JP2781997B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトオステオカルシンの21位及び24位のγ
−カルボキシグルタミン酸（Gla）をグルタミン酸（Gl
u）に置換した新規ポリペプチドの製造方法、並びに生
体由来の他の成分を含有しない純化されたヒトオステオ
カルシンの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

オステオカルシン（以下OCと略称する）は骨で生産さ
れるビタミンＫ依存性カルシウム結合蛋白である。OC
は、造骨過程において骨形成の成長因子として機能して
いることが示唆されており、骨代謝異常に起因する疾病
の治療薬となることが期待される。OCの生合成は骨組
織、特に骨芽細胞で行われ、骨代謝、骨の石灰化、異所
石灰化に関与し、癌の骨転移、ページエット病、原発性
副甲状腺機能亢進症、オステオペニアとも関連してい
る。ヒトOCは49個のアミノ酸からなり、21位及び24位に
Glaを含有するGla蛋白質である。

〔発明が解決しようとする課題〕

天然のOCはウシ等の骨から抽出できるが、純化された
ヒトOCを大量に得ることは困難であり、またウシとヒト
OCではその構造も異なる。

ヒトOCは49個アミノ酸と比較的長鎖ポリペプチドであ
り、化学合成法も困難である。ヒトOCを大量にかつ安価
に得るためには、その前駆体ポリペプチド、すなわちヒ
トOCの21位及び24位のGlaをGluに置換したポリペプチド
（以下、Glu-OCと略称する）を安価に大量に供給するこ
とが必要とされる。

本発明の目的はGlu-OCのの製造方法、及び該Glu-OCを
前駆物質とし、GluをGla化したヒトOCの製造方法を提供
し、生体由来の他の成分を含有しない純化されたヒトOC
を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は下記式I: （式中ＹはOH又はLys-OH基を示す）において、ＹがOH
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの製造方
法に関する発明であって、前記式Ｉにおいて、ＹがLys-
OH基で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをカ
ルボキシペプチダーゼＢで分解することを特徴とする。

また本発明の第２の発明は、純化されたヒトOCの製造
方法に関する発明であって、第１の発明で得られるポリ
ペプチドに、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを作用
させることを特徴とする。

更に、本発明の第３の発明は、第１の発明のポリペプ
チドの前駆体に関する発明であって、下記式II: （式中ｎは２以上の整数を示す）で表されるアミノ酸
配列を有することを特徴とする。

遺伝子組換え技法によって小分子のペプチドを大量生
産することは一般に困難とされている。その理由は、微
生物の宿主細胞中で作られた小分子のペプチドは細胞内
で酵素作用により容易に分解されてしまうためであると
考えられている。

本発明者らは、第１の発明の目的ポリペプチドすなわ
ちGlu-OCをコードする遺伝子を複数個連結してベクター
に組込み、得られる組換え体DNAを大腸菌に入れ、形質
転換体を培養する方法によれば、目的ポリペプチドが重
合した高分子ペプチドとして得られ、この重合ペプチド
を切断することによりGlu-OCを製造することができるこ
と、また最終目的ポリペプチドすなわちヒトOCは、前記
Glu-OCにビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを作用させ
ることによって製造することができることを見出した。

以下本発明を詳細に説明する。

遺伝子組換え法によるOC前駆体の製造は例えば下記の
とおり行うことができる。

添付図面において、第１図はプラスミドpOC12及びプ
ラスミドpOC21の、第２図はプラスミドpOC73の、第３図
はプラスミドpOC82及びプラスミドpOC83の、及び第４図
はプラスミドpOC980の各々造成工程、制限酵素認識部
位、及び機能地図を表す模式図である。

工程１（第１図参照） 遺伝子断片の合成： まず、下記式III、IV、Ｖ及びVIで表されるDNAを化学
合成する。

（式中、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃはそれぞれヌクレオチド中の塩
基アデニン、チミン、グアニン、シトシンを示す。以下
同じ） これらのDNAの合成は、リン酸アミダイト法による固
相合成法に従い、DNA自動合成機により行う。

式IIIで表されるDNA（以下DNA3という）と式IVで示さ
れるDNA（以下DNA4という）から形成される、一部が二
重鎖になったDNAをクレノウ酵素で二重鎖にして下記式V
IIで表される二重鎖DNA断片（以下、遺伝子７という）
を造成する。

（式中、Dra Iに向かう引出し線は制限酵素Dra Iによる
切断部位を示す。以下同じ） 同様に、式Ｖで表されるDNA（以下DNA5という）と式V
Iで表されるDNA（以下DNA6という）から下記式VIIIで表
される二重鎖DNA断片（以下、遺伝子８という）を造成
する。

工程２（第１図参照） 遺伝子７、８を含むプラスミドの造成： プラスミドpUC19（宝酒造製）を制限酵素Hinc IIで切
断後、遺伝子７をリガーゼで結合してプラスミドpOC12
を造成する。同様にHinc IIで切断したプラスミドpUC19
に遺伝子８をリガーゼで結合してプラスミドpOC21を造
成する。

工程３（第２図参照） pstS-（Glu-OC）融合遺伝子を含むプラスミドの造
成： プラスミドpOC21を制限酵素Dra IとHinc IIで切断
し、Glu-OCのＮ末端にLys残基が付加したポリペプチド
〔以下、Lys-（Glu-OC）と略称する〕をコードする断片
（以下DNA9という）を単離する。DNA9をリガーゼで連結
したのち、制限酵素Dra IとHinc IIで切断する。これに
より、DNA9が同じ向きに複数個結合した線状及び環状の
二重鎖DNAが得られる。

一方、pst S遺伝子をコードする1.5kb Pst I-Mlu I D
NA断片をpBR322のPst I-EcoRI部位に組込んだpSN5182
〔マゴタ（K.Magota）ら、ジャーナル オブ バクテリ
オロジー（J.Bacteriol.）第157巻、第909頁（1984）〕
のPst I-EcoRI断片をpUC19に移しかえたプラスミドであ
るpSN5182-Apを制限酵素Hpa Iで切断し、先のDNA9を連
結、切断した反応液に混合してリガーゼで連結すること
によりpstS遺伝子の途中にpstSと同じ読取り枠で、また
同じ向きに（ｎ−１）個のLys-（Glu-OC）遺伝子をもつ
プラスミドを造成する。ｎは２以上の整数であればよい
が、例えばプラスミドpOC73は４個のLys-（Glu-OC）遺
伝子をもつ。

工程４（第３図参照） ｎ個のLys-（Glu-OC）遺伝子を含むプラスミドの造
成： pOC73はpstSのシグナルペプチド25アミノ酸残基、pst
S成熟蛋白のＮ末端部分31アミノ酸残基に続いてLys-（G
lu-OC）が４個、更にpstS成熟蛋白のＣ末端部分238アミ
ノ酸残基から成るペプチドをコードする遺伝子を含む。
この遺伝子から生成するポリペプチドはＣ末端部分に23
8アミノ酸残基から成る不要な配列を含むのでこれを除
去することが望ましい。

pOC12をHinc II-Dra Iで切断してLys-（Glu-OC）をコ
ードするDNA断片を単離する（以下DNA10という）。一方
pOC73をHpa Iで切断する。両DNAを連結することによっ
てLys-（Glu-OC）遺伝子を５個含むプラスミドpOC82を
造成する。

同様に工程３において（ｎ−１）個のLys-（Glu-OC）
遺伝子をもつプラスミドを造成し、これを本工程に適用
することによりLys-（Glu-OC）遺伝子をｎ個含むプラス
ミドを造成することができる。この遺伝子を発現させる
ことにより、前記式IIで表されるLys-（Glu-OC）がｎ個
連結されたポリペプチドが生産される。

以下ｎが５の場合の遺伝子発現について説明する。

pOC82のpstS-〔Lys-（Glu-OC）〕_５融合遺伝子の転写
はpstSプロモーターの支配下にあり、リン酸欠乏下誘導
される。リン酸欠乏培地では宿主菌の生育が良くないた
めに大量の産物を得ることが困難である。

pOC82を制限酵素Hinf Iで切断し、pstS-〔Lys-（Glu-
OC）〕_５遺伝子を含むDNA切断を単離する（以下DNA11と
いう）。DNA11の両端をクレノウ酵素によって平滑末端
にし、Hinc IIで切断したpUC119に連結してpOC83を造成
する。pOC83のpstS〔Lys-（Glu-OC）〕_５遺伝子の転写
はpUC119由来のlacプロモーターの支配下におかれる。

工程５（第４図参照） Glu-OC生産性の向上： 大腸菌を宿主として異種蛋白を生産する場合、シグナ
ル配列に変異を導入すると分解を受けにくくなり、産物
が細胞内に大量に蓄積する例がある〔ジエンツ（R.Gent
z）ら、ジャーナル オブ バクテリオロジー、第170
巻、第2212頁（1988）〕。

pOC83のシグナル配列をコードする部分にあるCla I部
位でプラスミドを切断し、エキソヌクレアーゼIIIとマ
ングビーンヌクレアーゼでシグナル配列をコードするDN
Aを欠失させ、クレノウ酵素で平滑末端にしたのちリガ
ーゼで環状にしてpOC980を造成する。

pOC83を導入した大腸菌を培養し、全菌体蛋白のSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及び抗ウシOCモノクロー
ナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ったと
ころ、蛋白染色では宿主と区別ができず、ウエスタンブ
ロッティングでは予想される分子量よりも低分子量の数
個のバンドが見られる。これに対してpOC980を導入した
大腸菌の蛋白を同様に分析すると、蛋白染色で予想され
る分子量の位置に主要なバンドがみられ、ウエスタンブ
ロッティングでは単一のバンドとなる。

以上の遺伝子組換え手法を用いて多量に生産されたps
tSに連結したｎ個のLys-（Glu-OC）融合遺伝子産物から
以下の手順でGlu-OCが製造される。

菌体を超音波破砕し、その不溶化物から細胞内に蓄積
した目的の産物を含む顆粒をショ糖密度勾配遠心によっ
て得る。この顆粒を尿素で可溶化したのちリシルエンド
ペプチダーゼで加水分解するとGlu-OCのカルボキシル末
端側にLysが結合したポリペプチド、〔以下、（Glu-O
C）‐Lysと略称する〕が得られる。（Glu-OC）‐Lysを
カルボキシペプチダーゼＢで加水分解するとカルボキシ
ル末端のLysが除かれてGlu-OCが単一の生成物として得
られる。

以上のようにGlu-OCが遺伝子組換え手法により容易
に、かつ大量に得られる。本発明のGlu-OCの製造方法は
酵素的に除去可能なスペーサーを介して目的の遺伝子を
合成して重合化し、適当な遺伝子と融合させ、微生物に
よって融合遺伝子産物を大量に生産し、得られた産物を
化学的、酵素的に処理して単量体に変換する方法であ
る。

本発明ではスペーサーとしてLys、単量体化にリシル
エンドペプチダーゼ、スペーサーの除去にカルボキシペ
プチダーゼＢを用いたが、目的のポリペプチドを切断し
ない他の方法を用いることができる。例えば臭化シアン
はメチオニン（Met）のカルボキシル側を切断するの
で、Glu-OCに続いてLys-Metから成るスペーサーをコー
ドする遺伝子を合成し、重合化発現した後臭化シアンに
よって単量体化し、カルボキシペプチダーゼＡによって
Metから生じたホモセリン（Hse）を除去し、カルボキシ
ペプチダーゼＢによってLysを除去して目的のGlu-OCを
得ることができる。

Glu-OCのヒトOCへの変換は、例えばカルボキシラーゼ
を用い、Gluをカルボキシル化することにより行うこと
ができる。カルボキシラーゼとしては、例えばビタミン
Ｋ依存性カルボキシラーゼを例えばウシ肝臓からギラル
ドット（Girardot）らの方法〔アナリチカル バイオケ
ミストリー （Analytical Biochemistry）、第121巻、
第315〜320頁（1982）〕で調製すれば良い。

Glu-OCにカルボキシラーゼを作用させて得たヒトOCは
公知の方法で精製することができる。精製方法の一例を
示せば、Glu-OCは認識せず、ヒトOCを認識するモノクロ
ーナル抗体OC4-30（宝酒造社製）固定化カラムを用いる
方法により、効率よく精製することができる。またヒト
OCはヒドロキシアパタイトに吸着することを利用し、ヒ
ドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを行って
も良い。

以上一連の方法により、前駆物質Glu-OC及び目的物質
ヒトOCを効率よく得ることができ、生体由来の他成分を
含有しない純化されたヒトOCを工業的に製造することが
できる。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示す。本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。

実施例１ （１）プラスミドpOC12,pOC21の作製： DNA3、４各々0.25μｇをTE緩衝液（10mMトリス・HCl
pH8,1mM EDTA）10μｌに溶解し、65℃でインキュベート
したのち37℃まで徐冷した。これにdATP,dGTP,dCTP,TTP
を各々最終濃度1mMになるよう加え、クレノウ酵素（宝
酒造）2Uを添加して37℃で１時間インキュベートした後
65℃で15分間熱失活した。一方、pUC19（宝酒造）0.1μ
ｇをHinc II（宝酒造）5Uを含む中塩濃度緩衝液（Mediu
m-salt buffer）〔マニアティス（Maniatis）ら編、モ
レキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュ
アル（Molecular Cloning a Laboratory Manual）第453
頁、コールド スプリング ハーバー（Cold Spring Ha
rbor）社刊〕５μｌ中37℃１時間切断し、65℃で15分間
熱失活したのち上記のクレノウ酵素処理したDNA3、４の
反応液と混合し、DNAライゲーションキット（宝酒造）
を用いて連結した。これをJM109コンピテントセル（宝
酒造）に導入し、アンピシリンとX-galを含む寒天培地
で白色コロニーを形成する株を得た。このコロニーより
アルカリ処理法（前述のモレキュラー クローニング、
第368頁）によってプラスミドDNAを回収してpOC12を得
た。

DNA5、６を用いて全く同様にpOC12を得た。

pOC12、pOC21の挿入DNAの配列はジデオキシ法〔メッ
シング（J.Messing.）、メソッズ イン エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）第101巻、第20〜78頁
（1983）〕により確認した。

（２）プラスミドpOC73の作製： pSN5182の１μｇをBamHI,EcoRI各々10Uを含む10μｌ
の高塩濃度緩衝液（High-salt buffer）（前述のモレキ
ュラー クローニング、第453頁）中で37℃２時間切
断、65℃で15分間熱失活した。pUC19 0.1μｇをBamHI、
EcoRI各々5Uを含む10μｌの高塩濃度緩衝液中で37℃、
２時間切断し、65℃で15分間熱失活した。両DNAをDNAラ
イゲーションキットで16℃、30分間連結し、JM109コン
ピテントセルに導入した。アンピシリン、X-galを含む
寒天培地で白コロニーを形成する株からアルカリ処理法
によってプラスミドpSN5182・Apを得た。

pSN5182・Ap 0.1μｇをHpaI 5Uを含むTA緩衝液〔オフ
ァレル（Ｏ′Farrell）ら、モレキュラー アンド ジ
ェネラル ジェネティクス（Mol.Gen.Genet.）第179
巻、第421頁（1980）〕５μｌ中で切断し、65℃15分間
熱失活した。100μｇのpOC21をHinc II、Dra I各々100U
を含む中塩濃度緩衝液200μｌ中で37℃２時間切断し
た。２％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロ
マイドで染色して150塩基対（bp）の断片を切出し、透
析チューブに封入して電気溶出した（前述のモレキュラ
ー クローニング、第164頁）。更にフェノール処理、
エタノール沈殿によってDNAを回収した。このDNAをDNA
ライゲーションキットで連結し、フェノール処理、エタ
ノール沈殿ののち中塩濃度緩衝液50μｌに溶かし、Dra
IとHinc II各々50Uで37℃２時間反応させ、65℃で15分
間熱失活した。

これとHpaIで切断したpSN5182・Ap 0.1μｇをDNAライ
ゲーションキットで連結し、HB101コンピテントセル
（宝酒造）に導入してアンピシリン耐性コロニーを得
た。これらの中からGlu-OC遺伝子を４個、pstS遺伝子と
同じ向きに持つプラスミドpOC73をアルカリ処理法によ
り得た。

（３）プラスミドpOC82、pOC83の作製： pOC12の５μｇを20UのHinc IIを含む中塩濃度緩衝液5
0μｌ中で37℃２時間切断し、アガロースゲル電気泳
動、エチジウムブロマイド染色後約170bp DNAを含むア
ガロース片を透析チューブに封入して電気溶出を行い、
フェノール処理、エタノール沈殿でDNAを回収した。

一方pOC73 0.1μｇを5UのHpa Iを含むTA緩衝液10μｌ
中で37℃１時間切断し、熱失活の後上記のDNAとDNAライ
ゲーションキットで連結した。これをHB101コンピテン
トセルに導入し、アンピシリン耐性コロニーから４個の
Glu-OC遺伝子同じ向きに５個目のGlu-OC遺伝子を持つプ
ラスミドpOC82を得た。

pOC82の10μｇをHinfI 10Uを含む10μｌのTA緩衝液で
切断し、70℃15分間熱失活した。アガロースゲル電気泳
動、エチジウムブロマイド染色後、約1000bpのDNAを電
気溶出法により抽出し、フェノール処理、エタノール沈
殿で回収した。これにdATP、dGTP、dCTP、TTP各々0.1m
M、10mMトリスHCl pH8、5mM MgCl₂を含む溶液10μｌと
クレノウ酵素2Uを加え、37℃５分間反応させ、65℃15分
間熱失活した。

これをHinc IIで切断したpUC19に連結し、JM109コン
ピテントセルに導入し、アンピシリン、X-galを含む寒
天培地で白コロニーを形成する株からプラスミドpOC83
を得た。

（４）プラスミドpOC980の作製： pOC83の２μｇを10UのCla Iを含むTA緩衝液中で37℃
１時間切断する。これをキロシークエンス用デレーショ
ンキット（宝酒造）を用い、取扱説明書に従ってシグナ
ル配列をコードする部分を欠くプラスミドを作製した。
但しExo IIIの反応時間は15秒、30秒、45秒、60秒、90
秒、105秒とした。このプラスミドをHB101コンピテント
セルに導入し、アンピシリン耐性コロニー80個を各々5m
lのLB-Ap培地〔10gバクト トリプトン、5g酵母エキス
〔共にディフコ（Difco）社〕、5g NaCl、100mgアンピ
シリン/l、pH7.7〕で培養して各々の全菌体蛋白をSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、分子量35,0
00から40,000の位置に強いバンドを与える株の中からプ
ラスミドpOC980を保持する株を得た。ウシOCでマウスを
免疫して得られたハイブリドーマOC-G2（FERMBP-2077）
の生産する抗OCモノクローナル抗体OC-G2を用いたウエ
スタンブロッティングによって分子量35,000〜40,000の
蛋白がGlu-OCの重合体であることを確認した。

このプラスミドpOC980を保持する大腸菌は、Escheric
hia coli HB101/pOC980と表示し、微工研条寄第2625号
（FERM BP-2625）として、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。

（５）Escherichia coli HB101/pOC980によるLys-（Glu
-OC）重合体蛋白質の生産と精製： 本菌株を5mlのLB-Ap培地に接種し、37℃で１晩培養
し、これを200mlのLB-Ap培地に接種してエアポンプで通
気を行いながら37℃で１晩培養した。この培養液を7000
rpmで５分間遠心して菌体を集め、20mMトリス−HCl緩衝
液（pH8）で洗浄したのち同緩衝液10mlに懸濁して10分
間超音波処理し、10000rpmで15分間遠心して沈殿をとっ
た。20mMトリス−HCl緩衝液（pH8）に70％及び50％にな
るようにショ糖を溶解した溶液を遠心管中に重層し、更
に上で得られた沈殿を20mMトリス−HCl緩衝液（pH8）に
懸濁したものを重層して14000rpmで40分間遠心した。

50％ショ糖と70％ショ糖の間に層をなす不溶物を集
め、20mMトリス−HCl緩衝液（pH8）で洗浄し、顆粒を得
た。この顆粒を8M尿素を含む20mMトリス−HCl緩衝液（p
H8）0.5mlに懸濁し、10分間超音波処理して可溶化し
た。

（６）（Glu-OC）‐Lys単量体の製造： （５）で得られた溶液50μｌに尿素を含まない上記緩
衝液50μｌを加えた後、リシルエンドペプチダーゼ（和
光純薬社製）0.01Uを加えて30℃で１時間反応させた。

（７）（Glu-OC）‐LysからのLys残基の除去： （６）で得られた（Glu-OC）‐Lys単量体の溶液100μ
ｌにカルボキシペプチダーゼＢ〔シグマ（Sigma）社〕1
0μｇを加え、37℃で２時間放置した後、0.1％トリフル
オロ酢酸溶液50μｌを加えて反応を停止した。これをC
₁₈逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（HP
LC）で分離し、定量的収率でGlu-OCを得た。

実施例２ （１）ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼの調製 ウシ肝臓300gを緩衝液Ａ｛50mM 3−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸〔MOPS〕pH7.4、1mM EDTA、1mM
2−メルカプトエタノール、1mMフッ化フェニルメチル
スルホニル｝300ml中でホモジナイズし、20,000×ｇで2
0分遠心した後、その上清を100,000×ｇで１時間遠心
し、沈殿の表面を緩衝液Ｂ（50mM MOPS pH7.4、0.1M Na
Cl）で洗ってミクロソームを得た。このミクロソーム
を、３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアン
モニオ〕１−プロパンスルホネート（CHAPS）を含む緩
衝液Ｂに懸濁し、４℃で１時間かくはんした。CHAPSは
最終濃度が１％になるように加えた。これを200,000×
ｇで１時間遠心し、上清に75％飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加えて４℃で30分かくはんし、10,000×ｇ
で20分遠心した沈殿を緩衝液Ｂに懸濁して同緩衝液に対
して透析することによって可溶化ミクロソームを得た。

（２）Glu-OCのカルボキシル化とヒトOCの精製 実施例１−（７）の方法で得られたGlu-OC 1mgを20mM
トリス−HCl pH7.5、150mM NaCl、0.5M(NH₄)₂SO₄、8mM
MnCl₂、8mM ジチオスレイトール、20mM NaHCO₃、0.25m
g/mlビタミンＫを含む混合液8mlに溶解し、実施例２−
（１）で得られた可溶化ミクロソーム2ml（約20mg蛋白/
ml）を加えて17℃で16時間カルボキシル化反応を行っ
た。これを1mM CaCl₂を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）に
対して透析し、Glu-OCは認識しないが天然型ウシOCは認
識するモノクローナル抗体OC4-30（宝酒造社製）を常法
通りセファロース4B（ファルマシア社）に固定化したカ
ラムに吸着させ、0.5％ツィーン（Tween）80、1mM CaCl
₂、8M尿素を含むPBSで溶出した。モノクローナル抗体OC
4-30とOC-G4（宝酒造社製）を用いたサンドイッチELISA
によってヒトOCが溶出画分にあることを確認した。ヒド
ロキシアパタイトを充てんしたHPLCカラムであるHCA-CO
LUMN（三井東圧）を用いて10mMから200mMのリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.8）の濃度勾配で更に精製を進め
た。この条件ではGlu-OCはカラムに吸着せず、ウシOCは
約80mMで溶出されてくる。OC4-30カラム溶出物を分離し
たところ、約80mMの濃度で溶出されるピークに純化され
たヒトOCの存在することがELISAとＮ末端から10残基目
までのアミノ酸配列分析によって確認された。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明した通り、本発明によりヒトOC前駆体
重合体の遺伝子が創製された。該遺伝子を含有するプラ
スミドで形質転換した微生物により、該重合体が効率よ
く生産される。該重合体よりスペーサーを酵素学的に除
去すること、続いて該ヒトOC前駆体を酵素学的に処理す
ることにより医薬品として有用な純化ヒトOCを効率よく
製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpOC12及びプラスミドpOC21の、第２
図はプラスミドpOC73の、第３図はプラスミドpOC82及び
プラスミドpOC83の、及び第４図はプラスミドpOC980の
各々造成工程、制限酵素認識部位、及び機能地図を表す
模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩ ＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，Ｖｏｌ．255，Ｎｏ．18，（1980) Ｐ．8685−8691 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．８，Ｐ．1885−1890 （1986) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C07K 14/00 - 14/825 C12N 15/00 - 15/90 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式I: （式中ＹはOH又はLys-OH基を示す）において、ＹがLys-
   OH基で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをカ
   ルボキシペプチダーゼＢで分解することを特徴とする該
   式Ｉにおいて、ＹがOHで表されるアミノ酸配列を有する
   ポリペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】請求項１記載の製造方法で得られるポリペ
   プチドに、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを作用さ
   せることを特徴とするヒトオステオカルシンの製造方
   法。
3. 【請求項３】下記式II: （式中ｎは２以上の整数を示す）で表されるアミノ酸配
   列を有することを特徴とするポリペプチド。