KR100189698B1

KR100189698B1 - 신규한 피브린 분해효소의 cdna

Info

Publication number: KR100189698B1
Application number: KR1019960023013A
Authority: KR
Inventors: 정광회; 고유석; 황재훈; 김두식; 윤영대; 문홍모
Original assignee: 허영섭; 재단법인목암생명공학연구소
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1999-06-01
Also published as: JPH104977A; EP0814164A2; US5821106A; EP0814164A3; KR980002266A

Abstract

본 발명은 한국산 살모사(Korean salmosa snake: Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘으로부터 분리한 신규한 피브린 분해효소(direct-acting fibrinolytic serine protease)인 살모나제(Salmonase)의 cDNA 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 살모나제에 관한 것이다. 살모나제의 cDNA는 233개의 아미노산을 코딩하는 699개 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 그로 부터 번역되는 단백질은 77개의 아미노산과 156개의 아미노산으로 구성된 두개의 서브유닛으로 이루어진다. 본 발명의 살모나제 cDNA는 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발전될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량생산된 살모나제는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 피브린 분해효소의 cDNA

본 발명은 신규한 피브린 분해효소(direct-acting fibrinolytic serine protease)의 cDNA에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 살모사(Korean salmosa snake : Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘으로 부터 분리한 신규한 피브린 분해효소의 cDNA 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 피브린 분해효소에 관한 것이다.

혈전증(thrombosis)과 지혈(hemostasis)은 오랫동안 의학적으로 주요한 관심의 대상이있는 바, 혈전증 치료제로서는 그 동안 유로키나제, 스드렙토키나제 및 조직형 플라스미노겐 활성화제 등이 주로 연구되고 실용화 되어왔다(참조:H.R. Lijnen et al., Thromb. Haemost.,66:88(1991)). 그러나, 최근에는 천연물로 부터 유효성분을 추출하여 실용화하는 노력이 계속되어, 거머리, 흡혈박쥐 및 뱀독 등으로 부터 혈전증 치료제로서 사용가능한 물질들이 분리되었다(참조:Roy T. Sawyer, Bio/Technology,9:513(1991); USP 4,568,545; Stephen J. Gardell et a1., J. Biol. Chem.,264:17947(1989); J. Meier and K. Stocker, Toxico1ogy, 21:171(1991); E.Siigur and J. Siigur, Biochem. Biophys. Acta, 1074:223(1991); A.Randolph et al. , Protein Science, 1:590(1992)).

이러한 차원에서, 사람의 지혈체계(hemostatic system)에 영향을 주는 것으로 알려진 뱀독소에 대해서도 비교적 자세히 연구되었으며, 지혈작용에 작용하는 다수의 독소성분이 분리되고 검정되었다. 이들 중에서 많은 물질들이 기초연구나 진단 및 치료에 실질적으로 응용되고 있는데, 특히, 피브리노펩타이드(fibrinopeptide)를 절단하여 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 전화시키는 트롬빈 유사 단백질 분해효소(thrombin-like serine protease)에 관하여는 다양한 종류의 뱀독에 대한 연구결과가 발표되어 있다(참조: J. Meier and K. Stocker, Toxicology,21:171(1991)). 현재, 이 종류의 효소들로서 23종이 알려져 있으며, 4종의 경우에는 효소 전체의 아미노산 서열도 밝혀져 있는 것으로 보고되고 있다.

이들 중 효소적 특성에 대하여 자세히 알려진 것으로, 랜스 헤드스네이크(Lance head snake)라고 통칭되는 Bothrops atrox moojeni 독에서 분리한 트롬빈 유사 단백질 분해효소인 바트록소빈(Batroxobin)은 피브리노겐의 피브리노펩타이드 A만을 절단하는 특성이 있다. 소량의 바트록소빈 처리시, 피브리노겐은 피브린 I(Des-A-fibrin)으로 전환되어 플라스민에 의하여 빠르게 분해되며, 그 결과 혈중의 피브리노겐 농도가 낮아진다. 또한, 소량의 바트록소빈 처리시 형성된 피브린 I는 지혈작용을 하지 못하고, 생체내에서 혈전으로 인식되어 생리적으로 혈전용해계의 활성을 자극하여 혈전의 분해를 촉진하나, 다량 처리시에는 혈액응고를 유도한다. 실제적으로 전자의 성질을 이용한 경우는 데피브라제(Defibrase)라는 상품명의 디피브리노겐화 약물(defibrinogenating drug)이, 후자의 경우는 렙틸라제(Reptilase)란 상품명의 지혈제로 사용되고 있다(참조: J. Meier and K.Stocker, Medical Use of Snake Venom Proteins, CRC Press, 136(1990)).

뱀독소에는 상기의 트롬빈 유사 단백질 분해효소 외에도 피브린 분해효소가 존재하여, 매우 제한적이기는 하나 그에 대한 연구가 진행되어 최근 몇가지 피브린 분해효소의 특성이 보고되고 있다. 예를 들면, 웨스턴 다이아몬드백 래틀 스네이크(Western Diamondback Rattle Snake)의 독에서 분리된 아트록세이즈(Atroxase)는 분자량이 23,5OO달톤이며, 2O6개의 아미노산으로 구성된 단일사슬의 염기성(pI:9.6) 단백질로 보고되고 있다(참조:T.W. Willis and A. T. Tu, Biochem, 27:4769(1988)). 특히, 시스테인(cysteine) 잔기가 없으며, 금속이온인 아연(zinc)을 포함하고 있으므로, 일종의 메탈로프로테아제(metalloprotease)로 추정되고 있다. 미국의 카이론사(Chiron사)에서 개발중인 피브롤레이즈(Fibrolase)는 아그키스트로돈 콘터트릭스(Agkistrodon Contortrix) 독에서 분리되었으며, 이 효소는 203개의 아미노산으로 구성된 분자량 22,891달톤의 단일사슬 메탈로프로테아제로서, 6개의 시스테인 잔기를 포함하고 있다(참조: A. Randolph et al, Protein Science, 1:590(1992)). 또한, 비페라 레베티나(Vipera lebetina)의 뱀독에서 분리한 레베테이즈(Lebetase)는 214개 아미노산으로 구성된 단일사슬의 메탈로프로테아제인 것으로 보고되고 있다(참조: E. Siigur and J. Siigur, Biocllem. Biophys. Acta, 1074:223(1991)).

한편, 힌국에는 14종의 뱀이 있으며, 그들 중에서 아그키스트로돈(Agkistrodon) 속의 3종만이 독소를 가지고 있는 것으로 알려져 있다(참조: K.Y. Nah, Korean J. Surgery, 17:13(1975); H.K. Gloyd, Proc, Biol. Soc., Washington, 85:577(1971)). 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brevicaudus) 독액에서 처음 보고된 분자량 39,200달톤의 피브린 분해효소는 323개의 아미노산으로 구성된 단일사슬의 당단백질로서, 글루탐산과 아스파르트산을 다량 함유한다는 것 이외에, 다른 생화학적인 활성에 대해서는 아직까지 자세히 규명되고 있지 않다(참조: J. Sun et al., Chem. Abstr., 108:90629n(1988)).

아울러, 아그키스트로돈 핼리스 브래비카우두스의 독액으로부터 51,000달톤의 피브린 분해효소가 정제되어 보고된 바 있다(참조: K.H. Chung et al., Thromb. Haemost. THHADQ, 65:953(1991)). 또한, 본 발명자들은 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독액에는 전기 51,000달톤의 피브린 분해 단백질 분해효소보다 더욱 혈전용해능력이 있는 31,000달톤의 신규한 피브린 분해 효소(direct-acting fibrinolytic serine proteinase)를 분리 정제하는데 성공하였다. 이 효소를 '살모나제(Salmonase)'라 명명하였고, 그의 구조적 특성을 조사해 본 바, 16,000달톤과 17,000달톤의 두개의 서브유닛(subunit)이 이황화결합으로 연결된 당단백질임이 확인되었다(참조: 대한민국 특허공개 제 95-871호).

이에, 본 발명자들은 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 뱀독 cDNA 라이브러리로 부터 피브린 분해효소인 살모나제의 cDNA를 클로닝하였고, 그 cDNA의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열이 신규하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독샘으로 부터 분리한 신규한 피브린 분해효소(살모나제)의 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 피브린 분해효소(살모나제)의 cDNA로부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 피브린 분해효소를 제공하는 것이다.

제1도는 한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리 제조과정을 나타내는 모식도이다.

제2도는 살모나제 cDNA의 염기서열을 나타낸다.

제3도는 제2도에 개시된 살모나제 cDNA의 염기서열로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

제4도는 살모나제 및 공지된 뱀독 세린계 단백질 가수분해효소들의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 아그키스트로돈 핼리스 브례비카우두스의 뱀독에서 분리한 세린계 단백질 가수분해효소의 N-말단 아미노산 부위에 대한 올리고 뉴클레오티드 프라이머들과 독샘의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)시켜, 피브린 분해효소인 살모나제 cDNA를 클로닝하였다. 클로닝된 cDNA는 233개의 아미노산을 코딩하는 699개 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 그로부터 번역되는 단백질은 77개의 아미노산과 156개의 아미노산으로 구성된 두개의 서브유닛으로 나누어지는 것으로 추정된다. 또한, 살모나제는 cDNA로 부터 유추되는 아미노산 서열로 부터의 추정 분자량이 26kDa이고, 1개의 N-글리코실화 부위(N-glycosylation site)가 있었다.

한편, 단백질의 정보검색 결과로 부터, 살모나제는 공지된 뱀독의 세린계 단백질 가수분해효소들과 54 내지 68%의 아미노산 서열상의 유사성이 있음이 확인되었다. 아울러, 본 발명의 살모나제는 세린계 단백질 가수분해효소의 활성부위를 구성하는 His, Asp, Ser 및 그 주변의 아미노산 서열 그리고 N-말단 부위의 아미노산 서열이 기존에 알려진 효소들과 같이 잘 보존되어 있음이 확인되었다. 또한, 특히 이 부류에 속하는 효소들의 아미노산 서열 전체에 보존(conservation)되어 있는 12개의 시스테인중 11개의 시스테인이 모두 잘 보존되어 있음을 알 수 있었고, 두개의 서브유닛으로 절단되는 부분에 위치한 나머지 하나의 시스테인은 보존되지 않아, 77번째 아르기닌과 더불어 이 시스테인의 변형이 이량체(dimer) 형성에 중요할 것으로 예상되었다.

본 발명의 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독샘으로 부터 분리한 신규한 살모나제의 cDNA는 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량생산된 살모나제는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제안되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

(실시예 1)

한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리 제조

한국산 살모사 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독샘 조직을 분리하였다. 독샘은 콩알 크기의 작은 조직으로, 최소한 5개 정도를 사용하여 충분한 양의 RNA를 분리하였다. 전체 RNA의 분리는 공지된 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)를 사용하여 CsCl 쿠션(cushion) 하에서의 고속 원심분리하는 방법을 이용하였다. 전체 RNA로 부터 올리고(dT)-셀룰로스 컬럼을 2회 사용하여 poly(A)+RNA를 분리한 다음, 역전사효소, RNase H 및 E.coli DNA 중합효소 I을 이용하여, 첫번째 및 두번째 가닥 cDNA를 제조하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)). 제조된 cDNA에 적절한 어댑터(adaptor)를 부착한 다음, 람다 ZAPII(Stratagene, USA)에 삽입하고 실험실적 패키징(in vitro packaging)을 거쳐 라이브러리를 완성하였다. cDNA 라이브러리는 10⁶개의 독립된 플라크를 포함하는 것으로 검정되었다.

한국산 살모사의 독샘 cDNA 라이브러리를 재조하는 과정은 재 1도에 모식적으로 나타내었다

(실시예 2)

살모나제 cDNA의 클로닝

실시예 1에서 제조한 cDNA 라어브러리로 부터 살모나제 cDNA를 다음과 같이 2가지로 나누어 클로닝하였다.

살모나제를 구성하는 두개의 서브유닛 중 분자량이 큰 서브유닛을 클로닝하기 위하여, 5'-프라이머로는 분자량이 큰 서브유닛의 N-말단 영역의 아미노산 서열인 NYNQW에 근거하여, 5'-AA(T/C)TA(T/C)AA(T/C)CA(A/G)TTG-3' 서열을 보유하는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하였고, 3'-프라이머로는 세린계 단백질 가수분해효소의 C-말단 부위의 아미노산 서열인 DWIQSII에 근거하여 5'-AT(A/T/G)ATGCT(C/T)TG(A/T/G)CA(A/G)TC-3' 서열을 보유하는 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다.

실시예 1에서 제조된 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 상기 프라이머들과 Taq DNA 중합효소를 이용하여 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 39℃에서 1분), 연장(extension, 72℃에서 1분)을 30회 진행시키는 PCR을 수행한 결과, 450bp PCR 산물을 수득하였다. 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pCRII(Invitrogen, USA)에 서브클로닝하고 염기서열을 결정하였다.

아울러, 살모나제를 구성하는 두개의 서브유닛 중 분자량이 작은 서브유닛을 클로닝하기 위하여, 5' 프라이머로는 분자량이 작은 서브유닛의 N-말단 아미노산 서열인 VIGGDEC에 근거하여, 5'-GTIATIGGIGGNGA(T/C)GA(A/G)TG-3' 서열을 보유하는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하였고 (이때, I는 이노신; 및, N은 A, G, C 또는 T를 각각 나타낸다), 3' 프라이머로는 앞서 사용한 NYNQW 아미노산 서열에 근거하여 제조한 축퇴 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열의 을리고뉴클레오티드 즉, 5'-TT(A/G)AT(A/G)TT(A/G)GT(T/C)AAC-3를 사용하였다. 실시예 1에서 제조된 cDNA 라이브러리를 주형으로 상기 프라이머들과 Tap DNA 중합효소를 이용하여 변성(94℃에서 30초), 결합(48℃에서 1분), 연장(72℃에서 30초)을 3O회 진행시키는 PCR을 수행한 결과, 250bp PCR 산물을 수득하였다. 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pCRII(Invitrogen, USA)에 서브클로닝하고 DNA서열을 결정하였다.

(실시예 3)

실시예 2에서 수득한 PCR 산물들은 시쿼나제(Sequenase, USB, USA)를 사용한 디데옥시 종결(dideoxy termination)법(참조:Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed.,(1989))으로 벡터상의 프라이머와 cDNA 서열에서 유래한 프라이머를 사용하여 양쪽 상에서 서열이 결정되었다.

살모나제 cDNA의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 결정한 결과(참조: 제2도 및 제3도), 살모나제 cDNA는 233개의 아미노산을 코딩하는 699개 뉴클레오티드를 갗는 것으로 확인되었으며, 아울러 233개의 아미노산으로 이루어진 살모나제는 1번 아미노산부터 77번 아미노산까지의 77개 아미노산과 78번 아미노산부터 233번 아미노산까지의 156개 아미노산 두개의 서브유닛으로 구성된 성숙 효소로 예상되었다. 성숙된 효소는 아미노산 서열로 부터의 분자량이 26kDa이고, 1개의 가능한 N-글리코실화 영역을 보유하므로, 살모사의 독액에서는 더 큰 분자량을 가지는 당단백질일 것으로 예상되었으며, 아미노산 성분으로 부터 등전점(pI)이 5.04로 추정되었다.

한편, Swiss-Prot을 이용한 단백질의 정보검색에서, 살모나제 cDNA로 부터 번역되는 아미노산 서열은 공지된 세린계 단백질 가수분해효소, 즉 BATROXOBIN(참조: Itoh, N. et al., J. Biol. Chem., 263:7628-7631(1988)), FLAVOXOBIN(참조: Shieh, T. C. et al., J. Biochem.(Tokyo) 103:596-605(1988)) 및 ANCROD(참조: Hatton, M. W. C., Chem. J., 131:799-807(1973))와 54 내지 68%의 상동성을 보유함이 확인되었다(참조:제4도). 제4도에시, (*) 표시는 보존된 아미노산을; ($) 표시는 그중 활성부위를; (#) 표시는 보존된 시스테인 잔기를 각각 나타낸다.

아울러, 본 발명의 살모나제는 세린계 단백질 가수분해효소의 활성 부위를 구성하는 His, Asp, Ser(제4도에서 $로 표시됨) 및 그 주변의 아미노산 서열, 그리고 N-말단 부위의 아미노산 서열이 기존에 알려진 효소들과 같이 잘 보존되어 있음이 확인되었다. 또한, 특히 이 부류에 속하는 효소들의 아미노산 서열 전체에 보존되어 있는 12개의 시스테인중 11개의 시스테인(제4도에서 #로 표시됨)이 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다. 시스테인이 보존되어 있지 않은 73번 위치와 성숙한 효소에서 절단되는 부위로 추정되는 77번 아르기닌은 본 발명의 살모나제가 공지된 이 부류의 효소들과 달리 두개의 서브유닛으로 구성되는 구조적 요인을 제공한다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스종의 독샘으로 부터 분리한 신규한 피브린 분해효소 살모나제의 cDNA 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 살모나제를 제공한다. 살모나제의 cDNA는 233개의 아미노산를 코딩하는 699개 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 그로 부터 번역되는 단백질은 77개의 아미노산과 156개의 아미노산으로 구성된 두개의 서브유닛으로 이루어진다. 본 발명의 살모나제 cDNA는 재조합 대장균, 효모, 배큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있므며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 살모나제는 혈전증 치료제 및 지혈제의 제조에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims

한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brev-

icaudus)의 독샘 cDNA 라이브러리로 부터 분리한 하기와 같은 염기서열을 가지는 피브린 분해효소 살모나제(Salmonase)의 cDNA :
제1항에 있어서, 하기와 같은 올리고 뉴클레오티드 2쌍을 프라이머로 하여 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독샘 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되는 것을 특징으로 하는 살모나제의 cDNA:

상기에서, I는-이노신; 및, N은 G, A, T 또는 C를 나타낸다.
제1항의 피브린 분해효소 살모나제의 cDNA로부터 번역되는 하기와 같은 아미노산 서열을 가지는 살모나제:
제3항에 있어서, 77번 Arg과 78번 Asn 사이에서 절단된 두 개의 서브유닛으로 존재하는 것을 특징으로 하는 살모나제.