KR101005821B1

KR101005821B1 - 배트록소빈의 변이 뉴클레오타이드 서열, α－인자 분비 시그널 서열 변이체 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법및 이를 이용한 배트록소빈의 제조방법

Info

Publication number: KR101005821B1
Application number: KR1020070139776A
Authority: KR
Inventors: 손영덕; 김범준; 김옥환; 김경준; 신지훈; 홍성유; 황재훈; 정광회
Original assignee: (주)바이오버드
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2011-01-05
Also published as: WO2009084841A2; CN103773780A; US8377676B2; US20110136207A1; KR20090071852A; CN101952423B; WO2009084841A3; CN103773780B; CN101952423A

Abstract

본 발명은 특정 서열을 갖는 배트록소빈(batroxobin)-코딩 뉴클레오타이드 서열 및/또는 변형된 α-인자 분비 시그널 서열, 이를 포함하는 벡터 및 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 배트록소빈-코딩 뉴클레오타이드 서열은 효모, 특히 피키아 패스토리스에서 발현 효율이 매우 우수하며, 천연(natural-occurring)의 배트록소빈-코딩 서열과 비교하여 4-13배 정도 증가된 수율로 재조합 배트록소빈을 얻을 수 있도록 한다. 본 발명의 배트록소빈-코딩 뉴클레오타이드 서열과 변형된 α-인자 분비 시그널 서열을 동시에 사용하여 융합 단백질 형태로 발현하면, 천연의 배트록소빈-코딩 서열과 비교하여 최대 20배 정도 증가된 수율로 재조합 배트록소빈을 얻을 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 서열을 이용하여 제조된 재조합 배트록소빈은 천연의 배트록소빈과 비교하여 활성이 우수하며, 안정성이 우수하다.

배트록소빈, 유전자, 효모, 피키아, 단백질, 발현, 제조, 수율

Description

배트록소빈의 변이 뉴클레오타이드 서열, α－인자 분비 시그널 서열 변이체 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법및 이를 이용한 배트록소빈의 제조방법{Mutated Nucleotide Sequences of Batroxobin, Mutated α－Factor Secretion Signal Sequence and Processes for Preparing Batroxobin Using the Same}

본 발명은 특정 서열을 갖는 배트록소빈(batroxobin)-코딩 뉴클레오타이드 서열 및/또는 변형된 α-인자 분비 시그널 서열, 이를 포함하는 벡터 및 형질전환체에 관한 것이다.

뱀독이 사람을 포함한 포유류의 혈액 응고계 및 혈전 용해계에 미치는 영향은 오래 전부터 많이 연구되어 왔으며, 다수의 유효 성분들이 분리되고 그 활성이 규명되었다. 뱀독을 구성하는 여러 가지 성분들은 피브린 응고(fibrin clotting) 또는 혈소판 응집 등에 직간접적으로 영향을 주어 응고 촉진제(pro-coagulant)로서 혹은 항응고제(anticoagulant)로서의 기능들을 가지고 있음이 알려져 있다(Meaume, J. Toxicon, 4:2558(1966); Matsui et al., Biochim . Biophys . Acta ., 1477: 146- 156(2000)). 이들 중 일부 성분들은 혈전증의 진단 및 치료에 광범위하게 사용되고 있다. 그 중 피브리노-펩타이드를 절단하여 피르리노겐을 피브린으로 전환시키는 트롬빈 유사 효소(thrombin-like enzyme)들이 현재까지 20여종 이상 보고 되었고 일부는 cDNA 서열까지 규명되었다.

트롬빈 유사 효소의 작용은 포유류 본래의 혈액 응고 단백질인 트롬빈과 달리 초기에는 피브리노겐 분자의 피브리노펩타이드 A를 가수분해하여 des-A-피브린이라는 불안정한 피브린 응괴(fibrin clot)를 형성하지만, 시간이 지나면서 이 불안정한 피브린 응괴는 생체내의 혈전용해계(fibrinolysis system)가 작동되면서 빠르게 분해되어 결과적으로 혈중의 피브리노겐 농도를 감소시킨다(Pirkle, H., and Stocker, K. Thromb . Haemost . 65:444-450(1991); Marsh, N.A., Blood Coagul. Fibrinolysis, 5:339-410(1994)).

실제 임상에서는 이러한 양면적인 효소 특성을 이용하여 지혈제로도 사용하기도하고 혈전의 예방 및 치료제로도 응용하고 있다. 또한, 이 효소는 혈액 내의 다른 응고 인자 등에는 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 혈소판의 활성화에도 영향을 미치지 않는 장점이 있어, 수술 1-2 시간 전에 소량(2 NIH unit/60 kg)을 근육 및 정맥 주사하면 효과적인 지혈 활성을 나타낸다. 반면에 효소의 투여량과 투여 시간을 조절함에 따라 혈중 내 피브리노겐 농도를 혈전 용해 효소를 사용할 때 생길 수 있는 출혈과 같은 부작용이 없이 낮출 수 있고, 이 과정에서 형성된 des-A-피브린과 FDP(fibrinogen degradation products)의 방출로 혈관 내피 세포를 자극하여 플라스미노겐 활성자의 생성을 유도하며, 트롬빈의 활성을 억제하여 혈전증의 예방 과 치료에도 사용되고 있다(Schumacher et al., Thromb . Res . 81:187-194(1996); 및 Bell W. R. Jr., Drugs, 54:18-30(1997)).

최근에는 이러한 트롬빈 유사 효소의 피브리노겐 감소 효과를 이용하여 헤파린 투여로 발생하는 헤파린 유도성 혈소판감소증(heparin-induced thrombocytopenia)이나 급성 허혈성 뇌졸증(acute ischemic stroke)의 치료(Dempfle et al. Blood, 96, 2793 2802, 2000)에도 효과적이라는 보고가 있다.

임상에 실제로 사용되고 있는 트롬빈 유사 효소들은 모두 뱀독에서 분리 정제한 천연형의 단백질들로서 중남미 독사인 Bothrops atrox moojeni의 독으로부터 분리한 배트록소빈은 이탈리아 Solco Basle Ltd. 사와 스위스 Pentapharm 사에서 판매하고 있으며, reptilase(지혈용), defibrase(혈전 용해용), reptilase-reagent (진단 시약용) 등의 상품명으로도 시판되고 있다. 또한 중남미 독사인 Bothrops jararaca의 독에서 정제한 botropase(지혈용, 이탈리아 Ravizza 사), Malayan pit viper와 Calloselasma rhodostoma의 독에서 분리한 ancrod(미국 Knoll Pharmacetical 사) 등도 판매되고 있다.

또한 최근에는 수술시의 출혈방지 및 봉합목적의 자가 피브린 접합제(autologous fibrin sealant)에 배트록소빈을 이용한 Vivostat System(덴마크, Vivosolution사) 등이 각광을 받고 있다.

이와 같이 뱀으로부터 정제 추출되는 배트록소빈은 대량생산의 한계로 많은 연구진들에 의해 재조합 단백질 생산방법이 연구되어 왔다. 대장균과 같은 미생물에서 진핵생물 유래의 단백질을 발현할 경우, 진핵생물 유래 유전자의 전사 후 번역과정 중에 원핵세포인 대장균의 번역효율이 낮은 유전자 코돈으로 인해 단백질 발현이 낮은 현상이 발생하는데, 이를 해결하기 위하여 대장균에서 낮은 빈도의 아미노산 코드를 인식할 수 있는 외래 진핵생물의 tRNA 유전자를 갖는 재조합 대장균 균주를 이용하여 단백질의 번역을 향상시키는 방법 등이 상용화 되어 있다. 그럼에도 불구하고 대장균에서 발현 시에 단백질의 리폴딩 과정에서 비활성의 단백질로 만들어지는 현상이 나타낸다(참조: Yang et al., Biotechnol . Lett ., 25:101-104(2003); Fanetal., Biochem . Mol . Biol . Int . 47:217-225(1999); Maeda et al., J. Biochem ., 109:632-637(1991)). 현재까지 보고된 바로는 대장균 발현 재조합 트롬빈 유사 효소를 재구성하여 천연형 효소의 비활성도와 견줄만한 활성을 갖도록 제조한 예는 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 재조합 배트록소빈을 효모, 특히 피키아(Pichia) 속의 효모에서 높은 수율로 얻을 수 있는 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 배트록소빈에 대한 cDNA 서열을 변헝시키거나 또는 변형된 α-인자 리더 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 경우에는 높은 효율로 활성의 재조합 배트록소빈을 수득할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 배트록소빈(batroxobin)-코딩 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 배트록소빈의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 α-인자 분비 시그널 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 배트록소빈(batroxobin)-코딩 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명자들은 재조합 배트록소빈을 효모, 특히 피키아(Pichia) 속의 효모에서 높은 수율로 얻을 수 있는 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 배트록소빈에 대한 cDNA 서열을 변헝시키거나 또는 변형된 α-인자 리더 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 경우에는 높은 효율로 활성의 재조합 배트록소빈을 수득할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 제시되는 서열목록 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열은 효모, 바람직하게는 피키아(Pichia) 속의 미생물, 가장 바람직하게는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 배트록소빈을 높은 효율로 발현시키기 위한 서열이다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 서열”은 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열, 가장 바람직하게는 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열이다.

하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 경우에는, 원래의 배트록소빈-코딩 서열과 비교하여 4-13배 정도 증가된 수율로 재조합 배트록소빈을 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 배트록소빈을 코딩하는 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 효모, 바람직하게는 피키아(Pichia) 속의 미생물, 보다 바람직하게는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)를 숙주로 한다.

본 발명의 벡터가 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모를 숙주 로 하는 경우, 알코올 옥시다아제 1(AOX1), 알코올 옥시다아제 2(AOX2), 3-포스포글라이서레이트 키나아제, 에놀라아제, 글라이서알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 헥소키나아제, 파이루베이트 디카르복실라아제, 포스포프럭토키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글라세레이트 뮤타아제 또는 파이루베이트 키나아제 유전자의 프로모터가 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 알코올 옥시다아제 1(AOX1) 유전자의 프로모터가 이용된다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 배트록소빈의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 분비 시그널 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 분비 시그널 펩타이드로서 α-인자 분비 시그널 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 가장 바람직하게는 서열목록 제11서열 의 변형된 α-인자 분비 시그널 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 도 12의 유전자 지도를 갖는 벡터이다. 바람직하게는, 도 12에서 ColE1, 즉 복제원점은 pBR322 유래의 복제원점이며, 선택표지는 대장균 앰피실린 항생제 내성 유전자와 효모 히스티틴 아미노산 생합성유전자(His4)이고, 효모 프로모터유전자는 알코올 옥시다아제 1(AOX1) 프로모터이다. 배트록소빈 유전자는 서열목록 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열이며, α-인자 분비 시그널 서열은 서열목록 제11서열의 변형된 α-인자 분비 시그널 서열이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 배트록소빈-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 효모 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 피키아 패스토리스, 피키아 메타놀리카, 한세눌라 폴리모르파, 사카로마이세스 세레비시애 및 씨조사카로마이세스 폼브 등이 이용될 수 있다.

가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 숙주세포는 피키아 패스토리스이다. 피키아 패스토리스는 메틸로트로픽 이스트의 일종으로서, 성장속도가 빠르로, 간단하면서도 저가의 배지에서 잘 성장되는 이점이 있고, 단백질의 대량 발현에 적합하다. AOX1 프로모터가 벡터에 포함된 경우에는 메탄올을 배지에 첨가함으로써 단백질의 발현을 강하게 유도할 수 있다. 또한, α-인자 분비 시그널 펩 타이드가 벡터에 포함된 경우에는 발현하고자 하는 배트록소빈이 배지로 분비되어 단백질 정제를 용이하게 한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)), 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 재조합 배트록소빈을 제공하는 단계를 포함하는 재조합 배트록소빈의 제조방법을 제공한다.

형질전환된 세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 미생물의 배양 및 발효의 상세한 내용은 Kubitschek, H. E., Introduction to Research with Continuous Cultures. Englewood Cliffs, N.J.:Prentice-Hall, Inc., 1970; Mandelstam, J., et al., Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed. Oxford:Blackwell, 1982; Meynell, G.G., et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed., Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 형질전환된 세포를 BMG(Buffered Minimal Glycerol) 액상 배지에 접종하여 배양을 실시한 다음, 세포밀도가 일정 수준에 도달한 시점에서 메탄올을 배지에 첨가하여 AOX1 프로모터에 의한 배트록소빈 단백질 발현을 유도하고 배양함으로써, 배지로 분비된 배트록소빈을 얻는다.

배지로 분비된 배트록소빈은 당업계에 공지된 다양한 정제방법에 따라 정제된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화 (solubility fractionation), 크기 분별 여과 (한외여과) 및 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 배트록소빈을 얻을 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제11서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 α-인자 분비 시그널 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

서열목록 제11서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 α-인자 분비 시그널 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열은 효모, 바람직하게는 피키아(Pichia) 속의 미생물, 가장 바람직하게는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 단백질을 높은 효율로 분비시키기 위한 서열이다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 서열”은 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 경우에는, 천연의 α-인자 분비 시그널 서열과 비교하여 2-3배 정도 증가된 수율로 재조합 단백질, 예컨대 배트록소빈을 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 변형된 α-인자 분비 시그널을 포함하는 벡터를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) α-인자 분비 시그널 서열, 및 (ⅱ) 상기 시그널 서열에 3’-쪽에 위치하는 발현하고자 하는 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으 며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터가 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모를 숙주로 하는 경우, 알코올 옥시다아제 1(AOX1), 알코올 옥시다아제 2(AOX2), 3-포스포글라이서레이트 키나아제, 에놀라아제, 글라이서알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 헥소키나아제, 파이루베이트 디카르복실라아제, 포스포프럭토키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글라세레이트 뮤타아제 또는 파이루베이트 키나아제 유전자의 프로모터가 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 알코올 옥시다아제 1(AOX1) 유전자의 프로모터가 이용된다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이 클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질은 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질은 배트록소빈이다.

본 발명의 벡터가 배트록소빈의 발현에 이용되는 경우, 바람직하게는 배트록소빈-코딩 서열로서 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열이 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열, 가장 바람직하게는 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열이 이용될 수 있다. 서열목록 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열은 효모, 바람직하게는 피키아(Pichia) 속의 미생물, 가장 바람직하게는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 배트록소빈을 높은 효율로 발현시키기 위한 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 도 12의 유전자 지도를 갖는 벡터이다. 바람직하게는, 도 12에서 ColE1, 즉 복제원점은 pBR322 유래의 복제원점이며, 선택표지는 대장균 암피실린 항생제 내성 유전자와 효모 히스티틴 아미노산 생합성유전자(His4)이고, 효모 프로모터유전자는 알코올 옥시다아제1(AOX1) 프로모터이다. 배트록소빈 유전자는 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열이며, α-인자 분비 시그널 서열은 서열목록 제11서열의 변형된 α-인자 분비 시그널 서열이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 숙주세포는 피키아 패스토리스이다. 피키아 패스토리스는 메틸로트로픽 이스트의 일종으로서, 성장속도가 빠르로, 간단하면서도 저가의 배지에서 잘 성장되는 이점이 있고, 단백질의 대량 발현에 적합하다. AOX1 프로모터가 벡터에 포함된 경우에는 메탄올을 배지에 첨가함으로써 단백질의 발현을 강하게 유도할 수 있다. 또한, α-인자 분비 시그널 펩타이드가 벡터에 포함된 경우에는 발현하고자 하는 단백질, 예컨대 배트록소빈이 배지로 분비되어 단백질 정제를 용이하게 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 재조합 단백질을 제공하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

예를 들어, 형질전환된 세포를 BMG(Buffered Minimal Glycerol) 액상 배지에 접종하여 배양을 실시한 다음, 세포밀도가 일정 수준에 도달한 시점에서 메탄올을 배지에 첨가하여 AOX1 프로모터에 의한 단백질 발현을 유도하고 배양함으로써, 배지로 분비된 단백질을 얻는다.

배지로 분비된 단백질은 당업계에 공지된 다양한 정제방법에 따라 정제된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화 (solubility fractionation), 크기 분별 여과 (한외여과) 및 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명의 배트록소빈-코딩 뉴클레오타이드 서열은 효모, 특히 피키아 패스토리스에서 발현 효율이 매우 우수하며, 천연(natural-occurring)의 배트록소빈-코딩 서열과 비교하여 4-13배 정도 증가된 수율로 재조합 배트록소빈을 얻을 수 있도록 한다.

(ⅱ) 본 발명의 변형된 α-인자 분비 시그널 서열은 약 2-3배 정도 증가된 수율로 재조합 배트록소빈을 얻을 수 있도록 한다.

(ⅲ) 따라서 본 발명의 배트록소빈-코딩 뉴클레오타이드 서열과 변형된 α-인자 분비 시그널 서열을 동시에 사용하여 융합 단백질 형태로 발현하면, 천연의 배트록소빈-코딩 서열과 비교하여 최대 20배 정도 증가된 수율로 재조합 배트록소빈을 얻을 수 있도록 한다.

(ⅳ) 본 발명의 서열을 이용하여 제조된 재조합 배트록소빈은 천연의 배트록소빈과 비교하여 활성이 우수하다.

(ⅴ) 본 발명의 서열을 이용하여 제조된 재조합 배트록소빈은 안정성이 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 뱀독 유래 천연형 배트록소빈 cDNA 유전자의 분석

본 발명자들에 의해 제작된 천연형 배트록소빈 유전자의 효모 발현용 벡터인 pPIC-rBat(참조: 특허출원 공개 제2007-4541호, 한국미생물보존센터 기탁번호 KCCM-10522)을 함유한 균주 GSrBAT으로부터 Bothrops atrox moojeni의 성숙형(mature form) 배트록소빈의 촉매 도메인(catalytic domain) 아미노산 제1번의 발린(valine: GTC) 코돈으로부터 제231번 프롤린(proline: CCG)에 해당하는 231개 의 아미노산을 코딩하는 696 bp와 부속 염기서열 20 bp를 포함하는 XhoI/KEX2-NotI 716 bp 절편을 전방향 프라이머 (A5')5'-ctcgagaaaagagtcattggaggtgatg-3' 및 역방향 프라이머(NotI) 5'-gcggccgctcatgggcaagtagcag-3'을 이용하여 PCR 반응으로 증폭하였다. PCR 증폭 과정의 온도 사이클은 다음과 같다: 변성 94℃ 1분 30초, 어닐링 52℃ 1분, 연장반응 72℃ 1분 30초의 반응, 30 사이클. PCR 생성물을 1% 아가로스에서 전기영동하여 확인하고, 716 bp의 DNA 절편을 정제하여 pGEMT-Easy 벡터(Promega. USA)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 클로닝된 천연형 배트록소빈의 유전자 서열은 서열목록 제1서열에 기재되어 있다.

천연형 배트록소빈 cDNA 서열을 근거로 mRNA의 구조와 Pichia 효모에서의 코돈활용도를 분석하였다. 분석결과, 천연형 배트록소빈 유전자 코돈중 Pichia 효모에 10% 미만의 낮은 번역효율을 갖는 코돈이 15개로서 전체서열의 6.4%를 차지하며 번역효율이 20% 미만인 코돈은 42개 18.1%를 차지하여 이들 20% 미만의 57개 아미노산 해당 코돈의 총비율은 24.6%이었다. 상세하게는, 10% 미만의 번역효율을 보이는 코돈은 알기닌(argine:CGG/CGC), 알라닌 (alanine:GCG), 루이신(leucine:CTC) 세린 (serine;AGC), 글라이신(glycine:GGG) 및 프롤린(proline:CCG)이었으며, 20% 미만의 코돈에는 알기닌(argine:CGT), 이소루이신(isoleucine;ATA), 발린(valine;GTA/GTG), 트레오닌(threonine:ACG ), 프롤린(proline:CCC), 글라이신(glycine:GGC), 루이신(leucine:TTA/CTG/CTT) 및 세린 (serine;AGT)이 포함되어 있었다. 또 발현 시 번역과정에서 mRNA의 가능한 헤어핀-루프 2차 구조를 예측할 수 있는 천연형 배트록소빈 유전자의 ΔG 값은 -128.3 kcal/mol 이었다.

실시예 2: 뱀독 유래 천연형 배트록소빈 cDNA 유전자의 단백질 번역 효율을 증대시키기 위한 유전자 변형

뱀독 유래 천연형 배트록소빈 cDNA 유전자의 단백질 번역 효율을 증대시키기 위하여 변이유발(mutagenesis)을 실시하였다.

실시예 1에서 확인한 천연형 배트록소빈 cDNA를 포함하는 716 bp의 유전자를 주형으로 하고, 전방향 프라이머(A5') 5-ctcgagaaaagagtcattggaggtgatg-3‘ 및 역방향 프라이머(A3') 5’-gtgaattctcataaatctcctgttacagtgtgc-3‘를 이용하여 N-말단 155 bp의 XhoI-EcoRI 절편과, 전방향 프라이머(B5') 5‘-gaattcacttgggtaaacatgccggaagtgtagca-3’ 및 역방향 프라이머(B3') 5’-gtaagcttcacgacacaccgtattat-3’를 이용하여 312 bp의 EcoRI-HindⅢ 절편을 PCR 증폭하였다. PCR 증폭 과정의 온도 사이클은 실시예 1과 동일하다. 이 과정에서 천연형의 5‘-CGCATACACCTT-3’서열이 코딩하는 아미노산, (Arg48), (Ile49) 및 (Leu51)의 염기서열이 Pichia 효모가 선호하는 코돈인 5‘-AGAATTCACTTG-3’로 치환되며, 동시에 EcoRI 제한효소 인식서열이 생성된다. 또한 배트록소빈 유전자를 155 bp의 XhoI-EcoRI 절편, 312 bp의 EcoRI-HindⅢ 절편 및 250 bp의 HindⅢ-NotI 절편으로 분리 할 수 있다. 이들 절편을 pGEMT-Easy 벡터(Promega. USA) 또는 pUC118HincII/BAP 벡터(Takara Bio Inc, JAPAN)에 클로닝하여 염기서열분석과 추가적인 염기서열 변이유발을 실시하였다. pGEMT-Easy 벡터에 클로닝된 155 bp의 XhoI-EcoRI 절편을 주형으로 하고, 전방향 프라이머(M1) 5’-actactctcctagatatttctgtggtatgactttga-3’과 역방향 프라이머 (M2) 5‘-cagaaatatctaggagagtagtacatgaatgc-3’를 이용한 변이유발 PCR 반응을 실시하여 Arg 23번의 코돈 cgg을 aga로 치환하였다. pGEMT-Easy 벡터에 클로닝된 312 bp의 EcoRI-HindⅢ 절편을 주형으로 하고, 전방향 프라이머(M3) 5’-caaagacaaaggagcgatgtgttcactgtttttgacag-3’와 역방향 프라이머(M4) 5’-acatcgctcctttgtctttgccttccaaccctcccagt-3’를 이용한 변이유발 PCR 반응을 실시하여 아미노산 Ala103 번 , Leu105번 및 Ser106 번의 코돈 “gcg”, “cct” “ctc” 및 “agc”를 각각 “gct”, “cct”, “ttg” 및 “tct”로 치환하였다.

마지막으로 C-말단부의 효모 코돈 효율이 낮은 HindⅢ-NotI의 250 bp 절편에서 변이를 유발시키기 위하여, 전방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드 링커 프라이머 세트를 합성하여 각 프라이머 조합을 동일 농도로 혼합하고 95℃ 5분 동안 변성시킨 후 상온까지 온도를 감소시켜 어닐링 시켰다. 프라이머 반응물을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(PNK) 효소(Takara Bio Inc, JAPAN)반응으로 인산화 처리 후 프라이머 세트 서열 순서로 T4 DNA 라이게이션 반응을 실시하였다. 이용된 프라이머 세트의 염기서열은 다음과 같다:

(C1F) 5’-agcttacaatggtttgccagctaaaacattgtgtgcaggtgtcttgcaa-3’, (C1R) 5’-ctccttgcaagacacctgcacacaatgttttagctggcaaaccattgta-3’;

(C2F) 5’-ggaggtattgatacatgtggtggtgactctggtggacctttgatctgta-3’, (C2R) 5’-ccattacagatcaaaggtccaccagagtcaccaccacatgtatcaatac-3’;

(C3F) 5’-atggacaattccagggtattttgtcttggggatctgatccttgtgccg-3’, (C3R) 5’-ggttcggcacaaggatcagatccccaagacaaaataccctggaattgt-3’;

(C4F) 5’-aaccaagaaagcctgccttctacaccaaggtctttgattatttgccttg-3’, (C4R) 5’-gatccaaggcaaataatcaaagaccttggtgtagaaggcaggctttctt-3’; 및

(DF) 5’-gatccagtctattattgcaggaaataaaactgctacttgcccatgagc-3‘ , (DR) 5’-ggccgctcatgggcaagtagcagttttatttcctgcaataatagactg-3’.

위의 라이게이션 반응물을 주형으로 하고, 전방향 프라이머(C5') 5’-aagcttacaatggtttgcca-3’와 역방향 프라이머(NotI) 5’-gcggccgctcatgggcaagtagcag-3’을 이용하여 PCR 반응을 실시하여, HindⅢ-NotI의 250 bp의 절편을 증폭하고 pUC118HincII/BAP 벡터의 HincII 부위에 클로닝 하였다. 이상의 반응을 통해 배트록소빈 C-말단의 Gly156, Pro158, Ala159, Leu167, Gly170, Asp171, Gly175, Gly179, Pro181, Leu182, Gly190, Leu192, Ser196, Pro198, Pro202, Arg203, Leu215, Pro216, Ser220, Ala228 및 Pro 231 아미노산을 코딩하는 염기서열이 전사 효율이 높은 코돈으로 치환되었고, 이를 염기서열 분석으로 확인하였다.

이상과 같이 재조합 배트록소빈 유전자를 5'-말단으로부터 XhoI-EcoRI 절편, EcoRI-HindⅢ 절편 및 HindⅢ-NotI 절편의 순서로 3개 절편을 만든 다음, 유전자 카세트를 제한효소 순서대로 클로닝한 배트록소빈 변형 유전자 BatMd(참조: 서열목록 제3서열)는 천연형 배트록소빈 유전자에서 10% 미만의 효율의 코돈을 모두 10% 이상의 코돈으로 치환한 변형 유전자로서 이를 기본으로 하여 추가의 유전자 코돈 변이체들을 제조하였다. BatMd 변이 서열을 기초로 하여 20% 미만의 효율을 나타내는 코돈까지 20% 이상으로 변형 시킨 BatMx(참조: 서열목록 제5서열)을 제조하였으며, 이론적으로 효모에서 가장 효율이 높은 코돈으로 모두 치환된 BatSMx(참조: 서열목록 제7서열) 최적의 코돈 염기서열을 구축하였다.

상기의 베트록소빈 변이 유전자들을 효모 발현 벡터 pPIC9(Invitrogen, Corp.)의 XhoI-NotI 부위에 클로닝하여 각각 pBatMd, pBatMx 및 pBatSMX를 구축하였다.

실시예 4: Pichia 단백질 분비 리더 펩타이드 번역 효율을 증대시키기 위한 유전자 변형 및 융합단백질 클로닝 벡터의 구축

재조합 단백질을 효모에서 발현시켜 세포배양액으로 분비시키는데 사용되는 효모의 분비 리더 펩타이드는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자 페로몬 단백질로부터 유래된 것이다. 현재 상업화되어 있는 효모발현벡터에 이용되고 있는 α-인자 분비 리더 펩타이드는 모두 사카로마이세스 세레비시에의 유전자 서열로 이루어져 있으며 특히 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)와 같은 이종의 효모의 발현벡터에도 사카로마이세스의 서열로 된 리더 서열(참조: 서열목록 제9서열)이 포함되어 있다. 이 리더 서열의 코돈 활용도를 피키아의 코돈으로 분석한 결과 85개 아미노산중 20% 이하의 코돈이 19개, 10% 이하 코돈이 7개로 확인되었다. 이를 근거로 피키아 패스토리스의 발현벡터인 pPIC9의 사카로마이세스-유래 분비신호 유전자 코돈을 대체하기 위한 피키아 패스 토리스 최적화된 분비신호 유전자 코돈을 합성하였으며(제노텍, 한국), 이를 SMF라 명명하였으며 그 염기서열은 서열목록 제11서열에 기재되어 있다. 이와 같은 합성된 분비신호 서열(SMF)의 C-말단에 원하는 재조합 단백질을 융합시킬 수 있도록 pUC118HincII/BAP(Takara Bio Inc., JAPAN)의 멀티클로닝 위치에 삽입하고 이를 pSMF라 명명하였다. 이는 기존에 상용화 되어 있는 천연형의 α-인자 리더 분비서열의 C-말단부의 클로닝부위로 이용되는 XhoI (CTC GAG) 서열이 코딩하는 Leu 코돈이 특히 전사효율이 낮은 코돈(ctc)인 것을 해소하기 위하여 Val80-Ser81-Leu82-Glu83에 염기서열인 GTA-TCT-CTC-GAG를 GTT-TCT-TTG-GAA로 바꾸면서 Batroxobin N-말단과 중첩이되는 C-말단 프라이머인 SMF -R 5' - TAACTCTTTTTTCCAAAGAAACACCTTCTTCCTTTGCTGC - 3'와 재조합 SMF 유전자 카세트의 N-말단에 BamHI 서열을 만들 수 있는 SMF -F : 5' ? GGATCCAAACGATGAGATTTCCAT - 3' 를 이용하여 SMF 유전자를 주형으로 PCR을 수행하였다. 다음 배트록소빈유전자들의 N-말단 코딩 염기서열들을 앞서 SMF의 C-말단에 변형된 코돈과 일치하는 중첩서열 (아미노산 서열: L E K R / V I G G D E 해당 )에 해당하는 프라이머들을 설계하였다. 배트록소빈 batMd 및 barMx의 N-말단 연장 프라이머 aMd / Mx : 5‘- CTTTGGAAAAAAGAGTCATTGGAGGTGATGAA -3’ 와 batSMx의 N-말단 연장 프라이머 aSMx2 : 5’- CTTTGGAAAAAAGAGTTATTGGTGGTGATGAA -3를, C-말단은 batMd 및 barMx의 경우는 프라이머 Md/Mx-R: 5’-GCGGCCGCTCATGGGCAAGT-3’batSMx의 경우는 SMx -R : 5' - GCGGCCGCTTATGGACAAGT -3'를 각각 이용하여 해당 배트록소빈 변이체르유전자를 주형으로 PCR 반응을 수행하였다. 이로서 얻어진 SMF 와 배트록소빈 유 전자의 PCR 산물들을 해당 조합에 따라 섞은 후 SMF 변형에 이용된 N-말단 프라이머들과 배트록소빈 변형에 이용된 C-말단 프라이머들을 각각 섞은 후 assembly PCR을 수행하고 이를 pTOP Blunt vector (엔지노믹스, 한국)에 클로닝하여 SMF유전자의 α-분비서열과 배트록소빈 유전자의 코돈이 최적화된 유전자 카세트인 SMFBatMd/ SMFBatMx /SMFSMx를 완성하였다, 이들 유전자를 BamHI-NotI 제한 효소 처리한 후 BamHI-NotI 절편 (970bp)을 회수하고 피키아 발현벡터 pPIC9에 서브클로닝하여 발현벡터들인 pSMFrbat, pSMFBatMd, pSMFBatMx 및 pSMFBatSMX을 구축하였다.

실시예 5: 배트록소빈 천연형 cDNA 과 변형 cDNA 들의 발현 비교

실시예 3 및 4에서 완성된 벡터를 피키아 패스토리스(GS115, Invitrogen) 균주에 엘렉트로포레이터(Electroporator, Bio-Rad Gene Pulser, U.S.A.)를 사용하여 1.5 kV의 전압조건 하에 형질전환을 수행한 다음, 히스티딘 결손 YNB( yeast nitrogen base) 고체배지에서 선별하였다. 이를 통해 얻어진 단일 콜로니를 BMG(Buffered Minimal Glycerol)액상 배지(100 mM 소듐 포스페이트 pH 6.0, 효모 질소 베이스 1.34％,바이오틴 4 x 10-5％, 글라이세롤 1％) 1 L에 접종한 다음, 30℃에서 진탕 배양을 실시한 다음, 세포밀도가 600 nm 에서 약 1.0 흡광도에 도달하는 시점에서 최종 0.1%의 메틸알코올을 약 24시간 간격으로 첨가하여 AOX1(Alcohol Oxidase 1) 프로모터에 의한 재조합 단백질 발현을 유도 배양하였다. 이어, 효모세포를 원심분리하고 배양액을 수확하였다. 효모배양액에 분비 발현된 배트록소빈 을 분석하기 위해 실시예 6과 같이 정제하고 각각 동일 배양체적에 해당하는 양을 SDS-폴리아크릴아마이드 단백질 전기영동을 실시한 후 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색을 하고 약 29-33 kDa 크기의 신생 단백질 밴드의 생성을 기준으로 발현 여부를 판단하였다(도 1a). 아울러 이 단백질 전기영동 젤에 배트록소빈 단백질에 대한 항체를 반응시켜 웨스턴 블롯을 실시함으로써 단백질의 발현 여부를 재확인 하였다(도 1b).

이와 같이 단백질의 발현을 수행하고 단백질 발현 양을 비교하였다. 도 1a 및 도 1b에서 레인 1은 천연형 cDNA를 갖는 대조군 pPIC-rBat, 레인 2는 변형 재조합 클론인 pBatMd, 레인 3은 pBatMx, 레인 4는 pBatSMx, 레인 M은 분자량 마커, 레인 5는 분비신호 SMF 치환된 천연형 rbat, 레인 6은 SMFbatMd, 레인 7은 SMFBatMx 및 레인 8은 SMFBatSMx를 각각 나타낸다. 도 1a 및 도 1b에서 볼 수 있듯이, 배트록소빈 단백질에 해당하는 약 33 kDa의 단백질 밴드가 천연형 유전자 (pPIC-rBat)보다 변형 재조합 클론들인 BatMd, BatMx 및 BatSMx에서 더 많이 발현되고 축적됨을 확인 하였다. 발현 양의 정도는 BatSMx, BatMx 및 BatMd 순이었다. 또한, 변형된 α-인자 리더 펩타이드를 이용한 경우 배양액에서 보다 많은 양의 배트록소빈이 나온다는 것을 알 수 있었다.

한편, 발현된 배트록소빈 단백질의 당쇄화(glycosylation)를 확인하기 위해 endo-H 효소(New England Biolab Inc. U.S.A)를 처리하여 탈당쇄화 반응을 시킴으로써 약 33 kDa의 밴드가 26 kDa으로 이동하여 배트록소빈 단백질임을 재확인하였다(도 2). 도 2에서, 레인 1은 천연형 rbat, 레인 2는 SMFBatMd, 레인 3은 SMFBatMx, 레인 4는 SMFBatSMx의 온전한(intact) 배트록소빈 밴드를 나타내며, 레인 5는 천연형 rbat, 레인 6는 SMFBatMd, 레인 7은 SMFBatMx 및 레인 8은 SMFBatSMx에 각각 endo-H 효소 반응시킨 것으로서, 밴드가 이동됨을 보여준다.

이상과 같이 배트록소빈 변형 cDNA인 BatMd, BatMx, BatSMx 및 분비신호치환체 SMF를 통해 천연형 유전자에 비하여 재조합 배트록소빈 단백질의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 6: 재조합 배트록소빈의 정제

실시예 5의 배트록소빈 발현벡터들로 형질전환된 효모 균주들의 메탄올 유도 배양물을 5000 x g에서 원심분리하여 배양액을 수득하고, 이를 2.5 M 암모늄 설페이트 용액으로 평형화시킨 페닐-세파로스(Phenyl-sepharose, GE Healthcare, USA)가 충진된 컬럼(1.3 x 20 cm)에 주입한 다음, 2.5-0 M의 암모늄 설페이트 용액농도 선형구배를 0.5 ml/min의 유속으로 용출시켜 재조합 배트록소빈 효소활성 분획을 수득하였다(도 3a), 이때, 재조합 배트록소빈 효소의 활성은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 이어, 수득한 활성분획을 모아서 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에서 8시간씩 3회에 걸쳐 투석한 다음, 동일 완충 용액으로 평형화된 헤파린 컬럼(heparin-Sepharose, 1 x 5 cm, GE Healthcare, USA)에 주입시키고, 1 M 염화나트륨을 포함하는 동일 완충용액을 이용하여 0 내지 1 M 까지 선형구배를 1 ml/min의 유속으로 단백질을 용출시켜서, 순수분리된 재조합 트롬빈 유사 효소를 수득하였다 (도 3b).

이때, 제조 수율은 배양액 1 L 당 천연형 배트록소빈 유전자에 의한 발현을 1로 기준하여, 코돈변이체인 BatMd가 약 4.5배, BatMx가 8.5배, 그리고 BatSMx가 약 13배임을 확인하였다. 또한 이들 배트록소빈 유전자들에 효모 최적화 분비신호인 SMF를 융합한 경우 천연형 유전자의 경우 3배, 코돈변이체인 BatMd가 12배, BatMx와 BatSMx는 약 20배 이상 발현 수율이 증가하였음을 확인하였다(도 4).

재조합 배트록소빈 효소의 아미노산 서열을 분석하기 위하여, 정제된 재조합 트롬빈 유사 효소를 환원조건 하에서 전기영동한 다음, 배트록소빈 단백질 밴드를 절단하고 트립신-인 젤 절단을 실시한 후 MALD I -TOF 분자량 분석기를 이용하여 분석한 결과, N-말단 아미노산의 서열 VIGGDECDIN~의 서열과 배트록소빈의 내부 아미노산서열이 확인되어 발현된 단백질이 재조합 배트록소빈 효소인 것을 재확인하였다( 도 5).

실시예 7: 재조합 배트록소빈 효소와 천연형 배트록소 효소 활성 비교

재조합 배트록소빈과 천연형 배트록소빈 효소의 활성을 비교하기 위하여 합성 발색 기질들(chromogenic substrate; Chromogenix, Instrumentation Laboratory, Spain / Sigma, USA)의 분해 활성을 측정하였으며 사람 혈장의 응고 시간의 변화를 시료 농도별로 ACL 자동 혈액 응고 검사 장비(Instrumentation Laboratory, Spain)를 이용하여 관찰하였다. 재조합 트롬빈 유사 효소와 천연형 트롬빈 유사 효소를 동일한 양으로 동일한 합성 발색 기질과 반응하여 합성 발색 기질의 분해를 405 nm에서의 흡광도 변화로 측정하였다. 이때 적용한 발색기질의 종류로는 S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA),S2222(Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA), S2288(H-D-Ile-Pro-Arg-pNA),S2266(H-D-Val-Leu-Arg-pNA) S2302(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA),T1637(N-P-Tonsyl-Gly-Pro-Arg-pNA) V2628(DL-Val-Leu-Arg-pNA), B7632(N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-pNA)을 이용하였다. 여러 가지 합성 발색 기질에 대한 트롬빈 유사 효소의 분해 활성은 재조합 단백질이나 천연형 단백질 모두 유사한 양상을 보여주고 있으며, 재조합 배트록소빈 효소의 비활성도가 다소 높은 것을 확인할 수 있었다(도 6a). 도 6a에서, 재조합 단백질은 유전자 수준에서 변이가 이루어지지 않은 배트록소빈 유전자를 피키아 패스토리스에서 발현시켜 얻은 단백질을 나타낸다. 천연형 배트록소빈은 뱀독으로부터 정제된 배트록소빈 효소(Pentapharm Ltd, Swiss)를 나타낸다.

배트록소빈 효소의 실제 혈액 내 지혈 활성을 알아보기 위하여, 사람 혈액으로부터 혈장을 분리한 후, 재조합 배트록소빈 효소와 천연형 배트록소빈 효소를 동일한 양의 농도 구간별로 첨가한 다음, ACL 자동 혈액 응고검사 장비를 이용하여 PT(prothrombin time)를 측정하였다. 실험 결과, 배트록소빈 효소의 첨가 농도에 따라 응고 시간이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 비활성도는 합성 발색 기질을 이용한 활성 측정시와 유사하게 재조합 배트록소빈 효소가 천연형에 비해 다소 우수한 것으로 나타났다(도 6b).

실시예 8: 재조합 배트록소빈 효소의 fibrin 응고 활성

재조합 배트록소빈 효소에 의한 피브린 응고 활성을 인 비트로 실험과 역상 자이모그라피(reverse zymography) 실험을 이용하여 측정하여 천연형 배트록소빈 효소와 비교하였다. 도 7에서 보듯이 재조합 배트록소빈 효소를 0.5％ 사람 피브리노겐 용액에 넣어 반응시키면 불용성의 피브린 응괴가 생성되어 수용성의 염색약과의 혼합이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 도 8a의 역상 자이모그라피에서도 0.5％ 피브리노겐-아가 평판에서 불용성의 피브린 응괴가 재조합 배트록소빈 효소의 단백질 위치에서 형성되는 것을 관찰하였다. 이때 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯에서 보이지 않았던 마이너 활성 밴드를 확인하였으며 이를 endo-H 효소 처리한 후 자이모그래피를 실시한 결과 이 밴드 역시 효모에서 당쇄화가 일부만 이루어진 미량의 배트록소빈임을 확인하였다(도 8b).

실시예 9: 재조합 배트록소빈 효소의 동물 실험 모델에서의 출혈시간 및 전혈 응고 시간 감소 활성

재조합 배트록소빈 효소의 임상 적용 가능성을 알아보기 위하여 래트를 이용한 동물 실험 모델에서의 출혈 시간 감소 활성을 천연형 배트록소빈 효소와 비교하였다. 태어난 지 8주 정도 되는 래트(대한바이오링크, 한국)를 가지고 실제 임상에 사용하는 정도의 시료를(1 NIH unit/kg) 꼬리 정맥에 약 1 ml 주사한 다음 1시간 30분 경과 후에 래트의 꼬리 5 mm 되는 부분을 절단하여 PBS 완충 용액 상에서 출혈이 멈추는 시간(bleeding time)을 측정하였으며, 대조군으로는 PBS 완충 용액만을 주사한 동물을 사용하였고 각 군별로 5마리의 실험 동물을 사용해서 수행하였다. 도 9a에서 보듯이, 재조합 배트록소빈 효소 또는 천연형 배트록소빈 효소를 주사한 동물들의 출혈 시간이 대조군에 비해 짧은 것을 확인할 수 있었으며 이는 배트록소빈 효소의 지혈 활성에 의한 결과로 판단되고, 재조합 배트록소빈효소의 지혈 효과가 조금 더 우수한 것을 알 수 있었다.

또한, 시료 처리에 의한 전혈 응고 시간의 감소 효능도 동물 실험 모델을 통하여 측정하였다. 재조합 배트록소빈 효소와 천연형 배트록소빈 효소를 2 NIH unit/kg의 양으로 래트의 꼬리 정맥에 주사한 다음, 1시간, 4시간의 시간 경과 후, 실험동물로부터 전혈을 채혈하여 전혈 응고 시간을 측정하였으며 대조군으로는 PBS 완충 용액을 주사한 동물의 혈액을 사용하였고 각 군당 5마리의 동물을 사용해서 수행하였다. 전혈 응고 시간은 1.5 ml 튜브(eppendorf tube)에 채혈한 혈액 0.5 ml을 10 mM CaCl₂과 같이 혼합한 다음, 45^o의 경사와 2 rpm/min의 속도로 흔들어 주면서 혈액이 응고되는 시간을 측정하였다. 전혈 응고 시간도 출혈 시간 측정 실험 결과와 유사하게 배트록소빈 효소들을 처리한 혈액들의 응고 시간이 대조군에 비해 감소되었으며, 재조합 배트록소빈 효소의 활성이 천연형 배트록소빈 효소에 비해 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 9b).

실시예 10: 재조합 배트록소빈 효소에 의한 동물 실험 모델에서의 PT , APTT 및 TT 변화 측정

상기한 바와 같이, 재조합 배트록소빈 효소는 천연형 배트록소빈 효소처럼 불용성의 피브린 응괴를 형성하는 지혈 활성을 가지고 있음을 몇 가지 실험 등을 통하여 증명하였다. 따라서 이러한 재조합 배트록소빈 효소의 활성에 의해 혈액내의 다른 여러 가지 혈액 응고 인자들에 대해 영향을 미치는 지의 여부를 확인하기 위해 동물 실험 모델을 이용하여 혈액의 PT(prothrombin time), APTT(activated partial thromboplastin time) 및 TT(thrombin time)의 변화를 측정하였다. 재조합 배트록소빈 효소와 천연형 배트록소빈 효소를 0.1 NIH unit/kg의 농도로 래트의 꼬리 정맥에 주사한 다음 2시간 후, 혈액을 채혈하여 혈장을 분리하고 분리된 각 혈장에 대해서 ACL 자동 혈액 응고 장비를 이용하여 PT(도 10a), APTT(도 10b) 및 TT(도 10c)의 변화를 측정하였다. 이들 변화는 인 비보에서의 포유류 혈액 응고계의 여러 응고 인자들에 대한 변화를 간접적으로 측정할 수 있는 분석 방법이다. 한편 대조군은 PBS 완충 용액을 주사한 동물의 혈장이었으며 각 군당 5마리의 동물을 사용하여 수행하였다. 모든 측정 항목의 경향이 비슷한 결과를 보여주었는데, 시료를 주사한 동물의 혈장들이 각 항목에서 약간의 증가를 나타내고 있으나 유효 범위내의 수치로 큰 변화는 보여주지 못하였다. 이러한 실험 결과를 토대로, 재조합 트롬빈유사 효소는 지혈 효소로서 가지고 있는 활성에 비하여 혈액내의 여러 가지 다른 혈액 응고 인자들에 대한 영향이나 변화를 크게 주지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 11: 재조합 배트록소빈 효소와 천연형 배트록소빈 효소의 안정성 측정

상기 여러 가지 활성 비교 실험에서 나타난 결과, 재조합 배트록소빈 효소의 활성이 천연형에 비해 더 우수한 것으로 보여지며, 이는 단백질의 안정성과 상당 부분 관련이 있을 것이라 예상하고 재조합 배트록소빈 효소와 천연형 배트록소빈 효소의 안정성을 여러 가지 pH 조건에서 단백질의 활성 유지를 측정함으로써 비교 분석하였다. 도 11의 실험 결과와 같이, 재조합 배트록소빈 효소의 안정성이 각각의 조건에서 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과는 최종 분리 정제된 단백질의 순도와 밀접한 관계가 있을 것으로 판단된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a는 배트록소빈 천연형 cDNA 및 본 발명의 변형된 cDNA의 발현 정도를 비교한 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyarcylamide gel electrophoresis) 결과이다. 도 1b는 배트록소빈 천연형 cDNA 및 본 발명의 변형된 cDNA의 발현 정도를 비교한 웨스턴 블롯팅 결과이다. 도 1a 및 도 1b에서 레인 1은 천연형 cDNA를 갖는 대조군 pPIC-rBat, 레인 2는 변형 재조합 클론인 pBatMd, 레인 3은 pBatMx, 레인 4는 pBatSMx, 레인 M은 분자량 마커, 레인 5는 분비신호 SMF 치환된 천연형 rbat, 레인 6은 SMFbatMd, 레인 7은 SMFBatMx 및 레인 8은 SMFBatSMx를 각각 나타낸다.

도 2는 발현된 배트록소빈 단백질의 당쇄화(glycosylation)를 확인하기 위하여 en d o-H 효소를 처리한 이후의 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyarcylamide gel electrophoresis) 결과이다. 레인 1은 천연형 rbat, 레인 2는 SMFBatMd, 레인 3은 SMFBatMx, 레인 4는 SMFBatSMx의 온전한(intact) 배트록소빈 밴드를 나타내며, 레인 5는 천연형 rbat, 레인 6는 SMFBatMd, 레인 7은 SMFBatMx 및 레인 8은 SMFBatSMx에 해당된다.

도 3a-3b는 재조합 배트록소빈의 정제를 보여주는 크로마토그램으로서, 도 3a은 페닐-세파로스에 대한 크로마토그램, 도 3b는 헤파린-세파로스에 대한 크로마토그램이다. 재조합 배트록소빈은 SMFBatSMx 유전자를 이용하여 제조된 것이다. 화살표는 재조합 배트록소빈이 가장 많은 분획을 나타낸다.

도 4는 여러 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 제조된 재조합 배트록소빈의 제조 수율을 비교한 그래프이다.

도 5는 SMFBatSMx 유전자를 이용하여 제조된 재조합 배트록소빈에 대한 MALDI-TOF 분석 결과이다.

도 6a-6b는 천연형 배트록소빈 및 재조합 배트록소빈에 대한 혈액 응고 분석 결과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 여러 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 제조된 재조합 배트록소빈의 피브린 응고 활성을 보여주는 사진이다.

도 8a-8b는 여러 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 제조된 재조합 배트록소빈의 피브린 응고 활성을 보여주는 역상 자이모그라피(reverse zymography) 실험 결과이다.

도 9a-9b는 재조합 배트록소빈의 동물 실험 모델에서의 출혈시간(도 9a) 및 전혈 응고 시간(도 9b) 감소 활성을 보여주는 그래프이다.

도 10a-10c는 재조합 배트록소빈의 PT(prothrombin time, 도 10a), APTT(activated partial thromboplastin time, 도 10b) 및 TT(thrombin time, 도 10c)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

도 11은 재조합 배트록소빈의 pH 안정성을 보여주는 그래프이다.

도 12는 본 발명에서 사용되는 벡터의 일 구현 예를 나타내는 유전자 지도이다. 5’AOX1, 5’AOX1 유전자의 프로모터; 3’AOX1, 3’AOX1 유전자의 프로모터; Amplicillin, 암피실린 내성 유전자; His4, HIS4 유전자의 오픈리딩프레임; MF-α, α-인자 분비 시그널 서열; ColE1, pBR322 유래의 복제원점; Batroxobin, 배트록소 빈 유전자.

<110> Biobud, Inc. <120> Mutated Nucleotide Sequences of Batroxobin, Mutated alpha Factor Secretion Signal Sequence and Processes for Preparing Batroxobin Using the Same <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 696 <212> DNA <213> snake <220> <221> CDS <222> (1)..(693) <400> 1 gtc att gga ggt gat gaa tgt gac ata aat gaa cat cct ttc ctt gca 48 Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 1 5 10 15 ttc atg tac tac tct ccc cgg tat ttc tgt ggt atg act ttg atc aac 96 Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 20 25 30 cag gaa tgg gtg ctg acc gct gca cac tgt aac agg aga ttt atg cgc 144 Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 35 40 45 ata cac ctt ggt aaa cat gcc gga agt gta gca aat tat gat gag gtg 192 Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 50 55 60 gta aga tac cca aag gag aag ttc att tgt ccc aat aag aaa aaa aat 240 Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 65 70 75 80 gtc ata acg 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Leu 180 185 190 tct tgg ggt tct gat cca tgt gca gaa cca aga aag cca gca ttt tac 624 Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 195 200 205 act aag gtt ttt gat tac ttg cca tgg att caa tct att att gca ggt 672 Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 210 215 220 aat aag act gca act tgt cca taa 696 Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 225 230 <210> 8 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 1 5 10 15 Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 20 25 30 Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 35 40 45 Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 50 55 60 Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 65 70 75 80 Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val 85 90 95 Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro 100 105 110 Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr 115 120 125 Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu 130 135 140 Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys 145 150 155 160 Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly 165 170 175 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu 180 185 190 Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 195 200 205 Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 210 215 220 Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 225 230 <210> 9 <211> 255 <212> DNA <213> yeast <220> <221> CDS <222> (1)..(255) <400> 9 atg aga ttt cct tca att ttt act gca gtt tta ttc gca gca tcc tcc 48 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 gca tta gct gct cca gtc aac act aca aca gaa gat gaa acg gca caa 96 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 att ccg gct gaa gct gtc atc ggt tac tca gat tta gaa ggg gat ttc 144 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 gat gtt gct gtt ttg cca ttt tcc aac agc aca aat aac ggg tta ttg 192 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 ttt ata aat act act att gcc agc att gct gct aaa gaa gaa ggg gta 240 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 tct ctc gag aaa aga 255 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 10 <211> 85 <212> PRT <213> yeast <400> 10 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 11 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMF <220> <221> CDS <222> (1)..(255) <400> 11 atg aga ttt cca tct att ttt act gca gtt ttg ttt gca gca tct tct 48 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 gca ttg gca gca cca gtt aac act act act gaa gat gaa act gca caa 96 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 att cca gca gaa gca gtt att ggt tac tct gat ttg gaa ggt gat ttt 144 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 gat gtt gct gtt ttg cca ttt tct aac tct act aat aac ggt ttg ttg 192 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 ttt att aat act act att gca tct att gca gca aag gaa gaa ggt gtt 240 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 tct ttg gaa aaa aga 255 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 12 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 13 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning cassette for SMF <400> 13 ggatccaaac gatgagattt ccatctattt ttactgcagt tttgtttgca gcatcttctg 60 cattggcagc accagttaac actactactg aagatgaaac tgcacaaatt ccagcagaag 120 cagttattgg ttactctgat ttggaaggtg attttgatgt tgctgttttg ccattttcta 180 actctactaa taacggtttg ttgtttatta atactactat tgcatctatt gcagcaaagg 240 aagaaggtgt ttctttggaa aaaagagcgg ccgc 274

Claims

서열목록 제3서열, 제5서열 또는 제7서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 배트록소빈(batroxobin)-코딩 뉴클레오타이드 서열.
상기 제 1 항의 뉴클레오타이드 서열 및 서열목록 제11서열의 α-인자 분비 시그널 펩타이드-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
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상기 제 2 항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
다음의 단계를 포함하는 재조합 배트록소빈의 제조방법:

(a) 상기 제 2 항의 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 재조합 배트록소빈을 제공하는 단계.
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