CN103773780A - 巴曲酶的突变核苷酸序列、突变的α因子分泌信号序列和使用其制备巴曲酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及编码巴曲酶的核苷酸序列和/或突变的α因子分泌信号序列、以及使用其的载体和转化体。本发明的编码巴曲酶的核苷酸序列在酵母特别是巴斯德毕赤酵母中显示出极佳的表达效率,并且重组巴曲酶以比天然存在的编码巴曲酶的序列高4-13倍的产率获得。与天然存在的编码巴曲酶的序列相比较,使用本发明的编码巴曲酶的核苷酸序列以及突变的α因子分泌信号肽序列的蛋白质表达系统以高约20倍的产率获得重组巴曲酶。此外,与天然存在的巴曲酶相比较,使用本发明的序列制备的重组巴曲酶具有显著可靠的活性和稳定性。
Description
本申请是申请日为2008年12月23日、申请号为200880126598.1、发明名称为“巴曲酶的突变核苷酸序列、突变的α因子分泌信号序列和使用其制备巴曲酶的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
发明领域
本发明涉及编码巴曲酶的核苷酸序列和/或包含特定序列的突变的α因子分泌信号序列、以及使用其的载体和转化体。
技术背景
一般地,毒液对哺乳动物包括人的凝血级联和溶解纤维蛋白途径的作用已研究了很长时间,并且已分离且表征了数种有效试剂。已知在毒液中包括的各种组分直接或间接影响纤维蛋白凝固、血小板聚集等等,因此被用作促凝血剂或抗凝血剂(Meaume,J.Toxicon,4:2558(1966);Matsui等人,Biochim.Biophys.Acta.,1477:146-156(2000))。某些组分已得到表征且广泛用于血栓形成的诊断和治疗。特别地,已积极进行关于通过切割纤维蛋白肽使纤维蛋白原转变成纤维蛋白的凝血酶样酶的研究,已报告了超过20种蛋白质,并且已表征了某些的cDNA。
凝血酶样酶最初水解纤维蛋白原分子的纤维蛋白肽A,以形成不像凝血酶(哺乳动物天然血液凝固蛋白质)的不稳定的纤维蛋白凝块(des-A-纤维蛋白),但这种不稳定的纤维蛋白凝块通过体内纤维蛋白溶解系统随着时间被快速降解,以最终降低血液纤维蛋白原水平(Pirkle,H.和Stocker,K.Thromb.Haemost,65:444-450(1991);Marsh,N.A.,Blood Coagul.Fibrinolysis,5:339-410(1994))。
因此,通过使用酶的这些两面特征,凝血酶样酶在临床领域中被用作止血剂或血栓形成的治疗和预防试剂。这种酶对其他凝血因子和血小板激活没有影响,由于这个优点,在手术前1-2小时静脉内或肌内注射少量酶(2NIH单位/60kg)显示有效的止血活性。另一方面,通过控制酶的剂量和施用时间,可以降低血液纤维蛋白原水平而不引起在使用血栓溶解酶时可能发生的副作用,例如出血。在上述过程期间形成的des-A-纤维蛋白和FDP(纤维蛋白原降解产物)的释放刺激血液内皮细胞,以诱导纤溶酶原激活物产生。该酶被用作血栓形成的治疗和预防试剂,因为该酶可以抑制凝血酶活性(Schumacher等人,Thromb.Res.,81:187-194(1996);和Bell W,R.Jr.,Drugs,54:18-30(1997))。
近来,据报告凝血酶样酶的这种纤维蛋白原减少效应对治疗肝素诱发的血小板减少症或由肝素施用造成的急性缺血性中风有效(Dempfle等人,Blood,96:2793-2802(2000))。
临床上使用的所有凝血酶样酶都是从毒液中分离并纯化的天然蛋白质。从Latin毒蛇迈阿密矛头蝮蛇(Bothrops atrox moojeni)的毒液中分离的巴曲酶可以从Italian Solco Basle Ltd.Company和Swiss Pentapharm Company通过商购获得,并且作为商品名如立止血(reptilase,用于止血)、去纤酶(用于溶栓)、立止血试剂(用于诊断试剂)销售。从Latin毒蛇美洲矛头蝮蛇(Bothrops jararaca)的毒液中分离的巴曲酶(用于止血,Italian Ravizza Company),以及从马来红口蝮蛇(Calloselasma rhodostoma)的毒液中分离的Malayan pit viper和Ancrod(American Knoll PharmaceuticalCompany)也是可以通过商购获得的。
近来,使用巴曲酶作为自体纤维蛋白粘合剂用于手术操作中的出血预防和缝合的Vivostat System(Denmark,Vivosolution Co.)也是引人注目的。
同样地,产生重组蛋白质的方法已由众多研究者进行了深入研究,因为大量生产从蛇中纯化的巴曲酶是有限的。在微生物中表达来自真核生物的蛋白质的研究中,由于在真核基因转录后的翻译中具有大肠杆菌(原核生物)的低翻译效率的基因密码子,蛋白质表达减少。为了克服这一点,通常通过使用重组大肠杆菌菌株进行改善蛋白质翻译的方法,其中将外源真核tRNA基因转化到所述大肠杆菌菌株内,以识别在大肠杆菌中具有低频率的氨基酸密码子。尽管存在这些努力,但在大肠杆菌中表达的蛋白质的重折叠过程中产生无活性蛋白质(Yang等人,Biotechnol.Lett.,25:101-104(2003);Fanetal.,Biochem.Mol.Biol.Int.,47:217-225(1999);Maeda等人,J.Biochem.,109:632-637(1991))。如迄今为止报告的,仍未报告其中重组凝血酶样酶在大肠杆菌中表达且随后具有与天然酶的比活性相比较而言相似活性的任何成功案例。
本申请全文中提及了各种出版物和专利,并且在括号中提供了引证。这些出版物和专利整体的公开内容在此通过引用合并入本申请,以便充分描述本发明和本发明所属领域的技术水平。
发明详述
本发明人已进行深入研究,以开发在酵母特别是毕赤酵母属(Pichia)中高产率的重组巴曲酶的表达系统。作为结果,我们已发现通过使用突变的巴曲酶cDNA或突变的编码α因子前导肽的核苷酸序列,可以以较高产率收集生物学上有活性的重组巴曲酶。
因此,本发明的一个目的是提供编码巴曲酶的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供包含所述核苷酸序列的载体。
本发明的另外一个目的是提供由该载体转化的转化体。
本发明的进一步目的是提供重组巴曲酶的制备方法。
本发明的再进一步目的是提供编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供包含所述核苷酸序列的载体。
本发明的另外一个目的是提供由该载体转化的转化体。
本发明的进一步目的是提供重组巴曲酶的制备方法。
根据下述详述连同随附的权利要求和附图,本发明的其他目的和优点将是显而易见的。
在本发明的一个方面,提供了编码巴曲酶的核苷酸序列,其中包含SEQ ID NO:3、NO:5或NO:7的核苷酸序列。
本发明人已进行深入研究,以开发在酵母特别是毕赤酵母属中高产率的重组巴曲酶的表达系统。作为结果,我们已发现通过使用突变的巴曲酶cDNA或突变的编码α因子前导肽的核苷酸序列可以以较高产率收集生物学上有活性的重组巴曲酶。
本发明中代表的SEQ ID NO:3、NO:5或NO:7的核苷酸序列包括这些核苷酸序列,以在酵母中,优选在毕赤酵母属中有关的微生物中,并且最优选在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中,以高产率表达巴曲酶。
术语“核苷酸序列”在本文中用于指具有经修饰的糖或碱基的类似物以及天然核苷酸(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980);Uhlman和Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
根据一个优选实施方案,本发明的核苷酸序列是SEQ ID NO:5或NO:7,且最优选是SEQ ID NO:7。
如下文实施例中举例说明的,与天然存在的编码巴曲酶的序列相比较,通过使用本发明的核苷酸序列,以4-13倍产率获得重组巴曲酶。
在本发明的另一个方面,提供了包含上述编码巴曲酶的核苷酸序列的载体。
本发明的载体系统可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行构建,所述方法公开于Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中,所述参考文献通过引用合并入本文。
一般地,本发明的载体可以构建为克隆或表达载体。本发明的载体利用酵母,优选毕赤酵母属中有关的微生物,并且更优选巴斯德毕赤酵母,作为宿主。
使用酵母如巴斯德毕赤酵母作为宿主,本发明的载体利用基因的启动子,所述基因例如醇氧化酶1(AOX1)、醇氧化酶2(AOX2)、3-磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶或丙酮酸激酶,并且最优选醇氧化酶1(AOX1)的启动子。
为了以简单方式纯化由本发明的载体表达的巴曲酶,其他序列可以与之融合。例如,融合序列包括谷胱甘肽-S-转移酶(Pharmacia,USA)、麦芽糖结合蛋白质(NEB,USA)、FLAG(IBI,USA)和6xHis(六组氨酸;Quiagen,USA)等等。由于存在用于纯化的添加序列,所以可以通过亲和色谱法以高通量和简单方式纯化宿主中表达的蛋白质。
另一方面,本发明的表达载体包括本领域普通技术人员已知的抗生素抗性基因作为选择标记,例如针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素和四环素的抗性基因。
根据一个优选实施方案,本发明的载体包括编码分泌信号肽的核苷酸序列。更优选地,本发明的载体包括编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列作为分泌信号肽,且最优选是由SEQ ID NO:11突变的编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列。
根据一个优选实施方案,本发明的载体是具有图19的基因图的载体。优选地,ColE1代表图19中pBR322衍生的复制起点,并且大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酵母的组氨酸氨基酸生物合成基因(His4)用作选择标记,启动子基因衍生自酵母的醇氧化酶1(AOX1)。巴曲酶基因包括SEQ ID NO:3、NO:5或NO:7的核苷酸序列,并且α因子分泌信号序列包括由SEQ ID NO:11突变的α因子分泌信号肽序列。
在本发明的另外一个方面,提供了被包含编码巴曲酶的核苷酸序列的载体转化的转化体。
本发明的载体在其中稳定且相继地克隆且表达的宿主细胞也利用本领域技术人员已知的酵母细胞中的任何一种,例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
最优选地,在本发明中使用的宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母是一类甲醇酵母,并且具有几个优点:(i)以低成本在培养基中快速和方便的生长,(ii)蛋白质的大量表达。在包含AOX1启动子的载体中,通过向培养基中加入甲醇可强烈诱导蛋白质表达。在包含α因子分泌信号肽的载体中,通过所需巴曲酶分泌到培养基内可容易地进行蛋白质纯化。
将本发明的载体递送到宿主细胞内的系统包括CaCl2方法(Cohen,S.N.等人,Proc.Natl.Acac.Sci USA,9:2110-2114(1973))、Hanahan方法(Cohen,S.N.等人,Proc.Natl.Acac.Sci USA,9:2110-2114(1973);和Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))、显微注射(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980))、磷酸钙沉淀(Graham,F.L.等人,Virology,52:456(1973))、电穿孔(Neumann,E.,等人,EMBO J.,1:841(1982))、脂质体介导的转染(Wong,T.K.等人,Gene,10:87(1980))、DEAE-葡聚糖处理(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985))和基因轰击(Yang等人,Proc.Natl.Acad.Sci,87:9568-9572(1990))。
在本发明的另外一个方面,提供了重组巴曲酶的制备方法,其包括步骤:(a)使用本发明的载体转化宿主细胞;和(b)培养经转化的细胞以提供重组巴曲酶。
经转化的细胞的培养可以通过本领域技术人员已知的各种方法来进行。微生物培养和发酵的详细描述公开于Kubitschek,H.E.,Introduction to Research with Continuous Cultures.EnglewoodCliffs,NJ.:Prentice-Hall,Inc.,1970;Mandelstam,J.,等人,Biochemistry of Bacterial Growth,第3版Oxford:Blackwell,1982;Meynell,G.G.,等人,Theory and Practice in ExperimentalBacteriology,第2版Cambridge:Cambridge University Press,1970;和Gerhardt,P.,编辑,Manual of Methods for GeneralBacteriology,Washington:Am.Soc.Microbiol,1981中,所述参考文献通过引用合并入本文。
例如,经转化的细胞通过接种在BMG(缓冲的小量甘油)液体培养基中进行培养,并且当细胞密度达到预定点时,通过向培养基中加入甲醇诱导通过AOX1启动子的巴曲酶蛋白质表达,获得分泌到培养基内的巴曲酶。
根据本领域技术人员已知的各种纯化方法以纯化形式收集分泌到培养基内的巴曲酶。例如,使用纯化方法例如使用硫酸铵的溶解度分级、大小分级过滤(超滤)和各种色谱法(使用大小、电荷、疏水性或亲和力的分离),获得纯化形式的巴曲酶。
在本发明的一个方面,提供了由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成的编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列。
由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成的编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列包括所述核苷酸序列,以在酵母中,优选在毕赤酵母属中有关的微生物中,并且最优选在巴斯德毕赤酵母中,以高产率比表达蛋白质。
术语“核苷酸序列”在本文中用于指具有经修饰的糖或碱基的类似物以及天然核苷酸(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980);Uhlman和Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
如下文实施例中举例说明的,与用天然的编码α因子分泌信号肽的序列相比较,通过使用本发明的核苷酸序列,以高约2-3倍的产量获得到重组蛋白质(例如巴曲酶)。
在本发明的另一个方面,提供了包括核苷酸序列的载体,所述核苷酸序列包含突变的α因子分泌信号。
本发明的载体系统可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行构建,所述方法公开于Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中,所述参考文献通过引用合并入本文。
一般地,本发明的载体可以构建为克隆或表达载体。本发明的载体利用酵母,优选毕赤酵母属中有关的微生物,并且更优选巴斯德毕赤酵母,作为宿主。
使用酵母如巴斯德毕赤酵母作为宿主,本发明的载体利用基因的启动子,所述基因例如醇氧化酶1(AOX1)、醇氧化酶2(AOX2)、3-磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶或丙酮酸激酶,并且最优选醇氧化酶1(AOX1)基因的启动子。
为了以简单方式纯化由本发明的载体表达的蛋白质,其他序列可以与之融合。例如,融合序列包括谷胱甘肽-S-转移酶(Pharmacia,USA)、麦芽糖结合蛋白质(NEB,USA)、FLAG(IBI,USA)和6xHis(六组氨酸;Quiagen,USA)等等。由于存在用于纯化的添加序列,所以可通过亲和色谱法以高通量和简单方式纯化宿主中表达的蛋白质。
另一方面,本发明的表达载体包括本领域普通技术人员已知的抗生素抗性基因作为选择标记,例如针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素和四环素的抗性基因。
由本发明的载体表达的蛋白质并无特别限制,并且包括但不限于激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白质或其部分、抗体或其部分、单克隆抗体、结合蛋白质或其结合结构域、抗原、粘附蛋白质、结构蛋白质、调节蛋白质、毒性蛋白质、细胞因子、转录因子、血液凝固因子和植物防御相关蛋白质。优选地,由本发明载体表达的蛋白质是巴曲酶。
优选地,SEQ ID NO:1、NO:3、NO:5或NO:7的核苷酸序列,更优选SEQ ID NO:3、NO:5或NO:7的核苷酸序列,且最优选地SEQ ID NO:5或NO:7的核苷酸序列在巴曲酶表达中使用的本发明载体中用作编码巴曲酶的序列。在酵母中,优选在毕赤酵母属中有关的微生物中,并且最优选在巴斯德毕赤酵母中,SEQ ID NO:3、NO:5或NO:7的核苷酸序列以高产率表达巴曲酶。
根据一个优选实施方案,本发明的载体是具有图19的基因图的载体。优选地,ColE1在图19中代表pBR322衍生的复制起点,并且大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酵母的组氨酸氨基酸生物合成基因(His4)用作选择标记,启动子基因衍生自酵母的醇氧化酶1(AOX1)。巴曲酶基因包括SEQ ID NO:1、NO3、NO:5或NO:7的核苷酸序列,并且α因子分泌信号序列包括由SEQ ID NO:11突变的α因子分泌信号肽序列。
在本发明的另外一个方面,提供了通过上文描述的载体转化的转化体。
本发明的载体在其中稳定且相继地克隆且表达的宿主细胞也利用本领域技术人员已知的酵母细胞中的任何一种,例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、多形汉森酵母、酿酒酵母和栗酒裂殖酵母。
最优选地,在本发明中使用的宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母是一类甲醇酵母,并且具有几个优点:(i)以低成本在培养基中快速和方便的生长,(ii)蛋白质的大量表达。在包含AOX1启动子的载体中,可通过向培养基中加入甲醇强烈诱导蛋白质表达。在包含α因子分泌信号肽的载体中,通过所需巴曲酶分泌到培养基内可容易地进行蛋白质纯化。
将本发明的载体递送到宿主细胞内的系统包括CaCl2方法(Cohen,S.N.等人,Proc.Natl.Acac.Sci USA,9:2110-2114(1973))、Hanahan方法(Cohen,S.N.等人,Proc.Natl.Acac.Sci USA,9:2110-2114(1973);和Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))、显微注射(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980))、磷酸钙沉淀(Graham,F.L.等人,Virology,52:456(1973))、电穿孔(Neumann,E.,等人,EMBO J.,1:841(1982))、脂质体介导的转染(Wong,T.K.等人,Gene,10:87(1980))、DEAE-葡聚糖处理(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985))和基因轰击(Yang等人,Proc.Natl.Acad.Sci,87:9568-9572(1990))。
在本发明的另外一个方面,提供了重组巴曲酶的制备方法,其包括步骤:(a)使用本发明的载体转化宿主细胞;和(b)培养经转化的细胞以提供重组巴曲酶。
经转化的细胞的培养可以通过本领域技术人员已知的各种方法来进行。微生物培养和发酵的详细描述公开于Kubitschek,H.E.,Introduction to Research with Continuous Cultures.EnglewoodCliffs,NJ.:Prentice-Hall,Inc.,1970;Mandelstam,J.,等人,Biochemistry of Bacterial Growth,第3版Oxford:Blackwell,1982;Meynell,G.G.,等人,Theory and Practice in ExperimentalBacteriology,第2版Cambridge:Cambridge University Press,1970;和Gerhardt,P.,编辑,Manual of Methods for GeneralBacteriology,Washington:Am.Soc.Microbiol,1981中,所述参考文献通过引用合并入本文。
例如,经转化的细胞通过接种在BMG(缓冲的小量甘油)液体培养基中进行培养,并且当细胞密度达到预定点时,通过向培养基中加入甲醇诱导通过AOX1启动子的蛋白质表达,获得分泌到培养基内的蛋白质。
根据本领域技术人员已知的各种纯化方法以纯化形式收集分泌到培养基内的蛋白质。例如,使用纯化方法,例如使用硫酸铵的溶解度分级、大小分级过滤(超滤)和各种色谱法(使用大小、电荷、疏水性或亲和力的分离),获得纯化形式的蛋白质。
本发明的特征和优点概括如下:
(i)本发明的编码巴曲酶的核苷酸序列在酵母、特别是巴斯德毕赤酵母中显示出极佳的表达效率,并且重组巴曲酶以比天然存在的编码巴曲酶的序列高4-13倍的产率获得。
(ii)本发明的突变的α因子分泌信号肽序列也导致重组巴曲酶的产量高约2-3倍。
(iii)因此,使用本发明的编码巴曲酶的核苷酸序列以及突变的α因子分泌信号肽序列的蛋白质表达系统以比天然存在的编码巴曲酶的序列高约20倍的产率获得重组巴曲酶。
(iv)与天然存在的巴曲酶相比较,使用本发明的序列制备的重组巴曲酶具有极佳的活性。
(v)使用本发明的序列制备的重组巴曲酶具有显著的可靠的稳定性。
附图简述
图1代表使天然巴曲酶cDNA和本发明的突变的cDNA的表达相比较的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。图2代表使天然巴曲酶cDNA和本发明的突变的cDNA的表达相比较的Western印迹。在图1和图2中,每个泳道如下:泳道1,对照(包含天然cDNA的pPIC-rBat);泳道2,突变的重组克隆(pBatMd);泳道3,pBatMx;泳道4,pBatSMx;泳道M,分子大小标记;泳道5,分泌信号SMF取代的天然rbat;泳道6,SMFbatMd;泳道7,SMFBatMx;和泳道8,SMFBatSMx。
图3代表用内切酶H处理的SDS-PAGE,以检查巴曲酶蛋白质的糖基化。泳道1、泳道2、泳道3、泳道4的每个条带代表衍生自天然rbat、SMFBatMd、SMFBatMx、SMFBatSMx的完整巴曲酶;泳道5,天然rbat;泳道6,SMFBatMd;泳道7,SMFBatMx;和泳道8,SMFBatSMx。
图4-5是代表重组巴曲酶的纯化的色谱图。图4和图5分别是苯基-琼脂糖和肝素-琼脂糖色谱图。通过使用SMFBatSMx基因制备重组巴曲酶。箭头指示包含最高量的重组巴曲酶的级分。
图6是通过使用各种核苷酸序列制备的重组巴曲酶的制备产率的曲线图。
图7代表通过使用SMFBatSMx基因制备的重组巴曲酶的MALDI-TOF分析。
图8-9分别是分析通过天然和重组巴曲酶的血液凝固的曲线图。
图10代表通过经由使用各种核苷酸序列制备的重组巴曲酶的纤维蛋白凝固活性的曲线图。
图11-12代表通过经由使用各种核苷酸序列制备的重组巴曲酶的纤维蛋白凝固活性的反相酶谱法(zymographies)。
图13-14是代表在重组巴曲酶的动物模型系统中减少出血时间(图13)和全血凝固时间(图14)的活性的曲线图。
图15-17是测量PT(凝血酶原时间,图15)、APTT(活化的部分凝血活酶时间,图16)和TT(凝血酶时间,图17)的曲线图。
图18是关于重组巴曲酶的pH稳定性的曲线图。
图19代表本发明的载体的基因图。5'AOX1,5'AOX1基因的启动子;3'AOX1,3'AOX1基因的启动子;氨苄青霉素,氨苄青霉素抗性基因;His4,His4基因的开放读码框;MF-α,α因子分泌信号序列;ColE1,pBR322衍生的起点;巴曲酶,巴曲酶基因。
现在将通过实施例进一步详细描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是,这些实施例意欲更具体地举例说明,并且如随附权利要求书中阐述的本发明的范围并不限于实施例或受实施例限制。
实施例
实施例1:毒液衍生的天然巴曲酶cDNA克隆
迈阿密矛头蝮蛇的成熟形式巴曲酶的催化结构域获自包含pPIC-rBat载体(酵母表达载体)的GSrBAT菌株(专利申请公开号2007-4541,Korean Culture Center of Microorganisms,保藏号KCCM-10522),以表达本发明的天然巴曲酶。催化结构域包括由231个氨基酸(从缬氨酸(第一个密码子,GTC)到脯氨酸(231个密码子,CCG))的696bp编码区序列和20bp的添加碱基序列组成的XhoI/KEX2-Not I716bp片段。使用正向引物(A5')5'-ctcgagaaaagagtcattggaggtgatg-3'和反向引物(Not I)5'-gcggccgctcatgggcaagtagcag-3',通过PCR反应扩增此片段。PCR扩增的温度循环如下:在94℃变性1.5分钟,在52℃退火1分钟,在72℃延伸1.5分钟,30个循环。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,纯化716bp DNA片段,并且随后亚克隆到pGEMT-Easy载体(Promega,USA)内,所述片段通过测序加以证实。经亚克隆的天然巴曲酶的基因序列在SEQ ID NO:1中描述。
基于天然巴曲酶cDNA序列,在酵母巴斯德毕赤酵母中分析mRNA结构和密码子使用。具有不超过10%的低翻译效率的密码子数目在酵母中是15,相当于全序列的6.4%,不超过20%的密码子数目是42,相当于全序列的18.1%。因此,与不超过20%的52个氨基酸密码子相对应的全部百分比是24.6%。更详细地,具有不超过10%的翻译效率的密码子是精氨酸(CGG/CGC)、丙氨酸(GCG)、亮氨酸(CTC)、丝氨酸(AGC)、甘氨酸(GGG)和脯氨酸(CCG),并且具有不超过20%的翻译效率的密码子包括精氨酸(CGT)、异亮氨酸(ATA)、缬氨酸(GTA/GTG)、苏氨酸(ACG)、脯氨酸(CCC)、甘氨酸(GGC)、亮氨酸(TTA/CTG/CTT)和丝氨酸(AGT)。此外,ΔG值允许假定在翻译过程中mRNA的潜在发夹-环二级结构,天然巴曲酶的ΔG值是-128.3kcal/mol。
实施例2:增强毒液衍生的天然巴曲酶cDNA的蛋白质翻译效率的基因修饰
进行诱变以增强毒液衍生的天然巴曲酶cDNA的蛋白质翻译效率。
在实施例1中描述的包含天然巴曲酶cDNA的716bp DNA片段用作模板。随后,通过使用引物组(正向引物(A5'),5'-ctcgagaaaagagtcattggaggtgatg-3';反向引物(A3'),5'-gtgaattctcataaatctcctgttacagtgtgc-3')扩增155bp Xho I-EcoRI片段,并且通过使用引物组(正向引物(B5'),5'-gaattcacttgggtaaacatgccggaagtgtagca-3';反向引物(B3'),5'-gtaagcttcacgacacaccgtattat-3')扩增312bp EcoR I-Hind III片段。PCR扩增的温度循环与实施例1相同。在PCR反应过程中,将编码Arg48、Ile49和Leu51的天然5'-CGCATACACCTT-3'核苷酸序列取代为包含EcoR I识别序列的5'-AGAATTCACTTG-3'核苷酸序列,其是酵母(巴斯德毕赤酵母)中优选的。此外,将巴曲酶基因分离成155bp Xho I-EcoR I片段、312bp EcoR I-Hind III片段和250bp HindIII-Not I片段。通过将这些片段亚克隆到pGEMT-Easy载体(Promega.USA)或pUC118HincII/BAP载体(Takara Bio Inc,JAPAN)内来进行测序和额外的诱变。使用亚克隆到pGEMT-Easy载体内的155bp XhoI-EcoR I片段作为模板和引物组(正向引物(M1),5'-actactctcctagatatttctgtggtatgactttga-3';反向引物(M2),5'-cagaaatatctaggagagtagtacatgaatgc-3'),通过诱变PCR反应,将Arg23(cgg)密码子序列取代为其他Arg密码子序列(aga)。使用亚克隆到pGEMT-Easy载体内的312bp EcoR I-Hind III片段作为模板和引物组(正向引物(M3),5'-caaagacaaaggagcgatgtgttcactgtttttgacag-3';反向引物(M4),5'-acatcgctcctttgtctttgccttccaaccctcccagt-3'),通过诱变PCR反应,将每个Ala103(gcg)、Pro104(cct)、Leu105(ctc)和Ser106(agc)密码子序列取代为其他Ala(gct)、Pro104(cca)、Leu105(ttg)和Ser106(tct)密码子序列(aga)。
最后,为了诱导其C末端在酵母中具有低密码子效率的250bpHind III-Not I片段中的诱变,合成每个正向和反向寡核苷酸连接体引物组,并且以相等浓度混合。混合物(DNA和引物组)在95℃变性5分钟,并且在室温退火。引物反应物通过T4多核苷酸激酶(PNK)(Takara Bio Inc,JAPAN)进行磷酸化,并且随后根据引物组的次序进行T4DNA连接反应。使用的引物组的核苷酸序列如下:C1F,5′-
使用上文描述的连接产物作为模板和引物组(正向引物(C5'),5'-aagcttacaatggtttgcca-3';反向引物(Not I),5'-gcggccgctcatgggcaagtagcag-3'),通过PCR反应扩增250bp HindIII-Not I片段,并且克隆到pUC118HincII/BAP载体的Hind III位点内。随后,将巴曲酶的C末端的Gly156、Pro158、A1a159、Leu167、Gly170、Asp171、Gly175、Gly179、Pro181、Leu182、Gly190、Leu192、Ser196、Pro198、Pro202、Arg203、Leu215、Pro216、Ser220、A1a228和Pro231密码子序列取代为具有高转录效率的其他密码子序列,这通过测序加以证实。
如上所述,将重组巴曲酶基因从5'末端顺次分成3个片段(XhoI-EcoR I片段、EcoR I-Hind III片段和Hind III-Not I片段),根据限制性酶的顺序将所述3个片段亚克隆到基因盒内,产生巴曲酶突变基因BatMd(SEQ ID NO:3)。对于天然巴曲酶基因中具有不超过10%效率的所有密码子,基于具有不小于10%效率的BatMd取代的密码子,进一步合成基因密码子变体。使用BatMd突变序列,将具有不超过20%效率的所有密码子取代为具有不小于20%效率的密码子,产生BatMx(SEQ ID NO:5),并且将具有低效率的所有密码子取代为在酵母中理论上具有最高效率的密码子,产生具有最优化的密码子核苷酸序列的BatSMx(SEQ ID NO:7)。
将上文描述的每个巴曲酶变体基因亚克隆到pPIC9(Invitrogen,Corp.)载体(酵母表达载体)的Xho I-Not I位点内,构建pBatMd、pBatMx和pBatSMx。
实施例4:增强毕赤酵母属蛋白质的分泌前导肽翻译效率的基因修饰和融合蛋白克隆载体的构建
用于将重组蛋白质分泌到细胞培养基内的酵母分泌前导肽衍生自酿酒酵母的α因子外激素。迄今为止,在商业酵母表达载体系统中使用的所有α因子分泌前导肽由酿酒酵母的基因核苷酸序列组成。特别地,异源酵母表达载体系统例如巴斯德毕赤酵母包括由酿酒酵母的核苷酸序列组成的前导序列(SEQ ID NO:9)。
通过使用毕赤酵母属的密码子分析前导序列的密码子利用,证实在85个氨基酸中不超过20%效率的密码子数目是19,并且不超过10%效率的密码子数目是7。合成分泌信号基因密码子(genotech,Korea),以取代酵母菌属衍生的分泌信号基因密码子,将其命名为SMF,它的核苷酸序列在SEQ ID NO:11中描述。为了在SMF的C末端处融合所需重组蛋白质,将它插入pUC118HincII/BAP(Takara BioInc.,JAPAN)的多克隆位点内,将其命名为pSMF。编码Val80-Ser81-Leu82-Glu83的GTA-TCT-CTC-GAG的核苷酸序列替换为GTT-TCT-TTG-GAA的核苷酸序列,其意义在于,常规商业化的天然α因子前导分泌序列C末端的克隆位点中使用的Xho I核苷酸序列(CTCGAG)编码具有低转录效率的Leu密码子(CTC)。并且随后,通过使用SMF基因作为模板和引物组(SMF-R,5'-TAACTCTTTTTTCCAAAGAAACACCTTCTTCCTTTGCTGC-3';SMF-F,5'-GGATCCAAACGATGAGATTTCCAT-3')进行PCR反应。SMF-R用作与巴曲酶的N末端重叠的C末端引物,并且SMF-F用作在重组SMF基因盒的N末端处产生BamH I核苷酸序列的N末端引物。使用与重叠序列(氨基酸序列:L E K R/V I G G D E)相对应的引物设计下述巴曲酶基因的N末端编码核苷酸序列,所述重叠序列与在SMF的C末端处突变的密码子一致。通过使用每个巴曲酶变体作为模板和以下引物组进行PCR反应:在batMd和barMx中采用aMd/Mx(5'-CTTTGGAAAAAAGAGTCATTGGAGGTGATGAA-3'),在batSMx中采用aSMx2(5'-CTTTGGAAAAAAGAGTTATTGGTGGTGATGAA-3')分别作N末端延伸引物;在batMd和barMx中采用Md/Mx-R(5'-GCGGCCGCTCATGGGCAAGT-3'),以及在batSMx中采用SMx-R(5'-GCGGCCGCTTATGGACAAGT-3')分别作C末端引物。所得到的SMF和巴曲酶基因的PCR产物根据相对应组合相混合,并且加入在每种SMF和巴曲酶修饰中使用的N末端和C末端引物。进行装配PCR,并且随后亚克隆到pTOP Blunt载体(EnzynomicsTM,Korea)内,构建SMFBatMd/SMFBatMx/SMFSMx作为基因盒,其中SMF的α分泌序列和巴曲酶基因的密码子得到优化。这些基因用BamH I-Not I限制性酶进行消化。回收BamH I-Not I片段(970bp),并且亚克隆到pPIC9—一种毕赤酵母属表达载体内,产生表达载体(即pSMFrbat、pSMFBatMd、pSMFBatMx和pSMFBatSMX)。
实施例5:巴曲酶的天然cDNA和突变cDNA之间的比较表达
使用电穿孔仪(Bio-Rad Gene Pulser,USA)在1.5kV的电压条件下,将在实施例3和4中制备的载体转化到巴斯德毕赤酵母菌株(GS115,Invitrogen)内,并且将转化体接种到组氨酸缺陷的YNB(酵母氮源)固体培养基上。这之后,将经选择的单个菌落接种到1L BMG(缓冲的小量甘油)液体培养基(100mM磷酸钠(pH6.0)、1.34%酵母氮源、4x10-5%生物素、1%甘油),并且伴随振荡在30℃温育。在其中吸光度在600nm达到1.0的细胞密度下,通过以24小时间隔加入0.1%甲醇来诱导重组蛋白质经由AOX1(醇氧化酶1)启动子的表达。通过离心除去酵母细胞,收获培养溶液。在酵母培养溶液中表达的巴曲酶如实施例6中所述进行纯化,并且将对应于相同培养体积的每个量在SDS-PAGE上电泳。凝胶用考马斯亮蓝R-250进行染色。表达通过具有约29-33kDa分子量的新蛋白质条带的产生进行测定(图1a),并且也通过Western印迹使用针对蛋白质凝胶中的巴曲酶蛋白质的抗体进行检查(图1b)。
同样地,进行蛋白质的表达,并且比较蛋白质的表达量。在图1a-1b中,每个泳道如下:泳道1,对照(包含天然cDNA的pPIC-rBat);泳道2,突变的重组克隆(pBatMd);泳道3,pBatMx;泳道4,pBatSMx;泳道M,分子大小标记;泳道5,分泌信号SMF取代的天然rbat;泳道6,SMFbatMd;泳道7,SMFBatMx;和泳道8,SMFBatSMx。如图1a-1b中所示,证实与天然基因(pPIC-rBat)中相比较,与巴曲酶蛋白质相对应的33kDa蛋白质条带在突变的重组克隆(例如BatMd、BatMx和BatSMx)中丰富累积。表达量按照BatSMx、BatMx、BatMd的次序增加。还证实通过使用突变的α因子前导肽,多得多的巴曲酶量被分泌到培养溶液内。
另一方面,使用内切酶H(New England Biolab Inc.,USA)通过去糖基化反应检查所表达的巴曲酶蛋白质的糖基化。这种处理导致条带从33kDa变动成26kDa,证实该条带是巴曲酶蛋白质(图2)。在图2中,检测出完整巴曲酶,并且每个泳道如下:泳道1,天然rbat;泳道2,SMFBatMd;泳道3,SMFBatMx;泳道4,SMFBatSMx;泳道5,天然rbat;泳道6,SMFbatMd;泳道7,SMFBatMx;和泳道8,SMFBatSMx。泳道5至8分别是泳道1-4的经内切酶H处理的对应物,代表通过内切酶H的蛋白质条带偏移。如上所述,应当理解与天然基因相比较,重组巴曲酶蛋白质的表达在BatMd、BatMx和BatSMx(巴曲酶突变cDNA)和SMF(分泌信号取代的)中增加。
实施例6:重组巴曲酶的纯化
通过在5000x g离心收获用实施例5的巴曲酶表达载体转化的酵母菌株的甲醇诱导培养溶液,并且装载到用2.5M硫酸铵溶液平衡的、填充有苯基-琼脂糖(GE Healthcare,USA)的柱(1.3x20cm)内。使用0-2.5M硫酸铵溶液的线性梯度以0.5ml/分钟的流速洗脱具有重组巴曲酶的酶活性的级分(图3a)。根据实施例1的相同方法测量重组巴曲酶的酶活性。具有酶活性的收集级分在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中透析8小时(3次),并且随后装载到用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的亲和柱(肝素-琼脂糖柱,1x5cm,GEHealthcare,USA)内。用包含1M氯化钠的0-1M相同缓冲溶液的线性梯度以1ml/分钟的流速洗脱重组巴曲酶,以得到纯的分离的重组凝血酶样酶(图3b)。BatMd、BatMx和BatSMx的产率各自增加4.5、8.5和13倍,其中每1L培养溶液中天然巴曲酶基因的表达视为1。还证实天然基因和与SMF融合的BatMd的产率各自增加3和12倍,并且与SMF融合的BatMx和BatSMx的产率增加20倍(图4)。
为了分析重组巴曲酶的氨基酸序列,经纯化的重组凝血酶样酶在还原条件下进行电泳。切下巴曲酶蛋白质条带,然后进行胰蛋白酶凝胶内消化。使用MALDI-TOF MS分析仪来分析N末端氨基酸序列。证实序列是VIGGDECDIN的序列,暗示所表达的蛋白质是重组巴曲酶(图5)。
实施例7:重组巴曲酶和天然巴曲酶的活性的比较
测量所合成的显色底物(Chromogenix,InstrumentationLaboratory,Spain/Sigma,USA)的催化活性,以比较重组巴曲酶和天然巴曲酶的活性,并且通过ACL自动化血液凝固仪器(Instrumentation Laboratory,Spain)测量人血浆凝固时间的改变。通过在405nm处的吸光度的改变来测量通过接触相同量的重组凝血酶样和天然凝血酶样酶引起的合成显色底物的催化。显色底物利用S2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA)、S2222(Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA)、S2288(H-D-Ile-Pro-Arg-pNA)、S2266(H-D-Val-Leu-Arg-pNA)、S2302(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA)、T1637(N-P-Tonsyl-Gly-Pro-Arg-pNA)、V2628(DL-Val-Leu-Arg-pNA)、B7632(N-苯甲酰-Phe-Val-Arg-pNA)。重组蛋白质和天然蛋白质都显示凝血酶样酶对几种合成显色底物的催化活性的相似模式,并且重组巴曲酶证实更高的比活性(图6a)。在图6a中,重组蛋白质代表天然巴曲酶基因在巴斯德毕赤酵母中表达的蛋白质。天然巴曲酶代表从毒液中纯化的巴曲酶(Pentapharm Ltd,Swiss)。
为了鉴定巴曲酶的实际止血活性,从人血液中分离出血浆,并且根据浓度将相同量的重组巴曲酶和天然巴曲酶加入血浆中,并且随后通过ACL自动化血液凝固仪器测量PT(凝血酶原时间)。结果证实巴曲酶的添加以浓度依赖性方式增加凝固时间,并且重组巴曲酶的比活性大于天然巴曲酶,如同使用合成显色底物的活性测量结果(图6b)。
实施例8:重组巴曲酶的纤维蛋白凝固活性
用重组巴曲酶和天然巴曲酶进行体外纤维蛋白凝固活性测试和反相酶谱法测试。如图7中所示,向0.5%人纤维蛋白原溶液中加入重组巴曲酶产生了不溶性纤维蛋白凝块,其不与水溶性染料相混合。如图8a的反相酶谱所示,在0.5%纤维蛋白原-琼脂平板上在重组酶的位置处形成不溶性纤维蛋白凝块,并且检测出在SDS-PAGE和Western印迹中不存在的较小条带。证实这些条带是通过部分糖基化形成的极少量的巴曲酶(图8b)。
实施例9:在动物实验模型中通过重组巴曲酶减少出血时间和全血凝固时间
为了检查重组巴曲酶的临床应用可能性,在动物实验模型中与天然巴曲酶的出血时间减少相比较。在8周龄的大鼠(DBL,Korea)的尾静脉上注射如同在临床应用中使用的那种相似量的约1ml样品(1NIH单位/kg)。在1.5小时后,在距离尖5mm处横切大鼠的尾部,并且在PBS中用尾部测量停止出血的时间。对照仅用PBS进行注射。每个组具有5只动物。如图9a中所示,用重组巴曲酶或天然巴曲酶注射的动物的出血时间短于对照,这是巴曲酶的止血活性的结果。重组巴曲酶的止血活性优于天然巴曲酶。
此外,测量了在经处理的动物模型中的全血凝固时间减少。在大鼠的尾静脉上注射重组巴曲酶和天然巴曲酶(分别为2NIH单位/kg)。在1小时和4小时后,收集血液并且测量全血凝固时间。对照仅用PBS进行注射。每个组具有5只动物。全血凝固时间如下测量:在1.5mleppendorf管中使所收集的0.5ml血液与10mM CaCl2相混合,并且随后伴随2rpm/分钟的搅拌和45°斜度测量血液凝固时间。用巴曲酶处理的血液的全血凝固时间短于对照,如同出血时间测试的结果,并且重组巴曲酶的活性强于天然巴曲酶的活性(图9b)。
实施例10:在动物实验模型中重组巴曲酶对PT、APTT和TT的改变
如上所述,几个实验证实重组巴曲酶具有止血活性,以形成不溶性纤维蛋白凝块,如同天然巴曲酶。因此,为了研究这种重组巴曲酶是否对其他血液凝固因子具有影响,在动物实验模型中测量血液的PT(凝血酶原时间)、APTT(活化的部分凝血活酶时间)和TT(凝血酶时间)改变。在大鼠的尾静脉上注射重组巴曲酶和天然巴曲酶(分别为0.1NIH单位/kg)。在2小时后,收集血液并且分离血浆。通过使用自动化ACL血液凝固测试仪来测量每种经分离的血浆的PT(图10a)、APTT(图10b)和TT(图10c)的改变。这种改变是体内测定方法,以间接研究哺乳动物血液凝固系统中的几种凝固因子的改变。
对照是仅用PBS进行注射的动物的血浆。每个组具有5只动物。所有结果都是相似的,用样品注射的动物的血浆在每次测试时显示极轻微的增加。然而,差异不显著。基于这些结果,认为与止血活性相比较,重组巴曲酶对其他血液凝固因子不具有显著影响。
实施例11:重组巴曲酶和天然巴曲酶的稳定性测试
由于用于活性比较的上述几个实验的结果,认为重组巴曲酶的活性强于天然酶,估计这与蛋白质稳定性有关。因此,通过测量在几种pH条件下的蛋白质活性的维持,分析重组巴曲酶和天然巴曲酶的稳定性。如图11中所示,重组巴曲酶在每种条件下更稳定。估计这种结果与最终分离且纯化的蛋白质的纯度有关。
已描述了本发明的优选实施方案,应当理解其包含在本发明的精神内的变型和修饰对于本领域技术人员是显而易见的,并且本发明的范围由随附的权利要求及其等同物决定。
优选的实施方式:
1.编码巴曲酶的核苷酸序列,其中包含SEQ ID NO:3、NO:5或NO:7的核苷酸序列。
2.包含项目1的核苷酸序列的载体。
3.根据项目2的载体,其中所述载体进一步包含SEQ ID NO:11的编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列。
4.被项目2或3的载体转化的转化体。
5.用于制备重组巴曲酶的方法,其包括以下步骤:
(a)使用项目2或3的载体转化宿主细胞;和
(b)培养所述经转化的细胞以提供重组巴曲酶。
6.编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列,其中包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
7.包含项目6的核苷酸序列的载体。
8.被项目7的载体转化的转化体。
9.用于制备重组巴曲酶的方法,其包括以下步骤:
(a)使用项目7的载体转化宿主细胞;和
(b)培养所述经转化的细胞以提供重组巴曲酶。
Claims (2)
1.编码α因子分泌信号肽的核苷酸序列,其由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成。
2.一种载体,其包含
(i)权利要求1的核苷酸序列;和
(ii)位于(i)所述核苷酸序列的3’末端的编码目的蛋白质的核苷酸序列。
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