KR0127776B1 - 신규한 단백질 분해효소의 cDNA 서열 및 그로 부터 유래된 단백질 - Google Patents

신규한 단백질 분해효소의 cDNA 서열 및 그로 부터 유래된 단백질

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Abstract

본 발명의 신규한 트롬빈 유사 단백질 분해효소(thrombin-like serine protease)의 cDNA 서열 및 그로부터 유래한 아미노산 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 살모사(Korean salmosa snake : Agkistrodon halys vrevicaudus)의 독샘으로 부터 분리한 신규한 트롬신 유사 단백질 분해효소의 cDNA 서열, 그로부터 유래한 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 한국산 살모사인 아그키스트로돈헬리스 브레비카우두스종의 독샘으로 부터 분리한 신규한 트롬빈 유사 단백질 분해효소의 cDNA 서열은 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량생산된 트롬빈 유사 단백질 분해효소는 혈전중 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 단백질 분해효소의 cDNA 서열 및 그로 부터 유래된 단백질
제1도는 한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리 제조과정을 나타내는 모식도이다.
제2(A)도는 cDNA 라이브러리로부터 유래한 PCR 산물의 DNA 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
제2(B)도는 PCR 산물과 다른 뱀독 세린계 단백질 가수분해효소의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
제3도는 cDNA 라이브러리의 스크리닝 결과를 나타낸 사진이다.
제4(A)도는 핼리브(Halybin)의 DNA 서열을 모식적으로 나타낸다.
제4(B)도는 핼리빈의 cDNA 서열을 나타낸다.
제4(C)도는 제4(B)도에 개시된 핼리빈의 cDNA 서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
제5도는 PCR 산물의 DNA 서열로부터 번역되는 아미노산 서열과 핼리빈의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
제6도는 핼리빈 및 공지된 뱀독 세린계 단백질 가수분해효소들의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
본 발명은 신규한 단백질 분해효소 cDNA 서열 및 그로부터 유래된 아미노산 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 살모사(Korean salmosa snake : Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘으로부터 분리한 신규한 트롬빈 유사 단백질 분해효소(thrombin-like serine protease)의 cDNA 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다.
혈전증(thrombosis)과 지혈(hemostasis)은 오랫동안 의학적으로 주요한 관심의 대상이었는바, 혈전증 치료제로서는 그 동안 유로키나제, 스트렙토키나제 및 조직형 플라스미노겐 활성화제 등이 주로 연구되고 실용화되어 왔다(참조 : H.R. Lijnen et al., Thromb. haemost., 66 : 88(1991)). 그러나, 최근에는 천연물로부터 유효성분을 추출하여 실용화하는 노력이 계속되어, 거머리, 흡혈박쥐 및 뱀독 등으로 부터 혈전층 치료제로서 사용가능한 물질들이 분리되었다(참조 : Roy T. Sawyer, Bio/Technology, 9 : 513(1991); USP 4,568,545; Stephen J. Gardell et al., J. Biol. Chem., 264 : 17947(1989); J. Meier and K. Stocker, Toxicology, 21 : 171(1991)).
이러한 차원에서, 사람의 지혈체계(hemostatic system)에 영향을 주는 것으로 알려진 뱀독소에 대해서도 비교적 자세히 연구되었으며, 지혈작용에 작용하는 다수의 독소성분이 분리되고 검정되었다. 이들 중에서 많은 물질들이 기초연구나 진단 및 치료에 실질적으로 응용되고 있는데, 특히, 피브리노펩타이드(fibrinopeptide)를 절단하여 피브리노겐(fibrinogen)으로 절단하여 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 전환시키는 트롬빈 유사 단백질 분해효소에 관햐여는 다양한 종류의 뱀독에 대한 연구결과가 발표되어 있다(참조 : J. Meier and K. Stocker, Toxicology, 21 : 171(1991)). 현재, 이 종류의 효소들로서 23종이 알려져 있으며, 4종의 경우에는 효소 전체의 아미노산 서열도 밝혀져 있는것으로 보고되고 있다.
이들 중 효소적 특성에 대하여 자세히 알려진 것으로, 랜드 헤드 스네이크(Lance head snake)라고 통칭되는 Bothrops atrox moojeni의 독에서 분리한 트롬빈 유사 단백질 분해효소인 바트록소빈(batroxobin)은 피브리겐의 피브리노펩타이드 A만을 절단하는 특성이 있다. 소량의 바트록소빈 처리시,피브리노겐을 피브린 Ⅰ(Des-A-fibrin)으로 전환되어 플라스민에 의하여 빠르게 분해되며, 그 결과 혈중의 피브리노겐 농도가 낮아진다. 또한, 플라스미드겐 활성화제(plasminogen activator)의 생성을 유도하며 혈전의 분해를 촉진하나, 다량 처리시에는 혈액응고를 유도한다. 실제적으로 전자의 성질을 이용한 경우는 데피브라제(Defibrase)라는 상품명의 디피브리노겐화 약물(defibrinogenating drug)이, 후자의 경우는 렙틸라제(Reptilase)란 상품명의 지혈제로 사용되고 있다(참조 : J. Meier and K. Stocker, Medical Use of Snake Venom Proteins, CRC Press, 136(1990)).
한편, 한국에는 14종의 뱀이 있으며, 그들 중에서 아그키스토로돈(Agkistrodon) 속의 3종만이 독소를 가지고 있는 것으로 알려져 있다(참조 : K.Y. Nah, Korean J. Surgery, 17 : 13(1975); H.K. Gloyd Proc, Biol. Soc., Washington, 85 : 577(1971)). 최근에는 흔히 살모사로 통칭되는 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agristrodon halys brevicaudus)의 독액으로부터, 39,200달톤의 트롬빈과 유사한 단백질 분해효소가 분리되었다. 이 효소는 당단백질로 323개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 글루탐산과 아스파르트산을 많이 함유한다는 것이외에, 다른 생화학적인 활성에 대해서는 자세히 규명되지 않았다(참조 : J. Sun, Y. Ren, Z. WU, Zhongguo Yike Daxue Xuebao, 16 : 276(1987); Chem. Abstr., 108 : 90629n(1988)). 이러한 가운데, 살모사의 독액으로부터 33,000달톤과 51,000달톤의 피브린 분해 단백질 분해효소(fibinolytic serine protease)가 정제되어 보고된 바 있다(참조 : K.H. Chung et al., Thromb. Haemost. THHADQ, 65 : 953(1991)).
이에, 본 발명의 발명자들은 한국산 살모사의 뱀독 cDNA 라이브러리로부터 클로닝한 트롬빈과 유사한 단백질 분해효소의 cDNA 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열이 신규한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스종의 독샘으로 부터 분리한 신규한 트롬빈 유사 단백질 분해효소의 cDNA 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 뱀독에서 분리한 세린계 단백질 가수분해효소에 잘 보존되어 있는 아미노산 부위에 대한 올리고 뉴클레오티드 플라이머들과 독샘의 cDNA 라이브러리로부터 PCR 산물을 프로브로 사용하여, 2.1kb의 트롬빈과 유사한 단백질 분해효소를 코팅하는 cDNA를 클로닝하였다. 클로닝된 cDNA는 279개의 아미노산을 코팅하는 837 뉴클레오티드의 개방 해독틀을 갖으며, 추정되는 아미노산 서열은 45개 아미노산으로 구성된 시그널 펩타이드와 234개 아미노산으로 구성된 성숙된 효소(mature enzyme)의 세린계 단백질 분해효소(이하, 편의상 핼리빈(Halybin)이라 함)로 분리됨이 확인되었다. 핼리빈은 아미노산 서열로부터 추정 분자량이 25.7kD이고, 1개의 N-글루코실화 부위(N-glycosylation site)가 있으므로, 살모사의 독액에서는 더 큰 분자량을 가지는 당단백질일 것으로 예상되며, 아미노산 성분으로부터 동전점(pI)이 5.68으로 추정되었다.
한편, 단백질의 정보검색 결과로부터, 이 세린계 단백질 가수분해 효소는 공지된 뱀독의 트롬빈 유사 단백질 분해효소들과 64 내지 71%의 아미노산 서열상의 유사성이 있음이 확인되었다. 아울러, 본 발명의 신규한 단백질은 세린계 단백질 가수분해효소의 활성부위를 구성하는 His, Asp, Ser 및 그 주변의 아미노산 서열, 그리고 N-말단 부위의 아미노산 서열이 기존에 알려진 효소들과 같이 잘 보존되어 있음이 확인되었다. 또한, 특히 이 부류에 속하는 효소들의 아미노산 서열 전체에 보존(conservation)되어 있는 12개의 시스테인이 모두 잘 보존되어 있음을 알 수 있었으므로, 본 발명의 신규한 단백질도 트롬빈과 유사한 단백질 분해활성을 가질 것으로 예상되었다.
본 발명의 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스종의 독샘으로부터 분리한 신규한 트롬빈 유사한 단백질 분해효소의 cDNA 서열은 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량생산된 단백질 가수분해효소는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리 제조
한국산 살모사 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독샘 조직을 분리하였다. 독샘을 콩알 크기의 작은 조직으로, 최소한 5개 정도를 사용하여 충분한 양의 RNA를 분리하였다. 전체 RNA의 분리는 공지된 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)를 사용하여 CsCl 쿠션(cushiong)하에서의 고속 원심분리하는 방법을 이용하였다. 전체 RNA로 부터 올리고(dT)-셀룰로스 컬럼을 2회 사용하여 poly(A)+RNA를 분리한 다음, 역전사효소, RNase H 및 E.coli DNA 중합효소 Ⅰ을 이용하여, 첫번째 및 두번째 가닥 cDNA를 제조하였다(참조 : Sambrook et al., Molecular Cloning, Znd Ed., Cold Spring harbor laboratory(1989)). 제조된 cDNA에 적절한 어댑터(adaptor)를 부착한 다음, 람다 ZAPⅡ(Stratagene, USA)에 삽입하고 실험실적 패키징(in vitro packaging)을 거쳐 라이브러리를 완성하였다. cDNA라이브러리는 106개의 독립된 플라크를 포함하는 것으로 검정되었다. 한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리를 제조하는 과정을 제1도에 모식적으로 나타내었다.
실시예 2
프로브의 제조
실시예 1에서 제조한 cDNA 라이브러리를 이용하여 트롬빈 유사 단백질 분해효소를 스크리닝하기 위한 프로브를 선정하기 위하여, 뱀독의 세린계 프로테아제들에서 잘 보존된 아미노산 부위에 대한 올리고 뉴크렐오티드 프라이머들을 합성하였다 : 즉, 5'-프라이머로는 뱀독의 N-말단 영역의 공통된 아미노산 서열의 VIGGDEC에 근거하여, 5'-GTIATIGGIGGNGA(T/C)GA(A/G)TG-3' 서열을 보유하는 올리고 뉴클레오티드를 사용하였고; 3'-프라이머는 세린계 단백질 가수분해효소의 활성부위 중위 하나인 히스티딘 주위의 아미노산 서열 WVLTAAH에 근거하여 5'-TGIGCIGCIGTNA(A/G)NACCCA-3' 서열을 보유하는 축퇴 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다(상기에서, I는 이노신율; N은 A,G,C,T의 각 뉴클레오티드를 나타낸다).
실시예 1에서 제조된 cDNA 라이브러리를 주형으로 상기 프라이머들과 Taq DNA 중합효소를 이용하여 95℃에서 1분, 48℃에서 2분, 72℃에서 1분씩의 조건으로, 25회의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)을 수행한 결과,120bp PCR 산물을 수득하였다. 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pCRⅡ(Invitrogen, USA)에 서브클로닝하고 DNA 서열을 결정하였다(제2(A)도).
DNA 서열로부터 유래된 아미노산 서열(PCR 120)은 공지된 세린계 단백질 가수분해효소, 즉 Bothropsatrox moojeni로 부터 분리한 BATROXOBIN 및 Trimeresurus flavaviridis로부터 분리한 FLAVOXOBIN과 65내지 72%의 상동성을 보유함이 확인되었다(제2(B)도). 제2(A)도 및 제2(B)도에서, 밑줄친 부분은 PCR 프라이머로부터 유래된 DNA의 서열이고, 박스부분은 cDNA 라이브러리 스크리닝시 사용한 DNA의 서열이다.
따라서, 실제 cDNA 라이브러리의 스크리닝에는 120bp PCR 산물의 중간부분에 해당하는 염기서열 5'-CGTTCCCTTGTTGTCTTGTTTAACTCCAGCG-3'을 사용하였다.
실시예 3
cDNA 라이브러리의 스크리닝
실시예 1에서 제조한 cDNA 라이브러리를 E. coli XL-1 Blue 위에 플레이팅하여 전체 1.2×105개의 플라크를 얻었다. 플라크를 2회에 걸쳐 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 다음, 막을 변성용액(0.5N NaOH, 1.5M NaCl)에 2분, 중화용액(0.5M Tris HCl(pH 7.4), 1.5M NaCl)에 5분간 처리하고, 2×SSC에서 30초간 세척하였다. 막을 80℃ 진공하에서 2시간 처리한 다음, 5×SSC, 20mM 인산화 나트륨(pH 6.5), 3% SDS, 100㎍/㎖ 연어 정액(salmon sperm) DNA 를 포함하는 용액에서 68℃, 3시간 전혼성화(prehybridization)하였다. 실시예 2에서 선정한 프로브를 [γ-32P]ATP로 말단 표지(end-label)하여 1×106cpm/㎖의 농도로 상기의 전혼성화 용액에 첨가한 후, 53℃에서 6시간 동안 혼성화하였다. 그런 다음, 막을 3×SSC, 3% SDS, 10mM 인산화 나트륨(pH 6.5)을 포함하는 용액에서 53℃, 1시간 동안 세척한 후, 제차 1×SSC, 1% SDS 포함 용액에서 53℃, 1시간 동안 세척하였다. 막은 증감 스크린(intensifying screen)하에서 X-ray 필름(Agfacurix)에 -70℃, 24시간 노출시켰다. 그 결과 X-ray 필름의 복사물(duplicate)에서, 동일 위치에 스폿(spot)이 형성된 11개의 양성 클론(positive clone)을 찾아내었다(제3도). 제3도의 사진은 동일한 플레이트로부터 2장의 니트로 셀룰로스막으로 옮겨진 파아지 플라크를 혼성화한 다음, X-ray 필름에 노출시킨 결과를 나타내는데, 각 막의 동일한 위치에 스폿이 나타난 셀룰로스막으로 옮겨진 파아지 플라크를 혼성화한 다음, X-ray 필름에 노출시킨 결과를 나타내는데, 각 막의 동일한 위치에 스폿이 나타난 양성 결과를 나타낸다. 낮은 희석 배수도 플레이팅하여 2차, 3차 스크리닝을 위와 동일한 방법으로 반복한 결과, 각각 독립된 플라크를 얻었다.
각 클론은 pBluescript 벡터(Stratagene, USA)에 서브클로닝하였으며, 제한 효소의 처리결과, 그 삽입체 크기가 0.5 kb에서 2.1kb로 확인되었다. 각 클론이 부분 서열을 결정하여 11개의 클론이 동일한 유전자의 일부를 보유하고 있는 것으로 확인되어, 그 중 가장 긴 2.1kb의 클론 전체의 서열을 결정하였다.
실시예 4
DNA 서열의 결정
2.1kb의 클론은 시쿼나제(Sequenase, USB, USA)를 사용한 디데옥시 종결(dideoxy termination)법(참조 : Sambrook et al. Molecular Cloning, 2nd Ed., (1989))으로 벡터상의 프라이머와 cDNA 서열에서 유래한 프라이머를 사용하여 양쪽 상에서 서열이 결정되었다. 서열의 결정은 전체 삽입체 2.1kb중, 전체 개방 해독틀을 포함하는 부위에 대하여 중심적으로 수행하였으며, 그 결과 1003bp의 서열을 결정하였다. 서열이 결정된 부분을 49bp의 5'-미번역 부위(untranslation region), 837bp의 개방 해독틀(ORF : open reading frame) 및 114bp의 3'-미번역 부위를 포함하고 있다(제4(A)도).
실시예 5
DNA 서열의 분석
DNA 서열을 결정한 결과, 이 cDNA는 279개의 아미노산을 코팅하는 837뉴클레오티드의 개방 해독틀을 갖는 것으로 확인되었으며, 아울러 279개의 아미노산으로 이루어진 이 단백질은 45아미노산의 시그날 펩타이드와 234 아미노산이 성숙 효소로 구성되어 있는 것으로 예상되었다(제4(B)도). 성술된 효소는 아미노산 서열로 부터의 분자량이 25.7kD이고, 1개의 가능한 N-글리코실화 영역을 보유하므로, 살모사의 독액에서는 더 큰 분자량을 가지는 당단백질일 것으로 예상되었으며, 아미노산 성분으로부터 등전점(pI)이 5.68으로 추정되었다.
이 클론(HALYBIN)과 실시예 2에서 얻어진 120bp의 PCR산물의 DNA 서열(PCR 120)및 아미노산 서열을 비교한 결과, 3개의 뉴클레오티드와 그에 따른 3개의 아미노산이 상이하다는 것을 발견하였다(제5도). 이 결과로부터 살모사 독액에는 약간의 아미노산 서열이 다른 매우 유사한 세린계 단백질 가수분해효소가 존재하리라 예상할 수 있었다. 제5도에서, (*)표시는 보존된 아미노산을; ($) 표시는 그 중 활성부위를; (#)표시는 보존된 시스테인 잔기를 각각 나타낸다.
한편, Swiss-Port을 이용한 단백질의 정보검색 결과로부터, 이 세린계 단백질 가수분해효소는 공지된 뱀독의 트롬빈 유사 단백질 분해효소들과 64 내지 71%의 아미노산 서열상의 유사성이 있음이 확인되었다(제6도). 아울러, 본 발명의 신규한 단백질은 세린계 단백질 가수분해효소의 활성부위를 구성하는 His, Asp, Ser(제6도에서 $로 표시됨) 및 그 주변의 아미노산 서열, 그리고 N-말단 부위의 아미노산 서열이 기존에 알려진 효소들과 같이 잘 보존되어 있음이 확인되었다. 또한 특히 이 부류에 속하는 효소들의 아미노산 서열 전체에 보존(conservation)되어 있는 12개의 시스테인(제6도에서 #로 표시됨)이 모두 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 신규한 단백질도 트롬빈과 유사한 단백질 분해활성을 가질 것으로 예상되어, 핼리빈(Halybin)이라 부르기로 결정하였다.
이상에서 상세히 설명하였듯이,본 발명은 한국산 살모사인 아그키 스트로돈 핼리스 브레비카우두스종의 독샘으로부터 분리한 신규한 트롬빈 유사 단백질 분해효소의 cDNA서열 및 그로부터 유래한 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스종의 독샘으로 부터 분리한 신규한 트롬빈 유사 단백질 분해효소의 cDNA 서열은 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량생산된 단백질 가수분해효소는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (4)

  1. 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘으로부터 분리된 다음과 같은 서열 전체 또는 일부를 가지는 트롬빈 유사 단백질 분해 효소의 cDNA :
  2. 제1항에 개시된 cDNA 의 라이브러리 스크리닝에 사용하는 다음과 같은 서열을 가지는 프로브 :
    5'-CGTTCCCTTGTTGTCTTGTTTAACTCCAGCG-3'
  3. 제1항에 개시된 cDNA로부터 유래한 다음과 같은 서열 전체 또는 일부를 가지는 아미노산 서열 :
    5 10 15 20 25 30
    1M A L I R V L A N L L I L Q L S Y D L L H Y T V C N I W V I
    31A S E T N L K T A Q K S S E L V V G G D E C N I N E H R S L
    61V V L F N S S G L I C S G T L I N Q E W V L T A A H C D S K
    91N F Q M L F G V H S K K I L N E D E Q T R D P K E L F I C P
    121N K K K D D E L D K D I M L I R L D S P V S N S E H I A P L
    151S L P S S S P T V D S V C R I M G W G T I K P A D E T Y P D
    181VPHCANINILDHTVCRAAYPVLLAGSSTLC
    211AGTQQGGKDTCVGDSGGPLICNGQIQGIVS
    241WGAHPCGQGSKPGVYTKVFDHLDWIKSIIA
    271GNTAVTCPP*
  4. 제3항의 아미노산 서열을 가지는 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘으로 부터 분리된 트롬빈 유사 단백질 분해효소.
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