KR100492417B1

KR100492417B1 - 신규한조직형플라스미노젠엑티베이터뮤테인

Info

Publication number: KR100492417B1
Application number: KR1019960047650A
Authority: KR
Inventors: 양재영; 이재형; 조중명
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1996-10-23
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2005-09-12
Also published as: KR19980028546A

Abstract

인간 tPA단백질의 아미노산 서열 일부를 제거 및 치환시켜서 변형한 신규한 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 뮤테인에 관한 것으로서, 인체내에서 긴 반감기를 가지며 정제후 동일성이 높은 신규의 tPA 뮤테인을 제공하여 우수한 혈전용해제의 생산을 가능하게 한다.

Description

신규한 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 뮤테인

본 발명은 신규한 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 뮤테인(a mutein of tissue type plasminogen activator protein)에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 인간 tPA 단백질의 아미노산 서열 일부를 제거 및 치환시켜서 변형한 신규한 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 뮤테인에 관한 것이다.

tPA는 혈관 내피세포 등의 인체 조직에서 생산되는 분자량 68000달톤 정도 크기의 당단백질로서 혈전 용해제로 사용되고 있다. 혈전이란 혈관내에 생기는 혈액의 덩어리로서 이로 인해 모세혈관이 막혀서 수족마비, 뇌 경색, 심근 경색 등이 발생한다. 혈전의 주성분은 피브린이라는 당단백질이며, 플라스민에 의해 분해된다. tPA는 혈전을 형성하는 피브린에 대한 친화성이 높을 뿐만 아니라 피브린이 존재할 때 그 활성도가 100-200배 증가하는 특성이 있어서 피브린 표면에서 국소적으로 작용하여 플라스미노젠을 플라스민으로 전환시키며, 스트랩토카이네이즈나 유로카이네이즈 등과 같은 다른 혈전 용해제에 비해 특이성이 높은 것으로 알려져 있다(Bergmann, S. R. et al., Science (1981) 220: 1181-1183). 스트랩토카이네이즈나 유로카이네이즈 등은 혈액내에 순환하는 플라스미노젠까지도 활성화시키기 때문에 심한 출혈현상 등과 같은 부작용을 나타내기도 한다.

인간의 조직에서 추출한 천연의 인간 tPA는 단일 형태와 단백질 분해 효소에 의해 절단된 형태의 2가지 형태로 존재하는데 모두 동일한 활성도를 나타낸다 (Wallen, P. et al , .Prog. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis (1981) 5: 16-23).

차이니스 햄스터 오바리(CHO) 세포에서 발현되는 재조합 tPA(Activase™, Genentech)는 사람과 햄스터의 차이로 인해서 당화되는 패턴이 약간 차이가 있을 뿐 천연의 인간 tPA와 아미노산, 염기 서열이 동일하고 활성도도 비슷하다. 상기 재조합 tPA는 전체 무게의 약 7%정도가 다당류로 이루어지며 117번째 아미노산에는 만노스(mannose)가 풍부한 다당류가, 184번째와 448번째 아미노산에는 복잡한 형태의 다당류가 붙어 있다. 또한, 상기 재조합 tPA는 184번째 아미노산의 다당류 존재여부에 따라 두종류로 나눌 수 있는데, 184번째 아미노산(아스파라진)에 다당류가 붙어 있으면 타입 1 (type I), 다당류가 붙어 있지 않으면 타입 II (type II)로서 활성에는 서로 차이가 없는 것으로 알려져 있다. 상기 천연의 인간 tPA와 재조합 tPA의 아미노 말단부위는 다른 단백질과 유사한 몇 개의 부위로 구성되어 있는데 아미노산 4-5는 피브로텍틴의 핑거부위(finger domain)와 유사하며 아미노산 50-87은 인간 표피 성장 인자(epidermal growth factor)와 유사하며 아미노산 87-176(K1), 176-262(K2)은 플라스미노젠의 크링글(Kringle)부위와 유사하다. 상기 tPA의 아미노산 276-527부위는 세린 단백질 분해 효소로 알려져 있다. 베넷 등은 이런 부위가 피브린과 결합, 피브린과 결합된 플라스미노젠을 플라스민으로 활성화, 엔도셀리알(endothelial) 세포수용체에 결합, 생체 내에서의 짧은 반감기에 관여한다고 밝혔다(Bennett, W. F. et al , Fibrinolysis (1990) 4. 14). 그러나, 상기한 tPA 단백질은 그 투여량(60Kg 기준, 100mg/dose)에 비해 생체내 반감기가 7분정도로 매우 짧은 단점을 가지고 있다. 실제 동물 실험에서 tPA가 체내에서 신속하게 없어지며, 이것은 주로 아미노 말단 절반부위에 의해 나타나고(Rijken D.C., et al , Biochem. J. (1986) 238:643), 상기 tPA 단백질은 대부분 간에서 없어진다(Barnathan E. S. et al., J. Biol. Chem. (1990) 46: 658) 바나단 등은 tPA의 핑거 부위, 성장 인자 부위가 엔도셀리알 세포에 결합되고 그 결과 짧은 반감기를 갖는다는것을 밝혔다(Barnathan E. S. et al., J. Biol. Chem. (1990) 4: 131). 그러나 tPA의 핑거 부위, 성장 인자 부위, 단백질 분해 효소 부위 중의 어느 부위를 제거시킨 뮤테인들을 이용한 실험에서, 핑거 부위와 단백질 분해 효소 부위만을 갖는 tPA 뮤테인의 경우 천연형 단백질보다 4-5배 정도 긴 반감기를 갖으나 피브린 특이성은 심각하게 줄어들었으며(Trill, J. J. et al., Fibronolysis (1990) 4: 131) 성장 인자 부위만을 없앤 tPA 뮤테인의 경우도 5-10배 증가된 반감기를 갖는 다고 알려져 있다(Brown, M. J. et al., J. Biol. Chem. (1988) 263: 1599). 그러나 상기한 핑거 부위, 성장인자 부위, 단백질 분해 효소 부위 모두를 제거한 뮤테인의 경우 특이적 혈전용해력(specific thrombolytic activity)은 심하게 감소하였다(Collen, D. et al., Thromb. Haemost. (1991) 65: 174). 몇 개의 특정 아미노산의 치환, 제거에 의한 반감기 증가 실험으로서 아헌 등은 아미노산 42-49를 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 피브린 분해력에는 영향 없이 반감기가 약 6배 정도 증가되는 것을 보고하였다(Ahern T. J. et al., J. Biol. Chem. (1990) 265: 5540). 결과적으로 아헌 등은 상기 부위의 치환과 117번째의 당화위치를 제거함으로써 높은 피브린 분해력과 반감기가 늘어난 뮤테인을 만들었다. 브라운은 성장 인자 부위내의 아미노산 67-69를 다른 아미노산으로 치환시 체내에서 없어지는 정도가 약 10배 정도 감소하였다고 보고하였다(Brown, M., J. Thromb. Res. (1990) 59. 687). 또한 스즈키 등은 75번째 시스테인 아미노산과 다이썰파이드결합을 하는 84번째 시스테인을 세린으로 치환시킴으로써 반감기가 증가된 tPA 뮤테인 E6010을 개발하였다(Suzuki S, et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. (1991) 17: 738). 당화 부위를 제거한 tPA를 천연형과 비교한 결과, 당화는 반감기에 크게 관여하지 않은 것으로 알려졌다(Collen D. et al., J. Pharmacol. Exper. Therap. (1984) 231: 146). 상기와 같은 특정 아미노산이 치환된 tPA 뮤테인은 생체내 없어지는 정도가 감소함으로 인해 천연형 tPA보다 약 1/4정도 사용하여도 주입후 2시간 이내에 혈전의 약 50%가 용해되는 것을 관찰할 수 있었다. 즉 현재의 1도스(dose)보다도 적은 양을 사용하여 현재와 동일하거나 혹은 그 이상의 효과를 나타낸다. 그러나 상기한 종래의 재조합 tPA 뮤테인은 184번째 아미노산에 당류가 부착하고, 부착하지 않음에 따라 타입 1 (type I), 타입 II의 두 종류의 tPA 뮤테인이 혼합되어 동일성(homogenicity)이 높지 않다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 피브린의 분해력이 탁월하면서도 인체내에서 긴 반감기를 가지며 정제후 동일성이 높은 신규의 tPA 뮤테인을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질에 있어서, 상기 단백질의 아미노 말단으로부터 82 및 83번째 아미노산을 제거하고 186번째 아미노산인 세린을 알라닌으로 치환한 것을 특징으로 하는 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질을 제공하며 상기 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하며 상기 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 플라스미드 pLCED4sf tPAm95인 것이 바람직하다. 본 발명은 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 동물 세포주를 제공하며 상기 동물 세포주는 한국 유전자은행(KCTC)에 수탁 번호 KCTC 0280BP로 수탁된 CHO-tPAm95인 것이 바람직하다.

상기한 발명에 있어서 본 발명자들은 tPA의 35개 시스테인 아미노산 중에 유일하게 썰파이드 결합을 하고 있지 않는 83번째 아미노산인 시스테인과 82번째 아미노산인 라이신을 제거하여 성장 인자 부위를 변화시킴으로써 반감기의 증가를 기대할 수 있고 또한 활성도 및 반감기에는 관여는 없으나 차이니스 햄스터 오바리 세포를 이용한 재조합 tPA 단백질의 발현, 정제시 단백질의 동일성(homogenicity)을 높이기 위해 186번째 아미노산인 세린을 알라닌으로 치환시킴으로써 184번째 아미노산이 당화가 되지않는 신규 tPA 뮤테인을 고안하게 되었다.

본 발명자의 선행 특허 출원 "조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질을 발현하는 형질전환된 동물 세포" (대한민국 특허출원 제95-6519호)를 만드는데 사용된 동물 세포 발현용 플라스미드 pLCED4sf tPA 유전자 중 82, 83번째 아미노산에 해당하는 DNA 서열을 제거하기 위해 30개 베이스의 tPA82-83del 프라이머(5'-GGTATCTATTTCACACCCAGCAAATCCTTC-3')를, 그리고 184번째 아미노산의 당화부위를 없애기 위해 186번째 아미노산인 세린 코돈이 알라닌 코돈으로 바뀐 33개 베이스의 tPA186A 프라이머 (5'-CGTGCCACGGTAGGCTGCCCCATTCCCAAAGTA-3')를 합성하였다. tPA 유전자 일부를 M13벡터에 클로닝하고 여기서 얻은 재조합 박테리오파아지 M13mp19tPA720을 대장균 CJ236에 재감염시켜 우라실이 티민대신 플라스미드 DNA에 삽입된 단일 가닥 U-DNA를 얻는다. 이 U-DNA와 두 개의 합성 프라이머를 이용하여 변형된 tPA 유전자를 생합성하였고 변형된 염기 서열을 확인하였다. 변형된 tPA 유전자를 다시 동물 세포용 발현벡터에 재클로닝하여 pLCED4sf tPAm95을 완성하였다. tPA 뮤테인을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해 dhfr 결핍 CHO 세포(ATCC CRL9096)에 칼슘 포스페이트 침전법(Graham et al., Virology(1973) 52: 456)으로 pLCED4sf tPAm95 플라스미드 DNA를 세포내로 형질 감염(transfection)시키고 알파배지에서 선별 배양한 후 형질전환된 세포의 유전자를 증폭시키기위해 dhfr(dihydrofolate reductase)의 저해제인 MTX(Methotrexate)를 배지에 포함하여 배양하였다(Kaufman R. J., Method in Enzymology (1989) 185: 537-566). 초기농도 0.025μM MTX로부터 시작하여 4배씩 MTX농도를 높여가면서 400nM농도까지 선별하여 tPA 단백질을 10mg/L이상 합성할 수 있는 세포주를 개발하였고 MTX농도를 1mM까지 높일 경우 더 많은 양의 tPA 뮤테인의 합성을 기대할 수 있다. 정제된 tPA 뮤테인은 천연형의 tPA 단백질보다 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 그 크기에 있어서 편차가 크게 줄어들었으며 천연형 단백질과 비교하였을 때 그 활성도는 동일한 것으로 나타났다.

[실시예]

다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

단계 1: tPA 유전자의 염기 변환(Mutagenesis)

tPA 유전자의 염기 변환을 위하여 도 2에 기재한 공정을 실시하였으며 이를 자세히 설명하면 다음과 같다.

발현 벡터 pLCED4sf tPA DNA(대한민국 특허 출원 제95-6519호)를 BamH I, EcoR I 제한 효소로 절단하여 이를 7% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 tPA 유전자 5'-말단 약 720 염기쌍을 포함하는 740bp 크기의 유전자 절편을 얻었다. 한편 재조합 박테리오파아지 M13mp19벡터를 BamH I, EcoR I 제한 효소로 절단하고 이를 0.7% 아가로오스 젤로 분리하여 약 7.3Kb 핵산절편을 분리 정제하였다. T4 DNA리가아제(ligase) 접합반응 용기에 100ng의 상기 절단된 M13mp19벡터, 100ng의 상기 740bp의 tPA절편을 넣고 2㎕의 10배 접합반응용액[500mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂, 100mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol), 10mM ATP, 250㎍/ml 송아지 혈청 알부민(bovine serum albumin), pH7.8], 10단위체의 T4 DNA 리가아제와 적정량의 증류수를 가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 한 다음 16℃에서 2시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 이를 대장균 JM 105(ATCC 47016) 컴피턴트 세포로 형질전환시킨 뒤 형질전환된 세포에 8/㎕의 0.2M IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, USB cat. no. 17884, U.S.A.) 용액을 넣고 미리 배양된 헬퍼세포(대장균 JM105) 100㎕, 3ml의 2XYT 상층아가(soft agar, 1 ℓ 당 16g의 박토트립톤, 10g의 효모 추출물, 5g 의 박토아가)와 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하고 최소평판배지 A(Min A plate, 1 ℓ당 10.5g의 K₂HPO₄, 1g의 (NH₄)₂SO₄, 0.5g의 시트르산 나트륨, 12g의 박토아가, 1ml의 20% MgSO₄, 0.5ml의 1% Vit B, 10ml의 50% 글루코오스)위에 고르게 도포한 후 37℃에서 12시간 배양하였다. 재조합 박테리오파아지에 의해 생성된 투명한 플라크(plaque)를 대장균 JM105와 함께 2ml의 2XYT 액체배지에서 접종하고, 37℃에서 6시간 정도 배양한 후 배양액을 원심분리하였다. 대장균 세포 침전물로부터 플라스미드 DNA를 얻어 BamH I, EcoR I 제한 효소 절단시 740여쌍의 염기가 잘려져 나오는 클론을 선별하여 그 클론의 배양액을 원심분리하여 얻은 상층액으로부터 재조합 박테리오파아지 M13mp19tPA720을 얻었다.

염기 변환시키기 위해 클로람페니콜이 34ug/ml, 1% 우리딘이 1㎕ 들어간 2ml의 LB배지에 대장균 CJ236(dUTP-, ung-strain)을 3시간 정도 배양한 다음 상기한 박테리오파아지를 감염시키고 5시간정도 배양하였다. 배양액을 원심분리하고 그 상층액에 1/4부피의 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌글리콜, 2.5M 염화나트륨)을 넣은 다음 30분 정도 얼음수조에서 방치한 후 이를 14000rpm에서 원심분리하여 얻은 M13 파아지 침전물을 페놀/클로로포름으로 추출하여 우리딘이 삽입된 단일 가닥 U-DNA를 정제하였다.

tPA 유전자내의 82, 83번째 아미노산에 해당하는 DNA 서열을 제거하기 위해 30개 염기 (base)의 tPA82-83del 프라이머 (5'-GGTATCTATTTCACACCCAGCAAATCCTTC-3')를, 그리고 184번째 아미노산의 당화부위를 없애기 위해 186번째 아미노산인 세린을 알라닌으로 바꾸기 위한 33개 염기의 tPA186A 프라이머(5'-CGTGCCACGGTAGGCTGCCCCATTCCCAAAGTA-3')를 DNA 합성기(Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 합성하였다. 합성된 두 개의 프라이머 0.2㎍에 T4 폴리뉴클레오티드 인산화 효소를 처리하여 프라이머의 5'-말단을 인산화시켰다. 염기변환 실험은 에머샴사(Amersham Life Science Inc.)의 스컵터 인 비트로 염기변환 시스템(Sculptor in vitro mutagenesis system)을 이용하였는데, U-DNA 주형 0.2㎍에 인산화된 tPA82-83del 프라이머 0.05㎍, tPA186A 프라이머 0.05㎍과 키트내의 완충용액 A를 1 ㎕넣고 증류수를 최종부피가 8 ㎕이 되도록 첨가하였다. 65℃에서 2분 정도 반응시킨후 상온까지 천천히 식혔다. 여기에 키트내의 dNTP mix B를 8 ㎕넣고, T4 DNA 접합효소를 1㎕, T4 DNA 중합 효소를 1 ㎕, 증류수를 1.5 ㎕넣고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응액 중 2 ㎕를 대장균 JM105에 앞에서와 동일한 방법으로 형질전환시켰다. 재조합 박테리오파아지에 의해 생성된 투명한 플라크로부터 단일가닥 핵산을 추출하여 생거 등(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1977) 74:5463)의 방법에 따라 핵산 염기 서열을 분석한 결과 82, 83번째 아미노산 코딩 핵산 서열이 제거되고 또한 186번째 아미노산이 알라닌 코딩 서열로 치환된 클론 M13mp19tPAm95을 선별하였다. 원래의 tPA유전자와 본 발명의 tPA뮤테인의 염기서열 차이를 도 1에 도시하였다.

이 클론을 BamH I, EcoR I 제한 효소로 절단하여 740 염기쌍의 변형된 tPA 유전자를 얻고, 한편 pLCED4sf tPA 벡터를 동일 제한 효소로 절단하여 7.5Kb의 절편을 얻었다. 이 두 절편을 T4 DNA 리가아제로 접합시키고 대장균 HB101(ATCC 33694) 컴피턴트 세포에 접합 반응액을 첨가하여 주고 하나한의 방법(J. Mol. Biol. (1983) 116: 557)에 따라 형질전환시킨 후 LB-엠피실린(50㎍/ml 엠피실린을 포함하는 LB배지) 플레이트에 평판하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 형질전환체를 대량 배양하여 플라스미드 pLCED4sf tPAm95 DNA를 퀴아겐 칼럼(Quiagen, USA)을 이용해 순수 분리하고 이를 동물세포로의 형질전환에 이용하였다. 상기 동물 세포 발현 벡터 pLCED4sf tPAm95의 제조공정을 도 2에서 상세히 나타내었다.

단계 2: 동물 세포의 형질전환

이와 같이 제조된 발현 벡터 pLCED4sf tPAm95는 tPA유전자와 dhfr 유전자의 mRNA가 한 개의 프로모터로부터 전사되도록 하는 바이시스트로닉 벡터로서, 사이토메가로 바이러스(CMV) 프로모터에 tPA 유전자, 엔세파로마이오카디티스(EMC) 바이러스 RNA의 5'-말단 비암호화 부위(5'-terminal non-coding region) 그리고 dhfr 유전자를 차례로 넣음으로써 mRNA가 생성된 후 라이보솜에 의한 번역(translation)이 tPA 유전자 및 dhfr 유전자에 모두 일어나도록 하였다. tPA 유전자와 dhfr 유전자를 포함하는 상기 발현 벡터는 CHO 세포에 형질전환하여 염색체에 통합(integration)시키고 dhfr의 저해제인 MTX(methotrexate)를 이용하여 dhfr 유전자를 증폭시킬 때, 2개의 독립된 프로모터를 사용하는 플라스미드가 dhfr 유전자만 선별적으로 증폭되고 tPA 유전자가 제거되는 단점을 최소화한 벡터이다.

tPA 뮤테인을 발현하는 세포주를 개발하기 위해 우선 dhfr 결핍 CHO세포(ATCCCRL9096)를 35mm 플레이트에 15배 정도 희석 분양한 후 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70-80%정도 성장한 것을 확인한 후 칼슘 포스페이트 침전법(Graham et al., Virology(1973) 52: 456)으로 pLCED4sf tPAm95 플라스미드 DNA를 세포내로 형질감염(transfection)시켰다. 이때 사용한 배지는 10% 송아지 혈청, 하이포잔틴(hypoxanthine)과 티미딘(thymidine)이 각각 10㎍/ml 함유된 완전 알파 배지(complete α medium; Minimum Essential Medium(MEM), GibcoBRL Cat. 12000-022)를 사용하였다. 이틀 후에 하이포잔틴과 티미딘이 없고 투석된 송아지 혈청이 10% 함유된 알파 배지로 교체하여 형질전환된 CHO 세포만이 성장할 수 있도록 선택 배양을 하였다. 선택 배양 시작 2주일 후부터 살아남는 세포의 콜로니가 형성되기 시작하였다. 이중 성장 속도가 양호한 세포들이 직경 100mm 배양접시당 10⁷이상 될 때까지 배양한 후 일부를 동결 보관하고 일부는 유전자 증폭과정을 실행하였다.

단계 3: 형질전환된 CHO 세포의 tPA 유전자 증폭

형질전환된 세포의 유전자를 증폭시키기 위해 dhfr의 저해제인 MTX를 배지에 포함하여 배양하였다(Kaufman R. J., Method in Enzymology (1989) 185: 537-566). 상기 과정은 형질전환된 tPA 유전자의 증폭을 유도해나가는 과정이다. MTX의 농도는 초기에는 25nM에서 시작하여 4배씩 증가시켜 나가는데 각 MTX의 농도에서 최소한 2-3회 이상 계대 배양을 실시해서 정상적인 CHO세포의 성상과 성장 속도를 보일 때 다음 단계의 MTX로 그 농도를 증가시켰다. 특히 400mM의 MTX농도에서 성장속도가 양호한 10개의 세포군으로 나누어서 tPA 뮤테인의 발현양을 측정한 다음 그 중 발현양이 높은 #1, #5의 2개의 세포군을 선택하여 더 높은 농도의 MTX 존재하에서 계대 배양을 계속하였다.

일반적으로 세포 배양액으로 분비되는 tPA 단백질은 배양액에 존재하는 송아지 혈청에 함유된 플라스미노젠을 플라스민으로 전환시키게 되고 이 플라스민은 트립신 유사반응을 일으켜 세포배양시 배양접시로부터 세포가 떨어져 나오게 한다고 보고된 바 있는데(R. J. Kaufman et al., (1985) Molecular and cellular Biology 5(7) 1750-1759; U. H. Weidel et al., (1988) Gene 66, 193-203) 본 발명에 따른 발현 벡터 pLCED4sf tPAm95로 형질전환된 CHO 세포의 배양시에도 세포배양액으로 분비되는 tPA 뮤테인의 발현이 확인된 400nM의 MTX의 농도에서 동일한 현상이 관찰되었고 이때 0.1mg/ml의 아프로티닌(SIGMA, Cat. No. A-6279, 14 TIU/mg)을 첨가하여 배양시 배양접시로 세포가 떨어져 나오는 것을 방지할 수 있었다. 이것은 본 발명에 따라 발현된 뮤테인이 정상적인 활성을 가지는 것을 간접적으로 보여주는 것이다. 이후의 선택배양시에도 아프로티닌을 첨가해 주었고 최종적으로 MTX의 농도를 400nM까지 처리하였다.

단계 4. 세포 배양액으로 분비되는 tPA 뮤테인 발현의 확인

상기 단계 3에서 얻어진 세포주를 직경 100mm의 배양접시에서 400nM의 MTX와 10%의 투석한 송아지 혈청을 함유한 배양액에서 배양접시 면적의 50%까지 자라게 되었을 때 3ml씩의 무혈청 배양액(GibcoBRL, CHO-S-SFM II,Cat, No. 12052-023)으로 2회 세척해준 다음 10ml의 400nM MTX를 함유한 무혈청 배양액으로 이틀동안 배양하였다. 상기 세포 배양액을 13000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액만을 수거한 다음 이 중 20㎕씩에 SDS-폴리아크릴아미드 젤 완충액 20㎕를 가한 뒤 3분간 가열하고 12% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기영동하였다. 젤 상에서 분리된 단백질을 토빈의 방법에 따라서 나이트로 셀룰로오스 필터로 전달시켰다(Towin et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. (1979) 76: 4750) 이 필터를 0.2% 젤라틴이 함유된 PBS에 넣고 30분간 흔들면서 여분의 단백질 흡착부위를 차단시켰다. 그 다음 0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100, 그리고 0.02% 티메로살이 함유된 PBS로 500배 희석한 염소 항 사람 tPA 항체(Cortex Biochem Inc., Cat. No. CR6073G)를 가하여 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 상기 필터를 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS로 4회 세척한 다음 0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100, 그리고 0.02% 티메로살이 함유된 PBS로 500배 희석한 호스 래디쉬 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase)로 표지된 토끼 항 염소 이뮤노글로불린G 항체(Rabbit anti-Goat IgG-HRP; American Qualex, Cat. No. A102 PS)를 가하여 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 상기 필터를 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS로 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액 (pH 8.0)으로 2회 세척해 주었다. 이 필터를 400㎍ /ml의 4-클로로-1-나프톨과 0.03%의 과산화 수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액(pH 8.0)을 가하여 발색시킴으로써 형질전환된 CHO 세포를 400nM의 MTX 존재하에서 선별배양하였을 때 약 68 KDa정도의 크기로 tPA 뮤테인이 발현됨을 확인하였다.

단계 5: tPA 뮤테인의 정제

본 발명자의 선행특허인 "형질전환된 동물세포에서 발현된 사람 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질의 정제방법" (대한민국 특허 출원 95-39312)에서의 방법대로 정제하였는데 1리터의 세포배양액을 0.1M 소듐 아세테이트, pH 4.5, 150mM 염화 나트륨, 0.01% 트윈 80이 되게 조정한 후 25분간 원심분리하고 (Beckman J 2-21, JA 14 rotor, 12000rpm) 그 상등액만을 취하였다. 이 상등액을 소듐 아세테이트 완충액(0.1M 소듐 아세테이트, pH 4.5, 150mM 염화 나트륨, 0.01% 트윈 80)으로 평형된 SP-세파로스 양이온 교환 수지 칼럼(1.2cm×4cm, Vg=4ml)에 분당 1ml의 속도로 통과시킨 다음 다시 동일 완충액을 가하여 유리되어 나오는 단백질들을 제거하고 0.D 280에서의 흡광도가 기준선 이하로 떨어질 때까지 세척하였다. 칼럼에 흡착된 단백질들은 200ml(50 × Vg)의 0.15-1.0M 염화 나트륨 농도구배를 분당 2ml의 속도로 가하여 용출시켰으며 이를 5ml씩의 분획들로 수거한 뒤 12% SDS-PAGE함으로써 tPA뮤테인을 함유한 분획들만을 분리하여 수집하였는데 칼럼에 흡착된 tPA 뮤테인은 약 0.4-0.6M의 염화나트륨에 의해 용출되어 나오는 것을 확인하였다. 여기서 얻은 단백질 용액을 10mM 트리스 완충액(10mM 트리스, pH 7.5, 1mM 염화칼슘, 1mM 염화마그네슘, 0.15M 염화 나트륨)으로 투석한 다음 동일 완충액으로 평형된 콘카나발린 에이(Concanavalin A) 렉틴 친화 수지 칼럼(1.0cmx6cm, Vg=6ml)에 분당 1ml의 속도로 통과시킨 다음 다시 동일 완충액을 가하여 유리되어 나오는 단백질들을 제거하고 0.D 280에서의 흡광도가 기준선 이하로 떨어질 때까지 세척해주었다. 칼럼에 흡착된 단백질들은 100ml(15 × Vg)의 0-0.2M의 만노피라노사이드(Mannopyranoside) 농도 구배를 분당 2ml의 속도로 가하여 용출시켰으며 이를 3ml씩의 분획들로 수거한 뒤 12% 비환원 SDS-PAGE함으로써 tPA 뮤테인을 함유한 분획들만을 분리하고 수집하여 순도 98%이상의 tPA 뮤테인을 순수분리할 수 있었다. 이 실험의 웨스턴 블로팅 결과를 도 3에 도시하였다. 제 1열은 단백질표준 마커이며 2-3열은 흡착하지 않은 용출된 단백질들이고. 6,7열이 0.4-0.6M의 염화나트륨에 의해 용출된 tPA 뮤테인을 나타내는 밴드로서 정제된 tPA 뮤테인을 얻게 됨을 알 수 있다.

단계 6: 정제된 tPA 뮤테인의 활성도 측정

상기 단계 5에서 얻어진 정제된 tPA 뮤테인 단백질을 크로모짐(Chromozym) tPA(N-Met-D-Phe-Gly-Arg-4-nitranilide acetate; Boeringr Manheim Biochemica. Cat. No. 1093037)를 기질로 사용하여 활성도 측정을 수행하였다. 표준 단백질로서는 보우스-멜라노마 세포로부터 분리정제된 이중 사슬 tPA(SIGMA, T-0284)를 사용하였다. 적정 농도 희석과 기질 용액과의 혼합후 37℃에서 30분간 반응을 시킨 다음 0.D 405에서의 흡광도를 측정한 결과 표준 tPA 단백질들은 6.9 x10⁵I.U/mg인 반면 본 발명에 따라 순수 분리된 tPA 뮤테인의 활성도는 7.3x10⁵I.U/mg으로 측정되었다. 이 결과로부터 82, 83번째 아미노산이 제거되고 186번째 아미노산이 알라닌으로 치환된 tPA 뮤테인이 천연형의 tPA 단백질과 동일한 생물학적 활성도를 갖고 있음을 확인하였다.

높은 피브린 분해력과 함께 인체내에서 늘어난 반감기를 가지면서 동일성이 높은 신규한 tPA 뮤테인을 제공하게 되어 효과가 높은 혈전용해제의 생산이 가능하게 된다.

도 1은 보우스 멜라노마(Bowes Melanoma)세포 유래 조직형 플라스미노젠 엑티베이터(tissue type plasminogen activator, 이하 tPA로 칭함) 유전자와 본 발명의 tPA 뮤테인의 염기서열의 차이를 나타낸 염기서열표.

도 2는 동물세포 발현 벡터 pLCED4sf tPAm95의 제조공정을 개략적으로 나타낸 공정도.

도 3은 정제한 tPA 뮤테인의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 사진.

Claims

하기 기재한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질 유태인:

(서열번호 1)
제 1항의 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질 뮤테인을 코딩하는 유전자.
제 2항의 조직형 플라스미노젠 엑티베이터 단백질 뮤테인을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제 3항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 pLCED4sf tPAm95인 발현 벡터 .
제 3항의 발현 벡터에 의해 형질전환된 CHO(chinese Hamster Ovary) 세포주.
제 5항에 있어서, 상기 CHO 세포주는 한국 유전자은행(KCTC)에 수탁 번호 KCTC 0280BP로 수탁된 CHO-tPAm95인 CHO 세포주.
제 2항에 있어서, 상기 유전자는 하기 기재한 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인 유전자:

(서열번호 2)