KR100243526B1 - 아스퍼질러스 플레버스로부터 분리한 아미노펩티다제 및 그를 이용한 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제 거방법 - Google Patents

아스퍼질러스 플레버스로부터 분리한 아미노펩티다제 및 그를 이용한 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제 거방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961로부터 분리한 아미노펩티다제(aminopeptidase) 및 그를 이용한 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거방법에 관한 것이다. 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961 균주의 포자를 멸균배지에 접종하여 배양하고, 배양액을 이온 교환 크로마토그래피와 2회에 걸쳐 겔 여과 크로마토그래피 처리를 하여 아미노펩티다제를 제조한다. 본 발명의 아미노펩티다제를 이용하면, 비천연형의 유전자 재조합 단백질의 아미노 말단에 위치하는 메티오닌 잔기를 제거하여 천연형의 단백질로 전환할 수 있다.

Description

아스퍼질러스 플레버스로부터 분리한 아미노펩티다제 및 그를 이용한 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거방법
본 발명은 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961로부터 분리한 아미노펩티다제(aminopeptidase) 및 그를 이용한 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전자 재조합 방법으로 생산된 재조합 단백질의 아미노 말단에 부착된 메티오닌 잔기를 특이적으로 제거할 수 있는 아미노펩티다제를 아스퍼질러스 플레버스로부터 제조하는 방법, 그로부터 제조된 아미노펩티다제 및 전기 아미노펩티다제를 이용하여 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거방법에 관한 것이다.
유전공학의 발달과 함께, 재조합 미생물을 이용하여 필요한 단백질을 제조하는 방법이 급속도로 발전하여 왔다. 그러나, 일반적으로 재조합 단백질의 아미노 말단에 위치하는 메티오닌 잔기를 완전하게 처리하지 못하므로, 이러한 방법에 의하면 비천연형의 재조합 단백질이 만들어질 수 밖에 없었다. 이렇게 제조된 비천연형 재조합 단백질은 인체내의 단백질과 동일한 구조를 가지지 못하므로, 체내에 투여시, 예기치 못했던 면역반응이 유발되거나, 단백질 자체가 불안정하여 기능을 완전히 수행하지 못하기도 하였다. 예를 들어, 사람의 뇌하수체에서 분비되며, 아미노 말단이 페닐알라닌-프롤린-트레오닌(Phe-Pro-Thr)으로 시작되는 191개의 아미노산으로 구성된 인간성장호르몬은 유전자 재조합 방법으로 제조되어 왜소증의 치료에 사용되고 있다(참조: Rabin M.S., J. Chin. Endocr., 18:901(1958)). 그러나, 유전자 재조합 방법으로 제조된 인간성장호르몬에는 191개의 아미노산 이외에 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 제거되지 않은 채 남아있는 경우가 많으며, 유리한 메티오닌 잔기가 부가된 인간성장호르몬에 의하여 예기치 못했던 항체형성이 유발된다는 보고가 있었다.
따라서, 이러한 비천연형 재조합 단백질의 문제를 해결하기 위하여, 다양한 방법들이 개발되어 왔다. 우선, 재조합 인간성장호르몬의 아미노 말단에 위치한 메티오닌 잔기를 제거하여 천연형의 유전자 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 재조합 융합단백질을 생산하여 절단하는 방법(참조: WO 89/12678, EP 20209 , EP 321940) 및 인간성장호르몬을 숙주세포 밖으로 분비되도록 하여, 분비되는 과정에서 메티오닌 잔기가 절단되도록 하는 방법(참조: EP 008832, USP4755464) 등이 제안된 바 있다. 그러나, 이러한 방법들은 발현벡터의 재조작 및 숙주세포의 형질변환과 같은 추가 조작이 필요하고, 발효의 최적화를 위한 조건을 설정해 주어야 한다는 문제점이 노출되었다.
한편으로는, 유전자 재조합 단백질의 아미노 말단에 위치하는 메티오닌 잔기만을 선택적으로 절단하는 효소를 이용하여 천연형의 인간성장호르몬을 제조하는 방법이 제시되었다. 이러한 효소로는 세균인 에로모나스 프로티오리카(Aeromonas proteolytica)(참조: WO 86/01229) 및 스트렙토미세스 써모니트리피칸스(Streptomyces thermonitrificans)(참조; EP 6296695, USP 5569598), 몰드(mold)의 일종인 딕티오스텔리움 디스코이듐(Dictyostelium discoidium)(참조: EP 6296695) 및 돼지의 신장(참조: WO 86/204527)에서 분리한 아미노펩티다제가 있다. 이러한 아미노펩티다제를 이용하여 아미노 말단에 위치한 메티오닌 잔기를 제거하면, 유전자 재조합 단백질을 간단하게 천연형의 단백질로 전환시킬 수 있다. 그러나, 아미노펩티다제가 유전자 재조합 단백질에 작용하여 천연형의 단백질로 전환하기 위해서는, 아미노 말단의 메티오닌 잔기만을 제거하고 절단반응을 정지하여야 하며, 소량만으로도 비천연형의 유전자 재조합 단백질을 천연형의 단백질로 전환할 수 있어야 하는 바, 이러한 점에 비추어 볼 때 전기 효소들은 절단반응의 조절, 활성 및 원료수급의 용이성 면에서 문제점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 비천연형의 유전자 재조합 단백질을 천연형의 단백질로 전환할 수 있으며, 절단반응 조절, 활성 및 수율의 측면에서 우수한 특성을 가지는 아미노펩티다제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 아스퍼질러스 플레버스에 정제하여 제조한 아미노펩티다제가 비천연형의 유전자 재조합 단백질의 아미노 말단에 위치한 메티오닌 잔기를 선택적으로 절단하여 천연형의 단백질을 제조하는데 적합함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 신규한 아미노펩티다제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 아미노펩티다제를 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961 균주로부터 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 아미노펩티다제를 이용하여 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
제1도는 아스퍼질러스 플레버스 배양액으로부터 분리·정제한 아미노펩티다제의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 사진이다.
제2도는 본 발명의 아미노펩티다제를 N-글루코시다제로 처리하고 전기 영동시킨 결과를 나타내는 사진이다.
제3도는 본 발명에 의한 아미노펩티다제의 활성을 pH 변화에 따라 나타낸 그래프이다.
이하에서는, 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961 균주로부터 아미노펩티다제를 제조하는 방법을 공정별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다.
[제1공정] 아스퍼질러스 플레버스 KCTC 6961균주의 배양
아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961 균주의 포자를 바람직하게는 0.3% 효모추출물, 0.3% 펩톤 및 0.1% 인산칼륨이 포함된 멸균배지에 접종하여 20 내지 35℃에서 2 내지 4일간 배양한다.
[제2공정] 아미노펩티다제의 정제
전기에서 배양한 배양액을 여과제를 이용하여 상등액 만을 분리한 다음, 이를 20mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)으로 평형화된 칼럼에 주입하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행한 다음, 0.5M 염화나트륨을 포함하는 인산 완충액을 사용하여 아미노펩티다제를 용출시켜 아미노펩티다제 활성 분획을 수득하며, 한외여과하여 농축한다. 그런 다음, 0.5M 염화나트륨을 포함하는 50mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 평형화된 칼럼을 이용하여 겔 여과 크로마토그래피를 2회 수행하여 아미노펩티다제를 제조한다. 이때, 이온 교환 크로마토그래피에는 Q-세파로즈가 충진된 칼럼을 사용하며, 겔 여과 크로마토그래피에는 세파크릴 S-200이 충진된 칼럼을 사용하고, YM 막(Amicon)을 이용하여 한외여과시킨다.
또한, 본 발명에 의한 아미노펩티다제를 이용하여 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기를 제거하여 천연형의 재조합 단백질을 제조하는 방법을 구체적으로 설명하고자 한다.
메티오닐기가 아미노말단에 부착된 재조합 단백질과 아미노펩티다제를 중량대비 200:1 내지 2,000:1, 가장 바람직하게는 200:1의 비율로 반응완충액에 가하여 약 37℃에서 약 24시간동안 반응시킨다. 이때, 반응완충액으로는 0.1M 트리스(pH 8.0)를 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 아스퍼질러스 플레버스의 배양
아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961 균주의 포자를 0.3%, 효모추출물, 0.3% 펩톤 및 0.1% 인산칼륨이 포함된 멸균배지에 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였다.
[실시예 2] 아미노펩티다제의 정제
실시예 1에서 배양한 배양액을 여과한 다음, 수득한 상등액을 20mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)으로 평형화된 30ml의 Q-세파로즈가 충진된 칼럼(직경 2.5cm×길이 10cm)에 주입하고, 동일한 완충용액을 충분히 흘려준 다음, 0.5M 염화나트륨을 포함하는 인산 완충액을 사용하여 아미노펩티다제를 용출시켜 아미노펩티다제 활성 분획을 수득하였다. 그런 다음, 아미노펩티다제 활성 분획을 YM10막(Amicon)을 이용하여 한외여과하고 농축하며, 이를 다시 0.5M 염화나트륨을 포함하는 50mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 평형화된 약 170ml의 세파크릴 S-200이 충진된 칼럼(직경 1.5cm×길이 100cm)으로 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 아미노펩티다제 활성 분획을 수득하며, 이렇게 수득한 아미노펩티다제 활성분획은 다시 농축하고 동일한 완충액으로 평형화된 약 120ml의 세파크릴 S-200이 충진된 칼럼(직경 1.5cm×길이 75cm)으로 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 아미노펩티다제를 제조하였다.
상기한 아미노펩티다제의 제조과정을 각 단계별로 하기의 표 1에 요약하여 나타내었다. 이때, 아미노펩티다제의 활성은 0.1M 트리스(pH 8.0), 1mM 루이신-파라-니트로아닐리드를 포함하는 용액 1ml에 시료를 가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후 70% 아세트산 0.1ml을 첨가하여 반응을 종료시키고 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였으며, 효소활성을 나타내는 1단위(unit)는 1분동안 0.1mM의 파라-나이트로아닐린을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 또한, 단백질은 BCA(bicinchoninic acid) 방법으로 정량하였다.
Figure kpo00002
[실시예 3] 아미노펩티다제의 화학적 특성
[실시예 3-1] 아미노펩티다제의 분자량
본 발명의 아미노펩티다제의 분자량을 확인하기 위해 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하였으며, 그 결과는 제1도에 나타내었다. 제1도에서 레인 1 및 8은 전기영동된 표준 단백질을 나타내며, 레인 2 내지 레인 7은 각각 15, 12, 10, 7, 5 및 2㎍의 아미노펩티다제를 전기영동한 결과로서, 본 아미노펩티다제를 표준 단백질과 비교한 결과, 그 분자량이 약 60 내지 80kD 정도 임을 확인할 수 있었다.
[실시예 3-2] 아미노펩티다제의 아미노산 조성 분석
시료를 6N 염산에 넣어 110℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 이온교환수지 칼럼에 통과시켜, 본 발명의 아미노펩티다제의 아미노산 조성을 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 2와 같다.
Figure kpo00003
[실시예 3-3] 아미노펩티다제의 아미노산 서열 분석
본 발명의 아미노펩티다제의 아미노 말단 아미노산 서열은 아미노산 서열 분석기(471A, Applied Biosystems사, 미국)를 사용한 자동화된 에드만 분해반응(Edman degradation method)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과 본 발명의 아미노펩티다제의 아미노 말단은 글라이신-아지닌-알라닌-루이신-세린 혹은 그외의 아미노산-프롤린-아스파산-글루탐산-페닐알라닌(Gly-Arg-Ala-Leu-Ser/Xaa-Pro-Asp-Glu-Phe)의 서열로 구성되어 있음을 확인하였으며, 또한 상기 정제된 아미노펩티다제는 아미노 말단의 서열로부터 아미노 말단에서 한 개의 아미노산이 제거된 형태로도 존재함을 확인하였다.
[실시예 4] 아미노펩티다제의 당쇄의 분리
본 발명의 아미노펩티다제는 당단백질이므로, 단백질에 당쇄가 연결되는 방법을 알아보기 위하여, 단백질의 질소분자와 당쇄가 연결되어 있는 부분을 특이적으로 절단하는 N-글리코시다제를 사용하였다. 정제된 아미노펩티다제 0.01m당 N-글리코시다제 F(Boehringer Mannheim 사, 독일) 1 단위를 첨가하여 25mM EDTA를 포함한 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 용액에서 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 전기영동을 한 겔을 PAS(periodic acid-Schiff's reagent)로 염색하여 당단백질만을 표시하고 당쇄의 절단 완성 여부를 측정하였다. 한편, 단백질의 산소분자와 당쇄가 연결되어 있는 부분을 특이적으로 절단하는 O-글리코디사제로 본 발명의 아미노펩티다제를 각각 처리한 결과, 0-글리코시다제에 의해서는 당쇄가 제거되지 않는 것을 확인하였다. 결론적으로, 본 발명의 아미노펩티다제는 단백질의 아미노산 곁가지에 있는 질소에 당쇄가 결합되어 있는 것으로 나타났다. 제2도는 본 발명의 아미노펩티다제를 N-글루코시다제로 처리하고 전기영동시킨 결과를 나타낸 사진으로, 레인 1은 정제된 아미노펩티다제를 전기영동한 결과이며, 레인 2는 표준 단백질을 전기영동한 결과이고, 레인 3은 SDS 존재 하에 N-글루코시다제로 처리한 아미노펩티다제를 전기영동한 결과이다. 레인 나는 SDS가 없는 상태에서 N-글루코시다제로 처리하는 아미노펩티다제를 전기영동한 결과이다.
제2도에 나타난 바와 같이 N-글리코시다제를 처리한 아미노펩티다제를 전기영동한 결과, 당쇄가 제거된 단백질의 분자량은 약 50 내지 60kD으로 확인되었다.
[실시예 5] 아미노펩티다제의 효소학적 특성
[실시예 5-1] 최적 활성 pH
본 발명의 아미노펩티다제의 활성이 최대가 되는 최적 pH를 알아보기 위하여, pH 5.0 내지 11.5의 구간에서 효소의 활성을 측정하였다. 효소반응의 pH를 조절하기 위하여, 아세트산(pH 5에서의 5.5), 메스(pH 5.5에서 7.0), 헤피스(pH 6.5에서 8.0), 트리스(pH 8.0에서 9.5) 및 체스(pH 9.5에서 11.5) 완충용액을 0.1M 농도로 사용하였다. 그 결과, 제3도에서 보듯이, 본 발명의 아미노펩티다제는 pH 8.5 내지 9.5에서 활성이 가장 높았으며, pH 7.5 내지 10.5에서도 상대적으로 높은 활성을 유지하는 것으로 나타내었다.
[실시예 5-2] 최적 활성 온도
본 발명의 아미노펩티다제가 활성을 최대로 나타내는 최적온도를 알아보기 위하여, 30 내지 80℃의 구간에서 0.1M 트리스 완충용액(pH 8.0)을 사용하여 각 온도별로 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 아미노펩티다제는 50℃ 내지 65℃에서 가장 높은 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
[실시예 5-3] 아미노펩티다제의 활성에 미치는 화학물질의 영향
본 발명의 아미노펩티다제의 활성에 영향을 미치는 화학물질을 조사하기 위하여, 정제된 아미노펩티다제에 디티오트레이톨(dithiothreitol), 오르토페난트롤린(o-phenanthroline), 베스타틴(bestatin)과 포스포라미돈(phosphoramidon) 및 이오도아세타마이드(iodoacetamide)를 첨가하여 1시간 동안 방치한 다음 효소활성을 측정하였으며, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)에 대해서는 8시간 동안 방치한 후 효소활성을 측정하였다. 각 화학물질의 농도 및 효소에 미치는 활성저해 결과는 하기의 표 3에 나타내었다. 본 발명의 아미노펩티다제는 오르토페난트롤린 및 에틸렌디아민테트라아세트산에 의해 활성이 크게 저해되므로 금속단백질분해효소(metalloprotease)에 속하는 것임을 확인하였다. 한편, 이황결합(disulfide bond)을 절단하는 디티오트레이톨 및 이오도 아세타마이드에 의해 활성이 저해되는 것으로 보아, 아미노펩티다제에 존재하는 이황결합이 효소활성에 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
Figure kpo00004
[실시예 5-4] 아미노펩티다제의 기질 특이성
본 발명의 아미노펩티다제의 기질 특이성을 조사하기 위하여, 하기 표 4에 기재되어 있는 기질이 1mM의 농도로 첨가된 0.1M 트리스 완충액(pH 8.0)에 효소를 첨가하여 활성을 조사하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에서와 같이, 본 발명의 아미노펩티다제는 루이신과 메티오닌에 대해 가장 활성이 크며, 그 외의 아미노산에 대해서는 활성이 미미하였다.
Figure kpo00005
[실시예 5-5] 아미노펩티다제의 반응속도상수 측정
본 발명의 아미노펩티다제의 pH에 따른 반응속도상수를 결정하기 위하여, pH 6.0 내지 10.5 범위의 완충액을 준비하여 각 pH에 대해 기질의 농도를 변화시키면서 효소의 활성을 측정함으로써, 반응속도상수를 구하였다. 표 5는 루이신 기질에 대한 각 pH 에서의 미카엘리스 상수(Km) 및 촉매정수(kcat)를 나타낸 것이다.
Figure kpo00006
[실시예 6] 천연형 인강성장호르몬의 제조
메티오닐기가 아미노말단에 부착된 인간성장호르몬 약 1mg에 대하여 본 발명의 아미노펩티다제 0.07U(2㎍) 내지 0.018U(0.5㎍)를 반응 완충액(0.1M 트리스, pH 8.0)에 가하여 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 인간성장호르몬의 아미노 말단에 위치하는 아미노산을 아미노산 서열분석기(471A, Applied Biosystems사, 미국)로 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 아미노펩티다제를 처리한 메티오닐기가 아미노말단에 부착된 인간 성장호르몬에서 메티오닌이 완전히 제거되고, 동시에 아미노 말단이 페닐알라닌으로 전환되어 천연형 인간 성장 호르몬이 제조됨을 확인하였다. 한편, 메티오닐기가 아미노말단에 부착된 인간성장호르몬에 대하여 첨가되는 아미노펩티다제의 양의 변화에 따른 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거율을 하기 표 6에 나타내었다. 또한, 아미노펩티다제로 처리된 재조합 인간성장호르몬을 전기영동한 결과, 성장호르몬의 아미노말단 메티오닌을 제외한 절단은 없는 것으로 확인되어, 정제된 본 발명의 아미노펩티다제에는 엔도펩티다제로서의 활성이 없는 것으로 나타났다.
Figure kpo00007
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961로부터 분리한 아미노펩티다제 및 그를 이용한 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거방법을 제공한다. 본 발명의 아미노펩티다제를 이용하면, 비천연형의 유전자 재조합 단백질의 아미노 말단에 위치하는 메티오닌 잔기를 제거하여 천연형의 단백질로 전환할 수 있다.

Claims (6)

  1. 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus) KCTC 6961 균주의 포자를 멸균배지에 접종하여 20 내지 35℃에서 2 내지 4일간 배양하여 배양액을 수득하는 공정; 및, ii) 전기에서 수득한 배양액에 대하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 0.5M 염화나트륨을 포함하는 인산완충액으로 용출시켜 아미노펩티다제 활성분획을 얻고 한외여과를 통하여 농축한 다음, 겔 여과 크로마토그래피를 2회 수행하는 공정을 포함하는 아미노펩티다제의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 인산나트륨 완충용액으로 평형화된 세파로즈가 충진된 칼럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 아미노펩티다제의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피는 염화나트륨을 포함하는 트리스 완충액으로 평형화된 세파크릴이 충진된 칼럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 아미노펩티다제의 제조방법.
  4. 아스퍼질러스 플레버스(Aspergillus flavus ) KCTC 6961로부터 생산되며, 다음과 같은 특성을 가지는 아미노펩티다제
    i) 분자량은 약 60 내지 80kD이고;
    ii) Asp/Asn 14.83몰%, Glu/Gln 9.07몰%, Ser 7.28몰%, Gly 9.76몰%, His 1.53몰%, Thr 4.99몰%, Ala 11.86몰%, Arg 2.44몰%, Pro 4.17몰%, Tyr 5.30몰%, Val 6.03몰%, Met 0.86몰%, Ile 4.32몰%, Leu 8.19몰%, Phe 3.77몰% 및 Lys 5.66몰%의 아미노산 조성을 가지며;
    iii) 아미노 말단의 아미노산 서열은 글라이신-아지닌-알라닌-루이신-세린 혹은 그외의 아미노산-프롤린-아스파산-글루탐산-페닐알라닌(Gly-Arg-Ala-Leu-Ser/Xaa-Pro-Asp-Glu-Phe)의 서열로 구성되어 있으며, 또한 아미노 말단의 서열로부터 아미노 말단에서 한개의 아미노산이 제거된 형태로도 존재하고; 및, iv) 단백질의 질소분자와 당쇄가 연결되어 있는 당백질로서 당쇄를 제외한 단백질의 분자량은 약 50 내지 60kD이다.
  5. 메티오닌 잔기가 아미노말단에 부착된 재조합 단백질과 제4항의 아미노펩티다제를 중량대비 200:1 내지 2,000:1의 비율로 반응완충액에 가한 다음, 약 37℃에서 약 24시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거방법.
  6. 제5항에 있어서, 반응완충액은 0.1M 트리스(pH 8.0)를 사용하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제거방법.
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