JP2517241B2 - 遺伝子 - Google Patents
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- JP2517241B2 JP2517241B2 JP61193058A JP19305886A JP2517241B2 JP 2517241 B2 JP2517241 B2 JP 2517241B2 JP 61193058 A JP61193058 A JP 61193058A JP 19305886 A JP19305886 A JP 19305886A JP 2517241 B2 JP2517241 B2 JP 2517241B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は新規な遺伝子に関するものである。さらに
詳細には、この発明はバトロキソビンのアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードする遺伝子に関するものであ
る。
詳細には、この発明はバトロキソビンのアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードする遺伝子に関するものであ
る。
従来の技術およびこの発明の解決しようとする問題点 バトロキソビン（Batroxobin）は、南米産ガラガラ蛇
（Bothrops atrox，moojeni）の産生するトロンビン様
酵素で、フィブリノーゲンＡ鎖を特異的に切断して可溶
性フィブリンを生成する。このため、血栓症の予防・治
療剤として有用である［例えば、Stocker,K.Handbook
of Experimental Pharmacology vol.46,pp,451（197
8）,Springer−Verlag,Berlin参照］。
（Bothrops atrox，moojeni）の産生するトロンビン様
酵素で、フィブリノーゲンＡ鎖を特異的に切断して可溶
性フィブリンを生成する。このため、血栓症の予防・治
療剤として有用である［例えば、Stocker,K.Handbook
of Experimental Pharmacology vol.46,pp,451（197
8）,Springer−Verlag,Berlin参照］。
しかし、バトロキソビンは上記毒蛇の毒液より単離・
精製するために、高価でありかつ安定的な供給に不安が
ある。
精製するために、高価でありかつ安定的な供給に不安が
ある。
発明の構成および効果 そこで、この発明者等はバトロキソビンの安定供給を
確保するために、遺伝子組み換え技術、すなわち、バト
ロキソビンに対応する遺伝子を適当なベクター（例えば
プラスミド）等に挿入し、次いで、この組み換えベクタ
ーで宿主細胞（例えば微生物）を形質転換し、この形質
転換体を培養することによりバトロキソビンを製造する
方法に着目した。
確保するために、遺伝子組み換え技術、すなわち、バト
ロキソビンに対応する遺伝子を適当なベクター（例えば
プラスミド）等に挿入し、次いで、この組み換えベクタ
ーで宿主細胞（例えば微生物）を形質転換し、この形質
転換体を培養することによりバトロキソビンを製造する
方法に着目した。
このためには、バトロキソビンの遺伝子を単離するこ
とが必要である。そこで、この発明者等はバトロキソビ
ンを精製して、バトロキソビンのアミノ酸配列のうち、
Ｎ末端から22個のアミノ酸配列を決定し、これに基づき
29merのオリゴヌクレオチドからなるプローブを作成
し、このプローブを用いて、バトロキソビンのcDNAのク
ローン化に成功し、遺伝子組み換え技術によるバトロキ
ソビンの製造の道をひらいた。すなわち、この発明はバ
トロキソビンのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする遺伝子を提供するものである。
とが必要である。そこで、この発明者等はバトロキソビ
ンを精製して、バトロキソビンのアミノ酸配列のうち、
Ｎ末端から22個のアミノ酸配列を決定し、これに基づき
29merのオリゴヌクレオチドからなるプローブを作成
し、このプローブを用いて、バトロキソビンのcDNAのク
ローン化に成功し、遺伝子組み換え技術によるバトロキ
ソビンの製造の道をひらいた。すなわち、この発明はバ
トロキソビンのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする遺伝子を提供するものである。
ここで、バトロキソビンのアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードする遺伝子は、 アミノ酸配列（Ｉ）： ValIleGlyGlyAspGluCysAspIleAsnGluHisProPhe LeuAlaPheMetTyrTyrSerProArgTyrPheCysGlyMet ThrLeuIleAsnGlnGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCys AsnArgArgPheMetArgIleHisLeuGlyLysHisAlaGly SerValAlaAsnTyrAspGluValValArgTyrProLysGlu LysPheIleCysProAsnLysLysLysAsnValIleThrAsp LysAspIleMetLeuIleArgLeuAspArgProValLysAsn SerGluHisIleAlaProLeuSerLeuProSerAsnProPro SerValGlySerValCysArgIleMetGlyTrpGlyAlaIle ThrThrSerGluAspThrTyrProAspValProHisCysAla AsnIleAsnLeuPheAsnAsnThrValCysArgGluAlaTyr AsnGlyLeuProAlaLysThrLeuCysAlaGlyValLeuGln GlyGlyIleAspThrCysGlyGlyAspSerGlyGlyProLeu IleCysAsnGlyGlnPheGlnGlyIleLeuSerTrpGlySer AspProCysAlaGluProArgLysProAlaPheTyrThrLys ValPheAspTyrLeuProTrpIleGlnSerIleIleAlaGly AsnLysThrAlaThrCysPro で示されるポリペプチドをコードするDNAおよび アミノ酸配列（II）： MetValLeuIleArgValIleAlaAsnLeuLeuIleLeuGln ValSerTyrAlaGlnLysSerSerGluLeuValIleGlyGly AspGluCysAspIleAsnGluHisProPheLeuAlaPheMet TyrTyrSerProArgTyrPheCysGlyMetThrLeuIleAsn GlnGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCysAsnArgArgPhe MetArgIleHisLeuGlyLysHisAlaGlySerValAlaAsn TyrAspGluValValArgTyrProLysGluLysPheIleCys ProAsnLysLysLysAsnValIleThrAspLysAspIleMet LeuIleArgLeuAspArgProValLysAsnSerGluHisIle AlaProLeuSerLeuProSerAsnProProSerValGlySer ValCysArgIleMetGlyTrpGlyAlaIleThrThrSerGlu AspThrTyrProAspValProHisCysAlaAsnIleAsnLeu PheAsnAsnThrValCysArgGluAlaTyrAsnGlyLeuPro AlaLysThrLeuCysAlaGlyValLeuGlnGlyGlyIleAsp ThrCysGlyGlyAspSerGlyGlyProLeuIleCysAsnGly GlnPheGlnGlyIleLeuSerTrpGlySerAspProCysAla GluProArgLysProAlaPheTyrThrLysValPheAspTyr LeuProTrpIleGlnSerIleIleAlaGlyAsnLysThrAla ThrCryPro で示されるポリペプチドをコードするDNAまたは 塩基配列（Ｉ）： GTCATTGGAGGTGATGAATGTGACATAAATGAACATCCTTTC CTTGCATTCATGTACTACTCTCCCCGGTATTTCTGTGGTATG ACTTTGATCAACCAGGAATGGGTGCTGACCGCTGCACACTGT AACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGA AGTGTAGCAAATTATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAG AAGTTCATTTGTCCCAATAAGAAAAAAAATGTCATAACGGAC AAGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTTGTCAAAAAC AGTGAACACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCC AGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATTATGGGATGGGGCGCAATC ACAACTTCTGAAGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT AACATTAACCTGTTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTAC AATGGGTTGCCGGCGAAAACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAA GGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGACCCCTC ATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGT GATCCCTGTGCCGAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAG GTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGCATTATTGCAGGA AATAAAACTGCGACTTGCCCG で示されるDNAおよび 塩基配列（II）： ATGGTGCTGATCAGAGTGATAGCAAACCTTCTGATATTACAG GTTTCTTACGCACAAAACTCTTCTGAACTGGTCATTGGAGGT GATGAATGTGACATAAATGAACATCCTTTCCTTGCATTCATG TACTACTCTCCCCGGTATTTCTGTGGTATGACTTTGATCAAC CAGGAATGGGTGCTGACCGCTGCACACTGTAACAGGAGATTT ATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGAAGTGTAGCAAAT TATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAGAAGTTCATTTGT CCCAATAAGAAAAAAAATGTCATAACGGACAAGGACATTATG TTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCAAAAACAGTGAACACATC GCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCCAGTGTGGGCTCA GTTTGCCGTATTATGGGATGGGGCGCAATCACAACTTCTGAA GACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCTAACATTAACCTG TTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTACAATGGGTTGCCG GCGAAAACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGCATAGAT ACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGACCCCTCATCTGTAATGGA CAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGTGATCCCTGTGCC GAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAGGTCTTTGATTAT CTTCCCTGGATCCAGAGCATTATTGCAGGAAATAAAACTGCG ACTTGCCCG で示されるDNAを含む。
プチドをコードする遺伝子は、 アミノ酸配列（Ｉ）： ValIleGlyGlyAspGluCysAspIleAsnGluHisProPhe LeuAlaPheMetTyrTyrSerProArgTyrPheCysGlyMet ThrLeuIleAsnGlnGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCys AsnArgArgPheMetArgIleHisLeuGlyLysHisAlaGly SerValAlaAsnTyrAspGluValValArgTyrProLysGlu LysPheIleCysProAsnLysLysLysAsnValIleThrAsp LysAspIleMetLeuIleArgLeuAspArgProValLysAsn SerGluHisIleAlaProLeuSerLeuProSerAsnProPro SerValGlySerValCysArgIleMetGlyTrpGlyAlaIle ThrThrSerGluAspThrTyrProAspValProHisCysAla AsnIleAsnLeuPheAsnAsnThrValCysArgGluAlaTyr AsnGlyLeuProAlaLysThrLeuCysAlaGlyValLeuGln GlyGlyIleAspThrCysGlyGlyAspSerGlyGlyProLeu IleCysAsnGlyGlnPheGlnGlyIleLeuSerTrpGlySer AspProCysAlaGluProArgLysProAlaPheTyrThrLys ValPheAspTyrLeuProTrpIleGlnSerIleIleAlaGly AsnLysThrAlaThrCysPro で示されるポリペプチドをコードするDNAおよび アミノ酸配列（II）： MetValLeuIleArgValIleAlaAsnLeuLeuIleLeuGln ValSerTyrAlaGlnLysSerSerGluLeuValIleGlyGly AspGluCysAspIleAsnGluHisProPheLeuAlaPheMet TyrTyrSerProArgTyrPheCysGlyMetThrLeuIleAsn GlnGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCysAsnArgArgPhe MetArgIleHisLeuGlyLysHisAlaGlySerValAlaAsn TyrAspGluValValArgTyrProLysGluLysPheIleCys ProAsnLysLysLysAsnValIleThrAspLysAspIleMet LeuIleArgLeuAspArgProValLysAsnSerGluHisIle AlaProLeuSerLeuProSerAsnProProSerValGlySer ValCysArgIleMetGlyTrpGlyAlaIleThrThrSerGlu AspThrTyrProAspValProHisCysAlaAsnIleAsnLeu PheAsnAsnThrValCysArgGluAlaTyrAsnGlyLeuPro AlaLysThrLeuCysAlaGlyValLeuGlnGlyGlyIleAsp ThrCysGlyGlyAspSerGlyGlyProLeuIleCysAsnGly GlnPheGlnGlyIleLeuSerTrpGlySerAspProCysAla GluProArgLysProAlaPheTyrThrLysValPheAspTyr LeuProTrpIleGlnSerIleIleAlaGlyAsnLysThrAla ThrCryPro で示されるポリペプチドをコードするDNAまたは 塩基配列（Ｉ）： GTCATTGGAGGTGATGAATGTGACATAAATGAACATCCTTTC CTTGCATTCATGTACTACTCTCCCCGGTATTTCTGTGGTATG ACTTTGATCAACCAGGAATGGGTGCTGACCGCTGCACACTGT AACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGA AGTGTAGCAAATTATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAG AAGTTCATTTGTCCCAATAAGAAAAAAAATGTCATAACGGAC AAGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTTGTCAAAAAC AGTGAACACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCC AGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATTATGGGATGGGGCGCAATC ACAACTTCTGAAGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT AACATTAACCTGTTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTAC AATGGGTTGCCGGCGAAAACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAA GGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGACCCCTC ATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGT GATCCCTGTGCCGAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAG GTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGCATTATTGCAGGA AATAAAACTGCGACTTGCCCG で示されるDNAおよび 塩基配列（II）： ATGGTGCTGATCAGAGTGATAGCAAACCTTCTGATATTACAG GTTTCTTACGCACAAAACTCTTCTGAACTGGTCATTGGAGGT GATGAATGTGACATAAATGAACATCCTTTCCTTGCATTCATG TACTACTCTCCCCGGTATTTCTGTGGTATGACTTTGATCAAC CAGGAATGGGTGCTGACCGCTGCACACTGTAACAGGAGATTT ATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGAAGTGTAGCAAAT TATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAGAAGTTCATTTGT CCCAATAAGAAAAAAAATGTCATAACGGACAAGGACATTATG TTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCAAAAACAGTGAACACATC GCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCCAGTGTGGGCTCA GTTTGCCGTATTATGGGATGGGGCGCAATCACAACTTCTGAA GACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCTAACATTAACCTG TTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTACAATGGGTTGCCG GCGAAAACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGCATAGAT ACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGACCCCTCATCTGTAATGGA CAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGTGATCCCTGTGCC GAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAGGTCTTTGATTAT CTTCCCTGGATCCAGAGCATTATTGCAGGAAATAAAACTGCG ACTTGCCCG で示されるDNAを含む。
この発明のバトロキソビンのアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードする遺伝子は、例えば次のような方法
により製造される。
ペプチドをコードする遺伝子は、例えば次のような方法
により製造される。
まず、南米産ガラガラ蛇（Bothrops atrox，moojen
i）の毒腺よりフェノール法［Eur.J.Biochem.,97,1（19
79）］でRNAを単離し、このRNAからオリゴ（dT）セルロ
ース法［Proc．Natl．Acid．Sci.,69,1408（1972）］に
よりポリ（Ａ）ｍ−RNAを単離する。このポリ（Ａ）ｍ
−RNAを鋳型、オリゴ（dT）をプライマーとして、逆転
写酵素、大腸菌リボヌクレアーゼＨと大腸菌DNAポリメ
ラーゼＩを用いる方法［Gene，25,263（1983）］により
二重鎖cDNAを作成する。この二重鎖cDNAよりcDNAライブ
ラリーを作成する。すなわち、例えばこの二重鎖cDNAの
両端にEcoRIリンカーを付加し、これをT4DNAリカーゼを
用いる方法［Huynh,T.V.ら,DNA cloning vol.I,pp49（1
985）IRL Press,Oxford］により、EcoRIで消化したλgt
llDNA（Promega Biotec社製）と結合させ組み換えλgtl
lDNAを作成し、これからパッケージング・ミックスチャ
ー（Packaging Mixture）（Vector Cloning Systems社
製）を用いてcDNAライブラリーを作成する。
i）の毒腺よりフェノール法［Eur.J.Biochem.,97,1（19
79）］でRNAを単離し、このRNAからオリゴ（dT）セルロ
ース法［Proc．Natl．Acid．Sci.,69,1408（1972）］に
よりポリ（Ａ）ｍ−RNAを単離する。このポリ（Ａ）ｍ
−RNAを鋳型、オリゴ（dT）をプライマーとして、逆転
写酵素、大腸菌リボヌクレアーゼＨと大腸菌DNAポリメ
ラーゼＩを用いる方法［Gene，25,263（1983）］により
二重鎖cDNAを作成する。この二重鎖cDNAよりcDNAライブ
ラリーを作成する。すなわち、例えばこの二重鎖cDNAの
両端にEcoRIリンカーを付加し、これをT4DNAリカーゼを
用いる方法［Huynh,T.V.ら,DNA cloning vol.I,pp49（1
985）IRL Press,Oxford］により、EcoRIで消化したλgt
llDNA（Promega Biotec社製）と結合させ組み換えλgtl
lDNAを作成し、これからパッケージング・ミックスチャ
ー（Packaging Mixture）（Vector Cloning Systems社
製）を用いてcDNAライブラリーを作成する。
他方、バトロキソビンの市販品（Pentapharm社製）を
ヘパリン−セファロース（Heparin−Sepharose）CL−6
B、DEAE−セファセル（DEAE−Sephacel）およびセファ
デックス（Sephadex）Ｇ−100（すべてPharmacia社製）
を用いて精製する。精製バトロキソビンを還元カルボキ
シアミドメチル化法［Biochemistry 7,1959（1968）］
によりジスルフィド結合を切断し、下記実施例に示すよ
うな常法によりＮ末端の22個のアミノ酸配列を決定す
る。（第１図参照）。次いで、このようにして決定され
たバトロキソンビンのＮ末端アミノ酸配列の２番目から
12番目のアミノ酸配列の遺伝暗号に対応する29mer合成
オリゴヌクレオチド（第１図参照）を全自動DNA合成機
を用いて合成する。
ヘパリン−セファロース（Heparin−Sepharose）CL−6
B、DEAE−セファセル（DEAE−Sephacel）およびセファ
デックス（Sephadex）Ｇ−100（すべてPharmacia社製）
を用いて精製する。精製バトロキソビンを還元カルボキ
シアミドメチル化法［Biochemistry 7,1959（1968）］
によりジスルフィド結合を切断し、下記実施例に示すよ
うな常法によりＮ末端の22個のアミノ酸配列を決定す
る。（第１図参照）。次いで、このようにして決定され
たバトロキソンビンのＮ末端アミノ酸配列の２番目から
12番目のアミノ酸配列の遺伝暗号に対応する29mer合成
オリゴヌクレオチド（第１図参照）を全自動DNA合成機
を用いて合成する。
この29merの合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
て上記で調製したcDNAライブラリーをプラーク・ハイブ
リダイゼーション法［Maniatis,TらMolecular Cloning
pp.320（1982）,Cold Spring Hobor Laboratory,New Y
ork］でスクリーニングし、陽性のファージ・クローン
を単離する。
て上記で調製したcDNAライブラリーをプラーク・ハイブ
リダイゼーション法［Maniatis,TらMolecular Cloning
pp.320（1982）,Cold Spring Hobor Laboratory,New Y
ork］でスクリーニングし、陽性のファージ・クローン
を単離する。
このクローンより、プレート・リゼート法（上記Mole
cular Cloning pp.371）を用いて、組み換えλgtllDNA
単離する。この組み換えλgtllDNAよりEcoRI消化法（上
記Molecular Cloning pp.104）により、DNAインサート
を単離して、ベクター（例えばプラスミドpUC13）に挿
入して組換えベクターを作成し、この組換えベクターで
宿主細胞（例えばエシェリヒア・コリDHI）を形質転換
して形質転換体を得、常法（上記Molecular Cloning p
p.390）により、再クローニングする。［なお、このよ
うにしてクローン化されたもののうち、最長のDNAイン
サート（すなわち、第２図に示す塩基配列を有するバト
ロキソビンのcDNA）が挿入されたプラスミドpUC13（こ
の組み換えDNAをpBat−２と命名する）を含有するエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）DHI（pBat−２）
と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP−8
913として寄託した。］ 上記で再クローニングした形質転換体より、組み換え
ベクターをアルカリ溶菌法［Nucleic Acids Res．7,1
513（1979）］により単離し、この組み換えベクターよ
りEcoRI消化法とアガロースゲル電気泳動法（上記Molec
ular Cloning pp.104およびpp.173）により、cDNAイン
サートを単離する。
cular Cloning pp.371）を用いて、組み換えλgtllDNA
単離する。この組み換えλgtllDNAよりEcoRI消化法（上
記Molecular Cloning pp.104）により、DNAインサート
を単離して、ベクター（例えばプラスミドpUC13）に挿
入して組換えベクターを作成し、この組換えベクターで
宿主細胞（例えばエシェリヒア・コリDHI）を形質転換
して形質転換体を得、常法（上記Molecular Cloning p
p.390）により、再クローニングする。［なお、このよ
うにしてクローン化されたもののうち、最長のDNAイン
サート（すなわち、第２図に示す塩基配列を有するバト
ロキソビンのcDNA）が挿入されたプラスミドpUC13（こ
の組み換えDNAをpBat−２と命名する）を含有するエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）DHI（pBat−２）
と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP−8
913として寄託した。］ 上記で再クローニングした形質転換体より、組み換え
ベクターをアルカリ溶菌法［Nucleic Acids Res．7,1
513（1979）］により単離し、この組み換えベクターよ
りEcoRI消化法とアガロースゲル電気泳動法（上記Molec
ular Cloning pp.104およびpp.173）により、cDNAイン
サートを単離する。
実施例に示す方法により単離されたcDNAインサートの
塩基配列を常法に従い制限酵素で切断した後、得られた
DNA断片をM13mp18とM13mp19ファージ・ベクター（宝酒
造社製）のマルチプル・クローニングサイトにサブクロ
ーンする。この組み換えM13mp18とM13mp19ファージを用
い、サンガー（Sanger）法［Sanger,Fら，Proc．Natl．
Acad．Sci.,74,5463（1977）］に準じて、cDNAインサー
トの全塩基配列を決定する。
塩基配列を常法に従い制限酵素で切断した後、得られた
DNA断片をM13mp18とM13mp19ファージ・ベクター（宝酒
造社製）のマルチプル・クローニングサイトにサブクロ
ーンする。この組み換えM13mp18とM13mp19ファージを用
い、サンガー（Sanger）法［Sanger,Fら，Proc．Natl．
Acad．Sci.,74,5463（1977）］に準じて、cDNAインサー
トの全塩基配列を決定する。
pBat−２より単離されたcDNAインサートの全塩基配列
は、第２図に示されている通り、全長1,523のヌクレオ
チドからなる。そして、ヌクレオチド252〜317によって
コードされるアミノ酸配列は天然バトロキソビンのＮ末
端の22個のアミノ酸配列と一致する。ヌクレオチド945
〜947の終止コドンTGAの前のCCGでコードされるプロリ
ン（Pro）は天然バトロキソビンのＣ末端（下記実施例
参照）と一致する。さらにヌクレオチド252〜944に対応
するアミノ酸配列はほ乳動物のセリン・プロテアーゼで
あるトリプシン（trypsin）、パンクレアチック・カリ
クレイン（pancreatic kallikrein）およびトロンビン
（thrombin）ならびにクロタラーゼ（crotalase）の公
知の酵素のアミノ酸配列とかなりの相同性が見られる
（第３図参照）。以上の事実より、ヌクレオチド252〜9
44はバトロキソビンのアミノ酸配列をコードする遺伝子
であることは確実である。さらに、ヌクレオチド180〜1
82のATGコドン（メチオニンの遺伝暗号でありかつ翻訳
開始コドンでもある）から始まり231〜233のGCAコドン
（アラニンの遺伝暗号）で終るヌクレオチド180〜233に
対応するアミノ末端疎水性ペプチドはプレペプチド（シ
グナル・ペプチド）であり、ヌクレオチド234〜236のCA
Aコドン（グルタミンの遺伝暗号）から初まりヌクレオ
チド249〜251のCTGコドン（ロイシンの遺伝暗号）で終
るヌクレオチド234〜251に対応する親水性ペプチドはプ
ロペプチド（zymogen−ペプチド）と推定される。従っ
て、ヌクレオチド180〜944は255個のアミノ酸残基から
なるプレプロバトロキソビンをコードし、ヌクレオチド
234〜944は237個のアミノ酸残基からなるプロバトロキ
ソビンをコードする遺伝子である。
は、第２図に示されている通り、全長1,523のヌクレオ
チドからなる。そして、ヌクレオチド252〜317によって
コードされるアミノ酸配列は天然バトロキソビンのＮ末
端の22個のアミノ酸配列と一致する。ヌクレオチド945
〜947の終止コドンTGAの前のCCGでコードされるプロリ
ン（Pro）は天然バトロキソビンのＣ末端（下記実施例
参照）と一致する。さらにヌクレオチド252〜944に対応
するアミノ酸配列はほ乳動物のセリン・プロテアーゼで
あるトリプシン（trypsin）、パンクレアチック・カリ
クレイン（pancreatic kallikrein）およびトロンビン
（thrombin）ならびにクロタラーゼ（crotalase）の公
知の酵素のアミノ酸配列とかなりの相同性が見られる
（第３図参照）。以上の事実より、ヌクレオチド252〜9
44はバトロキソビンのアミノ酸配列をコードする遺伝子
であることは確実である。さらに、ヌクレオチド180〜1
82のATGコドン（メチオニンの遺伝暗号でありかつ翻訳
開始コドンでもある）から始まり231〜233のGCAコドン
（アラニンの遺伝暗号）で終るヌクレオチド180〜233に
対応するアミノ末端疎水性ペプチドはプレペプチド（シ
グナル・ペプチド）であり、ヌクレオチド234〜236のCA
Aコドン（グルタミンの遺伝暗号）から初まりヌクレオ
チド249〜251のCTGコドン（ロイシンの遺伝暗号）で終
るヌクレオチド234〜251に対応する親水性ペプチドはプ
ロペプチド（zymogen−ペプチド）と推定される。従っ
て、ヌクレオチド180〜944は255個のアミノ酸残基から
なるプレプロバトロキソビンをコードし、ヌクレオチド
234〜944は237個のアミノ酸残基からなるプロバトロキ
ソビンをコードする遺伝子である。
このようにして、バトロキソビンの遺伝子が明らかに
されたことにより、バトロキソビンのアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするDNAは本明細書で具体的に
開示した方法によらなくとも、制限酵素による切断やDN
A化学合成を用いる常法により、当業者ならばきわめて
容易に製造することができる。
されたことにより、バトロキソビンのアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするDNAは本明細書で具体的に
開示した方法によらなくとも、制限酵素による切断やDN
A化学合成を用いる常法により、当業者ならばきわめて
容易に製造することができる。
次に実施例によりこの発明を詳細に説明する。
実施例１（mRNAの調製） 南米産ガラガラ蛇（Bothrop atrox，moojeni）の毒
腺をハサミで細切し、0.01MEDTA、２％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）、0.1Mジチオスレイトール（DTT）を含
有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（Tris・HCl）（pH9.0）に
懸濁する。この懸濁液に同量のフェノール、クロロホル
ムおよびイソアミルアルコール（50:50:2）の混液を加
えてホモジナイズし、10分間激しく攪拌後、10,000rp
m、10分間遠心分離して、水層を分離した。この水層を
同量のフェノール、クロロホルムおよびイソアミルアル
コール（50:50:2）で３回抽出後、水層に0.1倍量の2M酢
酸ナトリウム水溶液（pH5.5）と2.5倍量のエタノールを
加え、全核酸成分を沈殿させた。この沈殿を水に溶解
し、同量の4Mリチウムクロライド水溶液を加え、RNAを
沈殿させ、回収した。0.4M塩化ナトリウム、1mMEDTA、
0.1％SDSを含む10mM Tris・HCl（pH7.4）に平衡化させ
たオリゴ（dT）セルロースカラムに上記RNAを加え、上
記と同じTris・HClでカラムを洗浄後、1mMEDTA、0.1％S
DSを含む10mM Tris・HCl（pH7.4）でmRNAを溶出した。
この溶出液に0.1倍量の2M酢酸ナトリウム水溶液（pH5.
5）と2.5倍量のエタノールを加え、ポリ（Ａ）mRNAを沈
殿させ、回収した。
腺をハサミで細切し、0.01MEDTA、２％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）、0.1Mジチオスレイトール（DTT）を含
有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（Tris・HCl）（pH9.0）に
懸濁する。この懸濁液に同量のフェノール、クロロホル
ムおよびイソアミルアルコール（50:50:2）の混液を加
えてホモジナイズし、10分間激しく攪拌後、10,000rp
m、10分間遠心分離して、水層を分離した。この水層を
同量のフェノール、クロロホルムおよびイソアミルアル
コール（50:50:2）で３回抽出後、水層に0.1倍量の2M酢
酸ナトリウム水溶液（pH5.5）と2.5倍量のエタノールを
加え、全核酸成分を沈殿させた。この沈殿を水に溶解
し、同量の4Mリチウムクロライド水溶液を加え、RNAを
沈殿させ、回収した。0.4M塩化ナトリウム、1mMEDTA、
0.1％SDSを含む10mM Tris・HCl（pH7.4）に平衡化させ
たオリゴ（dT）セルロースカラムに上記RNAを加え、上
記と同じTris・HClでカラムを洗浄後、1mMEDTA、0.1％S
DSを含む10mM Tris・HCl（pH7.4）でmRNAを溶出した。
この溶出液に0.1倍量の2M酢酸ナトリウム水溶液（pH5.
5）と2.5倍量のエタノールを加え、ポリ（Ａ）mRNAを沈
殿させ、回収した。
実施例２（cDNAライブラリーの調製） 実施例１で調製されたポリ（Ａ）mRNAを鋳型とし、グ
ブラー（Gubler）らの方法［Gubler et al,Gene 25,26
3（1983）に準じて、二重鎖cDNAを調製した。すなわ
ち、上記で得られたmRNA（５μｇ）を50mM塩化ナトリウ
ム、8mM塩化マグネシウム、1mMの各dATP、dCTP、dGTP、
dTTP、10mDTTを含むTris・HCl（pH8.3）に溶解させ、オ
リゴ（dT）12−18（２μｇ）（Pharmacia社製）、RNasi
n（60ユニット）（和光純薬社製）、逆転写酵素（生化
学工業製）（100ユニット）を加え、42℃に60分間保
ち、mRNA・cDNA混成体を調製した。反応終了後、反応液
をフェノール処理１回を行ない、同量の4M酢酸アンモニ
ウム、2.5倍量のエタノールを加え、mRNA・cDNA混成体
を沈殿させ、回収した。さらに、このmRNA・cDNA混成体
から、Huynhらの方法［Huynh et al，DNA Cloning Vo
l.1,PP49（1985）,IRL Press,Oxford］に準じて二重鎖c
DNAを調製した。すなわち、mRNA・cDNA混成体を5mM塩化
マグネシウム、10mM硫酸アンモニウム、100mM塩化カリ
ウム、1mMDTT、0.15mMβ−NAD、50μg/ml牛血清アルブ
ミン（BSA）、75μＭの各dATP、dCTP、dGTP、dTTPを含
む20mM Tris・HCl（pH7.4）に溶かし、E．coli RNase H
（2.5ユニット）（Pharmacia社製）、E．coli DNAポリ
メラーゼ（75ユニット）（Pharmacia社製）E．coli DNA
リカーゼ（2.5ユニット）（Pharmacia社製）を加え、13
℃に60分間さらに22℃に60分間保ち、二重鎖cDNAを調製
した。反応終了後、反応液をフェノール処理１回を行な
い、同量の4M酢酸アンモニウム、2.5倍量のエタノール
を加え、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。さらに、こ
の二重鎖cDNAを60mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウ
ム、5mMDTT、100μg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、0.
15mMの各dATP、dCTP、dGTP、dTPPを含む30mM Tris・HCl
（pH7.9）に溶かし、T4DNAポリメラーゼ（37ユニット）
（Pharmacia社製）を加え、37℃に30分間保ち、二重鎖c
DNAの両端を平滑末端（Flush ends）にした。反応終了
後、反応液を上記と同様な操作で、フェノール処理し、
エタノールにより、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。
さらに、この二重鎖DNAを80μM S−アデノシルメチオニ
ン、100μm/mlBSA、1mM EDTAを含むTris・HCl（pH8.0）
に溶かし、200ユニットのEcoRIメチラーゼを加え、37℃
に60分間保ち、二重鎖cDNAをメチル化した。反応終了
後、反応液を上記と同様な操作で、フェノール処理し、
エタノールにより、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。
さらに、この二重鎖cDNAを５μgEcoRIリンカー（Boehri
nger社製）、50mM塩化マグネシウム、5mMスペルミジ
ン、50mMDTT、1mMアデノシン３リン酸（ATP）を含む60m
M Tris・HCl（pH7.4）に溶かし、30ユニットのT4DNAリ
カーゼ（Pharmacia社製）を加え、37℃に60分間保ち、
二重鎖cDNAにEcoRIリンカーを付加した。反応終了後、
反応液を70℃に10分間保ち、次いで、０℃に冷却した。
さらに、反応液に750ユニットのEcoRI（東洋紡社製）を
加え、37℃に４時間保ち、過剰のEcoRIリンカーを分解
した。分解された過剰のEcoRIリンカーをセファロース
（Sepharose）4B（Pharmacia社製）のクロマトグラフィ
により反応液より除き、上記と同様な操作でエタノール
により、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。この二重鎖
cDNAを10mM塩化マグネシウム、1mMATP、10mMDTTを含む5
0mM Tris・HCl（pH7.4）に溶かし、EcoRIで消化したλg
t11DNA（1.5μｇ）（Promega Biotec社製）と14ユニッ
トのT4DNAリガーゼを加え、13℃に７時間保ち、組み換
えλgt11DNAを調製した。この組み換えλgt11DNAをパッ
ケージング・ミックスチャー（Packaging mixture,Vect
or Cloning Systems社製）と混合し、室温で１時間保
ち、組み換えDNAをファージ粒子内に挿入した。
ブラー（Gubler）らの方法［Gubler et al,Gene 25,26
3（1983）に準じて、二重鎖cDNAを調製した。すなわ
ち、上記で得られたmRNA（５μｇ）を50mM塩化ナトリウ
ム、8mM塩化マグネシウム、1mMの各dATP、dCTP、dGTP、
dTTP、10mDTTを含むTris・HCl（pH8.3）に溶解させ、オ
リゴ（dT）12−18（２μｇ）（Pharmacia社製）、RNasi
n（60ユニット）（和光純薬社製）、逆転写酵素（生化
学工業製）（100ユニット）を加え、42℃に60分間保
ち、mRNA・cDNA混成体を調製した。反応終了後、反応液
をフェノール処理１回を行ない、同量の4M酢酸アンモニ
ウム、2.5倍量のエタノールを加え、mRNA・cDNA混成体
を沈殿させ、回収した。さらに、このmRNA・cDNA混成体
から、Huynhらの方法［Huynh et al，DNA Cloning Vo
l.1,PP49（1985）,IRL Press,Oxford］に準じて二重鎖c
DNAを調製した。すなわち、mRNA・cDNA混成体を5mM塩化
マグネシウム、10mM硫酸アンモニウム、100mM塩化カリ
ウム、1mMDTT、0.15mMβ−NAD、50μg/ml牛血清アルブ
ミン（BSA）、75μＭの各dATP、dCTP、dGTP、dTTPを含
む20mM Tris・HCl（pH7.4）に溶かし、E．coli RNase H
（2.5ユニット）（Pharmacia社製）、E．coli DNAポリ
メラーゼ（75ユニット）（Pharmacia社製）E．coli DNA
リカーゼ（2.5ユニット）（Pharmacia社製）を加え、13
℃に60分間さらに22℃に60分間保ち、二重鎖cDNAを調製
した。反応終了後、反応液をフェノール処理１回を行な
い、同量の4M酢酸アンモニウム、2.5倍量のエタノール
を加え、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。さらに、こ
の二重鎖cDNAを60mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウ
ム、5mMDTT、100μg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、0.
15mMの各dATP、dCTP、dGTP、dTPPを含む30mM Tris・HCl
（pH7.9）に溶かし、T4DNAポリメラーゼ（37ユニット）
（Pharmacia社製）を加え、37℃に30分間保ち、二重鎖c
DNAの両端を平滑末端（Flush ends）にした。反応終了
後、反応液を上記と同様な操作で、フェノール処理し、
エタノールにより、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。
さらに、この二重鎖DNAを80μM S−アデノシルメチオニ
ン、100μm/mlBSA、1mM EDTAを含むTris・HCl（pH8.0）
に溶かし、200ユニットのEcoRIメチラーゼを加え、37℃
に60分間保ち、二重鎖cDNAをメチル化した。反応終了
後、反応液を上記と同様な操作で、フェノール処理し、
エタノールにより、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。
さらに、この二重鎖cDNAを５μgEcoRIリンカー（Boehri
nger社製）、50mM塩化マグネシウム、5mMスペルミジ
ン、50mMDTT、1mMアデノシン３リン酸（ATP）を含む60m
M Tris・HCl（pH7.4）に溶かし、30ユニットのT4DNAリ
カーゼ（Pharmacia社製）を加え、37℃に60分間保ち、
二重鎖cDNAにEcoRIリンカーを付加した。反応終了後、
反応液を70℃に10分間保ち、次いで、０℃に冷却した。
さらに、反応液に750ユニットのEcoRI（東洋紡社製）を
加え、37℃に４時間保ち、過剰のEcoRIリンカーを分解
した。分解された過剰のEcoRIリンカーをセファロース
（Sepharose）4B（Pharmacia社製）のクロマトグラフィ
により反応液より除き、上記と同様な操作でエタノール
により、二重鎖cDNAを沈殿させ、回収した。この二重鎖
cDNAを10mM塩化マグネシウム、1mMATP、10mMDTTを含む5
0mM Tris・HCl（pH7.4）に溶かし、EcoRIで消化したλg
t11DNA（1.5μｇ）（Promega Biotec社製）と14ユニッ
トのT4DNAリガーゼを加え、13℃に７時間保ち、組み換
えλgt11DNAを調製した。この組み換えλgt11DNAをパッ
ケージング・ミックスチャー（Packaging mixture,Vect
or Cloning Systems社製）と混合し、室温で１時間保
ち、組み換えDNAをファージ粒子内に挿入した。
このファージを大腸菌Y1088に感染させ、寒天プレー
ト上で、42℃に15時間保ち、増幅させ［DNA Cloning V
ol.1,pp.49（1985）,IRL Press,Oxford］、cDNAライブ
ラリーを調製した。このcDNAライブラリーは６×10７個
の独立したファージを含んでいた。
ト上で、42℃に15時間保ち、増幅させ［DNA Cloning V
ol.1,pp.49（1985）,IRL Press,Oxford］、cDNAライブ
ラリーを調製した。このcDNAライブラリーは６×10７個
の独立したファージを含んでいた。
実施例３（バトロキソビンの精製） バトロキソビン標品（Pentapharm社製）を0.1Mグリシ
ン・水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.2）で平衡化したの
ち、ヘパリン−セファロース（Heparin−Sepharose）CL
−6B（Pharmacia社製）のカラム・クロマトグラフィー
で分画した。各画分を、合成基質Pro−Phe−Arg−MCA
（ペプチド研究所製）を用いてバトロキソビン活性を測
定し、0.25M塩化ナトリウム水溶液で溶出されるバトロ
キソビン画分を得た。さらに、この画分をダイアフロー
・メンブランPM−10（Amicon社製）で限外濾過して、濃
縮した後、20mM Tris・HCl（pH8.2）に対して透析後、D
EAE−セファセル（DEAE−Sephacel）（Pharmacia社製）
のカラム・クロマトグラフィに付し、上記と同様な方法
でバトロキソビン活性を測定し、0.04M塩化ナトリウム
で溶出されるバトロキソビンを含む画分を得た。この画
分をダイアフロー・メンブランPM−10で濃縮後、100mM
塩化ナトリウムおよび10mM塩化カルシウムを含む50mM T
ris・HCl（pH8.0）で平衡化したセファデックス（Sepha
dex）Ｇ−100（pharmacia社製）で分画し、上記と同様
な方法でバトロキソビン活性を測定し、精製バトロキソ
ビン画分を得た。
ン・水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.2）で平衡化したの
ち、ヘパリン−セファロース（Heparin−Sepharose）CL
−6B（Pharmacia社製）のカラム・クロマトグラフィー
で分画した。各画分を、合成基質Pro−Phe−Arg−MCA
（ペプチド研究所製）を用いてバトロキソビン活性を測
定し、0.25M塩化ナトリウム水溶液で溶出されるバトロ
キソビン画分を得た。さらに、この画分をダイアフロー
・メンブランPM−10（Amicon社製）で限外濾過して、濃
縮した後、20mM Tris・HCl（pH8.2）に対して透析後、D
EAE−セファセル（DEAE−Sephacel）（Pharmacia社製）
のカラム・クロマトグラフィに付し、上記と同様な方法
でバトロキソビン活性を測定し、0.04M塩化ナトリウム
で溶出されるバトロキソビンを含む画分を得た。この画
分をダイアフロー・メンブランPM−10で濃縮後、100mM
塩化ナトリウムおよび10mM塩化カルシウムを含む50mM T
ris・HCl（pH8.0）で平衡化したセファデックス（Sepha
dex）Ｇ−100（pharmacia社製）で分画し、上記と同様
な方法でバトロキソビン活性を測定し、精製バトロキソ
ビン画分を得た。
実施例４（バトロキソビンのＮ末端アミノ酸配列および
Ｃ末端アミノ酸の決定） 上記で得たバトロキソビンをワクスダル（Waxdal）ら
の方法［Biochemistry 7,1959（1968）］に準じて還元
カルボキシアミノエチル化した。すなわち、バトロキソ
ビンを8M尿素、0.2％EDTAを含む4M Tris・HCl（pH8.5）
に溶かし、バトロキソビンに含まれるハーフ・シスチン
（half−cystine）の140倍量のβ−メルカプトエタノー
ルを加え、室温で６時間保ち、還元した。β−メルカプ
トエタノールの５倍量の２−ブロモエチルアミンを室温
で10分ごとに３回に分けて加えた。その後、室温で30分
間放置したのち、pHを3.0に調整した。反応終了後、反
応液を0.01M酢酸で透析し、その透析物を凍結乾燥し
て、還元カルボキシアミノエチル化バトロキソビンを調
製した。この還元カルボキシアミノエチル化バトロキソ
ビンのＮ末端アミノ酸を全自動気相アミノ酸配列決定機
（Model 470A,Applied Biosystems社製）を用いて、順
次、PTH−アミノ酸として遊離させた。遊離したPTH−ア
ミノ酸をPTH−アミノ酸分析機（Model 120A,Applied Bi
osystem社製）を用いて同定した。その結果、第１図の
ごとく、22番目までのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
また、バトロキソビンのＣ末端アミノ酸についてのヒド
ラジノリシス法［Bull．Chem Soc．Jap．29,507（195
6）］によりプロリン（Pro）と決定した。
Ｃ末端アミノ酸の決定） 上記で得たバトロキソビンをワクスダル（Waxdal）ら
の方法［Biochemistry 7,1959（1968）］に準じて還元
カルボキシアミノエチル化した。すなわち、バトロキソ
ビンを8M尿素、0.2％EDTAを含む4M Tris・HCl（pH8.5）
に溶かし、バトロキソビンに含まれるハーフ・シスチン
（half−cystine）の140倍量のβ−メルカプトエタノー
ルを加え、室温で６時間保ち、還元した。β−メルカプ
トエタノールの５倍量の２−ブロモエチルアミンを室温
で10分ごとに３回に分けて加えた。その後、室温で30分
間放置したのち、pHを3.0に調整した。反応終了後、反
応液を0.01M酢酸で透析し、その透析物を凍結乾燥し
て、還元カルボキシアミノエチル化バトロキソビンを調
製した。この還元カルボキシアミノエチル化バトロキソ
ビンのＮ末端アミノ酸を全自動気相アミノ酸配列決定機
（Model 470A,Applied Biosystems社製）を用いて、順
次、PTH−アミノ酸として遊離させた。遊離したPTH−ア
ミノ酸をPTH−アミノ酸分析機（Model 120A,Applied Bi
osystem社製）を用いて同定した。その結果、第１図の
ごとく、22番目までのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
また、バトロキソビンのＣ末端アミノ酸についてのヒド
ラジノリシス法［Bull．Chem Soc．Jap．29,507（195
6）］によりプロリン（Pro）と決定した。
実施例５（cDNAライブラリーのスクリーニング） バトロキソビンのＮ末端アミノ酸配列の２番目から12
番目のアミノ酸配列に対応する遺伝暗号を有する29mer
の合成オリゴヌクレオチド（第１図参照）を全自動DNA
合成機（Model 391A,Applied Biosystem社製）を用いて
合成した。なお、スクリーニング効率をよくするために
合成オリゴヌクレオチドの塩基の一部をデオキシイノシ
ン（Ｉ）に置き換えた［Proc．Natl．Acad．Sci．82,19
31（1985）］。
番目のアミノ酸配列に対応する遺伝暗号を有する29mer
の合成オリゴヌクレオチド（第１図参照）を全自動DNA
合成機（Model 391A,Applied Biosystem社製）を用いて
合成した。なお、スクリーニング効率をよくするために
合成オリゴヌクレオチドの塩基の一部をデオキシイノシ
ン（Ｉ）に置き換えた［Proc．Natl．Acad．Sci．82,19
31（1985）］。
cDNAライブラリーのスクリーニングはプラーク・ハイ
ブリダイゼーション法［Maniatis T.et al．Molecular
Cloning pp.320（1982）,Cold Spring Harbor Labora
tory（New York）］に準じて行なった。実施例１で得た
cDNAライブラリーを大腸菌Y1090［Huynh et al．DNA
Cloning Vol.pp.49（1985）,IRL Press,Oxford］に感染
させ、寒天平板上にまき、42℃に５時間保ち、プラーク
を形成させた。その後、寒天平板上にニトロセルロース
・フィルターをのせ、各プラークに含まれるDNAをニト
ロセルロース・フィルター上に転写した。ニトロセルロ
ース・フィルターを0.5M水酸化ナトリウム、1.5M塩化ナ
トリウム中、室温で10分間、さらに1.5M塩化ナトリウム
を含む0.5M Tris・HCl（pH7.4）中、室温で10分間処理
し、風乾後、80℃に２時間保ち、DNAを固定した。
ブリダイゼーション法［Maniatis T.et al．Molecular
Cloning pp.320（1982）,Cold Spring Harbor Labora
tory（New York）］に準じて行なった。実施例１で得た
cDNAライブラリーを大腸菌Y1090［Huynh et al．DNA
Cloning Vol.pp.49（1985）,IRL Press,Oxford］に感染
させ、寒天平板上にまき、42℃に５時間保ち、プラーク
を形成させた。その後、寒天平板上にニトロセルロース
・フィルターをのせ、各プラークに含まれるDNAをニト
ロセルロース・フィルター上に転写した。ニトロセルロ
ース・フィルターを0.5M水酸化ナトリウム、1.5M塩化ナ
トリウム中、室温で10分間、さらに1.5M塩化ナトリウム
を含む0.5M Tris・HCl（pH7.4）中、室温で10分間処理
し、風乾後、80℃に２時間保ち、DNAを固定した。
上記の29mer合成オリゴヌクレオチドの５′末端を［r
-32Ｐ］ATP（ICN社製）とT4ポリヌクレオチド・キナー
ゼ（Pharmacia社製）を用いて、32Pで標識後、フィルタ
ー上のDNAとハイブリダイズさせ、この合成オリゴヌク
レオチドとハイブリダイズするプラークを検出し、上記
スクリーニングを３回繰り返して、10個の陽性ファージ
を単離・精製した。
-32Ｐ］ATP（ICN社製）とT4ポリヌクレオチド・キナー
ゼ（Pharmacia社製）を用いて、32Pで標識後、フィルタ
ー上のDNAとハイブリダイズさせ、この合成オリゴヌク
レオチドとハイブリダイズするプラークを検出し、上記
スクリーニングを３回繰り返して、10個の陽性ファージ
を単離・精製した。
この10個の陽性ファージより、プレート・リゼート法
［Maniatis, T.et al.Molecular Cloning pp.371（198
2）,Cold Spring Harbor Laboratory（New York）］よ
り組み換えλgtllDNAを調製した。すなわち、陽性ファ
ージを大腸菌Y1090に感染させ、寒天平板上にまき、42
℃に15時間保ち、ファージを増幅させた。増幅したファ
ージを0.1M塩化ナトリウム、10mM MgSO4、0.1％ゼラチ
ンを含む50mM Tris・HCl（pH7.5）（SM緩衝液）で寒天
平板より抽出した。この抽出液に４μｇのRNaseA（Sigm
a社製）と４μgDNaseI（Sigma社製）を加え、37℃に30
分間保ち、大腸菌由来のRNA及びDNAを分解した。さら
に、この抽出液に同量の20％ポリエチレングリコール、
2M塩化ナトリウムを含むSM緩衝液［Maniatis, T.et a
l.Molecular Cloning pp.70（1982）,Cold Spring Harb
or Laboratory（New York）］を加え、０℃に１時間保
ち、ファージを沈殿させた。このファージをSM緩衝液に
懸濁させ、SDS（最終濃度0.1％）とEDTA（最終濃度5m
M）を加え、68℃に15分間保った。その後、この溶液を
フェノール処理を行ない、同量のイソプロパノールを加
え、組み換えλgtllDNAを沈殿し、回収した。
［Maniatis, T.et al.Molecular Cloning pp.371（198
2）,Cold Spring Harbor Laboratory（New York）］よ
り組み換えλgtllDNAを調製した。すなわち、陽性ファ
ージを大腸菌Y1090に感染させ、寒天平板上にまき、42
℃に15時間保ち、ファージを増幅させた。増幅したファ
ージを0.1M塩化ナトリウム、10mM MgSO4、0.1％ゼラチ
ンを含む50mM Tris・HCl（pH7.5）（SM緩衝液）で寒天
平板より抽出した。この抽出液に４μｇのRNaseA（Sigm
a社製）と４μgDNaseI（Sigma社製）を加え、37℃に30
分間保ち、大腸菌由来のRNA及びDNAを分解した。さら
に、この抽出液に同量の20％ポリエチレングリコール、
2M塩化ナトリウムを含むSM緩衝液［Maniatis, T.et a
l.Molecular Cloning pp.70（1982）,Cold Spring Harb
or Laboratory（New York）］を加え、０℃に１時間保
ち、ファージを沈殿させた。このファージをSM緩衝液に
懸濁させ、SDS（最終濃度0.1％）とEDTA（最終濃度5m
M）を加え、68℃に15分間保った。その後、この溶液を
フェノール処理を行ない、同量のイソプロパノールを加
え、組み換えλgtllDNAを沈殿し、回収した。
この組み換えDNAを100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マ
グネシウム、1mMDTTを含む50mM Tris・HCl（pH7.5）に
溶かし、10ユニットのEcoRI（東洋紡社製）を加え、37
℃に60分間保ち、反応終了後、反応液を１％アガロース
・ゲル電気泳動法［Maniatis, T.et al.Molecular Clo
ning pp.157（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory
（New York）］で分画し、分画後、ゲルを0.5μg/mlエ
チジウム・ブロマイドで染色し、cDNAインサートのサイ
ズを決定した。そのうち、最長のcDNAインサート（約1,
500bp）を常法［Maniatis, T.et al.Molecular Clonin
g pp.390（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory（Ne
w York）］に従い、プラスミドpUC13（Boehringer Mann
heim社製）のEcoRIサイトに再クローニングした。すな
わち、最長のインサートをもつ組み換えλgtllDNAを上
記の同様な方法でEcoRIで消化した。同様に、プラスミ
ドDNApUC13もEcoRIで消化した。これらの消化された組
み換えλgtllDNAとプラスミドDNApUC13を混ぜ、実施例
２と同様の条件で、T4DNAリカーゼを用いて、ライゲー
ションした。このライゲーションされた組み換えプラス
ミドDNAを用いて、大腸菌DHI［Maniatis, T.et al.Mol
ecular Cloning pp.505（1982）,Cold Spring Harbor L
aboratory（New York）］を形質転換し、アンピシリン
を含む寒天平板上にまき、形質転換した大腸菌DHIを単
離した。この形質転換された大腸菌DHIよりアルカリ・
抽出法［Maniatis, T.et al.Molecular Cloning pp.36
8（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory（New Yor
k）］に従い組み換えプラスミドDNAを調製した。すなわ
ち、大腸菌DHIを4mg/mlリゾチーム（Sigma社製）、50mM
グルコース、10mMEDTAを含む25mM Tris・HCl（pH8.0）
に懸濁させ、室温で、５分間保った。その後、２倍量0.
2N水酸化ナトリウム水溶液、１％SDSを加え、０℃に５
分間保ち、さらに、1.5倍量の5M酢酸カリウム（pH4.8）
を加え、０℃に５分間保ち、生じた沈殿を遠心分離で除
去した。得られた上清をフェノール処理１回し、組み換
えプラスミドDNAをエタノールで沈殿させ、回収した。
グネシウム、1mMDTTを含む50mM Tris・HCl（pH7.5）に
溶かし、10ユニットのEcoRI（東洋紡社製）を加え、37
℃に60分間保ち、反応終了後、反応液を１％アガロース
・ゲル電気泳動法［Maniatis, T.et al.Molecular Clo
ning pp.157（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory
（New York）］で分画し、分画後、ゲルを0.5μg/mlエ
チジウム・ブロマイドで染色し、cDNAインサートのサイ
ズを決定した。そのうち、最長のcDNAインサート（約1,
500bp）を常法［Maniatis, T.et al.Molecular Clonin
g pp.390（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory（Ne
w York）］に従い、プラスミドpUC13（Boehringer Mann
heim社製）のEcoRIサイトに再クローニングした。すな
わち、最長のインサートをもつ組み換えλgtllDNAを上
記の同様な方法でEcoRIで消化した。同様に、プラスミ
ドDNApUC13もEcoRIで消化した。これらの消化された組
み換えλgtllDNAとプラスミドDNApUC13を混ぜ、実施例
２と同様の条件で、T4DNAリカーゼを用いて、ライゲー
ションした。このライゲーションされた組み換えプラス
ミドDNAを用いて、大腸菌DHI［Maniatis, T.et al.Mol
ecular Cloning pp.505（1982）,Cold Spring Harbor L
aboratory（New York）］を形質転換し、アンピシリン
を含む寒天平板上にまき、形質転換した大腸菌DHIを単
離した。この形質転換された大腸菌DHIよりアルカリ・
抽出法［Maniatis, T.et al.Molecular Cloning pp.36
8（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory（New Yor
k）］に従い組み換えプラスミドDNAを調製した。すなわ
ち、大腸菌DHIを4mg/mlリゾチーム（Sigma社製）、50mM
グルコース、10mMEDTAを含む25mM Tris・HCl（pH8.0）
に懸濁させ、室温で、５分間保った。その後、２倍量0.
2N水酸化ナトリウム水溶液、１％SDSを加え、０℃に５
分間保ち、さらに、1.5倍量の5M酢酸カリウム（pH4.8）
を加え、０℃に５分間保ち、生じた沈殿を遠心分離で除
去した。得られた上清をフェノール処理１回し、組み換
えプラスミドDNAをエタノールで沈殿させ、回収した。
得られた組み換えプラスミドDNAを、上記と同様な方
法で、EcoRI消化法、アガロース・ゲル電気泳動法によ
り分析し、このプラスミドDNAにcDNAインサートが含ま
れていることを確認した。
法で、EcoRI消化法、アガロース・ゲル電気泳動法によ
り分析し、このプラスミドDNAにcDNAインサートが含ま
れていることを確認した。
実施例６（cDNAインサートの塩基配列の決定） 実施例５で形質転換したDHIより、実施例５と同様な
方法でcDNAインサートを含むプラスミドDNApUC13を調製
した。この組み換えプラスミドDNAを実施例５と同様な
方法で、EcoRI消化アガロース・ゲル電気泳動法で分画
した。cDNAインサートを含むゲル断片を透析チューブに
加え、1mMEDTAを含むTris・ホウ酸緩衝液存在下で電気
泳動的に溶出し、回収した。
方法でcDNAインサートを含むプラスミドDNApUC13を調製
した。この組み換えプラスミドDNAを実施例５と同様な
方法で、EcoRI消化アガロース・ゲル電気泳動法で分画
した。cDNAインサートを含むゲル断片を透析チューブに
加え、1mMEDTAを含むTris・ホウ酸緩衝液存在下で電気
泳動的に溶出し、回収した。
得られたcDNAインサートは、実施例５と同様な方法で
Hind III、BamHI、Sau3AI、HpaII（すべて東洋紡社製）
で切断した。
Hind III、BamHI、Sau3AI、HpaII（すべて東洋紡社製）
で切断した。
一方、ファージ・ベクターM13mp18とM13mp19（すべて
宝酒造社製）を同時に、HindIII、BamHI、EcoRI、AccI
（すべて東洋紡社製）で消化し、上記のcDNAインサート
断片をT4DNAリガーゼを用いて、上記のファージベクタ
ーのマルチプル・クローニングサイトに、上記と同様な
方法でサブクローニングした。
宝酒造社製）を同時に、HindIII、BamHI、EcoRI、AccI
（すべて東洋紡社製）で消化し、上記のcDNAインサート
断片をT4DNAリガーゼを用いて、上記のファージベクタ
ーのマルチプル・クローニングサイトに、上記と同様な
方法でサブクローニングした。
この組み換えM13mp18とM13mp19ファージを用い、サン
ガー（Sanger）法［Sanger,F.et al.Proc.Natl.Acad.S
ci.74.5463（1977）］に準じ、塩基配列決定キット（日
本ジーン社製）を使用し、cDNAインサートの全塩基配列
（第２図参照）を決定した。このcDNAインサートとプラ
スミドpUC13の組み換え体を含有する大腸菌DHIをエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）DHI（pBat−２）と
命名し、工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP−891
3として寄託した。
ガー（Sanger）法［Sanger,F.et al.Proc.Natl.Acad.S
ci.74.5463（1977）］に準じ、塩基配列決定キット（日
本ジーン社製）を使用し、cDNAインサートの全塩基配列
（第２図参照）を決定した。このcDNAインサートとプラ
スミドpUC13の組み換え体を含有する大腸菌DHIをエシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）DHI（pBat−２）と
命名し、工業技術院微生物工業技術研究所にFERMP−891
3として寄託した。
第１図はバトロキソビンのアミノ末端アミノ酸配列とそ
れから想定されるｍ−RNAの配列と29merのプローブの塩
基配列を示す。 第２図は本実施例で単離されたバトロキソビンのcDNAの
塩基配列と翻訳領域の塩基配列に対応するアミノ酸配列
を示す。ヌクレオチド塩基は５′から３′方向に番号を
付し、アミノ酸配列はバトロキソビンのアミノ末端のア
ミノ酸Valを１として、これを基に番号を付した。 第３図はバトロキソビンとほ乳類のセリン・プロテアー
ゼおよびクロタラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。番
号はバトロキソビンのアミノ末端アミノ酸から順次付し
た。アミノ酸配列のうち、かっこで囲む領域はバトロキ
ソビンのそれと一致していることを示す。
れから想定されるｍ−RNAの配列と29merのプローブの塩
基配列を示す。 第２図は本実施例で単離されたバトロキソビンのcDNAの
塩基配列と翻訳領域の塩基配列に対応するアミノ酸配列
を示す。ヌクレオチド塩基は５′から３′方向に番号を
付し、アミノ酸配列はバトロキソビンのアミノ末端のア
ミノ酸Valを１として、これを基に番号を付した。 第３図はバトロキソビンとほ乳類のセリン・プロテアー
ゼおよびクロタラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。番
号はバトロキソビンのアミノ末端アミノ酸から順次付し
た。アミノ酸配列のうち、かっこで囲む領域はバトロキ
ソビンのそれと一致していることを示す。
Claims (4)
- 【請求項１】一般式： ValIleGlyGlyAspGluCysAspIleAsnGluHisProPhe LeuAlaPheMetTyrTyrSerProArgTyrPheCysGlyMet ThrLeuIleAsnGlnGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCys AsnArgArgPheMetArgIleHisLeuGlyLysHisAlaGly SerValAlaAsnTyrAspGluValValArgTyrProLysGlu LysPheIleCysProAsnLysLysLysAsnValIleThrAsp LysAspIleMetLeuIleArgLeuAspArgProValLysAsn SerGluHisIleAlaProLeuSerLeuProSerAsnProPro SerValGlySerValCysArgIleMetGlyTrpGlyAlaIle ThrThrSerGluAspThrTyrProAspValProHisCysAla AsnIleAsnLeuPheAsnAsnThrValCysArgGluAlaTyr AsnGlyLeuProAlaLysThrLeuCysAlaGlyValLeuGln GlyGlyIleAspThrCysGlyGlyAspSerGlyGlyProLeu IleCysAsnGlyGlnPheGlnGlyIleLeuSerTrpGlySer AspProCysAlaGluProArgLysProAlaPheTyrThrLys ValPheAspTyrLeuProTrpIleGlnSerIleIleAlaGly AsnLysThrAlaThrCysPro で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るバトロキソビンの遺伝子。 - 【請求項２】塩基配列（Ｉ）： GTCATTGGAGGTGATGAATGTGACATAAATGAACATCCTTTC CTTGCATTCATGTACTACTCTCCCCGGTATTTCTGTGGTATG ACTTTGATCAACCAGGAATGGGTGCTGACCGCTGCACACTGT AACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGA AGTGTAGCAAATTATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAG AAGTTCATTTGTCCCAATAAGAAAAAAAATGTCATAACGGAC AAGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCAAAAAC AGTGAACACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCC AGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATTATGGGATGGGGCGCAATC ACAACTTCTGAAGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT AACATTAACCTGTTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTAC AATGGGTTGCCGGCGAAAACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAA GGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGACCCCTC ATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGT GATCCCTGTGCCGAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAG GTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGCATTATTGCAGGA AATAAAACTGCGACTTGCCCG で示される特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。
- 【請求項３】一般式： ValIleGlyGlyAspGluCysAspIleAsnGluHisProPhe LeuAlaPheMetTyrTyrSerProArgTyrPheCysGlyMet ThrLeuIleAsnGlnGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCys AsnArgArgPheMetArgIleHisLeuGlyLysHisAlaGly SerValAlaAsnTyrAspGluValValArgTyrProLysGlu LysPheIleCrsProAsnLysLysLysAsnValIleThrAsp LysAspIleMetLeuIleArgLeuAspArgProValLysAsn SerGluHisIleAlaProLeuSerLeuProSerAsnProPro SerValGlySerValCysArgIleMetGlyTrpGlyAlaIle ThrThrSerGluAspThrTyrProAspValProHisCysAla AsnIleAsnLeuPheAsnAsnThrValCysArgGluAlaTyr AsnGlyLeuProAlaLysThrLeuCysAlaGlyValLeuGln GlyGlyIleAspThrCysGlyGlyAspSerGlyGlyProLeu IleCysAsnGlyGlnPheGlnGlyIleLeuSerTrpGlySer AspProCysAlaGluProArgLysProAlaPheTyrThrLys ValPheAspTyrLeuProTrpIleGlnSerIleIleAlaGly AsnLysThrAlaThrCysPro で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るバトロキソビンの遺伝子を含有するクローニンングベ
クター。 - 【請求項４】一般式： ValIleGlyGlyAspGluCysAspIleAsnGluHisProPhe LeuAlaPheMetTyrTyrSerProArgTyrPheCysGlyMet ThrLeuIleAsnGlnGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCys AsnArgArgPheMetArgIleHisLeuGlyLysHisAlaGly SerValAlaAsnTyrAspGluValValArgTyrProLysGlu LysPheIleCysProAsnLysLysLysAsnValIleThrAsp LysAspIleMetLeuIleArgLeuAspArgProValLysAsn SerGluHisIleAlaProLeuSerLeuProSerAsnProPro SerValGlySerValCysArgIleMetGlyTrpGlyAlaIle ThrThrSerGluAspThrTyrProAspValProHisCysAla AsnIleAsnLeuPheAsnAsnThrValCysArgGluAlaTyr AsnGlyLeuProAlaLysThrLeuCysAlaGlyValLeuGln GlyGlyIleAspThrCysGlyGlyAspSerGlyGlyProLeu IleCysAsnGlyGlnPheGlnGlyIleLeuSerTrpGlySer AspProCysAlaGluProArgLysProAlaPheTyrThrLys ValPheAspTyrLeuProTrpIleGlnSerIleIleAlaGly AsnLysThrAlaThrCysPro で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るバトロキソビンの遺伝子を含むクローニングベクター
を含有する細菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61193058A JP2517241B2 (ja) | 1986-08-19 | 1986-08-19 | 遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61193058A JP2517241B2 (ja) | 1986-08-19 | 1986-08-19 | 遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6349084A JPS6349084A (ja) | 1988-03-01 |
| JP2517241B2 true JP2517241B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=16301491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61193058A Expired - Fee Related JP2517241B2 (ja) | 1986-08-19 | 1986-08-19 | 遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2517241B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| KR0127776B1 (ko) * | 1994-10-11 | 1997-12-29 | 허영섭 | 신규한 단백질 분해효소의 cDNA 서열 및 그로 부터 유래된 단백질 |
| JP2005281145A (ja) * | 2004-03-26 | 2005-10-13 | Yamada Bee Farm | ローヤルゼリー由来の新規アンジオテンシンｉ変換酵素阻害ペプチド |
| AU2007350619B2 (en) | 2007-03-30 | 2013-12-19 | Shanghai Tenry Pharmaceutical Co., Ltd. | A purified recombinant batroxobin with high specific activity |
| KR101005821B1 (ko) * | 2007-12-28 | 2011-01-05 | (주)바이오버드 | 배트록소빈의 변이 뉴클레오타이드 서열, α－인자 분비 시그널 서열 변이체 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법및 이를 이용한 배트록소빈의 제조방법 |
-
1986
- 1986-08-19 JP JP61193058A patent/JP2517241B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５１［６］（１９７６−３−２５）Ｐ．１６６３−１６６９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6349084A (ja) | 1988-03-01 |
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