DK166687B1 - Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af et oensket protein bortset fra humant vaeksthormon - Google Patents

Description

i DK 166687 B1

Den foreliggende opfindelse angår en enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket protein med den i indledningen til krav 1 angivne formel. Opfindelsen angår dog ikke fremstillingen af humant væksthormon.

5

Fra US patentskrift nr. 4 342 832 er det kendt at producere biosyntetisk hGH ved fermentering af en rekombinant værtscelle, specielt E. coli, som koder for hGH med tilhørende methionin. Ved den derfra kendte fremgangsmåde 10 fås imidlertid hGH, som til den N-terminale ende har knyttet aminosyren methionin, der ikke findes i modent hGH.

Der er et stort behov for at kunne fremstille biosynte-15 tiske proteiner med samme aminosyresekvens som i de tilsvarende naturligt forekommende proteiner. Dette problem har for så vidt angår væksthormon været søgt løst ved US patentskrift nr. 4 755 465 (DK-patentansøgning nr.

2046/84), som omhandler en fremgangsmåde til fremstilling 20 af hGH ud fra præ-hGH i en rekombinant prokaryotisk mikroorganisme, såsom Pseudomonas aeruginosa eller E. coli.

Anvendelsen af Ps. aeruginosa til fremstilling af hGH uden methionin til terapeutisk brug er imidlertid behæf-25 tet med den risiko, at denne bakterie og mange andre Pseudomonas bakterier, der er potentielt patogene, syntetiserer giftige toxiner, som vanskeligt kan findes ved oprensning af proteinet.

30 Udtrykkeisen af præ-hGH efterfulgt af proteolytisk spaltning til opnåelse af det modne hGH i en E. coli (som ikke er patogen) er antydet i DK-patentansøgning nr. 2046/84, men i denne beskrivelse er det ikke dokumenteret, at den proteolytiske spaltning entydigt fører til dannelsen af 35 modent hGH, dvs. hGH med korrekt aminosyresekvens.

DK 166687 B1 2

Fra CA Vol 77, 1972, page 223, nr. 2289 er det kendt, at dipeptidylaminopeptidase I (DAP I) kan fraspalte N-terminale dipeptider fra oligopeptider, men at enzymet ikke er i stand til at fjerne dipeptider med en N-terminal argi-5 nin eller lysin eller at spalte bindingen på hver side af prolin.

Ifølge DK-patentansøgning nr. 3448/84 er det foreslået at anvende enzymet leucinaminopeptidase, LAP, til at nedspi-10 se en aminoekstendering fra hGH. Udbytterne har dog været svingende i afhængighed af enzymets renhed og generelt meget lavt. Desuden bliver produktet meget urent, idet reaktionen ikke forløber fuldstændigt, og rensningen af det dannede hGH er meget besværlig.

15

Som anført i beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 0556/85 er det muligt at fremstille autentisk humant væksthormon i højt udbytte ved at nedspise biosyntetisk dannet aminoterminalt ekstenderet hGH, der har en speci-20 fik ladet ekstendering, idet der til nedspisningen anvendes enzymet dipeptidylaminopeptidase (DAP I). På grund af tilstedeværelsen af ladningen lader produktet sig let oprense ved ionbytning, hvorved rent hGH isoleres fra ikke omsat eller kun delvis omsat aminoterminalt 25 ekstenderet hGH.

Det har nu vist sig, at en sådan proces ikke er begrænset til anvendelse i forbindelse med hGH, men at den også kan benyttes mere generelt, nemlig til fremstilling af de 30 proteiner, som er defineret i indledningen til krav 1. Således er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at et biosyntetisk fremstillet aminoterminaleksten-deret protein med formlen: X-A-B-C-P, 35 hvor A, B, C og P har den i indledningen til krav 1 angivne betydning, og X er en lineær aminosyresekvens med et lige antal aminosyrer, idet mindst én af aminosyrerne DK 166687 B1 3 i den dipeptid-komponent af X, som er knyttet direkte til N-terminus af dét ønskede protein, er ladet, og idet den første aminosyre, regnet fra N-terminus, er forskellig fra Lys og Arg, alle øvrige ulige aminosyrer er forskel-5 lig fra Pro, Lys og Arg, og alle lige aminosyrer er forskellig fra Pro, nedspises med enzymet dipeptidylamino-peptidase I (DAP I).

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse udgør 10 således en videreudvikling af den i DK-patentansøgning nr. 0556/85 omhandlede fremgangsmåde. Det har altså nu vist sig, at den deri angivne metode er generelt anvendelig til alle proteiner, som i lighed med hGH opfylder de i krav 1 angivne kriterier. Processen forløbet selektivt 15 og fører til det ønskede protein i højt udbytte.

Eksempler på proteiner, som kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er følgende: 20 Proteiner med lysin på 1. pladsen

Navn Oprindelse N-terminal sekvens

Cholecystokinin Porcin Lys-Ala-Pro-

Neurotoxin I Skorpion Lys-Asp-Gly- 25 Penicillinase Staphylococcus Lys-Glu-Leu-

Aureus

Ribonuclease Bovin Lys-Glu-Ser-

Proparathyrin Human Lys-Ser-Val-

Lactalbumin Human Lys-Glu-Phe 30 Kallidin II Human Lys-Arg-Pro

Purothionin A-I Hvede Lys-Ser-Cys-

Viscotoxin A3 Eru.Mistelten Lys-Ser-Cys-

Lysozym Human Lys-Val-Phe 35 DK 166687 B1 4

Proteiner med arginin på 1. pladsen

Navn Oprindelse N-terminal sekvens

Beta Casein Bovin Arg-Glu-Leu- 5 Posterior Pituitært

Peptid Bovin Arg-Gly-Glu-

Serum Albumin

Precursor Bovin Arg-Gly-Val-

Long Neurotoxin I Sort Mamba Arg-Thr-Cys- 10 Tuberculin-Aktivt Mycobacterium Arg-Leu-Leu-

Protein tuberculosis

Bradykinin (Kaili- din I) Bovin Arg-Pro-Pro

Amyloid Protein AA Human Arg-Ser-Phe 15

Proteiner med prolin på 2. pladsen

Navn Oprindelse N-terminal sekvens

Choriogonadotropin Human Ala-Pro-Asx- 20 Follitropin (α-kæde) Human Ala-Pro-Asp-

Pancreatic Hormon Bovin Ala-Pro-Lys-

Aspartat Aminotransferase Porcin Ala-Pro-Pro-

Plasminogen Human Glu-Pro-Leu- 25 Insulinlignende

Prealbumin Human Gly-Pro-Thr-

Prolactin Porcin Leu-Pro-Ile-

Lipidbindende Protein C-I Human Thr-Pro-Asp- 30 Cholera Enterotoxin Vibrio Thr-Pro-Glu- (0-kæde) cholerae

Prolactin Bovin Thr-Pro-Val-

Lymphotoxin Human Lys-Pro-Gly-

Interleukin-2 Human Ala-Pro-Thr- 35 Erythropoietin Human Ala-Pro-Pro-

Somatotropin Porcin Phe-Pro-Ala- DK 166687 Bl 5

Proteiner med prolin på 3. pladsen

Navn Oprindelse N-terminal sekvens

Neurocarzinostatin Streptomyces Ala-A-la-Pro- 5 carzinostaticus

Somatotropin Bovin Ala-Phe-Pro-

Carbonic Anhydrase B Human Ala-Ser-Pro-

Toxin II Søanemone Gly-Val-Pro-

Allergin RA5 Bynke Leu-Val-Pro- 10 Lac Repressor E. coli Met-Lys-Pro-

Alkohol Dehydrogenase Gær Ser-Ile-Pro-

Orosomukoid tiuman Glx-He-Pro-

Interleukin-1 Murin Ser-Ala-Pro- ^ 15 Eksempler på ekstenderinger, som kan spaltes med DAP I, er følgende:

Met-Glu-Ala-Glu-Met-Phe-Glu-Glu-20 Met-Thr-Glu-Glu-

Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Glu-

Met-Phe-25 Met-Leu-

Ala-Glu Met-Ala-

Den omhandlede fremgangsmåde egner sig således til selek-30 tiv omdannelse af biosyntetiske proteiner, hvortil der er knyttet en forsekvens, der indeholder mindst én ladet aminosyre i det nærmest proteinet siddende dipeptid, og som lader sig fraspalte enzymatisk i højt udbytte og ved den enzymatiske spaltning med DAP I giver produkter, der 35 ved kendte oprensningsmetoder, såsom ionbytning, kan adskilles på tilfredsstillende måde til isolering af det rene protein.

DK 166687 B1 6

Eksempler på egnede aminoterminalekstenderinger, der kan fraspaltes ved hjælp af DAP I ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er sådanne, hvori den sidste aminosyre i ami-nosyresekvensen X, før A, er elektrisk ladet, såsom Glu 5 eller Asp.

Disse aminoterminalekstenderinger kan opnås ved, i et egnet substrat, at fermentere en mikroorganisme, som er transformeret med et plasmid, der koder for det ønskedé 10 ekstenderede protein.

Efter udtrykkeisen bliver methioninresten eventuelt fraspaltet enzymatisk i mikroorganismen, således at det udvundne protein er knyttet til den ønskede aminoterminal-15 ekstendering med et lige antal aminosyrer, der lader sig fraspalte selektivt og i højt udbytte. Isolering af det dannede protein sker på i og for sig kendt måde, f.eks. ved chromatografiske metoder.

20 Ved at vælge en aminoterminalekstendering som defineret i den kendetegnende del af krav 1 bliver det muligt at udføre adskillelsen og oprensningen af aminoterminaleksten-deret protein fra det modne protein i højt udbytte og i -= meget ren tilstand.

25 På grund af ladningen i det sidste dipeptid af X i eks-tenderingen for det ønskede protein er det muligt at kontrollere, om hele aminoterminalekstenderingen er afspaltet. Dette har især betydning i tilfælde af, at mikroor-30 ganismen in vivo kun delvis fraspalter den N-terminale methioninrest.

Det er mest hensigtsmæssigt, at en aminosyre med ladede sidekæder i aminoterminalekstenderingen til proteinet en-35 ten udelukkende er positivt eller negativt ladede. Dette forhindrer, at aminoterminalekstenderet protein, delvis enzymatisk omdannet aminoterminalekstenderet protein og DK 166687 B1 7 autentisk protein på noget tidspunkt får samme nettolad-ning.

I proteiner, som er beslægtet med hGH, sker der let en 5 deamidering af visse Gin- og Asn-rester, dvs. Gin og Asn omdannes til henholdsvis Glu og Asp - altså aminosyrer med negativt ladede sidekæder. Af den grund vil der derfor være mest hensigtsmæssigt, at de ladede aminosyrer i aminoterminalekstenderingen er de negativt ladede Glu 10 og/eller Asp, idet man derved undgår den situation, at én eller flere deamideringer i proteinet ophæver den/de positive ladninger, der er i ekstenderingen. En sådan ophævelse af ladninger vil nemlig føre til, at eventuelt uomsat deamideret aminoterminalekstenderet protein ikke kan 15 adskilles ved ionbytning fra det enzymatisk dannede protein .

Eksempler på særligt egnede aminoterminalekstenderinger, der kan fraspaltes med DAP i er 20 1. Met-Glu-Ala-Glu 2. (Ala-Glu)r, hvor r er et helt tal fra 1 til 12 3. Met-Phe-Glu-Glu 4. Thr-Glu-Ala-Glu 25 5 - Met-Asp-Ala-Asp 6. Met-Glu-Ala-Asp

Disse og andre egnede aminoterminalekstenderinger kan opnås ved, i et egnet substrat, at fermentere en mikroorga-2q nisme, som er transformeret med et plasmid, der koder for det ønskede protein med disse tilknyttede aminoterminalekstenderinger .

Ved nogle specifikke forsekvenser bliver methionin, som 25 er den N-terminale aminosyre i alle proteiner dannet i E.

coli, afspaltet enzymatisk i mikroorganismen efter ud-trykkelse af proteinet. Herved fremkommer blandt andet -- DK 166687 B1 8 nogle af de ovenfor nævnte aminoterminalekstenderede proteiner.

Disse proteiner oprenses ved konventionelle oprensnings-5 metoder. Aminoterminalekstenderingen af spaltes selektivt og i højt udbytte. Det dannede protein kan let adskilles fra eventuelle rester af delvis omdannet aminoterminal-ekstenderet protein ved kendte chromatografiske metoder.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle udførelseseksempler.

Eksempel 1 15

Fremstilling af porcint væksthormon ved hjælp af DAP 1

Til en klonet DNA-sekvens, som koder for et protein med aminosyresekvens som porcint væksthormon, pGH (191 amino-20 syrerester, hvoraf de fire første aminosyrer er Phe-Pro-Ala-Met), tilkobles følgende syntetisk fremstillede, dob-beltstrengede DNA-sekvens således, at +strengens 3' ende tilkobles ovennævnte gens +51 ende, og den syntetiske DNA-sekvens-streng 5' ende tilkobles ovennævnte gens 3' 25 ende ved stump endeligering.

+5' CGATG GCT GAA

-3' TAC CGA CTT

30 hvor de 2 første nucleotider i + strengen er et Clal-restriktionsstedoverhæng, og de efterfølgende nucleotidse-kvenser koder for aminosyrerne Met-Ala-Glu-.

Ved normalt anvendt genkloningsteknik indsattes ovennævn- 35 te gen i et ekspres sionsplasmid indeholdende en fusione- DK 166687 Bl 9 ret Trp-Lac-promotor samt S.D.-sekvensen AGGA. Denne konstruktion udtrykker Met-Ala-Glu-pGH.

Denne plasmidkonstruktion indføres herefter ved kendt 5 teknik i en E. coli celle. En velegnet klon, som indeholder ovennævnte konstruktion, isoleres og opdyrkes i 5 1 skala. Cellerne blev høstet ved centrifugering og opslæm-mes i et lille volumen og lyseres ved anvendelse af en såkaldt "fransk presse".

10

Ved immunologiske metoder under anvendelse af pGH-anti-stoffer kunne det formodede fusionsprotein påvises i ovennævnte bakterieekstrakt, svarende til, at der i dyrkningsmediet var en koncentration af 200 mg/1.

15

Fusionsproteinet oprenses konventionelt ved anionbytning, anunoniumsulfatfældning og hydrofob chromatografi.

Det oprensede Met-Ala-Glu-pGH blev ved SDS-elektroforese 20 bedømt til at være mere end 99% rent.

En aminoterminalsekvensbestemmelse viste, at det oprensede pGH-materiale havde sekvensen Ala-Glu-pGH, hvilket vil sige, at Met er blevet afspaltet af et i E. coli forekom-25 mende enzym.

100 mg AE-pGH i 10 mM Tris-Cl, pH 4,2 (1,5 mg/ml) tilsattes 5 mg DAP 1 (3.4.14.1).

30 Reaktionsblandingen blev derefter inkuberet ved 40 °C.

Efter 4 1/2 time afkøledes blandingen til 4 °C. Den afkølede reaktionsblanding blev derefter fraktioneret ved anionbytning, hvorefter hovedtoppen (pGH-produkt) blev isoleret. Udbyttet var 90%.

pGH-produktet blev vist at være mere end 99% rent, bedømt ved SDS-elektroforese. En aminoterminalbestemmelse 35 DK 166687 B1 10 (Edman-degradation) viste, at aminoterminalsekvensen af pGH-produktet var Phe-Pro-Ala-Met-Pro-, dvs. som for autentisk pGH.

5 EKSEMPEL 2

Fremstilling af porcint pGH ud fra Met-Glu-Ala-Glu-pGH med Dipeptidylaminopeptidase I, (DAP 1) 10 Met-Glu-Ala-Glu-pGH af porcintypen er fremstillet ved genteknologi i princippet som beskrevet i eksempel 1. Met-Glu-Ala-Glu-pGh er oprenset fra fermenteringsproduktet ved anionbytning og hydrofob interaktionschromatogra- fi.

15

Det oprensede Met-Glu-Ala-Glu-pGH blev ved ionbytning og SDS-elektroforese bedømt til at være mere end 99% rent.

En amino terminal sekvensbestemmelse viste, at det opren-20 sede pGH. havde sekvensen Met-Glu-Ala-Glu-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu, hvor de seks sidste aminosyrer svarer til N-terminalen i pGH. 200 ml Met-Glu-Ala-Glu-pGH (2,0 mg/ml) i 20 mM Tris, 10 mM citronsyre, 25 mM NaCl, pH 5,2, blev tilsat 10.000 mU (svarende til 3,3 mg) dipeptidylamino-25 peptidase I (E.C. 3.4.14.1) fra Boehringer . Mannheim.

Andre fabrikater kan dog også anvendes. pH rejusteres eventuelt til 4,2.

Reaktionsblandingen blev derefter inkuberet ved 40 °C i 30 60 minutter, hvorved opnås mere end 98% omdannelse af

Met-Glu-Ala-Glu-pGh- til pGH. Reaktionsblandingen afkøles til 4 °C efter endt reaktion. Den videre oprensning består af en isofældning, gelfiltrering og en anionbytning.

35 . pGH produktet blev vist at være mere end 99% rent bedømt ved IE-HPLC og SDS-elektroforese. En aminoterminal se-kvensbestemmelse ved Edman-degradation viste, at amino- DK 166687 B1 11 terminalsekvensen af pGH produktet var Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu, dvs. som for autentisk pGH.

Den biologiske aktivitet af pGH-produktet blev bestemt 5 ved en tibia-test og blev fundet equipotent med pGH, udvundet af svinehypofyser.

EKSEMPEL 3

10 Fremstilling af porcint pGH ud fra Met-Phe-Glu-Glu-pGH med Dipeptidylaminopeptidase I

Met-Phe-Glu-Glu-pGH er fremstillet ved genteknologi i princippet som beskrevet i eksempel 1. Met-Phe-Glu-Glu-15 pGH er oprenset fra fermenteringsproduktet ved anionbyt-ning, og hydrofob interaktionschromatografi.

Det oprensede Met-Phe-Glu-Glu-pGh blev ved IE-HPLC og SDS-elektroforese, bedømt til at være mere end 99% rent.

20

En aminoterminalsekvensbestemmelse viste, at det oprensede pGH havde sekvensen Met-Phe-Glu-Glu-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu, hvor de seks sidste aminosyrer svarer til N-terminalen i pGH.

25 100 ml Met-Phe-Glu-Glu-pGH (1,5 mg/ml) 1 20 mM Tris, 10 mM citronsyre, 25 mM NaCl, 1 mM L-Cystein pH 4,2 blev tilsat 15.000 mU (5,0 mg) dipeptidylaminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1) fra Boehringer Mannheim. Andre fabrikater.

30 kan dog også anvendes. p@ rejusteres eventuelt til 4,2.

Reaktionsblandingen blev derefter inkuberet ved 40 °C i 60 min., hvorved opnås mere end 98% omdannelse af Met-Phe-Glu-Glu-pGH til pGH. Reaktionsblandingen afkøles til 35 4 °C efter endt reaktion. Den videre oprensning består af en isofældning, gelfiltrering og en anionbytning.

DK 166687 B1 12 pGH produktet blev vist at være mere end 99% rent bedømt ved IE-HPLC og SDS-elektroforese. En aminoterminalse-kvensbestemmelse ved Edman-degradation viste, at amino-terminalsekvensen af pGH produktet var Phe-Pro-Ala-Met-5 Pro-Leu, dvs. som for autentisk pGH.

Den biologiske aktivitet af pGH-produktet blev bestemt ved en tibia test og blev fundet equipotent med pGH, udvundet af svinehypofyser.

10

Eksempel 4

Froroatilling af Interleukin 10, 111# ud fra Met-Glu-Ala^ Glu-1110 15

Biosyntetisk fremstillet Met-Glu-Ala-Glu-ILl/5 blev oprenset og isoleret ved chromatografi, og eluatet blev iblandet 0,38 enheder DAP 1 (fra Boehringer Mannheim, benævnt cathepsin C, 21,9 IU/ml) pr. mg protein, beregnet på ba-20 sis af E (280, 0,1%) = 0,6. Reaktionsblandingen henstilledes i 45 min. ved 37 °C. Opløsningen dialyseredes mod 20 mM Na-citrat, 2 mM EDTA, pH = -4,0 ved 4 °C i 18 timer.

Dialysatet blev påført en FF-Q Sepharose CL6B kolonne i 25 Tris-Cl pH = 8,0 med en NaCl-gradient til 0,2 M.

ILIØ-fraktionen koncentreredes ved ultrafiltrering med en 10 ml Nova celle til et rumfang på 2,0 ml (c « 7,0 mg pr. ml). Det samlede koncentrat påførtes en Sephacrylkolonne 30 i 0,5 M Na-acetat, pH =3,5.

Ud fra en 2 ΐ fermentering i rystekolber blev isoleret 30 mg IL10 med en renhed på over 95%.

35 Produktet blev karakteriseret ved aminosyreanalyse og N-terminal sekvensanalyse. Sekvensen viste sig identisk med de første 42 N-terminale aminosyrer i autentisk IL10.

DK 166687 B1 13

Eksempel 5

Fremstilling af humant lysozym (hLZ) 5 Ved sædvanlige bioteknologiske metoder fremstilles genet for proteinet MFEE-hLZ, hvor hLZ har aminosyresekvensen:

lKVFERCELåRTLKRLGMDGYRGISLANWMC 31LAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQIN 10 61SRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIA

91DAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRD

121 VRQYVQGCGV*

Genet indføres i et egnet ekspressionssystem og dyrkes g til dannelse af MFEE-hLZ. Dette protein blev oprenset og behandlet med DAP I under de i eksempel 1 angivne betingelser. Derved isoleres autentisk rent humant lysozym.

Fra 5 i fermenteringsvæske isoleres humant lysozym, hvis 20 renhed, bestemt ved reducerende SDS-elektroforese, er mere end 95%, og i en mængde svarende til ca. 9 mg, bedømt ved en Lowry proteinbestemmelse.

Eksempel 6 25

Fremstilling af humant IGF-1

Ved sædvanlig bioteknologiske metoder fremstilles et plasmid, der koder for en ekstenderet humant insulinlign-30 ende vækstfaktor 1, med formlen Met-Phe-Glu-Glu-IGF-1, hvor sekvensen IGF-1 har følgende struktur: 1 10 Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Asp- 35 20

Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe- 30 DK 166687 B1 14

Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala- 40 50

Pro-Gln-Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-Cys-Cys-Phr-Arg-Ser- 60 5 Cys-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu- 70

Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala 10 Plasmidet indførtes i E. coli, der dyrkes under sædvanlige betingelser. Det dannede fusionsprodukt isoleres og renses på kendt måde og behandles med enzymet DAP I til dannelse af autentisk humant IGF-1.

15 Fra 4 liter fermenteringsvæske er oprenset 400 mg IGF1 med en renhed på 94% eller derover, bedømt ved reversed phase HPLC.

Eksempel 7 20

Fremstilling af bovint vækstfaktor, bGH

Ved sædvanlige bioteknologiske metoder fremstilles et plasmid, der koder på et ekstenderet bovint væksthormon 25 med formlen MFEE-bGH, hvor sekvensen bGH har følgende struktur: 1AFPAMSLSGLFANAVLRAQHLHQLAADTFK 31EFERTYIPEGQRYSIQNTQVAFCFSETIPA 3Q 61PTGKNEAQQKSDLELLRISLLLIQSWLGPL 91QFLSRVFTNSLVFGTSDRVYEKLKDLEEGI 121 LALMRELEDGTPRAGQILKQTYDKFDTNMR 151 SDDALLKNYGLLSCFRKDLHKTETYLRVMK 181 CRRFGEASCAF*

Plasmidet indføres i E. coli, der dyrkes under sædvanlige betingelser. Det dannede fusionsprodukt isoleres og ren- 35 15 DK 166687 B1 5 Ud fra en 5 i fermentering isoleres et produkt med en renhed på mere end 94%, bedømt med FPLC. Produktet indeholder dog dimert materiale i en mængde på ca. 2%, bedømt ved GP-HPLC. Fra 5 liter fermenteret materiale isoleres 82 mg autentisk bGH.

10

Eksempel 8

Fremstilling af pickwhale (sildepisker) ribonuclease, pwR

Ved sædvanlige bioteknologi ske metoder fremstilles et plasmid, der koder på et ekstenderet protein med formlen MFEE-pwR, hvor sekvensen pwR har følgende struktur: 1RESPAMKTQRQHMDSGNSPGNNPNYCNQMM 2Q 31MRRKMTQGRCKPVNTFVHESLEDVKAVCSQ 61KNVLCKNGRTNCYESNSTMHITDCRQTGSS 91 KYPNCAYKTSQKEKHI IVACEGNPYVPVHF 121 D N S V *

Plasmidet indføres i E. coli, der dyrkes under sædvanlige 25 betingelser. Det dannede fusionsprodukt isoleres og renses chromatografisk, hvorefter det behandles med enzymet DAP 1. Reaktionsblandingen oparbejdes til isolering af rent pwR.

30

Ud fra 5 fi fermenteringsmateriale isoleres pwR med en renhed på mere end 90%, bedømt ved reducerende SDS-elek-troforese, i en mængde svarende til ca. 8 mg.

35

Claims (4)

1. Enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket 5 protein, bortset fra humant væksthormon, hGH, med formlen: A-B-C-P 10 hvor a) A er Lys eller Arg, og B og C er vilkårlige aminosyrer, eller 15 b) A er en vilkårlig aminosyre forskellig fra Pro, Lys og Arg, og B og/eller C er Pro, og P er i begge tilfælde den resterende aminosyresekvens i det ønskede protein, bortset fra humant væksthormon, 20 hGH, ved nedspisning af den aminoterminalekstenderede aminosyresekvens af det tilsvarende biosyntetisk fremstillede aminoterminalekstenderede protein, kendetegnet ved, at et biosyntetisk fremstillet aminoter-minalekstenderet protein med formlen: 25 X-A-B-C-P, hvor A, B, C og P har den ovenfor angivne betydning, og X er en lineær aminosyresekvens med et lige antal aminosy-30 rer, idet mindst én af aminosyrerne i den dipeptid-komponent af X, som er knyttet direkte til N-terminus af det ønskede protein, er ladet, og idet den første aminosyre, regnet fra N-terminus, er forskellig fra Lys og Arg, alle øvrige ulige aminosyrer er forskellig fra Pro, Lys og 35 Arg, og alle lige aminosyrer er forskellig fra Pro, nedspi ses med enzymet dipep tidylaminopeptidase I (E.C. 3.4.14.1). 17 DK 166687 B1

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den sidste aminosyre i aminosyresekvensen X er Asp eller Glu. 5

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den næstsidste aminosyre i aminosyresekvensen X er Asp eller Glu.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at både den sidste og den næstsidste aminosyre i aminosyresekvensen X er Asp eller Glu. 15 20 25 30 35