KR0162952B1 - 에어로모나스 히드로필라 유래의 혈전용해효소 - Google Patents

에어로모나스 히드로필라 유래의 혈전용해효소

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Abstract

본 발명은 새로운 혈전용해효소 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 혈전용해효소는 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) KCTC 0174BP로부터 유래된 것으로서 피브린을 분해하며 스킴밀크는 분해하지 않는 특성을 나타낸다.
상기 에어로모나스 히드로필라 KCTC 0174BP는 지렁이의 장으로부터 분리한 것이다.

Description

에어로모나스 히드로필라 유래의 혈전용해효소
제1도는 본 발명의 혈전용해효소의 분자량을 결정하기 위한 전기영동사진이다.
본 발명은 새로운 혈전용해효소 및 그의 제조방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)유래의 혈전용해효소 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
혈전은 피브리노젠이 트롬빈에 의해 피브린으로 전환되어 형성되는 중합체로써, 뇌혈관이나 심장혈관에서 혈전이 형성되는 질환인 혈전증은 치명적이다.
따라서 혈전을 용해시키기 위하여 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제(Tissue type plasminogen activator; tPA), 지렁이 추출물 등이 사용되고 있다. 그러나 유로키나제, 스트렙토키나제, tPA등은 혈중 반감기가 낮고, 출혈등 부작용이 나타나며, 동시에 가격이 비싼 결점이 있다(Sumi,화학과 생물, 29, 119, 1991). 혈전 이외의 신체부위를 분해하는 부작용도 갖는 이들 종래의 혈전용해효소는 스킴밀크를 분해한다.
이에 따라 이러한 부작용을 갖지 않는 혈전용해 물질을 찾고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예를 들면, 일본의 전통발효식품인 나토로부터 분리된 나토키나제(Sumi etal., Experiment, 43, 1110, 1987:Sumi, Bioindustry, 7,725,1990), 한국의 전통발효식품인 청국장으로부터 분리된 혈전용해제(김용택등,한국산입미생물학회,23,1,1995) 등을 예시할 수 있다.
본 발명자들을 지렁이 장내로부터 혈전을 용해하는 미생물을 분리하여 에어로모나스 히드로필라임을 동정하였으며, 미생물을 배양하여 혈전용해효소를 분리-정제하고, N-말단의 아미노산 배열을 결정하였다. 신규의 혈전용해효소는 피브린을 분해하며, 스킴밀크는 분해하지 않는다는 특성을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) (KC TC)유래의 신규한 혈전용해효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) (KCTC)를 배양하여 혈전용해효소를 축적하고 배양액으로부터 혈전용해효소를 회수함을 특징으로 하는 혈전용해효소의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란으로부터 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따라 지렁이의 장으로부터 에어로모나스 히드로필라를 분리하는 것은 지렁이의 분쇄물로부터 피브린 분해 활성을 나타내는 미생물 집락(colony)을 얻는 것에 의해 달성할 수 있다. 잘 세척한 지렁이의 분쇄물을 얻는 것은 통상의 물리적, 기계적 또는 화학적 방법에 의하여 행할 수 있으며, 예를 들면 지렁이를 호모게나이저로 처리하거나 또는 초음파 처리하여 분쇄물을 얻을 수 있다. 그리고, 이 분쇄물의 일부를 일반 세균용 평판 배지에 도말하여 나타나는 전 미생물을 분리한다.
지렁이 분쇄물에서 얻은 미생물을 피브린에 이식하여 배양한 후 투명환이 생성되는 집락을 수집함으로써 혈전용해활성을 갖는 미생물을 분리할 수 있다.
본 발명에 따르면, 혈전용해활성을 갖는 미생물은 에어로모나스 히드로필라로 밝혀졌으며, 이 미생물은 피브린 용해활성이 우수하며 스킴밀크는 분해하지 않는 혈전용해효소를 생산한다.
상기 미생물을 배양하여 혈전용해효소를 생산하는 것은 통상의 배양법에 의해 행할 수 있으며, 미생물의 배양법 또는 효소의 분리정제법에 특별한 제한은 없다.
본 발명에 따라 제공되는 신규한 혈전용해효소는 N-말단의 아미노산이 XDATG PGGNV XTGKY이며, 분자량이 38kd이고, 아미노산 조성비는 asp 8.07, thr 4.90, ser 13.44, glu 23.58, pro 1.26, gly 3.82, ala 5.30, cys 2.34, val 4.98, met 0.44, ile 5.02, leu 1.75, tyr 0.35, phe 0.62, his 0.55, lys 6.39, arg 0.34,trp 0이다.
한편, 본 발명에서 채택한 각종 실험법을 아래에 설명한다.
혈전용해는 아스트럽과 뭘러츠의 방법(Astrup Muellertz, Arch. Biochem. Biophys., 40, 346, 1952)을 활용하였다. 즉 0.15M 되도록 소금을 첨가한 10mM 인산 완충액(pH 7, 8)에 피브리노겐을 0.3% 되도록 용해시켜 얻은 피브리노겐 용액 5ml과 동일한 완충액에 아가로스를 1% 되도록 용해시켜 얻은 피브리노겐 용액 5ml과 동일한 완충액에 아가로스를 1% 되도록 용해시킨 아가로스액 5ml를 혼합하고, 다시 트롬빈(100NIH/ml) 0.1ml을 첨가하여 즉시 페트리 점시에 부어 굳혀 피브린 고체배지를 제조하였다. 접시당 7개의 구멍을 만들고, 시료 0.1ml을 주입한 뒤, 37℃에서 2시간 반응시킨 후 형성된 투명환의 지름을 측정하였다.
대조군으로 농도별로 회석한 유로키나제 ((주) 녹십자사 제품)를 상기와 동일한 방법으로 피브린 플레이트상에서 반응시켜 유로키나제의 농도에 따르 투명환의 면적을 측정-비교하였다.
이상에서 지렁이 장내에서 분리한 에어로모나스 히드로필라 KCTC 0174BP 유래의 신류 혈전용해효소는 피브린을 분해하며, 스킴밀크는 분해하지 않았다.
본 발명의 상세한 설명은 실시예를 통해 소개하지만, 본 발명의 개념이 실시예에만 국한되는 것이 아니다.
[실시예 1]
미생물의 분리
생리식염수로 2회 세척한 지렁이 0.08g을 초음파파쇄기(Sonic Materials사 제품, 모델?)을 파쇄한 다음, 생리식염수 100ml에 현탁시키고 영양배지 (쇠고기 엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 아가 1.6%)에 도달하고, 37℃ 에서 하루밤 배양하였다.
배양된 집락을 피브린 고제배지(피브린 5%를 구연산 완충액 pH7.8에 녹이고, 트롭빈 20유니트를 첨가하여 굳힌다)에 옮겨, 37℃에 하루밤 배양한 다음, 투명환을 형성하는 집락을 분리하였다.
[실시예 2]
미생물의 동정
실시예 1에서 분리된 미생물에 대해 버기 매뉴얼(Bergy's Manual)에 따라 동정을 위한 생리 실험을 행하고, 결과를 하기에 나타내었다.
이상에서 분리된 미생물은 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila )로 동정하였고, 동 미생물을 1995년 6월 22일자로 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자 은행 (KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 0174BP를 부여받았다.
[실시예 3]
효소의 생산 및 정제
실시예 1의 에어로모나스 히드로필라 KCTC 0174BP를 LB 배지에서 37℃, 하루 만 배양하고, 원심분리하여 상등액을 취하고, 에탄올을 50~80% 첨가하여 침전을 얻었다.
침전물을 0.01M 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 DEAE-세파덱스 A-50(컬럼 2 x 10cm)으로 크로마토그래피를 행하였다. 같은 완충액을 시간당 24ml의 속도를 흘려주었다.
상기 완충액을 전처리한 Sepharose 6B(컬럼 0.8 x 140cm)을 통하여 상기에서 얻은 용출액을 겔 여과하였다. 같은 완충액으로 시간당 4ml씩 흘려주었으며, 1.5ml씩 분획하여, 혈전용해효소 단백질을 정제하였다.
7개의 구멍을 제조한 피브린 배지상에 시료 0.1ml를 주입하고, 37℃에서 2시간 반응시킨 후 형성된 투명환의 면적을 측정하였다.
정제단계별 단백질양, 총 활성, 특이활성, 정제도, 수율을 정리하면 표 2과 같다.
[실시예 4]
분자량 측정
실시예 3에서 정제된 혈전용해효소의 분자량은 13% SDS-PAGE로 전기영동하여 분석하고, 그 결과를 제 1도에 나타내었다. 분자량 표준물질 (레인 M)로는 ①포스포릴라제(phosphorylase) b(97,4kd), ②소혈청알부민(bovine serum albumin) (66. 2kd), ③난 알부민(ovalbumin) (41kd), ④카본산 안하이드라제(carbonic anhydrase) (31kd), 및 ⑤대두 트립신 억제물질 (soybean trypsin inhibitor) (21.5kd)를 사용하였다. 제1도에서, 본 발명의 혈전용해효소는 화살표로 표시하였으며, 분자량은 38kd이었다.
전기영동 결과를 제1도에 나타내었다.
[실시예 5]
최적 pH
실시예 3에서 정제한 혈전용해효소액 0.5ml을 pH 4,5(초산완충액), 6,7(인산완충액), 8,9(브리스완충액), 또는 10(탄산완충액)의 완충액 0.5ml에 녹이고, 37℃에서 2시간 항온시킨 후, 피브린 고체배지의 투명환의 면적을 측정하여 혈전용해능을 측정하였다.
pH 8에서의 활성은 55mm 이며, 이 때의 혈전용해능을 100%로 했을 때 각 pH별활성은 표 3와 같다.
[실시예 6]
pH 안정성
실시예 5에서와 동일하게 실시하되, 37℃에서 2시간동안 항온시킨 후 이어서 4℃에서 24시간 항온시킨 후, 피브린 고체배지상의 투명환의 면적을 측정하여 이때의 pH 안정성을 100으로 했을 때 각 pH에 대한 안정성을 측정하였다.
pH 8에서의 투명환의 면적은 55mm 으로 효소의 활성의 손실이 전혀 없었으며, 이때의 pH 안정성을 100으로 했을 때, 각 pH별 안정도는 표 4와 같다.
[실시예 7]
열 안정성(1)
실시예 3의 혈전용해효소액 0.3ml을 0.01M 트리스완충액(pH 7.6) 0.7ml에 용해시키고, 용해액 100μl을 20,30,40,50,60,70,80℃ 에서 2시간 처리하였다. 각각의 온도에서 열처리된 효소액을 실시예 5와 동일한 방법으로 처리하고, 피브린 고체배지상의 투명환의 면적을 측정하여 열 안정성을 결정하였다.
40℃에서의 투명환의 면적은 55mm 으로 효소의 활성의 손실이 전혀 없었으며, 이때의 열 안정성을 100으로 했을 때, 각 온도별 안정도는 표 5와 같다.
[실시예 8]
열안정성(2)
실시예 7과 동일하게 실시하되 열 처리시간을 30분으로 변경하여 실험을 행하였다.
40℃에서의 투명환의 면적을 55mm 으로 효소의 활성의 손실이 전혀 없었으며, 이때의 열 안정성을 100으로 했을 때, 각 온도별 안정도는 표 6과 같다.
[실시예 9]
N-말단 아미노산
아미노산 분석기(모델 KB 41502)을 이용하여 본 발명의 효소의 아미노산 조성을, 그리고 펩티드 서열결정기(ABI 476A)를 이용하여 N-말단의 아미노산을 결정하였다.
N-말단은 아미노산은 XDATG PGGNV XTGKY이었다.
아미노산 조성비는 asp 8.07, thr 4.90, ser 13.44, glu 23.58, pro 1.26, gly 3.82, ala 5.30, cys 2.34, val 4.98, met 0.44, ile 5.02, leu 1.75, tyr 0.35, phe 0.62, his 0.55, lys 6.39, arg 0.34, trp 0이었다.
[실시예 10]
피브린 분해능
나카지마능의 방법(Nakajima et al., Biosci Biotech. Biochim. 57, 1726, 1993)에 따라 실시예 1에서 준비한 피브린 고체배지를 80℃에서 30분간 열처리하여 배지 내에 함유되어 있는 플라스미노겐을 불활성화시켰다.
플라스미노겐이 불활성화된 피브린 고체배지에 효소액 (농도 20㎍/㎖) 0.1㎖을 첨가하고 37℃에서 120분간 항온시켰을 때 60㎟ 크기의 투명환이 형성되었다.
이상에서 본 발명의 효소는 플라스민의 도움을 받지 않고, 직접 피브린을 분해하는 특성을 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 11]
스킴 분해능
LB 배지에 스킴 밀크를 1% 되도록 첨가하여 제조한 스킴 밀크 배지에 20㎍/㎖농도의 효소액 0.1㎖를 접종하고, 37℃에서 6시간 반응시켰다. 스킴 밀크 배지에서 투명환이 관찰되지 않았다.

Claims (4)

  1. 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) KCTC 0174BP로부터 유래되고, 하기 (i)∼(iii)과 같은 특징으로 갖는 혈전용해효소. (i) 분자량이 38kd이고, (ii) N-말단 아미노산 서열이 XDATG PGGNV XTGKY이며, (iii) 피브린은 분해하지만, 스킴밀크는 분해하지 않는 활성을 갖는다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에어로모나스 히드로필라 KCTC 0174BP는 지렁이의 장으로부터 분리한 것임을 특징으로 하는 혈전용해효소.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 조성비가 asp 8.07, thr 4.90, ser 13.44, glu 23.58, pro 1.26, gly 3.82, ala 5.30, cys 2.34, val 4.98, met 0.44, ile 5.02, leu 1.75, tyr 0.35, phe 0.62, his 0.55, lys 6.39, arg 0.34, trp 0인 혈전용해효소.
  4. 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) KCTC 0174BP를 배지에서 배양하여 혈전용해효소를 축적시키고, 배양액으로부터 혈전용해효소를 분리, 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의한 제1항의 혈전용해효소의 제조방법.
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