ES2231962T3 - Aminopeptidasa derivada del bacilus licheniformis y proceso para la obtencion de proteinas de tipo natural. - Google Patents
Aminopeptidasa derivada del bacilus licheniformis y proceso para la obtencion de proteinas de tipo natural.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para retirar restos de metionina (Met) en los N-terminales de proteínas. Particularmente, la presente invención se refiere a una aminopeptidasa que es purificada mediante el bacilo Licheniformis que elimina el residuo de metionina de los N-terminales del péptido y de las proteínas. La presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar un tipo natural de proteína a partir de las proteínas producidas por microorganismos mediante técnicas de recombinación de ADN. Se pueden preparar masivamente y de forma fácil mediante el procedimiento de la presente invención varias clases de tipos de proteínas naturales tales como la hormona del crecimiento humano (HGH).
Description
Aminopeptidasa derivada del Bacillus
licheniformis y proceso para la obtención de proteínas de tipo
natural.
La presente invención se refiere a un proceso
para eliminar un resto metionina (Met) del extremo N de péptidos y
proteínas específicamente.
La presente invención se refiere en particular a
aminopeptidasas derivadas del Bacillus licheniformis que
elimina un resto metionina del extremo N de péptidos y proteínas. La
presente invención se refiere además a un proceso de obtención de
una proteína de tipo natural a partir de proteínas recombinantes
producidas en el microorganismo. Con el proceso de la presente
invención pueden obtenerse de forma masiva y sencilla diversos
grupos de proteínas de tipo natural, por ejemplo la hormona del
crecimiento humano (HGH).
La tecnología del DNA recombinante permite la
producción a gran escala de proteínas eucarióticas en las bacterias.
Sin embargo, las proteínas así obtenidas se caracterizan con
preferencia por la adición de un resto metionina extra en el extremo
N. Las proteínas que contienen la metionina en el extremo N pueden
inducir una reacción inmunogénica en los organismos humanos y
animales y puede ocurrir que no cumplan con eficacia su función
original. Por ello conviene desarrollar el proceso de obtención de
proteínas de tipo natural (Nature 326, 315, 1987; J.
Bacteriol. 169, 751-757, 1987; Biol.
Technology 8, 1036-1040, 1990; Appl.
Microbiol. Biotechnol. 36, 211-215, 1991)
para solucionar estos problemas.
En particular, la hormona del crecimiento humano
(HGH) es un polipéptido compuesto por 191 aminoácidos, que tiene un
peso molecular de 22.125 kDa y contiene la secuencia
Phe-Pro-Thr en el extremo N. La HGH
se produce en la glándula pituitaria humana y se utiliza sobre todo
para mejorar el enanismo (Raben, M.S., J. Clin. Endocr. 18,
901, 1958). Inicialmente, la HGH se extraía de la glándula
pituitaria humana y se purificaba para utilizarse en el tratamiento
médico. Sin embargo, no existe una producción suficiente de HGH para
satisfacer la demanda de los pacientes, ya que el proceso anterior
limita la cantidad de HGH producida. Se ha publicado además un
informe sobre 4 niños inoculados con HGH purificada del hipotálamo
que resultaron infectados con un virus y murieron. Por este motivo,
la FDA ha prohibido la administración de la HGH producida por este
proceso para el tratamiento de pacientes (Science 234, 22,
1986). Muchos investigadores han intentado en años más recientes
producir la HGH en la Escherichia coli o en levaduras
empleando la tecnología de DNA recombinante y utilizar esta HGH
clínicamente (en la E. coli, publicación de patente coreana
nº 89-1244 y nº 87-701 y nº
90-9976; publicación de patente nº
87-2258 y nº 84-8695; en levaduras,
publicación de patente nº 92-99 y publicación de
patente nº 90-9973 y nº
90-9976).
En general, la HGH recombinante tiene un resto
metionina extra que se añade al extremo N durante la síntesis de la
proteína por acción del codón de iniciación, a diferencia de la HGH
de tipo natural que se compone de 191 aminoácidos sin la metionina.
Por lo tanto, la HGH recombinante se produce en forma
metionil-HGH que se compone de 192 aminoácidos y
contiene la secuencia
Met-Phe-Pro-Thr en
el extremo N. En lo que respecta a la actividad biológica, la
metionil-HGH despliega la misma actividad que la HGH
de tipo natural (Moore, J.A., Endocrinology 122,
2920-2926, 1988). No se han publicado artículos
sobre ningún otro efecto secundario que pueda inducir la metionina
extra. No obstante, se ha publicado que se pueden generar
anticuerpos contra la metionina extra en una cantidad mayor que
contra las proteínas de tipo natural (Lancet 697, 29 de marzo de
1986).
Por consiguiente, muchos investigadores han
intentado producir la HGH de tipo natural sin la metionina en el
extremo N. Se ha desarrollado en particular un método para obtener
la HGH de tipo natural en caldo de cultivo, que consiste en fusionar
el extremo N de la HGH con el extremo C de otras proteínas y en
cortar la proteína resultante de la fusión con una proteasa
específica (PCT WO 89/12678; EP 20209; EP 321940). Se ha intentado
también un método que consiste en expresar la HGH en el citoplasma
celular, segregarla de la célula y eliminar el resto metionina
durante la segregación (EP 008832; US-4755465; JP
01273591; EP 306673; solicitud de patente coreana nº
92-10932). Por desgracia, estos métodos resultan
difíciles de llevar a la práctica, puesto que conllevan
manipulaciones complicadas, por ejemplo la preparación de vectores
de expresión y la transformación de células hospedantes. Además, en
cada caso hay que optimizar las condiciones de fermentación.
Se ha intentado además un método para el caso de
proteínas recombinantes que contienen un aminoácido extra en el
extremo N, que utiliza aminopeptidasas para eliminar el aminoácido
del extremo N y obtiene proteínas de tipo natural por un proceso
simple. Por ejemplo, la HGH de tipo natural puede obtenerse a partir
de la metionil-HGH empleando una aminopeptidasa
específica para eliminar selectivamente la metionina del extremo N.
La metionil-HGH puede obtenerse en masa por métodos
ya establecidos (PCT WO 86/04609; WO 86/204527 A1).
Hasta la fecha se ha publicado que pueden
utilizarse diversas aminopeptidasas para obtener la HGH de tipo
natural, por ejemplo la aminopeptidasa purificada de la
Aeromonas proteolytica (PCT WO 86/01229; EP 0489711
A3, B.T.G. Co.; Prescott y Wikes, Methods in Enzymology 44,
530-543, 1976), las aminopeptidasas del riñón de
cerdo (PCT 86.204527 A1; Bio. Technology 5,
824-827, 1987, Takeda Co.),
dipeptidil-aminopeptidasas del Dictyostelium
discoidem (EP 557076 A1; US-5126249, Eli Lilly
Co.) y aminopeptidasa del Streptomyces thermonitrificans
(EP 6296695; US 5569598; Lucky Co.).
Sin embargo, la aminopeptidasa debería reaccionar
solamente con restos aminoácido extra del extremo N de las
proteínas, pero no con secuencias de aminoácidos de origen natural,
con el fin de obtener proteínas de tipo natural. Es decir, cuando
las secuencias de aminoácidos del extremo N son
X-Y-Z en la proteína de tipo natural
y Met-X-Y-Z en la
proteína recombinante, respectivamente, es preferida una
aminopeptidasa que elimine el resto metionina sin reaccionar con los
demás aminoácidos, por ejemplo
X-Y-Z, con el fin de obtener la
misma proteína que las proteínas de tipo natural. Por ello es
importante la especificidad de sustrato de la aminopeptidasa para
cumplir las condiciones anteriores. Dado que la
metionil-HGH tiene una secuencia de aminoácidos
Met-Phe-Pro-Thr-Ile
en el extremo N, las aminopeptidasas idóneas deberían reconocer la
secuencia X-Pro e interrumpir la reacción de corte
frente al aminoácido X para eliminar selectivamente la metionina del
extremo N. Para el uso industrial, la enzima debería desplegar
además una gran actividad específica de modo sobresaliente.
Se han purificado diversos tipos de
aminopeptidasas de microorganismos. La mayor parte de
aminopeptidasas requieren iones Ca^{2+}, Zn^{2+} u otros iones
metálicos para sus actividades y normalmente eliminan restos
aminoácido del extremo N, pero las aminopeptidasas purificadas de
diferentes microorganismos tienen diferentes propiedades enzimáticas
en función de su peso molecular, requerimiento de iones metálicos,
condiciones óptimas de reacción y especificidad de sustrato (FEMS
Microbiol Rev. 18, 319-344, 1996). Estas
aminopeptidasas están clasificadas dentro de las
exo-peptidasas que eliminan gradualmente aminoácidos
del extremo N de proteínas sustrato.
Actualmente, las aminopeptidasas que se han
purificado del género Bacillus son las del Bacillus
subtilis (Arch. Biochem. Biophys. 197,
63-77, 1979; Arch. Biochem. Biophys. 202,
504-545, 1980; J. Biochem. 107,
603-607, 1994; JP 03284584,
Diacel-Chem. Co.), Bacillus
stearothermophilus (Meth. Enzymol. 19,
544-552, 1970; Biochem. Biophys. Acta 438,
212-220, 1976; EP 101653, Unitika), Bacillus
thuringiensis (Biokhimiya 49, 1899-1907,
1984), Bacillus licheniformis (Arch. Biochem. Biophys.
186, 383-391, 1978; Microbiol. Zh. 51,
49-52, 1989), etcétera.
En las referencias recién citadas, las
aminopeptidasas se analizan para examinar sus propiedades
enzimáticas empleando diversos sustratos, por ejemplo
leucina-p-nitroanilida, dipéptidos,
etcétera. Pero, los oligopéptidos y proteínas que contienen la
secuencia Met-X-Pro en el extremo N
no se han utilizado para examinar la actividad de las
aminopeptidasas. Por ello, no se esperaba que pudieran utilizarse
las aminopeptidasas para eliminar únicamente una metionina extra de
las proteínas recombinantes que contienen la secuencia
Met-X-Pro en el extremo N.
Con el fin de obtener las proteínas de tipo
natural empleando la tecnología de DNA recombinante hemos
investigado y purificado las aminopeptidasas de cepas del
Bacillus licheniformis que eliminan únicamente un resto
metionina del extremo N de las proteínas. Las aminopeptidasas
derivadas del Bacillus licheniformis pueden eliminar un resto
metionina de sustratos sintéticos, oligopéptidos, proteínas,
etcétera, y son capaces además de reconocer específicamente la
secuencia Met-X-Pro (X indica
cualquiera aminoácido disponible). Se ha demostrado por tanto que
las aminopeptidasas de la presente invención pueden utilizarse para
obtener eficazmente la HGH de tipo natural.
El objeto de la presente invención es
proporcionar aminopeptidasas derivadas del Bacillus
licheniformis que eliminen un resto metionina del extremo N de
péptidos y proteínas.
Las aminopeptidasas de la presente invención
reconocen una secuencia Met-X-Pro en
el extremo N de péptidos y proteínas para eliminar el resto
metionina. X es con preferencia fenilalanina.
Las aminopeptidasas contienen la secuencia de
aminoácidos definida como SEQ ID NO:3 (secuencia
Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg)
y SEQ ID NO:4 (secuencia
Lys-Phe-Ser-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg-Ala-Tyr-Gln-Tyr-Ile-Tyr-His-Leu)
en el extremo N o secuencias que se eliminan y sustituyen por
aminoácidos del extremo N de las secuencias anteriores.
Las aminopeptidasas tienen un peso molecular del
orden de 43-47 kDa según
SDS-PAGE.
Las aminopeptidasas son activas con preferencia
en el intervalo de pH de 7,5 a 10,5 y con mayor preferencia en el
intervalo de pH de 8,5 a 9,5.
Las aminopeptidasas son activas con preferencia
en el intervalo de 40 a 70ºC y con mayor preferencia en el intervalo
de 50 a 60ºC.
Las aminopeptidasas son termoestables y conservan
el 50% de su actividad incluso cuando se incuban a 60ºC durante 4
horas.
La actividad de las aminopeptidasas se inhibe con
el ditiotreitol, el ácido yodoacético y la
orto-fenantrolina y se inhibe parcialmente con el
ácido etilendiaminatetraacético (EDTA).
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar procesos de obtención de aminopeptidasas, que consisten
en cultivar el Bacillus licheniformis, centrifugar el caldo
de cultivo para obtener el líquido sobrenadante y realizar una
cromatografía de filtración a través de gel con el líquido
sobrenadante concentrado. La cepa de Bacillus licheniformis
de la descripción anterior se elige con preferencia entre las KCTC
3058, KCTC 12759, KCTC 3045 y KCTC 1030.
La presente invención proporciona un
procedimiento de obtención de aminopeptidasas que consiste en
preparar células que producen aminopeptidasas empleando la
tecnología de DNA recombinante, en cultivar las células
recombinantes y en purificar las enzimas.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un proceso de obtención de proteínas de tipo natural,
que se basa en proteínas recombinantes obtenidas aplicando la
tecnología de DNA recombinante a aminopeptidasas y en purificar las
proteínas.
La presente invención proporciona en particular
un proceso de obtención de HGH de tipo natural a partir de la
metionil-HGH que contiene una secuencia
Met-X-Pro en el extremo N.
El proceso de obtención consiste en utilizar
aminopeptidasas en un intervalo de pH de 7,0 a 9,5 y en un intervalo
de temperaturas de 20 a 60ºC y purificar la HGH de tipo natural
mediante cromatografía a través de una resina de intercambio iónico,
etcétera. En este momento se añade NaCl en una cantidad de
30-230 mM a la mezcla reaccionante y las enzimas se
añaden con preferencia en una cantidad de 0,2 a 20 U por 1 mg de
metionil-HGH.
En la figura 1 se representa la cantidad de
aminopeptidasa que se produce a partir de un caldo de cultivo de
cepas de Bacillus licheniformis tales como la KCTC 1026, KCTC
1029, KCTC 1831, KCTC 3045, KCTC 3046, KCTC 3047 y KCTC 3049, que
generan proteasa alcalina. Como sustrato para medir la actividad
enzimática se emplea la
leucina-p-nitroanilida.
En la figura 2 se representa la cantidad de
aminopeptidasa producida por un caldo de cultivo de cepas de
Bacillus licheniformis tales como la KCTC 1030, KCTC 2215 y
KCTC 3006, que generan \alpha-amilasa. Para medir
la actividad enzimática se emplea como sustrato la
leucina-p-nitroanilida.
En la figura 3 se representa la cantidad de
aminopeptidasa producida por un caldo de cultivo de cepas de
Bacillus licheniformis tales como la KCTC 3056, KCTC 3057 y
KCTC 3058, que generan bacitracina. Para medir la actividad
enzimática se emplea como sustrato la
leucina-p-nitroanilida.
En la figura 4 se representa la actividad de
aminopeptidasa del Bacillus licheniformis ATCC 12759
comparándola con del Bacillus licheniformis KCTC 3045, KCTC
1030 y KCTC 3058, que tienen la actividad de aminopeptidasa más
alta. Para medir la actividad enzimática se emplea como sustrato la
leucina-p-nitroanilida.
En la figura 5 se representa la actividad de
aminopeptidasa del Bacillus licheniformis ATCC 12759
comparándola con del Bacillus licheniformis KCTC 3045, KCTC
1030 y KCTC 3058, que tienen la actividad de aminopeptidasa más
alta. Para medir la actividad enzimática se emplean como sustratos
oligopéptidos que contienen la secuencia
Met-Phe-Pro-X, la
secuencia del extremo N de la HGH.
En la figura 6 se representa la pureza y el peso
molecular de la aminopeptidasa purificada a partir de la cepa ATCC
12759 de Bacillus licheniformis, que se visualiza en
SDS-PAGE
En la figura 7 se representan las actividades de
aminopeptidasas en función de la variación del pH, la determinación
se realiza empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida.
En la figura 8 se representan las actividades de
aminopeptidasas en función de la variación de la temperatura, que
se determinan empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida.
En la figura 9 se representa la termoestabilidad
de la aminopeptidasa, que se determina empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida.
En la figura 10 se representa el efecto de la
variación del pH en la eliminación de la metionina de la
metionil-HGH durante la síntesis de la HGH de tipo
natural.
En la figura 11 se representa el efecto de la
variación de la temperatura en la eliminación de la metionina de la
metionil-HGH durante la síntesis de la HGH de tipo
natural.
En la figura 12 se representa el efecto de la
concentración de NaCl en la eliminación de la metionina de la
metionil-HGH durante la síntesis de la HGH de tipo
natural.
En la figura 13 se representa una HGH de tipo
natural que se obtiene a partir de la metionil-HGH
por un proceso en el que se realiza una cromatografía
mono-Q y un SDS-PAGE.
En la figura 14 se recogen los resultados del
análisis de la secuencia de aminoácidos de la HGH de tipo natural
obtenida por el proceso anterior.
En la figura 15 se recogen los resultados del
análisis de la secuencia de aminoácidos de la HGH de tipo natural
obtenida por el proceso anterior.
En la figura 16a se representa el cromatograma de
la aminopeptidasa purificada a partir del Bacillus
licheniformis por un proceso en el que se realiza una
cromatografía mono-S.
En la figura 16b se representa una aminopeptidasa
que se ha purifica a partir del Bacillus licheniformis
mediante un proceso en el que se efectúa una cromatografía
mono-S y un SDS-PAGE.
Las formas preferidas de ejecución de la
invención se ilustran en los ejemplos siguientes.
Sin embargo, los expertos en la materia
comprenderán fácilmente a la vista de esta descripción que se
pueden introducir modificaciones y mejoras dentro del espíritu y
alcance de la presente invención.
Las aminopeptidasas de esta invención, que
eliminan un resto metionina del extremo N de péptidos y proteínas,
se derivan del Bacillus licheniformis. Se examinan
aproximadamente 20 cepas del Bacillus licheniformis
depositadas en la Colección Coreana de Cultivos Tipo (KCTC) y se
comparan las actividades de las aminopeptidasas existentes en caldos
de cultivo.
Considerando las referencias mencionadas
previamente se dividen los Bacillus licheniformis en cepas
productoras de proteasa alcalina (que contienen una proteasa
alcalina resistente a los detergentes), cepas productoras de
\alpha-amilasa y cepas productoras de
bacitracina.
Se cultivan en particular 7 cepas de Bacillus
licheniformis productoras de proteasa alcalina, que son la KCTC
1026 (ATCC 21415), KCTC 1029 (ATCC 21418), KCTC 1831 (ATCC 21424),
KCTC 3045 (ATCC 21415), KCTC 3046 (ATCC 21416), KCTC 3047 (ATCC
21417), KCTC 3049 (ATCC 21424) (ver figura 1); 3 cepas productoras
de \alpha-amilasa, que son la KCTC 1030 (ATCC
27811), KCTC 2215 (ATCC 27811), KCTC 3006 (ATCC 39326) (ver figura
2); y 3 cepas productoras de bacitracina, que son la KCTC 3056 (ATCC
10716, ATCC 11944), KCTC 3057 (ATCC 11945), KCTC 3058 (ATCC 11946)
(ver figura 3). En el líquido sobrenadante de los caldos de cultivo
se determinan las actividades de aminopeptidasa por el
procedimiento descrito en el ejemplo de referencia 1.
De ello resulta que en las cepas KCTC 3045, KCTC
1030, KCTC 3058 y ATCC 12759 de Bacillus licheniformis se
observa un intervalo de 5-25 U de actividad de
aminopeptidasa empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida (ver figura
4). Entre estas cepas de Bacillus licheniformis, Rodriguez y
col. ya habían publicado un artículo en el que describen la cepa
ATCC 12759 como productora de una aminopeptidasa
(Rodriguez-Absi, J. y Prescott, J.M., Arch. Biochem.
Biophys. 186(2), 383-391, 1978).
Ejemplo de referencia
1
Se determinan las actividades de aminopeptidasa
de esta invención por el método de Pfleiderer (Pfleiderer, Meth.
Enzymol. 19, 514-521, 1970). Precisamente, 1
U de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que
cambia 1 absorbancia a 405 nm que se mide por el proceso de añadir
aminopeptidasa a 1 ml de solución de Tris-Cl 100 mM
(pH 8,0) y leucina-p-nitroanilida 2
mM (Sigma, EE.UU.), de incubar a 37ºC durante 1 min y después añadir
100 \mul de ácido acético del 70% para interrumpir la reacción. En
este momento, la
leucina-p-nitroanilida se disuelve
en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para convertir la solución en 100
mM.
Las actividades de aminopeptidasa de las cepas
del Bacillus licheniformis recién descritas pueden
determinarse también empleando como sustrato un
metionil-oligopéptido con el fin de detectar la
actividad de exo-peptidasa eliminando los restos
metionina de los péptidos y proteínas que contienen la metionina en
el extremo N (ver figura 5). Precisamente se utiliza como sustrato
un oligopéptido que contiene una secuencia de aminoácidos del tipo
SEQ ID NO:1
(Met-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro-Ser)
para determinar la actividad de aminopeptidasa por el proceso
descrito en el ejemplo de referencia 2.
Ejemplo de referencia
2
Con el fin de determinar las actividades de
aminopeptidasa se prepara una mezcla reaccionante que contenga un
sustrato y aminopeptidasa en concentraciones conocidas en una
solución tampón 0,1M de Tris-Cl, 0,1M de NaCl. Se
emplea como sustrato un oligopéptido que tenga una secuencia de
aminoácidos del tipo SEQ ID NO:1. Se lleva a cabo la reacción a 37ºC
durante un tiempo predeterminado y un mismo volumen de ácido acético
del 70% para interrumpirla. A continuación se efectúa una
cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC) para analizar
el producto de la reacción. Se disuelve el oligopéptido en DMSO para
convertir la solución en 30 mM, se diluye en 2,5 mM empleando DW y
se añade la mezcla reaccionante anterior en una concentración
idónea.
Se efectúa la cromatografía para analizar el
producto de reacción en las condiciones de reacción siguientes.
Precisamente una columna RP para proteínas de YMC (4,6 x 250 mm,
YMC Co.); como eluyente se emplea un disolvente A que contiene ácido
trifluoracético del 0,05% (TFA) y un disolvente B que contiene ácido
trifluoracético del 0,05% y acetonitrilo del 80%. Se inyecta la
mezcla anterior en la columna y se eluye con el disolvente B con un
gradiente de concentración lineal del 10% al 30%. A continuación se
calcula el área con arreglo a la absorbancia en 214 nm. De ello
resulta que el sustrato que no ha reaccionado se eluye al cabo de
unos 9,5 min y el producto de reacción unos 7,0 min en las
condiciones de reacción indicadas antes. Si se eluyen el sustrato y
el péptido producto de la reacción en dichas condiciones, el área de
cada pico es proporcional al número de aminoácidos del péptido. Por
consiguiente, la proporción entre el área del sustrato (6 enlaces
peptídicos) y el producto (5 enlaces peptídicos) de igual
concentración es de 6:5 aproximadamente. Por lo tanto, la
concentración del péptido producido en la reacción anterior se
obtiene mediante la siguiente fórmula:
[P] = (PA/5) /
(SA/6 + PA/5) x
[S]
PA: área del pico del péptido producto
SA: área del pico del péptido sustrato
[S]: concentración inicial del péptido
sustrato
[P]: concentración del péptido producto del
proceso
Dado que el oligopéptido recién mencionado
contiene un resto metionina en el extremo N y una secuencia
X-Pro adyacente, la aminopeptidasa que reacciona
solamente con el extremo N, pero no con la secuencia
X-Pro, puede elegirse fácilmente mediante el uso del
oligopéptido. Precisamente se ensayan las cepas de Bacillus
licheniformis como las KCTC 3045, KCTC 1030, KCTC 3058 y ATCC
12759 para producir aminopeptidasa que tenga las propiedades
mencionadas anteriormente. De este modo se pueden adoptar de forma
útil estas aminopeptidasas derivadas de estas cepas para eliminar la
metionina del extremo N de péptidos y proteínas que contengan la
secuencia Met-X-Pro en dicho extremo
N.
Se examina además la actividad de aminopeptidasa
con el fin de identificar la eliminación de la metionina del extremo
N de la proteína que tiene un peso molecular más alto. Se utilizan
aminopeptidasas que se han purificado en mayor grado con el fin de
disminuir las reacciones adicionales provocadas por otras
endoproteasas.
Se purifican precisamente las aminopeptidasas del
Bacillus licheniformis ATCC 12759 y KCTC 3058 y se examinan
sus propiedades enzimáticas. La aminopeptidasa muestra una
reactividad máxima con oligopéptidos en lo que respecta a la
reactividad con la
leucina-p-nitroanilida.
Las aminopeptidasas de la presente invención se
analizan por electroforesis a través de gel de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) y
tienen un peso molecular comprendido dentro del intervalo
43-47 kDa (ver figura 6 y figura 16).
Se identifica que la aminopeptidasa tiene una
secuencia de aminoácidos del tipo SEQ ID NO:3
(Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg)
y de tipo SEQ ID NO:4
(Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg-Ala-Tyr-Gln-Thr-Ile-Tyr-His-Leu)
en los extremos N.
La aminopeptidasa purificada del Bacillus
licheniformis ATCC 12759 coexiste con formas de enzima que han
sufrido deleción y carecen de 1 ó 2 aminoácidos en el extremo N y la
aminopeptidasa purificada del Bacillus licheniformis KCTC
3058 coexiste con una forma que ha sufrido la deleción de la lisina
o con una forma sustituida en el aminoácido 9º (de asparagina a
ácido aspártico).
En general, las aminopeptidasas de la presente
invención pueden clasificarse como aminopeptidasas de leucina porque
tienen reactividad específica y más elevada con la leucina que con
la metionina.
Se examinan las propiedades enzimáticas de las
aminopeptidasas empleando la
leucina-p-nitroanilida como sustrato
sintético. Las aminopeptidasas de la invención son activas con
preferencia en un intervalo de pH de 7,5 a 10,5 y con mayor
preferencia en un intervalo de pH de 8,5 a 9,5 (ver figura 7).
Las aminopeptidasas son activas con preferencia
en un intervalo de 40 a 70ºC y con mayor preferencia en un intervalo
de 50 a 60ºC (ver figura 8). Las aminopeptidasas son termoestables y
conservan más del 50% de su actividad incluso cuando se incuban a
60ºC durante 4 horas (ver figura 9). Las actividades de las
aminopeptidasas se inhiben con el ditiotreitol, con ácido
yodoacético, con orto-fenantrolina y se inhiben
parcialmente con el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
La presente invención proporciona procesos para
la obtención de aminopeptidasas derivadas del Bacillus
licheniformis.
En particular, con el fin de obtener la
aminopeptidasa se prepara un caldo de cultivo de una cepa de
Bacillus licheniformis, se centrifuga y después se concentra
el líquido sobrenadante del caldo de cultivo para llevar a cabo una
cromatografía de difusión a través de gel, etcétera. Se emplean con
preferencia las cepas ATCC 12759, KCTC 3058, KCTC 3045 y KCTC 1030
del Bacillus licheniformis.
Se preparan además células productoras de
aminopeptidasa empleando la tecnología del DNA recombinante, se
cultivan y después se pueden purificar las aminopeptidasas.
La presente invención proporciona un proceso de
obtención de proteínas de tipo natural a partir de proteínas
recombinantes.
El proceso de la presente invención de obtención
de proteínas de tipo natural consiste en tratar las proteínas
producidas por tecnología de DNA recombinante con la aminopeptidasas
y en purificar los productos que son exactamente los mismos que la
proteína de origen natural.
Se prepara en particular la HGH de tipo natural
que carece de metionina en el extremo N a partir de la
metionil-HGH que contiene la secuencia
Met-X-Pro, etcétera, por el proceso
descrito a continuación. Se trata con 0,2-20 U de
aminopeptidasa por 1 mg de metionil-HGH, con
preferencia en un intervalo de pH de 7,0 a 9,5 (ver figura 10) y en
un intervalo de temperaturas de 20 a 60ºC, con mayor preferencia a
37ºC (ver figura 11). Se añade NaCl en una concentración con
preferencia de 30 a 230 nM, con mayor preferencia de 100 mM (ver
figura 12). Se lleva a cabo después del tratamiento con
aminopeptidasa una cromatografía a través de resina de intercambio
iónico para purificar la HGH de tipo natural obtenida en el proceso
recién mencionado (ver figura 13).
Se inoculan 7 cepas de Bacillus
licheniformis de las que se sabe que producen proteasa alcalina,
a saber la KCTC 1026 (ATCC 21415), KCTC 1029 (ATCC 21418), KCTC 1831
(ATCC 21424), KCTC 3045 (ATCC 21415), KCTC 3046 (ATCC 21416), KCTC
3047 (ATCC 21417), KCTC 3049 (ATCC 21424), en 100 ml de un caldo que
contiene ampicilina en un matraz de 500 ml de autoclave (caldo AP) y
se incuba a 30ºC durante más de 50 horas agitando a una velocidad de
150 rpm.
Se centrifuga 1 ml del caldo de cultivo así
obtenido y se determina la actividad de aminopeptidasa del líquido
sobrenadante empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida. Se recogen
los resultados en la figura 1. Se ensayan las actividades de
aminopeptidasa de la mayoría de cepas de Bacillus
licheniformis, obteniéndose como valores exactos 12,3 U, 3,62
U, 1,87 U, 13,6 U, 0,67 U, 1,98 U y 1,25 U, respectivamente.
Se incuban en un matraz 3 cepas de Bacillus
licheniformis de las que se sabe que producen
\alpha-amilasa, saber la KCTC 1030 (ATCC 27811),
KCTC 2215 (ATCC 27811) y KCTC 3006 (ATCC 39326), (caldo AP) por el
mismo método del ejemplo 1. A continuación se obtiene el líquido
sobrenadante del caldo de cultivo, se mide la actividad de
aminopeptidasa del mismo empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida. Se recogen
los resultados en la figura 2. De la figura 2 se desprende que las
actividades de aminopeptidasa ensayadas tienen los valores exactos
de 1,04 U, 0,08 U y 0,09 U, respectivamente. Estas actividades
enzimáticas medidas empleando la
leucina-p-nitroanilida son muy
inferiores a las de otras cepas de Bacillus
licheniformis.
Se incuban en un matraz 3 cepas de Bacillus
licheniformis de las que se sabe que producen bacitracina, saber
la KCTC 3056 (ATCC 10716, ATCC 11944), KCTC 3057 (ATCC 11945), KCTC
3058 (ATCC 11946), (caldo AP) por el mismo método del ejemplo 1. A
continuación se obtiene el líquido sobrenadante del caldo de
cultivo, se mide la actividad de aminopeptidasa del mismo empleando
como sustrato la
leucina-p-nitroanilida. Se recogen
los resultados en la figura 3. Los valores exactos de las
actividades de aminopeptidasa son 4,40 U, 11,8 U y 13,3 U,
respectivamente.
Por el mismo método del ejemplo 1 se incuba en un
matraz la cepa ATCC 12759 del Bacillus licheniformis de la
que se sabe que produce aminopeptidasa. A continuación se obtiene el
líquido sobrenadante del caldo de cultivo, se mide la actividad de
aminopeptidasa del mismo empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida. Se recogen
los resultados en la figura 4. Los valores exactos de las
actividades de aminopeptidasa son de 4,16 U, que es un valor
intermedio si se compara con los valores que arrojan otras cepas de
Bacillus licheniformis.
En base a los resultados de los ejemplo 1, 2 y 3
se eligen las cepas de Bacillus licheniformis que presentan
actividades altas de aminopeptidasa, como son la KCTC 3045 (ATCC
21415), KCTC 1030 (ATCC 27811) y KCTC 3058 (ATCC 11946). Se inoculan
estas tres cepas de Bacillus licheniformis y la cepa ATCC
12759 de Bacillus licheniformis en 50 ml de caldo LB
(extracto de levadura 5 g/l, bacto-triptona 10 g/l,
NaCl 5 g/l) en un matraz de 50 ml de autoclave y se incuban a 30ºC
durante 20 horas agitando con una velocidad de giro de 150 rpm. A
continuación se inocula el caldo de cultivo en 5 litros de caldo AP
(glucosa 10 g/l, fosfato potásico monobásico 10 g/l, dibásico 10
g/l, NaCl 5 g/l, extracto de levadura 5 g/l,
bacto-peptona 10 g/l, sulfato magnésico 0,01 g/l,
FeSO_{4}.7H_{2}O 1 mg/l, ZnSO_{4}.7H_{2}O 1 mg/l,
MnSO_{4}.H_{2}O 1 mg/l) en un fermentador de autoclave de 5
litros y se incuban a 37,5ºC durante más de 50 horas agitando con
una velocidad de 300 a 400 rpm. Se retira 1 ml de caldo de cultivo
y se centrifuga.
A continuación se miden las actividades de
aminopeptidasa en el líquido sobrenadante empleando como sustrato la
leucina-p-nitroanilida. Se recogen
los resultados en la figura 4. Se ensayan las actividades de
aminopeptidasa de cada cepa de Bacillus licheniformis y se
obtienen los valores exactos de 14,6 U, 7,86 U, 24,4 U y 6,10 U,
respectivamente. Entre estas cepas de Bacillus licheniformis,
la ATCC 12759 presenta la actividad de aminopeptidasa más baja; la
cepa KCTC 3058 de Bacillus licheniformis tiene una actividad
4 veces superior a la de la cepa ATCC 12759.
Se mide la actividad de aminopeptidasa por el
proceso que emplea un caldo de cultivo obtenido en el ejemplo 5 y
oligopéptido descrito a continuación. A un tampón de reacción (0,1 M
de Tris-Cl, pH 8,0, 0,1M de NaCl, 1,25 mM de
metionil-oligopéptido de la SEQ ID NO:1 (secuencia
Met-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro-Ser))
se le añade un caldo de cultivo que tiene 0,2 U de actividad
enzimática en sustrato leucina-p- nitroanilida, se
ajusta a un volumen final de 0,3 ml y se incuba a 37ºC durante 10
min. A continuación se añaden 0,3 ml de ácido acético del 70% para
interrumpir la reacción. Se eliminan los compuestos contaminantes
centrifugando a 14.000 rpm durante 5 min. y filtrando seguidamente
a través de una membrana de 4 \mum. Se analiza la mezcla
reaccionante por HPLC y se determina la actividad de aminopeptidasa
en el sustrato oligopéptido por el método del ejemplo de referencia
2.
Se examina la actividad de aminopeptidasa en las
cepas KCTC 1030 (ATCC 27811), KCTC 3058 (ATCC 11946) y ATCC 12759
del Bacillus licheniformis y se obtienen los valores exactos
de 2,11, 1,46, 2,14 y 2,76 \mumoles/min., respectivamente. Dado
que estas aminopeptidasas eliminan solamente el resto metionina del
extremo N del oligopéptido sin la reacción previa, pueden utilizarse
para eliminar el resto metionina tanto en péptidos como en proteínas
que tengan la secuencia Met-X-Pro en
el extremo N. Dado que la actividad enzimática medida empleando
oligopéptido y
leucina-p-nitroanilida presenta
algunas diferencias, a pesar de utilizar la misma unidad de caldo de
cultivo, las actividades enzimáticas pueden no tener relación con
los dos sustratos descritos.
De ello resulta que se constata que las
aminopeptidasas derivadas del Bacillus licheniformis pueden
utilizarse de forma correcta para eliminar el resto metionina del
extremo N empleando como sustrato un
metionil-oligopéptido. En lo que respecta a la
especificidad de sustrato, la aminopeptidasa no reacciona con la
secuencia X-Pro del extremo N a pesar de que elimina
el resto metionina de dicho extremo N.
Se ha identificado además que la aminopeptidasa
derivada del Bacillus licheniformis puede utilizarse de forma
idónea para eliminar el resto metionina empleando un sustrato de
proteína, tal como se describe en los ejemplos siguientes. Se emplea
un sustrato de proteína metionil-HGH que contiene la
secuencia Met-X-Pro en el extremo N
(iniciada con la secuencia
Met-Phe-Pro-Thr-Ile
en el extremo N). Cuando se utiliza la proteína como sustrato, las
proteasas contaminantes, por ejemplo las
endo-proteasas, inducen reacciones adicionales. Por
lo tanto, las aminopeptidasas producidas por las cepas de
Bacillus licheniformis tendrían que purificarse antes de la
reacción.
Tal como se indica en la figura 5, la
aminopeptidasa purificada de las cepas ATCC 12759, KCTC 3058 etc.
del Bacillus licheniformis tienen la máxima actividad de
aminopeptidasa en sustrato oligopéptido, si se comparan con las
cepas de Bacillus licheniformis de la presente invención. En
este caso se emplea como patrón la actividad de aminopeptidasa en
leucina-p-nitroanilida. Por lo
tanto, las aminopeptidasas purificadas en masa se adoptan
convenientemente para el proceso de eliminación del resto metionina
de la metionil-HGH.
Con el fin de obtener grandes cantidades de la
cepa ATCC 12759 del Bacillus licheniformis se inoculan cepas
de Bacillus licheniformis en 100 ml de caldo LB de autoclave
y se incuban a 37ºC durante 20 horas para el cultivo de siembra. Se
inocula el caldo de cultivo en 10 ml de caldo LB de autoclave en un
fermentador de 10 litros de capacidad y se incuba durante
22-24 horas manteniendo el pH en 7,0.
Se centrifuga el caldo de cultivo obtenido en el
ejemplo 7 (aproximadamente 9 litros) a 8000 rpm durante 20 min. Se
extrae el líquido sobrenadante resultante, se le añade 1 mM de PMSF
(fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y se concentra hasta 1,5 litros
aprox. empleando un concentrador (cartucho espiral de Amicon, MWCO
10000). A la solución concentrada anterior se le añade ácido acético
para ajustar el pH a 5,0 y después se añade sulfato amónico para
obtener una concentración final del 40% (peso/volumen). Se añade el
mismo volumen de tert-butanol, se mezcla durante 1
hora, después se centrifuga para recuperar la capa acuosa inferior
empleando un embudo de decantación (1er TTP). Después se ajusta el
pH a 6,0 añadiendo NaOH 0,5 N y se añade también sulfato amónico
para obtener una solución de una concentración final del 85%. Se
añade el mismo volumen de tert-butanol, se mezcla
durante 1 hora, después se centrifuga durante 10 min para recuperar
una capa de proteína precipitada en la banda media
(2º TTP).
(2º TTP).
Se disuelve el precipitado en 20 mM de PBS (pH
6,8) y se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min. para eliminar el
precipitado contaminante. Considerando la conductividad de la
solución se ajusta la concentración de sal por debajo de 0,3 M
aproximadamente. Después se rellena con 1,5 litros de
SP-Sepharose (Pharmacia) una columna INdeX 220/500
y se equilibra con el mismo tampón. Se inyecta la anterior muestra
de proteína, después se lava la columna con tampón PBS que contiene
0,3-0,4 M de NaCl (caudal: 50 ml/min). Se eluye la
aminopeptidasa con un gradiente lineal de concentración de 0,3 - 0,4
M de NaCl a 1 M de NaCl (caudal: 25 ml/min).
Se examina cada fracción eluida en la columna de
SP-Sepharose para determinar la actividad
enzimática de la aminopeptidasa. Se recogen las fracciones que
indican la actividad enzimática y se concentran hasta 20 ml por
ultrafiltración (Amicon, tipo de celdilla agitada). Después se
lleva a cabo una cromatografía de filtración a través de gel
empleando una columna empaquetada de 1800 ml del tipo Sephacryl
S-200 y empleando como eluyente tampón PBS 20 mM (pH
6,8) que contiene además NaCl 0,25 M.
Se concentran las fracciones así obtenidas de la
cromatografía por filtración a través de gel y se diluyen con un
tampón fosfato 20 mM (pH 6,8). A continuación se absorbe una muestra
diluida en una columna mono-S de FPLC (0,5 cm x 5
cm) equilibrada 3 veces con el tampón y se eluyen las proteínas con
un gradiente lineal de 0,3 a 1 M de NaCl para obtener la
aminopeptidasa pura. Aunque la aminopeptidasa obtenida tenga
diversos picos en la cromatografía de columna, todos los picos
tienen el mismo peso molecular cuando se miden por
SDS-PAGE, tal como se indica en la figura 6. Además,
todos los picos indicados tienen la misma actividad enzimática. Por
secuenciación del extremo N de las aminopeptidasas se pone de
manifiesto que coexisten uno o dos aminoácidos del extremo N que han
sufrido deleción. Los procesos de cromatografía recién descritos se
resumen en la
tabla 1.
tabla 1.
Para determinar el peso molecular de la
aminopeptidasa se realiza un análisis SDS-PAGE con
la muestra anterior, tal como se indica en la figura 6. En la figura
6, en el carril M: la proteína patrón en calidad de marcador de peso
molecular; en el carril 1 y en el carril 2 las aminopeptidasas de
esta invención. El peso molecular de las aminopeptidasas se
identifica como situado entre 43 y 47 kDa, aproximadamente.
Con el fin de determinar las secuencias de
aminoácidos del extremo N de la aminopeptidasa se realiza un
análisis de degradación automatizada Edman (Geoffrey Zubay,
Biochemistry, 2ª edición, 47-48, 1988) empleando un
analizador de aminoácidos (modelo 471A, Applied Biosynthesis). Se
separa el aminoácido unido a la feniltiohidantoína por cromatografía
de columna HPLC (220 nm x 2,1 mm, modelo PHT-222,
Applied Biosystems, EE.UU.) y se compara el tiempo de retención. De
ello resulta que la secuencia del extremo N se constata que tiene
una SEQ ID NO:3
(Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg).
La aminopeptidasa purificada anterior coexiste con formas en las
que uno o dos aminoácidos del extremo N han sufrido deleción. Estas
enzimas pueden separarse aumentando lentamente la concentración
salina del gradiente lineal en la cromatografía
mono-S FPLC y tienen el mismo peso molecular y
actividad enzimática si se compara con los resultados del análisis
SDS-PAGE.
Con el fin de determinar el intervalo óptimo de
pH de la aminopeptidasa se examinan las actividades enzimáticas de
la aminopeptidasa en un intervalo de pH de 6,0 a 11,5. Para ajustar
el pH de la reacción enzimática se emplean tampones con una
concentración 0,1M de fosfato sódico (pH 6-7,5),
Tris-Cl (pH 7,0-9,0), ácido bórico
(pH 8,5-10,0), CAPS (ácido
3-ciclohexilamino-1-propanosulfónico).
Para medir las actividades enzimáticas se emplea como sustrato
sintético la leucina-p-nitroanilida.
De ello resulta que la aminopeptidasa de esta invención tiene una
actividad mayor en el intervalo de pH de 7,5 a 10,5 y la actividad
máxima en el intervalo de pH de 8,5 a 9,5, tal como se indica en la
figura 7.
Con el fin de determinar el margen óptimo de
temperaturas se estudian las actividades enzimáticas de la
aminopeptidasa en un margen de 30 a 90ºC, a intervalos de 10ºC,
empleando un tampón Tris-Cl 0,1 M (pH 8,0) y, como
sustrato sintético, se emplea la
leucina-p-nitroanilida. De ello
resulta que las aminopeptidasas de la invención tienen mayor
actividad en el margen de 40 a 70ºC y una actividad máxima en el
margen de 50 a 60ºC, tal como se indica en la figura 7.
Con el fin de examinar la termoestabilidad de la
aminopeptidasa se incuba la aminopeptidasa purificada a 60ºC y 80ºC
durante un período de 1, 2, 3, 4 y 6 horas, respectivamente, que
después se utiliza para determinar las actividades enzimáticas. Los
resultados se comparan con los de la aminopeptidasa que no se haya
tratado térmicamente. Como sustrato sintético se emplea la
leucina-p-nitroanilida.
Dado que las aminopeptidasas incubadas a 60ºC
durante 6 horas conservan más del 50% de su actividad, se constata
que la enzima de esta invención es termoestable, tal como se indica
en la figura 9. La termoestabilidad guarda una relación estrecha con
la estabilidad de las moléculas de la proteína, de modo que una
aminopeptidasa estable no se inactiva durante el proceso de
purificación ni la reacción enzimática. Por consiguiente, la
reacción enzimática puede llevarse a cabo durante un período largo
de tiempo y la enzima conserva constantemente su actividad inicial.
Por lo tanto, la aminopeptidasa de esta invención puede utilizarse
de forma muy útil en reacciones enzimáticas que requieran un período
largo de tiempo, como son las de eliminación de un resto metionina
de proteínas recombinantes.
Con el fin de examinar los materiales químicos
que afectan la actividad de la aminopeptidasa se determinan las
actividades enzimáticas de la aminopeptidasa tratada durante 2 horas
con ditiotreitol, ácido yodoacético,
orto-fenantrolina y EDTA en concentraciones de 1, 5
y 20 mM, respectivamente. Para ello se emplea como sustrato
sintético la leucina-p-nitroanilida
y los resultados se recogen en la tabla 2.
En particular se identifica la aminopeptidasa de
esta invención como metaloproteasa, ya que se inhibe por acción de
la orto-fenantrolina en mayor grado que con EDTA.
Dado que la aminopeptidasa resulta inhibida con el ditiotreitol por
reacción con el enlace disulfuro y con ácido yodoacético por
reacción con el grupo sulfhidrilo, el resto cisteína de la
aminopeptidasa puede desempeñar un papel importante en la reacción
de la enzima.
Con el fin de comparar la especificidad de
sustrato de las aminopeptidasas de esta invención se emplean 2 tipos
de sustrato. Un sustrato es sintético, un derivado de
p-nitroanilida, suministrado por Sigma, EE.UU., y
el otro es un oligopéptido, por ejemplo un
metionil-oligopéptido de la SEQ ID NO:1 que tiene
una secuencia de aminoácidos similar al extremo N de la
metionil-HGH y leucil-oligopéptido
de la SEQ ID NO:2. Se sintetizan los oligopéptidos de esta
invención.
Con el fin de sintetizar los oligopéptidos recién
mencionados se efectúa una síntesis en fase sólida automática a
escala 0,1 mM empleando un sintetizador de péptidos (Applied
Biosystems 431A, EE.UU.). Se corta el complejo de
péptido-resina producido en la reacción anterior
para obtener oligopéptidos preparados por el proceso de purificación
y secado. La composición de aminoácidos de los oligopéptidos
anteriores se analiza con un analizador de aminoácidos y se
determina la secuencia de aminoácidos exactamente con un analizador
de cromatografía de gases-espectro de masas. Se
disuelven los oligopéptidos en DMSO hasta una concentración de 30 mM
y se diluyen con DW hasta 2,5 mM. A la mezcla reaccionante se le
añaden oligonucleótidos diluidos en una concentración
predeterminada.
La reacción enzimática de la aminopeptidasa se
lleva a cabo por el proceso descrito en los ejemplos de referencia.
Para ello se emplea como sustrato sintético un derivado de la
p-nitroanilida. Como sustrato para efectuar la
reacción se emplean la
leucina-p-nitroanilida en
concentraciones de 0,03125, 0,0625, 0,125, 0,5 y 1 mM y la
metionina-p-nitroanilida en
concentraciones de 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mM y la aminopeptidasa en
una concentración de 0,5 U, respectivamente. Las reacciones
anteriores empleando la
leucina-p-nitroanilida duran 2 min y
la metionina-p-nitroanilida 40 min.
A continuación se añade ácido acético del 70% para interrumpir la
reacción y se mide la absorbancia a 405 nm. La concentración de
producto se mide adoptando la constante de absorbancia
\varepsilon_{405} = 9450 M^{-1}cm^{-1}.
Para efectuar la reacción enzimática se emplea
también un oligopéptido, en tal caso empleando un sustrato de
concentración conocida y aminopeptidasa en un tampón que contenga
0,1 M de Tris-Cl, 0,1 M de NaCl para ajustar el
volumen de reacción a 500 \mul. Se efectúa la reacción enzimática
a 37ºC y después de 5 y de 10 min se retiran 250 \mul de mezcla
reaccionante y se les añade ácido acético del 70% para interrumpir
la reacción. Se analiza la mezcla reaccionante efectuando una
cromatografía HPLC. Para ello se emplea el sustrato en
concentraciones de 0,125, 0,160, 0,25, 0,75 y 1,25 mM con
independencia de los tipos de sustrato y la aminopeptidasa se emplea
en 0,01 U en el caso del leucil-péptido y de 0,2 U
en el caso del metionil-péptido.
En las condiciones de reacción mencionadas antes
se mide la velocidad inicial de la reacción enzimática variando la
concentración de sustrato. Se emplea una gráfica de
Lineweaver-Burk para determinar el valor Km y la
velocidad máxima de reacción de la aminopeptidasa de Bacillus
licheniformis. Se determina además el parámetro kcat/Km
empleando el valor Km y la velocidad máxima de reacción determinados
anteriormente. Estos resultados se recogen en la tabla 3 y se
comparan con los de la aminopeptidasa de la Aeromonas
proteolytica (Vibrio proteolytica) (publicación
de patente coreana nº 94-14804), medidos en el mismo
ensayo.
Con arreglo al método general de clasificación,
ambas aminopeptidasas se clasifican como
leucina-aminopeptidasas ya que reaccionan
eficazmente con el sustrato que contiene leucina en el extremo N.
Las aminopeptidasas del Bacillus licheniformis tienen
parámetros cinéticos similares en un sustrato derivado de
p-nitroanilida que la aminopeptidasa de la
Aeromonas proteolytica. Sin embargo, en sustrato
oligopéptido, la aminopeptidasa del Bacillus licheniformis
presenta un valor kcat todavía más elevado. Dado que la
aminopeptidasa del Bacillus licheniformis tiene un valor Km
más bajo que el de la Aeromonas proteolytica ya
mencionada, presenta una mayor afinidad con el sustrato. Por lo
tanto, se constata que la aminopeptidasa de la presente invención
puede eliminar eficazmente un resto metionina y leucina del extremo
N.
Con el fin de obtener la HGH de tipo natural
empleando la aminopeptidasa del Bacillus licheniformis, se
examinan del modo descrito a continuación las condiciones óptimas de
reacción para eliminar la metionina del extremo N de la proteína. En
primer lugar se prepara la mezcla reaccionante que contiene 1 mg/ml
de metionil-HGH (final 0,1 mg), 50 mM de
Tris-Cl (pH 8,0), 0,1M de NaCl, 1 mM de PMSF y se
le añaden 0,5 U de aminopeptidasa con el fin de ajustar el volumen
final a 100 \mul. A continuación se lleva a cabo la reacción a
37ºC durante 30 min y se añaden 11 \mul de TCA del 100% para
interrumpir la reacción. Se centrifuga la mezcla reaccionante para
precipitar las proteínas en una centrífuga de pequeñas dimensiones
que gira a 14.000 rpm durante 5 min. Se lava dos veces el
precipitado de proteína con acetona y se seca. Con la muestra seca
se efectúa una degradación automática de Edman en un analizador de
secuencias de aminoácidos (modelo 471A, Applied Biosystems,
EE.UU.).
Con el fin de determinar el grado de eliminación
del resto metionina se mide la proporción entre metionina y
fenilalanina en el 1er ciclo. Para determinar el pH óptimo de la
reacción anterior se determina la proporción de eliminación de
metionina de la metionil-HGH en un margen de pH de
7,0 a 11,5. Para regular el pH de la solución anterior se emplea una
solución tampón en una concentración de 50 mm,
Tris-Cl (pH 7,0-9,0), ácido bórico
(pH 8,5-10,0) y CAPS (pH
9,5-11,5).
De ello resulta que el margen óptimo de pH que
puede utilizarse para obtener la HGH de tipo natural empleando la
aminopeptidasa se sitúa entre 7,5 y 9,5, tal como se indica en la
figura 10. Con el fin de hallar la temperatura óptima, se mide el
grado de eliminación del resto metionina del extremo N en un margen
de 20 a 70ºC y los resultados se recogen en la figura 11. El margen
óptimo de temperaturas para eliminar la metionina es de 50 a 60ºC. A
temperaturas altas, la velocidad de eliminación de la metionina se
reduce debido a la precipitación de la HGH. Teniendo en cuenta la
estabilidad de la HGH son más preferibles las temperaturas bajas,
inferiores a 37ºC, que las temperaturas altas del margen
50-60ºC. De la figura 12 se desprende que el NaCl
puede añadirse a la mezcla reaccionante en una concentración de 430
mM, con preferencia de 100 mM.
En un tubo de diálisis se mezclan 1 mg de
metionil-HGH y tampón de reacción (50 mM de
Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 1 mM de PMSF) que
contiene 10 U de aminopeptidasa (volumen final: 1 ml) y se hacen
reaccionar a 37ºC durante 24 h sobre un baño de agua para dializar
con el mismo tampón. Pasadas 24 horas se dializa de nuevo la mezcla
reaccionante anterior con Tris-Cl (pH 8,0) a 4ºC un
tiempo suficiente para que se complete la reacción. Después se
efectúa una cromatografía de intercambio iónico
mono-Q (cromatografía HPLC) eluyendo la HGH con 20
mM de Tris-Cl que contienen 0,1M de NaCl. La HGH
recuperada con ello es absolutamente pura, sin aminopeptidasa ni
otros contaminantes y los resultados se confirman con
SDS-PAGE del modo indicado en la figura 13.
Se analizan los aminoácidos del extremo N de la
HGH recuperada de este modo con un analizador de secuencias de
aminoácidos (modelo 471A, Applied Biosystems, EE.UU.), del modo
indicado en la figura 14. De ello resulta que se constata que los
aminopeptidasas de la presente invención eliminan por completo la
metionina del extremo N de la metionil-HGH y
sustituyen la metionina del extremo N por fenilalanina, produciendo
la nueva HGH de tipo natural.
Se tratan 50 mg de aminopeptidasa en 50 mg de
metionil-HGH a 37ºC durante 24 horas en las
condiciones mencionadas antes. Se obtiene la HGH por el proceso en
el que la muestra se trata con aminopeptidasa, se dializa para
reducir la concentración de sal, se somete a cromatografía de
intercambio iónico empleando Sepharose DEAE (Pharmacia) y se
recupera. Se determina la secuencia de aminoácidos del extremo N de
la HGH recuperada con un analizador de secuencias de aminoácidos,
del modo indicado en la figura 15. De ello resulta que se identifica
que la HGH producida por el método anterior tiene la fenilalanina en
el extremo N debido a la eliminación de la metionina.
Se cultiva la cepa KCTC 3058 del Bacillus
licheniformis por el mismo proceso descrito en el ejemplo 7. Se
centrifuga el caldo de cultivo (aproximadamente 8 litros) a 8000 rpm
durante 20 min. Se recupera el líquido sobrenadante formado y se
concentra hasta 1,6 litros empleando un condensador (cartucho
espiral Amicon, MWCO 10000). Se añade a la solución concentrada
anterior ácido acético del 10% para ajustar el pH a 5,0 y se añade
también sulfato amónico para ajustar la concentración final al 40%
(concentración de saturación). Se añade el mismo volumen de
tert-butanol, se mezclan durante 1 hora, después se
centrifuga a 8000 rpm para recuperar la capa acuosa inferior
empleando un embudo de decantación (1er TTP). Seguidamente se ajusta
el pH a 6,0 por adición de NaOH 0,5 N y se añade de nuevo sulfato
amónico para ajustar la concentración final de la solución al 85%
(concentración de saturación). Se añade el mismo volumen de
tert-butanol, se mezcla durante 1 hora, después se
centrifuga a 8000 rpm durante 10 min para recuperar la capa de
proteína precipitada de la capa central (2º TTP).
Se disuelve la proteína precipitada en PBS 20 mM
(pH 6,8) y se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min para separar el
precipitado contaminante. Teniendo en cuenta la conductividad de la
solución se diluye la concentración de sal con el mismo tampón hasta
menos de 0,3 M aproximadamente. Se prepara una columna de 500 ml de
SP-Sepharose (Pharmacia) y se equilibra con el mismo
tampón. Se inyecta la muestra de proteína anterior, después se lava
la columna con tampón PBS que contiene 0,3-0,4 M de
NaCl (caudal: 15 ml/min). Se eluye la aminopeptidasa con una
gradiente lineal de concentración de 0,3-0,4 M de
NaCl hasta 1 M de NaCl (caudal: 10 ml/min).
Se examina cada fracción eluida en la columna de
SP-Sepharose para determinar la actividad
enzimática de la aminopeptidasa. Se recogen las fracciones que
indican la actividad enzimática y se concentran hasta 20 ml por
ultrafiltración (Amicon, tipo de celdilla agitada). Después se
lleva a cabo una cromatografía de filtración a través de gel para
purificar la aminopeptidasa de esta invención.
Se realiza el proceso de purificación recién
descrito mediante dos sistemas tampón diferentes. Para efectuar la
cromatografía de filtración a través de gel, en un primer proceso se
emplea tampón Tris-Cl 20 mM (pH 7,5) que contiene
0,5 M de NaCl y en el segundo proceso se emplea tampón PBS 20 mM
(pH 6,8) que contiene NaCl 0,5 M, Tween 20 al 0,1%. El proceso de
cromatografía recién descrito se resume en la tabla 4 y en la tabla
5.
Se concentran las fracciones recién obtenidas
mediante cromatografía de filtración a través de gel y se diluyen.
Después se absorbe la muestra diluida en una columna
mono-S de FPLC (0,5 cm x 5 cm) y se eluyen las
proteínas con un gradiente lineal de concentración de 0,4M a 1M de
NaCl para obtener la aminopeptidasa pura.
Para determinar el peso molecular de la
aminopeptidasa que se purifica a partir de la cepa KCTC 3058 (ATCC
11946) del Bacillus licheniformis en el ejemplo 13 se
analizan en SDS-PAGE las fracciones resueltas por
cromatografía de columna mono-S FPLC. De ello
resulta que todos los picos de la aminopeptidasa que presentan
diferentes tiempos de elución se identifican por tener los mismos
pesos moleculares a pesar del anterior cromatograma, tal como se
indica en las figura 16a y 16b. La aminopeptidasa derivada de la
cepa KCTC 3058 del Bacillus licheniformis tiene también el
mismo peso molecular que la aminopeptidasa derivada de la cepa ATCC
12759 del Bacillus licheniformis. El peso molecular de la
aminopeptidasa que se determina se sitúa entre 43 y 47 kDa,
aproximadamente.
Con el fin de determinar la secuencia de
aminoácidos del extremo N de la aminopeptidasa derivada de la cepa
KCTC 3058 (ATCC 11946) del Bacillus licheniformis se realiza
un análisis de degradación automatizada Edman (Geoffrey Zubay,
Biochemistry, 2ª edición, 47-48, 1988) empleando un
analizador de aminoácidos del ejemplo 9. De ello resulta que la
secuencia de aminoácidos hallada se ajusta a la SEQ ID NO:4
(Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg-Ala-Tyr-Gln-Thr-Ile-Tyr-His-Leu).
La aminopeptidasa purificada antes coexiste con formas en las que
la lisina del extremo N ha sufrido deleción y la 9ª asparagina del
extremo N ha sido sustituida por ácido aspártico. La secuencia de
aminoácidos identificada coincide exactamente con la de la
aminopeptidasa derivada de la cepa ATCC 12759 del Bacillus
licheniformis.
Resumiendo los resultados obtenidos
anteriormente, las aminopeptidasas derivadas de diferentes cepas del
Bacillus licheniformis son las mismas, ya que las
aminopeptidasas derivadas de las cepas KCTC 3058 y ATCC 12759 del
Bacillus licheniformis tienen el mismo peso molecular y la
misma secuencia de aminoácidos en el extremo N.
Las aminopeptidasas de la presente invención son
útiles porque se purifican a partir del Bacillus
licheniformis y eliminan específicamente el resto metionina del
extremo N. Dado que las aminopeptidasas reconocen la secuencia
Met-X-Pro del extremo N, aparte de
la HGH todas las proteínas que tengan la secuencia
X-Pro podrían cambiarse fácilmente a proteínas de
tipo natural provista de actividad completa después de la producción
en masa en células bacterianas. Las aminopeptidasas de la presente
invención son idóneas además para el uso en la reacción mencionada
anteriormente gracias a su termoestabilidad.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: LG CHEMICAL LTD.
\hskip1.5cmLEE, Young-Phil
\hskip1.5cmHAN, Kyuboem
\hskip1.5cmKIM, Se-Hoon
\hskip1.5cmPARK, Soon-Jae
\hskip1.5cmLEE, Seung-Joo
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Aminopeptidasas derivadas del Bacillus licheniformis y proceso para la obtención de proteínas de tipo natural.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Phe Pro Thr Glu Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Phe Pro Thr Glu Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos del extremo N
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Ser Lys Lys Phe Asn Glu Asn
Arg}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos del extremo N
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Ser Lys Lys Phe Asn Glu Asn Arg Ala
Tyr}
\sac{Gln Thr Ile Tyr His Leu}
Claims (12)
1. Una aminopeptidasa derivada de una cepa del
Bacillus licheniformis que elimina el resto metionina del
extremo N de un péptido o proteína, que contiene una secuencia de
aminoácidos que se ajusta a la SEQ ID NO: 3 en el extremo N y tiene
un peso molecular comprendido entre 43 y 47 kDa según la
determinación por SDS-PAGE.
2. La aminopeptidasa de la reivindicación 1, que
reconoce la secuencia Met-X-Pro del
extremo N de dicho péptido o proteína para eliminar el resto
metionina.
3. La aminopeptidasa según la reivindicación 2,
en la que X es la fenilalanina.
4. Un proceso de obtención de la aminopeptidasa
de la reivindicación 1, que consiste en cultivar el Bacillus
licheniformis, centrifugar el caldo de cultivo y efectuar una
cromatografía de filtración a través de gel con el líquido
sobrenadante concentrado.
5. Un proceso de obtención de la aminopeptidasa
según la reivindicación 4, en el que las cepas de Bacillus
licheniformis son la ATCC 12759, la KCTC 3058, la KCTC 3045 y la
KCTC 1030.
6. Un proceso de obtención de la aminopeptidasa
de la reivindicación 1, que consiste en obtener células productoras
de aminopeptidasa empleando la tecnología de DNA recombinante,
cultivar las células recombinantes y purificar las enzimas.
7. Proceso de obtención de la proteína de tipo
natural que consiste en tratar las proteínas recombinantes obtenidas
empleando la tecnología de DNA recombinante con la aminopeptidasa de
la reivindicación 1 y purificar el material resultante.
8. El proceso de obtención de una proteína de
tipo natural según la reivindicación 7, en el que la proteína
recombinante contiene una secuencia
Met-X-Pro en el extremo N.
9. El proceso de obtención de una proteína de
tipo natural según la reivindicación 8, en el que la proteína
recombinante es la metionil-hormona del crecimiento
humano (metionil-HGH).
10. El proceso de obtención de una proteína de
tipo natural según la reivindicación 9, en el que se hace reaccionar
la aminopeptidasa a un pH comprendido entre 7,0 y 9,5 y a una
temperatura comprendida entre 20 y 60ºC y en el que se añade a la
mezcla reaccionante el NaCl en una concentración comprendida entre
30 y 230 mM.
11. El proceso de obtención de una proteína de
tipo natural según la reivindicación 9, en el que la aminopeptidasa
se emplea en una cantidad de 0,2 a 20 U por 1 mg de
metionil-HGH.
12. El proceso de obtención de una proteína de
tipo natural según la reivindicación 9, en el que después de tratar
la aminopeptidasa se purifica la HGH de tipo natural realizando una
cromatografía a través de una resina de intercambio iónico.
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