli después de la
expresión del gen. Sobre todo, cuando el transformante de E.
coli se trató por ultrasonidos y se analizó, las actividades
enzimáticas de la aminopeptidasa del transformante de E.
coli se encontraron en las fracciones solubles. Como resultado,
se identificó que la aminopeptidasa de acuerdo con la presente
invención tiene el mismo tamaño que la deducida del gen y exhibe las
actividades enzimáticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En la presente invención, el fragmento de DNA
digerido con HindIII-SacI, que contenía una región
codificante de aminopeptidasa así como un promotor, región no
traducida 3', que tenía aproximadamente un tamaño de 2,6 kb y se
subclonó en el vector pRB373 de Bacillus y el vector de
expresión resultante se designó pRB373-LAP. El
vector de expresión se transformó en Bacillus subtilis, y se
cultivó, y se analizó después el caldo del cultivo utilizando
SDS-PAGE. Se observó que la aminopeptidasa era
secretada de la solución de cultivo y tenía aproximadamente 45 kDa
de peso molecular, el cual era compatible con el de Bacillus
licheniformis (véase Fig. 3). En Fig. 3, la pista M
representaba un marcador estándar de peso molecular; la pista 1,
Bacillus subtilis transformado en el vector de expresión
pRB373. La pista 2, Bacillus subtilis transformado en el
vector de expresión pRB373-LAP; y la pista 3,
aminopeptidasa purificada de Bacillus licheniformis. La
flecha representada en Fig. 3 designaba la aminopeptidasa.
Con objeto de purificar la aminopeptidasa, un
transformante de Bacillus subtilis recombinante que contenía
el gen de acuerdo con la presente invención, y el caldo de cultivo
se separó por realización de cromatografía con
SP-Sepharose. La secuencia de aminoácidos del
término amino de la aminopeptidasa purificada se determinó por el
analizador de aminoácidos. Como resultado, se comprobó que la
secuencia de aminopeptidasa en el término amino era heterogénea
como se encuentra en la aminopeptidasa derivada de células
hospedadoras naturales e iniciada con SEQ. ID. NO: 17, en su mayor
parte entre aquéllos que tenían SEQ. ID. NO: 18. Existía también la
aminopeptidasa iniciada con Asn, Val y Glu.
El transformante de Bacillus subtilis
recombinante que contenía el gen de aminopeptidasa se cultivó y se
aprovechó el caldo de cultivo para purificar la aminopeptidasa por
utilización de cromatografía SP-Sepharose. El peso
molecular de la aminopeptidasa se examinó por espectrometría de
masas y, como resultado, aparecieron sustancias que correspondían a
42.965 Da de peso molecular, 43.241 Da y 43.478 Da. Este resultado
se comparó con el obtenido por el análisis de la secuencia de
aminoácidos en el Ejemplo 3 (3-2) y se dedujo que se
habían eliminado 6 aminoácidos adicionales en el término carboxi.
Es decir, en el polipéptido descrito en SEQ. ID. NO: 1, el término
amino empezaba desde SEQ. ID. NO: 17 y el término carboxi terminaba
en SEQ. ID. NO: 19 y tenía un peso molecular teórico
correspondiente a aproximadamente 43.241 Da. A continuación, otro
polipéptido al que se habían añadido dos aminoácidos respecto al
anterior tenía un peso molecular correspondiente a 43.468 Da y el
otro polipéptido delecionado en dos aminoácidos tenía un peso
molecular correspondiente a 42.965 Da, lo que era idéntico a los
resultados obtenidos exactamente por la espectrometría de masas.
Entretanto, la aminopeptidasa purificada a
partir de una célula hospedadora natural, Bacillus
licheniformis, se examinó utilizando espectrometría de masas
por el mismo procedimiento del Ejemplo 1 (1-1) y se
obtuvo el mismo resultado obtenido con el transformante
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Los autores de la presente invención midieron la
actividad de aminopeptidasa utilizando una solución de lisado de
células tratada por ultrasonidos en el caso del transformante de
E. coli recombinante y utilizando la solución de cultivo
obtenida en el Ejemplo 3 (3-1) en el caso del
transformante de Bacillus subtilis recombinante.
Concretamente, se utilizó el método Pfleiderer a
fin de estimar las actividades enzimáticas de la aminopeptidasa
producida en el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3 (Pfleiderer, Meth.
Enzymol., 1970, 19, 514-521). Se añadieron 50
\mul de solución de cultivo a la mezcla de Tris 1M (pH 8,5) (950
\mul), y leucina-p-nitroanilida
0,1M (20 \mul) en DMSO, se dejó reaccionar durante 3 minutos a
60ºC, se añadieron 100 \mul de ácido acético al 70%, se terminó
la reacción y se detectó la absorbancia a 405 nm.
Por consiguiente, como se muestra en Fig. 4,
había una diferencia precisa entre la cepa de Bacillus
subtilis transformada con el gen de aminopeptidasa y la cepa de
Bacillus subtilis que contenía el vector de expresión.
Adicionalmente, la aminopeptidasa purificada a partir de Bacillus
subtilis recombinante estaba compuesta coincidentemente por
formas defeccionadas en el término amino o en el término carboxi
como se demuestra en el Ejemplo 3 (3-2) y
(3-3) y se comprobó también que las muestras tenían
actividades enzimáticas. En Fig. 4, pRB373-LAP
representaba Bacillus subtilis transformado con el vector de
expresión que contenía el gen de aminopeptidasa; \Delta
representaba LG, Bacillus subtilis cultivado en caldo de
cultivo LB; y \blacklozenge representaba pRB373, Bacillus
subtilis transformado con el vector de expresión que no contiene
un gen de aminopeptidasa.
Como se demuestra claramente y se ha confirmado
arriba, de acuerdo con la presente invención el gen que codifica la
aminopeptidasa derivada de Bacillus licheniformis se clona y
se expresa utilizando transformante bacteriano recombinante y se
identifica que es un nuevo gen no consignado previamente. La
aminopeptidasa purificada e ilustrada de acuerdo con la presente
invención puede aprovecharse útilmente para fabricar proteínas
recombinantes de tipo natural y aplicarse da otras reacciones
enzimáticas.
<110> LG CHEM INVESTMENT, LTD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVA AMINOPEPTIDASA DERIVADA DE
BACILLUS LICHENIFORMIS, GEN QUE CODIFICA LA AMINOPEPTIDASA,
VECTOR DE EXPRESIÓN QUE CONTIENE EL GEN. TRANSFORMANTE Y MÉTODO
PARA SU PREPARACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
1p-05-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (133)..(211)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio PA (Asociado a proteasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (261)..(308)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Familia de peptidasas
M20/M25/M40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2052
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RBS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (179)..(184)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RBS candidato 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RBS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (195)..(200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RBS candidato 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (192)..(1538)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDS candidato 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (282)..(1538)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (192)..(281)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Met Lys Thr Val Pro Ala Asp Lys Glu
Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Tyr Val Ser Thr Leu Ser Glu Gln Glu
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Tyr Gln Thr Ile Tyr His Leu Ser Glu Thr
Val Gly Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Gly Gln Ile Ala Gly Thr Ala Val Tyr
Asn Leu Thr Lys Lys}
\sac{Glu Asn Arg Thr Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Lys Gly Val Lys Asn Pro Asp Ile Val
Tyr Val Thr Ser His}
\sac{Tyr Asp Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Lys Asn Pro Asp Ile Val Tyr Val Thr
Ser His Tyr Asp Ser}
\sac{Val Pro Tyr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ile Thr Phe Gly Ala Glu Glu Ile Gly Leu
Leu Gly Ser Arg His}
\sac{Tyr Val Ser Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Ser Leu Ser Leu Gly Lys Asp Val Leu
Phe Leu His Gln Gly}
\sac{Gly Ser Ser Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador LAP-5 de
aguas arriba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaayccngaya thgtntay
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador LAP-3 de
aguas abajo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipraanagnacr tcyttncc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Pro Asp Ile Val Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
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<213> Bacillus licheniformis
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<400> 16
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\sa{Gly Lys Asp Val Leu Phe Leu}
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<210> 17
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Bacillus licheniformis
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<400> 17
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\sa{Lys Phe Ser Lys Lys}
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<210> 18
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Bacillus licheniformis
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<400> 18
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\sa{Asn Val Glu Lys Phe Ser Lys Lys}
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<210> 19
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Bacillus licheniformis
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<400> 19
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\sa{Asn Arg Thr Pro Ser}
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Claims (9)
1. Una aminopeptidasa que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ. ID NO: 1.
2. La aminopeptidasa de acuerdo con la
reivindicación 1, que contiene una de las secuencias de aminoácidos
seleccionada del grupo que comprende las secuencias de aminoácidos
defeccionadas parcialmente en el término amino de la secuencia de
aminoácidos que tiene la longitud total de SEQ. ID NO: 1, entre la
alanina 30ª y la alanina 31ª, entre la lisina 39ª y la asparagina
40ª, entre la asparagina 40ª y la valina 41ª, entre la valina 41ª y
la glutamina 42ª o entre la glutamina 42ª y la lisina 43ª.
3. La aminopeptidasa de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, que contiene una secuencia de aminoácidos
delecionada parcialmente en el término carboxi entre la serina 443ª
y la tirosina 444ª de SEQ. ID NO: 1.
4. Un gen que codifica dicha aminopeptidasa de
acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3.
5. El gen de acuerdo con la reivindicación 4,
que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 2.
6. Un vector de expresión pLAP132 que contiene
dicho gen que codifica la aminopeptidasa que comprende la secuencia
de nucleótidos con la longitud total de SEQ. ID NO: 2.
7. Un transformante XLORL/LAP132 de
Escherichia coli que está transformado con el vector de
expresión pLAP132 (número de acceso: KCTC 1000 BP).
8. Un proceso para preparar una proteína de tipo
natural que comprende los pasos siguientes: (1) paso de
purificación de la proteína recombinante que contiene la secuencia
metionina-X-prolina en el término
amino; (2) paso de adición de dicha aminopeptidasa de la
reivindicación 1, 2 ó 3 en dicha mezcla de purificación; y (3) paso
de digestión de dicha secuencia
metionina-X-prolina en el término
amino de la proteína recombinante por utilización de dicha
aminopeptidasa.
9. El proceso para preparación de una proteína
de tipo natural de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual X de
dicha secuencia metionina-X-prolina
puede ser cualquier clase de aminoácido.
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