KR19980071239A - 바실러스 리케니포미스 균주에서 유래한 아미노펩티다제, 그의 제조방법 및 이를 이용한 천연형 단백질의 제조방법. - Google Patents
바실러스 리케니포미스 균주에서 유래한 아미노펩티다제, 그의 제조방법 및 이를 이용한 천연형 단백질의 제조방법. Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 (methionine, Met) 잔기를 특이적으로 제거하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 잔기를 제거할 수 있는 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)에서 유래한 아미노펩티다제, 그의 제조방법 및 이를 이용하여 미생물에서 생산된 재조합 단백질을 천연형 단백질 형태로 얻는 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법을 이용하면 천연형 인간 성장 호르몬을 포함한 다양한 천연형 단백질을 대량으로 생산하는 것이 용이하다.
Description
본 발명은 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 (methionine, Met) 잔기를 특이적으로 제거하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 잔기를 제거할 수 있는 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)에서 유래한 아미노펩티다제, 그의 제조방법 및 이를 이용하여 미생물에서 생산된 재조합 단백질을 천연형 단백질 형태로 얻는 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법을 이용하면 천연형 인간 성장 호르몬을 포함한 다양한 천연형 단백질을 대량으로 생산하는 것이 용이하다.
유전자 재조합 방법으로 단백질을 미생물에서 대량 생산하는 경우 대개 비천연형 형태의 단백질이 얻어지는데, 대개 아미노 말단의 최초(initiator) 메티오닌 (Methionine, Met)이 불완전하게 처리된 상태의 재조합 단백질이 생산된다. 아미노 말단에 메티오닌이 포함된 재조합 단백질이 인간이나 기타 동물에 적용되는 경우 면역 반응 (immunogenic)이 유발되거나 불안정하여 (unstable form) 본래의 단백질 기능을 수행하지 못하는 경우가 발생할 수 있다. 따라서 재조합 단백질을 천연형 단백질과 동일한 형태로 제조하는 방법을 개발하는 것은 매우 중요하다 (Nature, 326, 315, 1987; J. Bacteriol., 169, 751-757, 1987; Bio/Technology, 8, 1036-1040, 1990; Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211-215, 1991).
특히, 인간 성장 호르몬은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성되고 아미노 말단이 페닐알라닌-프롤린-트레오닌 (Phe-Pro-Thr)의 서열로 이루어져 있는 분자량 22,125 의 폴리펩티드 호르몬으로서, 주로 왜소증을 치료하는데 사용되어 왔다 (Raben, M. S., J. Clin. Endocr., 18, 901, 1958). 인간 성장 호르몬은 종래에 죽은 사람의 뇌하수체에서 추출 및 정제하여 사용되어 왔으나 생산되는 양이 크게 제한되어 모든 환자에게 공급되는데 어려움이 있었다. 또한 뇌하수체에서 분리한 인간 성장 호르몬을 접종받은 어린이 4명이 바이러스에 감염되어 사망했다고 밝혀져, 미국 식품 의약국에서 상기의 방법으로 생산된 인간 성장 호르몬의 사용을 금지시켰다 (Science, 234, 22, 1986). 따라서 최근에는 유전자 재조합 방법으로 대장균 및 효모 등에서 인간 성장 호르몬을 발현시켜 정제하려는 많은 시도가 이루어졌으며, 이러한 인간 성장 호르몬이 실제로도 임상에서 이용되고 있다 (대장균의 경우, 대한민국 특허공고 제 89-1244 호 및 제 87-701 호, 특허공개 제 87-2258 호 및 제 84-8695 호 참조; 효모의 경우, 대한민국 특허공고 제 92-99 호, 특허공개 제 90-9973 호 및 제 90-9976 호 참조).
그러나 상기의 유전자 재조합 방법으로 인간 성장 호르몬을 생산하는 경우 천연형의 인간 성장 호르몬에 존재하는 191개의 아미노산 잔기 이외에 그의 아미노 말단에 아미노산의 합성이 시작되는 코돈 (codon)인 메티오닌이 하나 더 첨가되어 아미노 말단이 메티오닌-페닐알라닌-프롤린-트레오닌 (Met-Phe-Pro-Thr)으로 시작되는 192개의 아미노산 잔기로 이루어진 메티오닐 인간 성장 호르몬이 생산된다. 메티오닐 인간 성장 호르몬은 생물학적 활성면에서 천연형 인간 성장 호르몬과 같은 성질을 보여주고 (Moore, J. A.., Endocrinology, 122, 2920-2926, 1988), 이에 메티오닌이 첨가되어 일어나는 부작용에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다. 그러나 메티오닌이 첨가됨으로 해서 간혹 항체가 생성될 수 있으며 체내에서 항체가 생성되는 비율이 천연형 단백질 보다 높다는 보고가 있다 (Lancet, March 29, 697, 1986).
따라서 인간 성장 호르몬을 아미노 말단에 메티오닌이 없는 천연형으로 제조하려는 많은 시도가 있었다. 구체적으로, 인간 성장 호르몬의 아미노 말단과 다른 단백질의 카복시 말단을 융합시킨 다음 특수한 프로테아제 (protease)를 이용하여 절단하는 방법 (PCT 국제출원 WO 89/12678, 유럽 특허출원 EP 20209, 유럽 특허 EP 321940) 그리고 성장 호르몬이 세포 내에서 발현되어 숙주세포 밖으로 분비되는 과정에서 메티오닌이 잘려나가게 함으로써 배지로부터 천연형의 인간 성장 호르몬을 얻는 방법 등이 이를 제조하기 위하여 시도되었다 (유럽 특허 EP 008832, 미국 특허 US 4755465, 일본 특허 JP 01273591, 유럽 특허출원 EP 306673, 대한민국 특허출원 제 92-10932 호). 그러나 상기의 방법들은 인간 성장 호르몬을 생산하기 위하여 발현 벡터를 새로이 만들거나 숙주세포를 형질전환하는 번거로운 조작을 거쳐야 하며 이 때 발효되는 조건을 최적화하려는 부가적인 노력이 필요한 단점이 있다.
한편 유전자 재조합 방법으로 생산된 단백질의 아미노 말단에 부가적인 아미노산이 포함되는 경우 아미노펩티다제를 처리하면 이러한 부가적인 아미노산을 제거할 수 있고, 그 결과 천연형 단백질과 동일한 단백질을 용이하게 생산할 수 있다. 구체적으로 천연형 인간 성장 호르몬을 생산하기 위하여 기존의 방법으로 정제된 메티오닐 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌만을 선택적으로 제거할 수 있는 특수한 아미노펩티다제 (aminopeptidase)를 사용하면 천연형 인간 성장 호르몬을 제조할 수 있다 (PCT 국제출원 WO 86/04609, WO 86/204527 A1).
현재까지 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하기 위하여 사용된 아미노펩티다제로는 에로모나스 프로티오리티카 (Aeromonas proteolytica)에서 정제한 아미노펩티다제 (국제출원 WO 86/01229; 유럽 특허 EP 0489711, A3, B.T.G. 사; Prescott and Wikes, Method in Enzymology, 44, 530-543, 1976), 돼지 신장에서 정제한 아미노펩티다제 (국제출원 WO 86/204527 A1; Bio/Technology, 5, 824-827, 1987, Takeda사), 딕티오스텔리움 디스코이듐 (Dictyostelium discoidem)에서 정제한 디펩티딜 (dipeptidyl) 아미노펩티다제 (유럽 특허 EP 557076, 미국 특허 US 5126249, A1, Eli Lilly사), 스트렙토미세스 써모니트리피칸스(Streptomyces thermonitrificans)에서 정제한 아미노펩티다제 (유럽 특허 EP 6296695; 미국 특허 US 5569598, Lucky 사)가 보고되었다.
아미노펩티다제가 상기의 목적에 사용되기 위해서는 재조합 단백질의 아미노 말단에 존재하는 불필요한 아미노산 잔기를 제거하지만 천연형 단백질의 아미노산 서열에는 작용하지 않는 특성을 가져야만 한다. 즉 천연형 단백질이 아미노 말단에 X-Y-Z- 로 시작되는 아미노산 서열을 가지고 유전자 재조합 방법으로 생산된 단백질이 아미노 말단에 부가적인 메티오닌을 포함하는 Met-X-Y-Z- 의 아미노산 서열을 가지는 경우, 아미노펩티다제가 메티오닌 잔기만을 제거하고 그 이후의 아미노산 (X-Y-Z-) 에는 작용하지 않아야 천연형 단백질과 동일한 단백질을 제조할 수 있다. 따라서 이러한 목적에 이용될 수 있는 아미노펩티다제는 목적 단백질에 따른 기질 특이성이 부합되어야만 적용할 수 있다. 구체적으로, 메티오닐 인간 성장 호르몬은 아미노 말단의 아미노산 서열이 메티오닌-페닐알라닌-프롤린-트레오닌-이소루이신 (Met-Phe-Pro-Thr-Ile)으로 시작되므로 아미노 말단의 메티오닌만을 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있는 아미노펩티다제는 X-프롤린 서열을 인지하고 절단 반응이 X 아미노산 앞에서 정지되는 특성을 가져야 한다. 또한 상기의 특성을 지니는 효소가 분리되어 있어도 이를 산업적으로 이용하기 위해서는 효소 자체내의 내재 활성도가 월등히 높아야 유리하다.
지금까지 아미노펩티다제는 미생물 등에서 수십 종 이상이 추출되어 보고되었으며, 대부분의 효소가 공통적으로 그의 활성을 나타내기 위하여 칼슘 또는 아연 등 금속 이온을 필요로 한다. 이들 아미노펩티다제는 아미노 말단에서 아미노산 잔기를 절단하는 측면에서는 공통적인 활성을 나타내지만, 이들이 정제된 미생물에 따라 분자량, 필요한 금속 이온, 반응의 최적 조건 및 기질 특이성 등의 측면에서는 매우 다양한 활성을 나타낸다 (FEMS Microbiol. Rev., 18, 319-344, 1996). 이와 같은 아미노펩티다제는 엑소펩티다제 (exopeptidase)로 분류되며 기질로 사용되는 단백질의 아미노 말단에서부터 순차적으로 아미노산을 유리시키는 성질을 가지고 있다.
이들 아미노펩티다제가 바실러스 속 (Bacillusgenus)에서는 바실러스 써브틸리스 (Bacillus subtilis) (Arch. Biochem. Biophys., 197, 63-77, 1979; Arch. Biochem. Biophys., 202, 540-545, 1980; J. Biochem., 107, 603-607, 1994; 일본 특허 JP 03285684, Diacel-Chem사), 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus) (Meth. Enzymol., 19, 544-552, 1970; Biochim. Biophys. Acta, 438, 212-220, 1976; 유럽 특허 EP 101653, Unitika사), 바실러스 써린젠시스 (Baciiius thuringensis) (Biokhimiya, 49 1899-1907, 1984), 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) (Arch. Biochem. Biophys., 186, 383-391, 1978; Mikrobiol. Zh., 51, 49-52, 1989) 등에서 분리되어 보고되었다.
상기에서 언급한 문헌들을 조사하여 보면, 아미노펩티다제를 정제하여 그의 효소적 특성을 루이신-파라-니트로아닐리드 및 몇가지 디펩티드(dipeptide) 등을 기질로 사용하여 분석하였다. 그러나 아미노 말단이 메티오닌-X-프롤린의 서열로 시작하는 올리고펩티드 또는 아미노 말단이 메티오닌-X-프롤린으로 시작되는 단백질을 기질로 사용하여 그 효소 활성은 측정하지 않았다. 따라서 이들 아미노펩티다제들이 아미노 말단에 메티오닌-X-프롤린 서열을 가지는 재조합 단백질에서 메티오닌을 제거하는 반응에 이용될 수 있는 가능성을 보여주지는 못하였다.
이에 본 발명자들은 유전자 재조합 방법으로 천연형 단백질을 대량 생산하기 위하여, 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 잔기만를 제거할 수 있는 아미노펩티다제를 다양한 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) 균주에서 조사한 결과, 상기 균주에 유래한 아미노펩티다제가 합성 기질, 올리고펩티드 및 단백질 등에서 메티오닌 잔기만을 제거할 수 있고, 특히 메티오닌-X-프롤린 (여기에서 X 는 어느 아미노산이든 무관함을 나타낸다)의 아미노산 서열을 인지하므로 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하는데 적합함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 잔기를 제거할 수 있는 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) 균주에서 유래한 아미노펩티다제를 제공함에 그 목적이 있다.
본 발명은 아미노 말단이 메티오닌-X-프롤린 서열로 시작하는 펩티드 또는 단백질을 인지하여 메티오닌 잔기만을 제거하고, 바람직하게는 상기 X 아미노산이 페닐알라닌인 서열을 인지하는 아미노펩티다제를 제공한다.
본 발명의 아미노펩티다제는 아미노 말단이 서열 또는 서열로 시작되고, 이들 서열 중 일부 아미노산이 제거되거나 치환된 형태가 함께 존재하며, 분자량은 약 43 내지 47 kDa 정도를 가진다.
본 발명은 바실러스 리케니포미스 균주를 배양하여 얻은 배양액을 원심분리한 다음 그의 상등액을 농축하여 젤 여과 크로마토그래피 등을 수행하는 상기 아미노펩티다제의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다. 이 때 바실러스 리케니포미스 KCTC 3045, KCTC 1030, KCTC 3058 및 ATCC 12759 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 아미노펩티다제를 생산하는 숙주세포를 유전자 재조합 방법으로 제조한 다음 이를 배양하여 다양한 정제 과정을 거침으로 상기 아미노펩티다제를 얻는 제조방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 유전자 재조합 방법으로 생산된 재조합 단백질에 상기 아미노펩티다제를 처리하고 다양한 정제 과정을 거쳐 천연형 단백질과 동일한 형태의 단백질을 얻는 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 아미노 말단이 메티오닌-X-프롤린 서열로 시작하는 메티오닐 인간 성장 호르몬으로부터 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하는 방법을 제공한다. 이 때 아미노펩티다제는 pH 7.0 내지 9.5 범위에서, 온도는 20 내지 60℃ 범위에서 처리하고, 반응 용액에는 염화나트륨을 최종 농도 30 내지 230 mM 로 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 메티오닐 인간 성장 호르몬 1mg 당 0.2 내지 20 U 범위의 아미노펩티다제를 반응시키는 것이 바람직하고, 아미노펩티다제를 처리한 다음 얻어진 천연형 인간 성장 호르몬은 이온 교환 수지 크로마토그래피 등을 수행하여 정제한다.
도 1은 알칼라인 프로테아제 (alkaline protease)를 생산하는 것으로 보고된 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 1026, KCTC 1029, KCTC 1831, KCTC 3045, KCTC 3046, KCTC 3047 및 KCTC 3049 균주를 각각 배양하여 생산된 아미노펩티다제의 양을 비교하여 나타낸 것이다. 본 효소의 활성 측정에 사용한 기질은 루이신-파라-니트로아닐리드 (leucine-p-nitroanilide)이다.
도 2는 알파-아밀라제 (α-amylase)를 생산하는 것으로 보고된 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 1030, KCTC 2215 및 KCTC 3006 균주를 각각 배양하여 생산된 아미노펩티다제의 양을 비교하여 나타낸 것이다. 본 효소의 활성 측정에 사용한 기질은 루이신-파라-니트로아닐리드이다.
도 3은 바시트라신 (Bacitracin)을 생산하는 것으로 보고된 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 3056, KCTC 3057 및 KCTC 3058 균주를 각각 배양하여 생산된 아미노펩티다제의 양을 비교하여 나타낸 것이다. 본 효소의 활성 측정에 사용한 기질은 루이신-파라-니트로아닐리드이다.
도 4는 상기 균주 가운데 아미노펩티다제의 활성이 높은 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 3045, KCTC 1030 및 KCTC 3058 균주 각각에서생산된 아미노펩티다제의 양을 측정하여 기존에 아미노펩티다제를 생산하는 것으로 알려진 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주의 활성과 비교한 것이다. 본 효소의 활성 측정에 사용한 기질은 루이신-파라-니트로아닐리드이다.
도 5는 상기 균주 가운데 아미노펩티다제의 활성이 높은 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 3045, KCTC 1030 및 KCTC 3058 균주 각각에서 생산된 아미노펩티다제의 양을 측정하여 기존에 아미노펩티다제를 생산하는 것으로 알려진 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주의 활성과 비교한 것이다. 본 효소의 활성 측정에 사용한 기질은 인간 성장 호르몬의 아미노 말단 부위 (Met-Phe -Pro-X)의 서열을 가지는 올리고펩티드이다.
도 6은 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) ATCC 12759 균주에서 분리·정제한 아미노펩티다제의 순도와 분자량을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 것이다.
레인 M : 표준 단백질; 레인 1 - 레인 2 : 정제된 아미노펩티다제
도 7은 상기 아미노펩티다제의 pH 에 따른 활성을 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 나타낸 것이다.
도 8은 상기 아미노펩티다제의 온도에 따른 활성을 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 나타낸 것이다.
도 9는 상기 아미노펩티다제의 열 안정성을 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 나타낸 것이다.
도 10은 메티오닐 인간 성장 호르몬으로부터 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하는 과정에서 pH 에 따라 메티오닌이 제거되는 양상을 비교하여 나타낸 것이다.
도 11은 메티오닐 인간 성장 호르몬으로부터 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하는 과정에서 온도에 따라 메티오닌이 제거되는 양상을 비교하여 나타낸 것이다.
도 12는 메티오닐 인간 성장 호르몬으로부터 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하는 과정에서 염화나트륨의 농도에 따라 메티오닌이 제거되는 양상을 비교하여 나타낸 것이다.
도 13은 메티오닐 인간 성장 호르몬으로부터 천연형 인간 성장 호르몬을 제조한 다음 모노-Q 크로마토그래피를 수행하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 것이다.
레인 M : 표준 단백질;
레인 1 - 레인 2 : 아미노펩티다제를 처리하지 않은 시료;
레인 3 - 레인 6 : 아미노펩티다제를 처리한 시료
도 14는 상기에서 제조한 천연형 인간 성장 호르몬의 아미노 말단 아미노산을 확인하여 나타낸 것이다.
도 15는 상기에서 대량으로 제조한 천연형 인간 성장 호르몬의 아미노 말단 아미노산 서열을 분석하여 나타낸 것이다.
도 16a는 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 균주에서 분리·정제한 아미노펩티다제를 모노-S 크로마토그래피를 수행하여 크로마토그램으로 확인한 것이다.
도 16b는 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 균주에서 분리·정제한 아미노펩티다제를 모노-S 크로마토그래피를 수행하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 것이다.
본 발명은 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 잔기를 제거할 수 있는 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) 균주에서 유래한 아미노펩티다제를 제공한다.
구체적으로, 균주 기탁기관 (한국 유전자은행, Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁되어 있는 약 20여종의 바실러스 리케니포미스 균주를 배양하여 배양액 내에 존재하는 아미노펩티다제의 활성을 비교한다. 바실러스 리케니포미스 균주는 기존에 보고된 문헌에 기초하여 알칼라인 프로테아제 (alkaline protease 및 detergent-resistant alkaline protease)를 생산하는 균주, 알파-아밀라제 (α-amylase)를 생산하는 균주 및 바시트라신 (bacitracin)을 생산하는 균주로 구별될 수 있다.
구체적으로, 알칼라인 프로테아제를 생산하는 균주인 바실러스 리케니포미스 KCTC 1026(ATCC 21415), KCTC 1029(ATCC 21418), KCTC 1831(ATCC 21424), KCTC 3045(ATCC 21415), KCTC 3046(ATCC 21416), KCTC 3047(ATCC 21417), KCTC 3049(ATCC 21424) 등의 7가지 균주들 (도 1참조), 알파-아밀라제를 생산하는 균주인 바실러스 리케니포미스 KCTC 1030(ATCC 27811), KCTC 2215(ATCC 27811), KCTC 3006(ATCC 39326) 균주들 (도 2참조) 그리고 바시트라신을 생산하는 균주인 바실러스 리케니포미스 KCTC 3056(ATCC 10716, ATCC 11944), KCTC 3057(ATCC 11945), KCTC 3058(ATCC 11946) 균주들을 (도 3참조) 배양하여, 그 배양 상등액 취한 다음 하기 참고예 1 의 방법으로 아미노펩티다제의 활성을 측정한다. 바실러스 리케니포미스 KCTC 3045, KCTC 1030, KCTC 3058 및 ATCC 12759 균주는 기질로 사용한 루이신-파라-니트로아닐리드에 대해 6 내지 25 U 범위의 우수한 활성도를 나타낸다 (도 4참조). 이들 균주 중 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주는 이미 로드리게스 등에 의해 아미노펩티다제를 생산하는 것으로 보고되어 있다 (Rodriguez-Absi, J. and Prescott, J. M., Arch. Biochem. Biophys., 186(2), 383-391, 1978).
참고예 1 루이신-파라-니트로아닐리드 기질에 대한 아미노펩티다제의 활성 측정
본 발명은 아미노펩티다제의 활성을 플레이더러 (Pfleiderer, Meth. Enzymol., 19, 514-521, 1970)의 방법에 따라 측정하였다. 구체적으로 효소 활성을 나타내는 1 단위 (unit)는 100 mM 트리스 (pH 8.0), 2 mM 루이신-파라-니트로아닐리드(시그마사, 미국)를 포함하는 용액 1 ml 에 아미노펩티다제를 가하여 37℃에서 1분 동안 반응시키고 다시 70% 아세트산 100μl 을 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 405nm 에서 흡광도 1 이 변화하는 효소의 양으로 정의하였다. 이 때 첨가되는 루이신-파라-니트로아닐리드는 디메틸설포옥사이드 (DMSO)에 100 mM 농도로 녹인 용액을 사용하였다.
또한, 본 발명은 상기에서 선별한 균주를 대상으로 아미노 말단에 메티오닌을 가지는 펩티드 또는 단백질에서 상기 메티오닌을 제거하는 엑소프로테아제 (exoprotease) 활성을 확인하기 위하여 메티오닐 올리고펩티드를 기질로 사용하여 아미노펩티다제의 활성을 조사한다 (도 5참조). 구체적으로 본 발명은 메티오닌-페닐알라닌-프롤린-트레오닌-글루탐산-프롤린-세린의 아미노산 서열을 가지는 올리고펩티드 기질을 사용하여 하기 참고예 2 의 과정으로 아미노펩티다제의 활성을 측정한다.
참고예 2 올리고펩티드 기질에 대한 아미노펩티다제의 활성 측정
본 발명의 아미노펩티다제 활성을 올리고펩티드 기질을 사용하여 측정하기 위하여, 0.1 M 트리스와 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 완충용액에 정해진 농도의 기질과 아미노펩티다제를 첨가한 반응용액을 제조하였다. 이 때 올리고펩티드 기질은 메티오닌-페닐알라닌-프롤린-트레오닌-글루탐산-프롤린-세린의 아미노산 서열을 가진다. 상기 반응용액을 37℃에서 일정 시간 동안 반응시키고 다시 동일 부피의 70% 아세트산을 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 반응 산물을 고압 역상계 액체 크로마토그래피 (fast performance liquid chromatography, FPLC)를 수행하여 분석하였다. 이 때 첨가되는 올리고펩티드는 DMSO (dimethylsulfoxide)에 30 mM 농도로 녹여 준비하였고, 상기 기질 용액은 증류수를 사용하여 2.5 mM 농도로 희석한 다음 상기 반응 용액에 필요한 농도로 첨가하였다.
상기 반응 산물을 분석하기 위하여 수행한 크로마토그래피의 반응 조건은 다음과 같다. 이 때 YMC 단백질 RP 칼럼 (YMC Protein RP column, 4.6×250mm, YMC 사)를 사용하였고, 0.05% 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA)을 함유하는 용매 A 와 0.05% 트리플루오르아세트산 및 80% 아세토니트릴 (acetonitrile)을 함유하는 용매 B 를 용출하는데 사용하였다. 상기 반응 용액을 칼럼에 주입한 다음 20분 동안 10% 에서 30% 로의 선형 농도 구배로 조성된 용매 B 를 이용하여 용출하고, 214nm 에서 흡광도를 나타내는 면적을 기록하여 계산하였다. 그 결과 상기 조건에서 반응하기 전의 기질은 약 9.5 분대에서, 반응 산물은 약 7.0 분대에서 용출되었다. 기질과 반응 산물인 펩티드를 상기 조건으로 용출한 경우, 각 피크의 면적은 펩티드의 수에 비례하므로 동일 농도에 대한 기질 (6개의 펩티드 결합)과 반응 산물 (5개의 펩티드 결합)에서 그의 면적 비가 약 6 : 5 로 나타났다. 따라서 상기 반응에 의해 생성된 반응 산물의 양은 다음의 식에 의해 구하였다.
PA : 기질 펩티드의 피크 면적
SA : 산물 펩티드의 피크 면적
[S] : 기질 펩티드의 초기 농도
[P] : 반응에 의해 생성된 산물 펩티드의 농도
상기 올리고펩티드는 아미노 말단에 메티오닌 잔기를 가지고 그 다음에 X-프롤린 서열을 가지므로 상기 과정을 통하여 아미노 말단의 메티오닌에는 반응하지만 X-프롤린 서열에는 전혀 반응하지 않는 아미노펩티다제를 선별할 수 있다. 바실러스 리케니포미스 KCTC 3045, KCTC 1030, KCTC 3058 및 ATCC 12759 균주들이 상기의 특성을 나타내는 아미노펩티다제를 생산하였다. 따라서 이들 균주에서 유래한 아미노펩티다제는 메티오닌-X-프롤린의 아미노산 서열로 시작하는 펩티드 또는 단백질에서 아미노 말단의 메티오닌만을 제거하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아미노펩티다제가 펩티드에 비하여 분자량이 큰 단백질에서도 아미노 말단 메티오닌을 제거함을 확인하기 위하여, 우선 아미노펩티다제를 순수 정제하여 다른 엔도프로테아제 등에 의한 부가적인 반응을 줄인다.
구체적으로, 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 및 KCTC 3058 균주 등을 대상으로 아미노펩티다제를 정제하여 그의 효소적 특성을 조사하는데, 상기 균주는 루이신-파라-니트로아닐리드 기질에 대한 반응성을 기준으로 올리고펩티드 기질에 대한 반응성이 가장 크게 나타난 것이다. 상기에서 정제한 아미노펩티다제는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 결과, 약 43 내지 47 kDa 의 분자량을 가진다 (도 6및도 16참조).
또한, 상기 아미노펩티다제의 아미노 말단은, 서열 또는 서열을 포함한다 (도 14및도 15참조).
이 때 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 에서 분리한 아미노펩티다제의 경우, 상기 서열의 아미노 말단에 한 개 또는 두 개의 아미노산이 제거된 형태 등이 함께 존재하고, 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 에서 분리한 아미노펩티다제는 아미노 말단의 라이신이 제거되거나 9번째 아스파라진이 아스파라진산으로 치환된 형태 등이 함께 존재한다.
상기 아미노펩티다제는 합성 기질을 이용하여 조사한 결과 루이신에 대해 특이성이 높고 메티오닌에 대해서는 상대적으로 반응성이 낮아 통상적으로 루이신 아미노펩티다제로 분류될 수 있다. 구체적으로 합성 기질인 루이신-파라-니트로아닐리드 (Leu-p-nitroanilide)를 기질로 사용하여 그의 효소적 특성을 조사한다. 본 발명의 아미노펩티다제는 pH 7.5 내지 10.5 범위에서 바람직한 활성을 나타내고 pH 8.5 내지 9.5 범위에서 더욱 바람직한 활성을 나타내며 (도 7참조), 온도 40 내지 70℃ 에서 바람직한 활성을 나타내고, 온도 50 내지 60℃ 에서 더욱 바람직한 활성을 나타낸다 (도 8참조). 또한, 본 발명의 아미노펩티다제는 열에 안정하여 60℃ 에서 4시간 동안 방치하여도 50% 이상의 활성을 보유하며 (도 9참조) 디티오트레이톨 (dithiothreitol), 이오도아세트산 (iodoacetic acid) 및 오르토페난트롤린 (ortho-penanthroline)에 의해 활성이 억제되고 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)에 의해 활성이 부분적으로 억제된다.
또한, 본 발명은 바실러스 리케니포미스 균주에서 유래한 아미노펩티다제를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로 바실러스 리케니포미스 균주의 배양액을 원심분리하여 그의 상등액을 얻고 이를 농축한 다음 다양한 젤 여과 크로마토그래피 등을 수행하여 상기 아미노펩티다제를 생산한다. 이 때 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759, KCTC 3058, KCTC 3045 및 KCTC 1030 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
이외에도 상기 아미노펩티다제를 생산하는 숙주세포를 유전자 재조합 방법으로 제조한 다음 이를 배양하여 다양한 정제 과정을 거침으로 상기 아미노펩티다제를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 유전자 재조합 방법으로 생산된 재조합 단백질에 상기 아미노펩티다제를 처리하고 다양한 정제 과정을 거쳐 천연형 단백질과 동일한 형태의 단백질을 얻는 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 아미노 말단이 메티오닌-X-프롤린 서열로 시작하는 메티오닐 인간 성장 호르몬으로부터 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하기 위하여 상기 아미노펩티다제를 사용하여 메티오닌 잔기를 제거한다.
이 때 메티오닐 인간 성장 호르몬 1 mg 당 0.2 내지 20 U 의 아미노펩티다제를 반응시키는 것이 바람직하다. 아미노펩티다제를 사용하여 메티오닌을 제거하는 반응은 pH 7.0 내지 9.5 범위에서 (도 10참조), 온도는 20 내지 60℃ 범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 온도 37℃ 는 가장 바람직하다 (도 11참조). 상기 반응 용액에는 염화나트륨을 최종 농도 30 내지 230 mM 로 첨가하는 것이 바람직하고 100 mM 로 첨가하는 것이 가장 바람직하다 (도 12참조). 또한, 아미노펩티다제를 처리하는 다음 얻어진 천연형 인간 성장 호르몬은 이온 교환 수지 크로마토그래피 등을 수행함으로 아미노펩티다제로부터 분리·정제된다 (도 13참조).
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 알칼라인 프로테아제를 생산하는 균주에서 아미노펩티다제의 활성 측정
알칼라인 프로테아제 (alkaline protease)를 생산하는 균주인 것으로 보고된 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 1026(ATCC 21415), KCTC 1029(ATCC 21418), KCTC 1831(ATCC 21424), KCTC 3045(ATCC 21415), KCTC 3046(ATCC 21416), KCTC 3047(ATCC 21417), KCTC 3049(ATCC 21424) 등의 7가지 균주들을 각각 AP-배지 100 ml (포도당 50 g/l, 인산칼륨; 모노-염기성 10 g/l, 디-염기 10 g/l, 염화나트륨 5 g/l, 효모 추출물 5 g/l, 박토-펩톤 10 g/l, 황산마그네슘 0.01 g/l, FeSO4·7H2O 1 mg/l, ZnSO4·7H2O 1 mg/l, MnSO4·H2O 1 mg/l)이 들어있는 멸균된 500 ml 플라스크에 접종하여 37℃ 에서 150 rpm 으로 진탕하면서 50시간 이상 배양하였다.
상기 배양액 1 ml 을 샘플링하여 원심 분리하고 그의 상등액만을 취한 다음 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 아미노펩티다제 활성을 측정하고 그 결과를도 1에 나타내었다.도 1에 나타난 바와 같이 대부분의 균주들에서 아미노펩티다제 활성이 나타났으며, 상기 효소의 각 활성은 12.3 U, 3.62 U, 1.87 U, 13.6 U, 0.67 U, 1.98 U 및 1.25 U 로 나타났다.
실시예 2 알파-아밀라제를 생산하는 균주에서 아미노펩티다제의 활성 측정
알파-아밀라제 (α-amylase)를 생산하는 균주인 것으로 보고된 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 1030(ATCC 27811), KCTC 2215(ATCC 27811), KCTC 3006(ATCC 39326) 균주들을 실시예 1 과 같은 방법으로 플라스크에 배양하였다. 다음 그 배양 상등액을 취하고 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 아미노펩티다제 활성을 측정한 다음 그 결과를도 2에 나타내었다.도 2에 나타난 바와 같이, 상기 효소의 각 균주에서의 활성은 각각 1.04 U, 0.08 U 및 0.09 U (도 2참조)로 나타났으며 이들 효소는 다른 분류군의 균주에서 발견되는 아미노펩티다제들보다 루이신-파라-니트로아닐리드 기질에 대한 활성이 상대적으로 매우 낮았다.
실시예 3 바시트라신을 생산하는 균주에서 아미노펩티다제의 활성 측정
바시트라신 (Bacitracin)을 생산하는 균주인 것으로 보고된 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 3056(ATCC 10716, ATCC 11944), KCTC 3057(ATCC 11945), KCTC 3058(ATCC 11946) 균주들을 실시예 1 과 같은 방법으로 플라스크에 배양하였다. 다음 그 배양 상등액 취하고 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 아미노펩티다제 활성을 측정하고 그 결과를도 3에 나타내었다. 각 균주에서의 효소 활성은 4.40 U, 11.8 U 및 13.3 U 로 나타났다 (도 3참조).
실시예 4 아미노펩티다제를 생산하는 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주에서 아미노펩티다제의 활성 측정
아미노펩티다제를 생산하는 균주인 것으로 이미 보고되어 있는 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) ATCC 12759 균주를 실시예 1 과 같은 방법으로 플라스크에 배양하였다. 다음 그 배양 상등액을 취하고 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 아미노펩티다제 활성을 측정하고 그 결과도 4에 나타내었다. 상기 균주에서의 효소 활성은 4.16 U 로 나타났으며 이는 다른 분류군의 균주에서 발견되는 아미노펩티다제들과 비교할 때 중간 정도 수준이었다 (도 4참조).
실시예 5 대량 배양한 균주 배양액에서 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용한 아미노펩티다제의 활성 측정
실시예 1, 2 및 3 에 나타난 바를 참고하여 각 분류군 가운데서 가장 아미노펩티다제 활성가 높은 균주를 1 개체씩 선별하는데, 구체적으로 이들은 각각 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KCTC 3045(ATCC 21415), KCTC 1030(ATCC 27811), KCTC 3058(ATCC 11946) 균주들이다. 이들 세가지 균주와 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주를 각각 50 ml LB 배지 (Luria Broth; 효모 추출물 5 g/l, 박토-트립톤 10 g/l, 염화나트륨 5 g/l)가 들어있는 멸균된 500 ml 플라스크에 접종하여 37℃ 에서 150 rpm 으로 진탕하면서 20시간 동안 종 배양하였다. 이 종 배양액을 AP-배지 (포도당 50 g/l, 인산칼륨; 모노-염기성 10 g/l, 디-염기 10 g/l, 염화나트륨 5 g/l, 효모 추출물 5 g/l, 박토-펩톤 10 g/l, 황산마그네슘 0.01 g/l, FeSO4·7H2O 1 mg/l, ZnSO4·7H2O 1 mg/l, MnSO4·H2O 1 mg/l)가 3L 가 들어있는 멸균 준비된 5L 발효조에 접종하여 36.5℃ 에서 300 - 400 rpm 으로 진탕하면서 50시간 이상 본 배양하였다. 본 배양액 1 ml 을 샘플링하여 원심 분리하고 그의 상등액만을 취한 다음 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하여 아미노펩티다제 활성을 측정하고 그 결과를도 4에 나타내었다.도 4에 나타난 바와 같이 각 균주에서 상기 효소의 활성이 14.3 U, 7.86 U, 24.4 U 및 6.10 U 로 각각 나타났으며, 이들 중 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주가 가장 낮은 아미노펩티다제 활성를 나타내고 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 균주는 상기 ATCC 12759 균주에 비하여 4배 정도 더 높은 활성를 나타냈다.
실시예 6 대량 배양한 균주 배양액에서 올리고펩티드를 기질로 사용한 아미노 펩티다제의 활성 측정
실시예 5 에서 얻은 각 균주의 배양 상등액으로 올리고펩티드 기질에 대한 아미노펩티다제의 활성을 다음의 방법으로 측정하였다. 0.1 M 트리스 (pH 8.0), 0.1 M 염화나트륨, 1.25 mM 메티오닐 올리고펩티드 (Met-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro -Ser)을 포함하는 반응 완충용액에 루이신-파라-니트로아닐리드 기질에 대한 활성 기준으로 0.2 U 의 활성을 나타내는 배양액을 각각 첨가하여 최종 부피가 0.3 ml 이 되도록 맞추고 37℃ 에서 10분 동안 반응시켰다. 다음 70% 아세트산을 0.3 ml 첨가하여 반응을 중지시키고 이를 14,000 rpm 으로 5분 동안 원심 분리하여 0.4μm 막으로 여과하는 과정을 순차적으로 거침으로 불순물을 제거하였다. 이 반응용액을 고압 역상계 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석하여 올리고펩티드 기질에 대한 아미노펩티다제의 반응 활성을 참고예 2 에 준하여 측정하였다.
이와 같이 측정한 결과, 바실러스 리케니포미스 KCTC 3045(ATCC 21415), KCTC 1030(ATCC 27811), KCTC 3058(ATCC 11946), ATCC 12759 균주 각각에서 아미노펩티다제의 활성이 각각 2.11, 1.46, 2.14, 2.76 μmole/분으로 나타났다. 그리고 이들 모두는 메티오닐 올리고펩티드를 기질로 사용한 반응에서 아미노 말단의 메티오닌에는 반응을 보였지만 추가적인 반응은 진행되지 않아, 이들의 아미노펩티다제는 모두 메티오닌-X-프롤린 서열을 아미노 말단에 가지는 올리고펩티드 또는 단백질에서 메티오닌 잔기만을 제거하는 반응에 이용될 수 있음을 확인하였다. 상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 루이신-파라-니트로아닐리드 기질에 대한 반응 활성 기준으로 동일한 단위 (U)의 배양액을 첨가했음에도 불구하고 올리고펩티드에 대한 반응 활성는 약간의 차이가 있어 두 가지 기질에서 효소 활성은 상관 관계가 없었다.
상기 과정을 통하여 바실러스 리케니포미스 균주에서 유래한 아미노펩티다제는 아미노 말단의 메티오닌만을 제거하는 과정에 메티오닐 올리고펩티드 기질이 적절하게 이용될 수 있음을 확인하였다. 구체적으로 이들 아미노펩티다제는 아미노 말단에 메티오닌이 존재하는 경우에 이를 제거하지만, 아미노 말단에 X-프롤린 서열이 존재하는 경우에는 전혀 반응하지 않는 기질 특이성을 나타냈다.
또한 바실러스 리케니포미스 균주에서 유래한 아미노펩티다제는 단백질을 기질로 사용한 경우에도 메티오닌 잔기를 제거하는데 적절하게 이용될 수 있음을 다음의 실시예들에서 확인하였다. 이 때 단백질 기질로 아미노 말단에 메티오닌-X-프롤린 서열을 갖는 메티오닐 인간 성장 호르몬을 (아미노 말단이 Met-Phe-Pro-Thr-Ile 으로 시작함) 사용하였다. 기질이 단백질인 경우에는 다른 프로테아제들 특히 엔도프로테아제들 (endo-proteases)에 의해 다른 부가적인 반응이 유발될 수 있으므로 바실러스 리케니포미스 균주가 생산하는 아미노펩티다제를 우선 순수하게 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.
도 5에 나타난 결과를 살펴 볼 때, 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 및 KCTC 3058 균주 등에서 유래한 아미노펩티다제는 루이신-파라-니트로아닐리드에 대한 동일한 활성 기준으로 올리고펩티드에 대한 활성이 가장 높으므로, 이 균주의 아미노펩티다제를 대량 분리·정제하여 메티오닐 인간 성장 호르몬에서 메티오닌 잔기를 제거하는 과정에 이용하였다.
실시예 7 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주의 배양
바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주를 대량으로 얻기 위하여, 종 배양으로 멸균된 LB 배지를 100 ml 준비하고 이에 상기 균주를 접종하여 37℃의 조건에서 20시간 동안 배양하였다. 이 종 배양액을 멸균 배지 (0.5% 효모 추출물, 1% 펩톤, 2% 인산칼륨, 0.5% 염화나트륨, 0.08 g/l MgSO4·7H2O, 0.01 g/ml FeSO4·7H2O, 0.01 g/l ZnSO4·7H2O, 0.01 g/l 황산망간, 3.3% 함수 포도당을 포함) 10 L 를 준비하여 10 L 용량의 발효조에 접종하고 이를 45℃ 에서 22시간 내지 24시간 동안 pH 를 7.0 으로 조절하면서 본 배양하였다.
실시예 8 아미노펩티다제의 정제
실시예 7 에서 얻은 균주 배양액 (약 9L)을 8,000 rpm 으로 20분 동안 원심 분리하여 (미국 벡크만사) 그의 상등액을 취하고 1 mM PMSF (phenylmethyl sulfonylfluoride)를 첨가한 다음 농축기(Amicon Spiral Cartridge, MWCO 1 만)를 이용하여 약 1.5 L 부피로 농축하였다.
농축액에 초산을 가하여 pH 를 조정한 다음 황산암모늄 분말을 최종 농도(무게/부피)가 40% 가 되도록 첨가하였다. 이 용액에 동일 부피의 삼차 부탄올 (ter-butanol)을 가하여 1시간 동안 저어준 다음 8,000rpm 으로 10분간 다시 원심분리하고 분액 깔대기를 이용하여 아래의 수용액 층을 회수하였다 (1차 삼상 분할). 다음 0.5 N 수산화나트륨을 첨가하여 pH 를 5.0 으로 조정한 다음 황산암모늄 분말을 추가로 첨가하여 최종 농도가 85% 가 되도록 하고, 이 혼합액에 동일 부피의 3차 부탄올을 가하여 1시간 동안 저어준 다음 8,000 rpm 으로 10분 동안 원심 분리하고 중간의 단백질 응집층을 회수하였다 (2차 삼상 분할).
응집된 단백질을 20 mM 인산나트륨 (pH 6.8) 완충용액에 충분히 녹이고 용해되지 않은 불순물은 10,000 rpm 으로 20분 동안 원심 분리하여 제거하였다. 용액의 전도율(conductivity)을 측정하면서 용액의 염 농도를 약 0.3 M 이하까지 상기 완충용액으로 희석하였다. 다음 INdeX 220/500 (Pharmacia사) 칼럼에 약 1.5L 의 SP-세파로스 (Pharmacia사)를 채우고 동일한 완충용액으로 평형화시켰다. 이 칼럼에 상기의 희석된 시료를 주입하고 0.3 내지 0.4 M 염화나트륨을 포함하는 인산 완충용액을 충분히 흘려준 다음 (유속 50 ml/분) 0.3 내지 0.4 M 에서 1 M 염화나트륨의 선형 농도구배를 사용하여 아미노펩티다제를 용출시켰다 (유속 25 ml/분).
SP-세파로스 칼럼에서 용출된 아미노펩티다제의 분획으로 효소의 활성을 측정하여 확인한 다음 각 분획을 모으고 한외여과 (Amicon stirred cell type)에 의하여 이를 20 ml 까지 농축하였다. 이를 다시 약 1,800 ml 의 세파크릴 S-200 이 충진된 (XK 50/10, Pharmacia사) 칼럼으로 젤 여과 크로마토그래피를 수행하여 아미노펩티다제를 정제하였다. 이 때 완충용액으로 0.25 M 염화나트륨을 추가로 포함하는 20 mM 인산 완충용액 (pH 6.8)을 사용하였다.
젤 여과 크로마토그래피를 통하여 용출된 활성 분획을 다시 농축한 다음 다시 20 mM 인산나트륨 (pH 6.8)으로 2배 희석시키고, 희석된 시료를 세 번에 걸쳐 완충용액으로 평형된 고압 역상계 액체 크로마토그래피 (FPLC, Pharmacia 사) 모노-S 칼럼 (0.5cm ×5cm)에 흡착시켰다. 다음 0.3 내지 0.4 M 에서 1 M 염화나트륨이 포함된 완충용액의 선형 농도구배를 가하여 단백질을 용출시킴으로 순수하게 정제된 아미노펩티다제를 얻었다. 용출된 아미노펩티다제는 칼럼 상에서 몇 개의 피크로 나누어졌지만, SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 결과 상에서는 모든 피크가 동일한 분자량을 가진 것으로 나타났다 (도 6참조). 이들 각 피크는 아미노펩티다제 활성도 동일한 것으로 나타났다. 또한, 그 단백질에서 아미노 말단의 아미노산 서열을 분석한 결과 하나 또는 두 개 정도의 아미노 말단 아미노산이 결여된 형태가 확인되었다. 상기에서 기술한 크로마토그래피 과정을표 1에 요약하였다.
| 정제 단계 | 시료의 부피 (ml) | 아미노펩티다제 (U/ml) | 전체 아미노펩티다제 (U/ml) | 엔도펩티다제 (U/ml) | 전체 엔도펩티다제 (U) | 단백질 (mg/ml) | 특이 아미노펩티다제 (U/mg) | 특이 엔도펩티다제 (U/mg) |
| 배양액 | 6250 | 8.7 | 54,000 | 0.43 | 2365 | 0.94 | 9.26 | 0.46 |
| 2차삼상 분할후 | 1520 | 32.95 | 50,081 | 0.701 | 1065 | 1.07 | 30.79 | 0.66 |
| SP-세파로스 | 1650 | 24.95 | 43,600 | 0.008 | 14 | 0.07 | 356.4 | 0.11 |
| 세파크릴 S-200 (농축) | 35 | 307 | 10,700 | 0.023 | 0.8 | 0.25 | 1228 | 0.09 |
| 모노-S (피크Ⅰ) | 10.5 | 345 | 3620 | 0.003 | 0.032 | 0.232 | 1490 | 0.011 |
| 모노-S (피크Ⅱ) | 6.5 | 243 | 1580 | 0.002 | 0.013 | 0.149 | 1630 | 0.013 |
실시예 9 아미노펩티다제의 구조적 특성
(1) 분자량 측정
상기 아미노펩티다제의 분자량을 확인하기 위하여, 이로서 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하고 그 결과를도 6에 나타내었다.도 6에서 레인 M 은 표준 단백질의 분자량을 나타낸 것이며, 레인 1 및 레인 2 는 최종 정제된 아미노펩티다제로서 이를 표준 단백질과 비교한 결과 그 분자량이 약 43 내지 47 kDa 정도임을 확인할 수 있었다.
(2) 아미노산 서열 분석
아미노펩티다제의 아미노 말단 아미노산 서열은 아미노산 서열 분석기 (모델 471 A, 미국 Applied Biosystems 사)를 사용한 자동화된 에드만 분해 반응을 수행하여 분석하였다 (Geoffrey Zubay, Biochemistry, 제 2판, 47-48, 1988). 상기 반응의 결과, 페닐티오하이단토인 (phenylthiohydantoin)이 붙은 아미노산은 역상 고압 크로마토그래피 칼럼 (220nm × 2.1mm 모델 PHT-222, 미국 Applied Biosystem 사)을 이용하여 분리하고, 표준 아미노산에서 나타나는 상기 칼럼의 머무름 시간을 비교한 결과 상기 아미노펩티다제의 아미노 말단은 기본적으로 (Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg)의 서열로 구성되어 있음을 확인하였다. 또한 상기에서 정제한 아미노펩티다제는 이 기본 서열로부터 아미노 말단에서 한 개 또는 두 개의 아미노산이 제거된 형태로도 존재하였다. 이들은 FPLC 모노-S 에서 염 농도의 선형 구배를 아주 천천히 증가시킬 때 서로 분리가 가능하였고 SDS-폴리아크릴아미드 젤상에서 분자량 및 효소적 활성은 동일한 것으로 나타났다.
실시예 10 아미노펩티다제의 효소적 특성
(1) 최적 pH 의 측정
상기 아미노펩티다제가 활성을 나타내는 최적 pH 를 측정하기 위하여, pH 6.0 내지 11.5 구간에서 효소의 활성도를 확인하였다. 효소 반응의 pH 를 조절하기 위하여 인산나트륨 (pH 6 에서 7.5), 트리스 (pH 7.0 에서 9.0), 붕산 (pH 8.5 에서 10.0), CAPS (3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic acid; pH 9.5 에서 11.5) 완충용액 등을 0.1 M 농도로 사용하였고, 효소 활성을 측정하기 위하여 합성 기질인 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하였다. 그 결과 상기 아미노펩티다제는 pH 7.5 내지 10.5 에서 높은 활성을 나타내고, pH 8.5 내지 9.5 에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 그 결과는도 7에 나타내었다.
(2) 최적 온도의 측정
상기 아미노펩티다제가 활성을 나타내는 최적 온도를 확인하기 위하여 온도 30 내지 90℃ 의 구간에서 0.1 M 트리스 완충용액 (pH 8.0)을 사용하여 10℃ 간격으로 효소 활성을 측정하였다. 이 때 합성 기질인 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하였다. 그 결과 상기 아미노펩티다제는 온도 40 내지 70℃ 범위에서 높은 활성을 나타내고, 바람직하게는 온도 50 내지 60℃ 범위에서 최적 활성을 나타냈으며 그 결과는도 8에 나타내었다.
(3) 열 안정성
상기 아미노펩티다제의 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 정제된 아미노펩티다제를 60℃ 와 80℃ 에서 각각 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간 동안 방치한 다음 남아있는 효소 활성을 측정하여 열을 처리하기 전의 효소 활성과 비교하였다. 이 때 합성 기질인 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하였다. 상기 아미노펩티다제는 60℃ 에서 6시간 동안 처리한 경우에도 50% 이상의 활성을 유지하여 열에 대해 안정함을 알 수 있었고, 그 결과는도 9에 나타내었다. 열 안정성은 대개 단백질 분자 자체의 안정성과 직결되고 이러한 안정성이 우수한 아미노펩티다제는 정제 과정에서 불활성화되지 않고 장시간 동안 효소 반응을 수행하더라도 지속적으로 초기 활성를 유지할 수 있으므로, 재조합 단백질에서 메티오닌을 제거하는 반응처럼 장시간이 요구되는 효소 반응에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
(4) 화학물질들에 의한 영향
상기 아미노펩티다제의 활성에 영향을 미치는 화학물질을 조사하기 위하여, 상기 아미노펩티다제에 디티오트레이톨(dithiothreitol), 이오도아세트산(iodoacetic acid), 오르토페난트롤린 (ortho-phenanthroline) 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)을 각각 1, 5, 20 mM 농도로 첨가하여 두시간 동안 방치한 다음 효소 활성을 측정하였다. 이 때 합성 기질인 루이신-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하였고, 그 결과는 다음표 2에 나타내었다.
구체적으로, 상기 아미노펩티다제는 EDTA 보다는 오르토페난트롤린에 의해 크게 활성이 저해되는 것으로 보아 메탈로프로테아제 (metalloprotease)에 속함을 확인할 수 있었다. 그리고 이황 결합 (disulfide bond)에 작용하는 디티오트레이톨, 썰프하이드릴 (sulfhydryl) 그룹에 작용하는 이오도아세트산에 의해 활성이 크게 저해되는 것으로 보아 상기 아미노펩티다제에 존재하는 시스틴 (cysteine) 잔기가 효소 활성에 중요한 역할을 수행함을 추가로 확인하였다.
| 처리한 화학물질 | 상대적인 활성도 (%) | |||
| 0 mM | 1 mM | 5 mM | 20 mM | |
| EDTA | 100 | 93.8 | 83.4 | 66.3 |
| 오르토페난트롤린 | 100 | 91.9 | 86.8 | 4.7 |
| 디티오트레이톨 | 100 | 0.8 | 0 | 0 |
| 이오도아세트산 | 100 | 98.1 | 104.2 | 0 |
실시예 11 아미노펩티다제의 기질 특이성 및 반응속도론적 매개 변수의 조사
(1) 기질의 준비
상기 아미노펩티다제들의 기질 특이성을 비교하기 위하여 두가지 부류의 기질을 사용하였다. 구체적으로 첫 번째 부류는 합성 기질인 파라-니트로아닐리드 유도체로서 루이실 파라-니트로아닐리드 및 메티오닐 파라-니트로아닐리드를 미국 시그마사에서 구입하여 사용하였다. 두 번째 부류는 메티오닐 인간 성장 호르몬의 아미노 말단의 아미노산 서열을 모방한 유사 아미노산 서열을 가진 올리고펩티드 기질로서 메티오닐 펩티드 (Met-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro-Ser) 및 루이실 펩티드(Leu-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro-Ser)를 사용하였다. 상기 올리고펩티드를 합성하기 위하여 펩티드 합성기 (Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer, 미국)내에서 자동화된 고체상 펩티드 합성 (solid-phase peptide synthesis) 반응을 0.1 mM 규모로 수행하였다. 다음 합성 반응을 통해 생성된 펩티드-레진 복합체를 절단하여 올리고펩티드를 획득하였으며, 이는 고압 역상계 액체 크로마토그래피를 수행하는 정제 과정과 건조 과정을 거쳐 시료로서 준비되었다. 준비된 올리고펩티드는 아미노산 분석기 (Applied Biosystems 사, 미국)를 사용하여 그의 아미노산 조성이 분석되었고, 기체 크로마토그래피-질량 분석기를 사용하여 합성된 펩티드의 아미노산 서열이 정확하게 확인되었다. 올리고펩티드는 DMSO 에 녹여 30 mM 농도로 준비하였고, 증류수를 사용하여 2.5 mM 농도로 희석한 다음 필요한 농도로 첨가하였다.
(2) 반응 조건
합성 기질인 파라-니트로아닐리드 유도체를 기질로 사용한 상기 아미노펩티다제의 효소 반응은 참조예에 기술한 동일한 방법을 사용하였다. 이 때 기질이 루이신-파라-니트로아닐리드인 경우는 0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mM 농도로서 반응을 수행하였고, 메티오닌 파라-니트로아닐리드인 경우는 0.125, 0.25, 0.5, 1 mM 농도로서 반응을 수행하였고, 효소인 아미노펩티다제는 동일하게 0.5 U 를 첨가하였다. 그리고 루이신-파라-니트로아닐리드 기질인 경우는 2분 동안 반응을 수행하고, 메티오닌-파라-니트로아닐리드 기질인 경우는 40분 동안 반응을 수행하였다. 다음 70% 아세트산을 첨가하여 반응을 종료시키고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 ε405= 9450 M-1cm-1의 흡광 계수를 적용하여 생성된 산물의 농도를 계산하였다.
올리고펩티드를 기질로서 상기 아미노펩티다제의 효소 반응에 사용하는 경우 0.1 M 트리스와 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 완충용액에 정해진 농도의 기질과 아미노펩티다제를 첨가하여 500μl 의 반응 용액을 제조하였다. 효소 반응은 37℃에서 수행하여 5분과 10분이 경과한 다음 250μl를 취하고 동일 부피의 70% 아세트산을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 반응 산물은 고압 역상계 액체 크로마토그래피를 수행하여 분석하였다. 이 때 기질 농도로는 기질 종류에 상관없이 공통적으로 각각 0.125, 0.160, 0.25, 0.75, 1.25 mM 을 사용하였으며, 효소로는 루이실 펩티드에서 0.01 U, 메티오닐 펩티드에서 0.2 U 의 활성을 나타내는 아미노펩티다제를 사용하였다.
(3) 아미노펩티다제에 대한 반응속도론적 매개 변수 (kinetic parameters)
상기의 반응 조건에서 기질 농도를 변화시키면서 효소 반응의 초기 속도를 측정하고, 린웨브-버어크 도면 (Lineweaver-Burk plot)을 이용하여 각각의 기질에 대한 바실러스 리케니포미스의 아미노펩티다제의 Km 값 및 최대 속도를 결정하였다. 결정된 Km 값 및 최대 속도를 이용하여 다시 kcat, kcat/Km 값을 결정하고, 그 결과를표 3에 나타내었다. 또한 에로모나스 프로티오리티카 (Aeromonas proteolytica, 일명Vibrio proteolytica)에서 정제한 (대한민국 특허공개 제94-14804호) 아미노펩티다제를 이용한 동일한 실험을 수행하여 그 결과를 함께 비교하였다. 두 아미노펩티다제 모두는 아미노 말단에 루이신을 가진 기질들에 대한 반응성이 월등히 높아 일반적인 아미노펩티다제의 분류 방법에 준하는 경우 루이신 아미노펩티다제로 분류될 수 있다. 바실러스 리케니포미스에서 생산되는 아미노펩티다제는 파라-니트로아닐리드 유도체인 기질에 대해서도 에로모나스 프로테오리티카에서 생산되는 아미노펩티다제와 유사한 속도론적 매개변수 값을 가졌다. 그러나 올리고펩티드를 기질로 사용한 경우는 바실러스 리케니포미스에서 정제된 아미노펩티다제가 훨씬 높은 전환율 (kcat)을 가졌다. 그리고 바실러스 리케니포미스에서 정제된 아미노펩티다제는 기존에 보고된 에로모나스 프로테오리티카의 효소보다 Km 값이 작으므로 기질에 대한 친화력이 우수한 것을 알 수 있다. 따라서 상기 아미노펩티다제는 펩티드의 아미노 말단에서 메티오닌 또는 루이신을 제거하는데 매우 유용함을 확인하였다.
| 아미노펩티다제 | 기질 | Km (mM) | kcat (sec-1) | kcat/km (mM-1sec-1) |
| 바실러스 리케니포미스 아미노펩티다제 | 루이신-파라-니트로아닐리드 | 0.739 | 130 | 176 |
| 메티오닌-파라-니트로아닐리드 | 1.004 | 2.59 | 2.58 | |
| 루이실 올리고펩티드 | 0.172±0.035 | 275.6±33.9 | 1626±141 | |
| 메티오닐 올리고펩티드 | 0.387±0.100 | 21.08±3.79 | 56.13±12.35 | |
| 에로모나스 프로테오리티카 아미노펩티다제 | 루이신-파라-니트로아닐리드 | 0.240 | 48 | 200 |
| 메티오닌-파라-니트로아닐리드 | 0.942 | 2.64 | 2.80 | |
| 루이실 올리고펩티드 | 0.336±0.045 | 70.29±4.37 | 211.2±2.4 | |
| 메티오닐 올리고펩티드 | 0.956±0.680 | 3.23±1.16 | 3.76±1.50 |
실시예 12 천연형 인간 성장 호르몬의 제조
(1) 메티오닐 인간 성장 호르몬에서 아미노 말단의 메티오닌을 제거하는 반응의 최 적화
바실러스 리케니포미스에서 정제한 아미노펩티다제를 이용하여 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하기 위하여, 그 단백질의 아미노 말단에서 메티오닌을 제거하는 최적 반응 조건들을 다음의 방법으로 조사하였다.
기본적으로 1 mg/ml 메티오닐 인간 성장 호르몬 (최종 0.1 mg), 50 mM 트리스 완충용액 (pH 8.0), 0.1 M 염화나트륨, 1 mM PMSF 를 포함하는 반응용액에 0.5 U 아미노펩티다제를 첨가하여 최종 부피가 100μl 가 되도록 한 다음 37℃ 에서 30분 동안 반응을 수행하였다. 상기 효소 반응은 100% TCA (trichloroacetic acid) 11μl 를 첨가하여 종료시킨 다음 반응 용액을 소형 원심분리기 14 rpm 으로 5분간 원심분리하여 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질은 아세톤으로 2번 세척한 다음 건조시켰다. 건조된 시료를 이용하여 아미노산 서열 분석기 (모델 471A, 미국 Applied Biosystems 사) 내에서 자동화된 에드만 분해 반응을 수행하는데, 첫 번째 싸이클에서 검출되는 메티오닌 잔기 및 페닐알라닌 잔기의 비율을 측정하여 메티오닌이 제거되는 정도를 확인하였다.
상기 반응이 일어나는 최적 pH 를 조사하기 위하여, pH 7.0 내지 11.5 범위에서 메티오닐 인간 성장 호르몬으로부터 메티오닌이 제거되는 정도를 측정하였다. 상기 반응에서 pH 를 조절하기 위하여 완충용액은 트리스 (pH 7.0 에서 9.0), 붕산 (pH 8.5 에서 10.0), CAPS (pH 9.5 에서 11.5)를 50 mM 농도로 사용하였다. 그 결과도 10에 나타난 바와 같이, 아미노펩티다제를 사용하여 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하는데 사용될 수 있는 최적 pH 는 7.5 내지 9.5 였다.
또한, 최적 온도를 조사하기 위하여 상기의 반응을 온도 20 에서 70℃ 범위에서 수행하고 아미노 말단에서 메티오닌이 제거되는 정도를 측정하여 그 결과를도 11에 나타내었다. 메티오닌이 제거되는 반응의 최적 온도는 50 내지 60℃ 인 것으로 나타났다. 그러나 높은 온도에서는 인간 성장 호르몬이 침전되어 메티오닌의 제거율이 낮으므로 인간 성장 호르몬의 안정성을 고려해 볼 때 50 내지 60℃ 의 높은 반응 온도보다는 37℃ 이하의 낮은 농도가 더욱 바람직하다. 또한, 반응에 있어서 염화나트륨은도 12에 나타난 바와 같이 430 mM 농도까지 첨가될 수 있고 바람직하게는 약 100 mM 이 적절하였다.
(2) 천연형 인간 성장 호르몬의 제조
메티오닐 인간 성장 호르몬 약 1 mg 에 아미노펩티다제 10 U 를 포함하는 반응 완충용액 (50 mM 트리스, pH 8.0, 100mM 염화나트륨, 1mM PMSF)을 제조하여 (최종 부피 1ml) 투석막 안에 넣고 동일한 완충용액에 충분히 투석하면서 37℃ 물 중탕기에서 24시간 동안 반응시켰다. 24시간이 경과한 다음 다시 4℃ 에서 20 mM 트리스 (pH 8.0) 완충용액으로 충분히 투석하여 반응을 완결시켰다. 다음 시료는 고압 역상계 액체 크로마토그래피 (FPLC, Pharmacia 사)로 모노-Q 이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스 완충용액을 이용하여 인간 성장 호르몬만을 용출하였다. 이 때 회수된 인간 성장 호르몬은 아미노펩티다제 뿐만 아니라 다른 불순물 단백질을 전혀 포함하지 않고 순수하다는 것을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인하였다 (도 13참조). 또한 회수된 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 존재하는 아미노산을 아미노산 서열 분석기 (미국 471A, 미국 Applied Biosystems사)로 분석하였다 (도 14참조). 그 결과 상기 아미노펩티다제를 처리하여 메티오닐 인간 성장 호르몬에서 메티오닌이 완전히 제거되고 동시에 아미노 말단이 페닐알라닌으로 전환된 새로운 천연형 인간 성장 호르몬이 생성되었다.
(3) 천연형 인간 성장 호르몬의 대량 제조
상기와 동일한 조건에서 메티오닐 인간 성장 호르몬 50 g 에 대해 50 mg 의 아미노펩티다제를 37℃ 에서 24시간 동안 처리하였다. 아미노펩티다제를 처리한 시료는 희석 여과법 (diafiltration)으로 그의 염 농도를 낮춘 다음 DEAE-세파로스(Pharmacia사)를 이용하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 이 때 얻어진 인간 성장 호르몬을 회수하였다. 회수한 인간 성장 호르몬의 아미노 말단에 존재하는 아미노산을 아미노산 서열 분석기로 분석하였다 (도 15참조). 그 결과, 상기의 과정으로 제조된 인간 성장 호르몬은 그의 아미노 말단에 모든 메티오닌이 제거되어 페닐알라닌을 가지고 있었다.
실시예 13 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 (ATCC 11946)로부터 아미노펩티 다제의 정제
실시예 7에서와 동일한 방법으로 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 균주를 배양하였다.
배양액 (약 8L)을 8,000rpm 으로 20분 동안 원심분리하여 (미국 벡크만사) 그의 상등액을 취하고 농축기 (Amicon Spiral Cartridge, MWCO 1만)를 이용하여 1.6L 부피로 농축하였다.
농축액에 10% 초산을 가하여 pH 5.0 으로 조정한 다음 황산암모늄 분말을 첨가하여 최종 농도(포화 농도) 40% 가 되도록 첨가하였다. 이 용액에 동일 부피의 삼차 부탄올 (ter-butanol)을 가하여 1시간 동안 저어 준 다음 8,000rpm 으로 10분 동안 원심분리하여 아래의 수용액층을 회수하였다 (1차 삼상 분할). 회수한 용액에 0.5 N 수산화나트륨을 첨가하여 pH 를 6.0 으로 조정한 다음 황산암모늄을 추가로 첨가하여 최종 농도 (포화 농도)가 85% 가 되도록 하고, 이 혼합액에 동일 부피의 3차 부탄올을 가하여 1시간 동안 저어준 다음 8,000rpm 으로 10분 동안 원심분리하고 중간의 단백질 응집층을 회수하였다 (2차 삼상 분할).
응집된 단백질을 20 mM 인산나트륨 (pH 6.8) 완충용액에 충분히 녹이고, 용해되지 않은 불순물은 10,000 rpm 으로 20분 동안 원심분리하여 제거하였다. 용액의 전도율 (conductivity)를 측정하면서 용액의 염 농도를 약 0.3 M 이하까지 동일 완충용액으로 희석하였다. 다음 약 500 ml의 SP-세파로스 (Pharmacia사)가 채워진 칼럼을 준비하고 동일 완충용액으로 평형화시켰다. 이 칼럼에 상기의 희석된 시료을 주입하고 0.3 내지 0.4 M 염화나트륨을 포함하는 동일한 인산 완충용액을 충분히 흘려준 다음 (유속 15 ml/분) 0.3 내지 0.4 M 에서 1 M 염화나트륨의 선형 농도구배를 사용하여 아미노펩티다제를 용출시켰다 (유속 10 ml/분).
SP-세파로스에서 용출된 아미노펩티다제의 분획으로 효소의 활성을 측정하여 확인한 다음 각 분획을 모으고 한외여과 (Amicon stirred cell type)에 의하여 이를 20 ml 까지 농축하였다. 이를 다시 약 1800 ml의 세파크릴 S-200 이 충진된 (XK 50/100, Pharmacia사) 칼럼으로 젤 여과 크로마토그래피를 사용하여 상기 아미노펩티다제를 정제하였다.
상기 정제 과정은 두 번에 걸쳐 수행되었는데, 첫번째 정제 과정은 젤 여과 크로마토그래피에서 완충용액으로 0.5 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스 (pH 7.5) 완충용액을 사용하였고, 두번째 정제 과정은 0.5 M 염화나트륨, 0.1% 트윈 20 (Tween 20)을 포함하는 20 mM 인산 (pH 6.8) 완충용액을 사용하였다. 상기에서 기술한 정제 과정을표 4및표 5에서 요약하였다.
| 정제 단계 | 시료 부피 (ml) | 단백질 | 아미노펩티다제 활성 | 엔도펩티다제 활성 | |||||
| 농도 (mg/ml) | 전체 양(mg) | U/ml | U/mg | 전체 (U) | U/ml | U/mg | 전체 (U) | ||
| 배양액 | 10,280 | 12.181 | 125,000 | 13.67 | 1.12 | 140,528 | 0.710 | 0.058 | 7,299 |
| 농축액 | 2,750 | 3.174 | 8,700 | 31.22 | 9.87 | 82,855 | 0.778 | 0.246 | 2,140 |
| 2차 삼상 분할 후 | 1,000 | 1.664 | 1,644 | 69.9 | 42.5 | 69,900 | 0.708 | 0.431 | 708 |
| SP-세파로스 | 18 | 1.773 | 31.9 | 1401 | 790.7 | 25,222 | 0.056 | 0.032 | 1.01 |
| S-200 | 24.5 | 0.394 | 9.65 | 442 | 1,122 | 10,829 | 0.031 | 0.079 | 0.76 |
| 정제 단계 | 시료 부피 (ml) | 단백질 | 아미노펩티다제 활성 | 엔도펩티다제 활성 | |||||
| 농도 (mg/ml) | 전체 양(mg) | U/ml | U/mg | 전체 (U) | U/ml | U/mg | 전체 (U) | ||
| 배양액 | 8,100 | 14.216 | 115,000 | 12.49 | 0.88 | 101,169 | 0.266 | 0.019 | 2,155 |
| 농축액 | 1,600 | 11.214 | 17,900 | 83.63 | 7.48 | 133,813 | 0.507 | 0.045 | 811 |
| 2차 삼상 분할 후 | 1,000 | 2.132 | 2,132 | 111.18 | 52.1 | 111,177 | 0.612 | 0.287 | 612 |
| SP-세파로스 | 32 | 2.753 | 88.1 | 3,636 | 1,321 | 116,362 | 0.047 | 0.017 | 1.50 |
| S-200 분획 | 12.2 | 1.765 | 21.5 | 1,520 | 862.5 | 18,544 | 0.011 | 0.006 | 0.134 |
| S-200 분획 | 13.3 | 1.715 | 22.8 | 1,824 | 1,064 | 24,259 | 0.010 | 0.006 | 0.133 |
| S-200 분획 | 11 | 0.317 | 3.49 | 648 | 2,042 | 7,128 | 0.023 | 0.072 | 0.253 |
| S-200 분획 | 12.4 | 0.468 | 5.8 | 834 | 1,783 | 10,342 | 0.024 | 0.051 | 0.298 |
| S-200 분획 | 11.5 | 0.879 | 10.1 | 1,660 | 1,890 | 19,090 | 0.046 | 0.052 | 0.529 |
상기 젤 여과 크로마토그래피에서 용출된 활성 분획을 다시 농축한 후, 다시 20 mM 인산 나트륨 (pH 6.8)으로 3배 희석시키고, 희석된 시료를 세번에 걸쳐 완충용액으로 평형된 FPLC 모노-S 칼럼 (0.5 cm x 5 cm)에 흡착시키고 0.4 내지 1 M 염화나트륨이 포함된 완충용액으로 선형 농도구배를 가하여 용출시켜 순수하게 정제된 아미노펩티다제를 얻었다.
실시예 14 아미노펩티다제의 구조적 특성
(1) 분자량 측정
실시예 13 에서 정제한 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 (ATCC 11946) 균주 유래의 아미노펩티다제의 분자량을 확인하기 위하여, 상기 FPLC 모노-S 칼럼의 크로마토그램상에서 몇 개의 피크로 나누어진 아미노펩티다제를 얻고 이로서 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하였다.
그 결과, 상기 아미노펩티다제가도 16a및도 16b에 나타난 바와 같이, 크로마토그램상에서 몇 개의 피크로 나누어졌지만 모든 피크는 동일한 분자량을 가짐을 확인하였다. 또한 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 균주에서 유래한 아미노펩티다제는 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 균주에서 유래한 실시예 9 의 아미노펩티다제와 그의 분자량이 동일하였다.
(2) 아미노산 서열 분석
바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 (ATCC 11946) 균주에서 유래한 아미노펩티다제를 FPLC 모노-S 칼럼으로 정제한 다음 그의 아미노 말단 아미노산 서열을 상기의 실시예 9 의 아미노산 서열 분석기를 사용한 자동화된 에드만 분해 반응을 수행하여 분석하였다. 그 결과 상기 아미노펩티다제의 아미노 말단은 기본적으로 (Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu-Asn-Arg-Ala-Tyr-Gln-Thr-Ile-Tyr-His-Leu)의 서열로 구성되어 있음을 확인하였다. 또한, 상기 아미노 펩티다제는 그 기본 서열에서 아미노 말단의 라이신이 제거된 형태로도 존재하였고, 9번째 아미노산인 아스파라진이 아스파라진산으로 치환된 형태로도 일부 존재하였다. 상기에서 확인한 아미노산 서열은 상기 차이점 이외에는 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 에서 유래한 아미노펩티다제와 정확히 일치하였다.
상기의 결과를 종합하여 살펴보면, 바실러스 리케니포미스 KCTC 3058 에서 유래한 아미노펩티다제는 바실러스 리케니포미스 ATCC 12759 에서 유래한 아미노펩티다제와 비교하여 분자량과 아미노 말단의 아미노산 서열에서 동일하였다. 따라서 서로 다른 바실러스 리케니포미스 균주에서 유래한 아미노펩티다제가 기본적으로 동일한 효소임이 입증되었다.
본 발명의 바실러스 리케니포미스 균주에서 유래한 아미노펩티다제는 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 잔기만을 특이적으로 제거할 수 있어 다양하게 이용될 수 있다. 구체적으로 상기 아미노펩티다제는 아미노 말단의 메티오닌-X-프롤린 서열을 인지하여 메티오닌 잔기만을 자를 수 있어 인간 성장 호르몬을 포함한 X-프롤린 서열로 시작하는 모든 단백질을 미생물에서 대량 생산한 다음 완전한 활성을 나타내는 천연형 단백질로 용이하게 전환시킬 수 있다. 또한 상기 아미노펩티다제는 열에 안정하여 더욱 편리하고 유용하게 상기 반응 등에 사용될 수 있다.
Claims (13)
- 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메티오닌 잔기를 제거할 수 있고, 아미노 말단이 서열로 시작되며, 분자량이 43 내지 47 kDa 정도인 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) 균주에서 유래한 아미노펩티다제.
- 제 1항에 있어서, 아미노 말단의 메티오닌-X-프롤린 서열을 인지하여 그의 메티오닌 잔기만를 제거하는 아미노펩티다제.
- 제 2항에 있어서, X 아미노산이 페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 아미노펩티다제.
- 제 1항에 있어서, 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 제거되거나 치환된 형태가 함께 존재하는 것을 특징으로 하는 아미노펩티다제.
- 바실러스 리케니포미스 균주를 배양하여 얻은 배양액을 원심분리한 다음 그의 상등액을 농축하여 젤 여과 크로마토그래피를 수행하는 제 1항의 아미노펩티다제의 제조방법.
- 제 5항에 있어서, 바실러스 리케니포미스 균주는 수탁번호가 ATCC 12759, KCTC 3058, KCTC 3045 또는 KCTC 1030 인 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 아미노펩티다제를 생산하는 숙주세포를 유전자 재조합 방법으로 제조한 다음 이를 배양하여 다양한 정제 과정을 거침으로 제 1항의 아미노펩티다제를 얻는 제조방법.
- 유전자 재조합 방법으로 생산된 재조합 단백질에 제 1항의 아미노펩티다제를 처리하고 다양한 정제 과정을 거쳐 천연형 단백질과 동일한 형태의 단백질을 얻는 제조방법.
- 제 8항에 있어서, 재조합 단백질은 아미노 말단이 메티오닌-X-프롤린 서열로 시작하는 단백질인 제조방법.
- 제 9항에 있어서, 단백질은 메티오닐 인간 성장 호르몬인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 아미노펩티다제를 pH 7.0 내지 9.5 범위에서, 온도는 20 내지 60℃ 범위에서 처리하고, 반응 용액에는 염화나트륨을 최종 농도 30 내지 230 mM 로 첨가하는 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 메티오닐 인간 성장 호르몬 1 mg 당 0.2 내지 20 U 의 아미노펩티다제를 반응시키는 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 아미노펩티다제를 처리한 다음 천연형 인간 성장 호르몬을 이온 교환 수지 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 제조방법.
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