KR100899173B1

KR100899173B1 - 인간 유래 조직형 플라스미노겐 활성화 인자의 대량발현용 재조합 유전자 및 그 단백질의 재구성 방법

Info

Publication number: KR100899173B1
Application number: KR1020030056597A
Authority: KR
Inventors: 정광회; 손영덕; 안수현; 최원석; 고유석
Original assignee: (주)바이오버드
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2009-05-26
Also published as: KR20050018231A

Abstract

본 발명은 인간유래 조직형 플라스미노겐 활성화 인자 (tissue plasminogen activator, 이하 tPA)를 미생물 균주에서 대량 발현 시킬 수 있는 재조합 유전자와 그로부터 생산된 tPA단백질의 제조방법에 관한 것이다.

Description

인간 유래 조직형 플라스미노겐 활성화 인자의 대량 발현용 재조합 유전자 및 그 단백질의 재구성 방법{Recombinant gene for mass production of Human tissue type plasminogen activator and protein refolding method thereof}

도 1은 실시예1에 사용된 인간 플라스미노젠 활성화 인자 (tPA)의 cDNA를 클로닝 및 재조합 발현벡터를 조성하는 과정을 나타낸다.

도 2는 실시예1에서 클로닝된cDNA에서 천연형 tPA단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드서열을 나타낸다.

도 3은 실시예2에서 천연형 tPA유전자를 이용하여 단백질 생산에 사용되는 발현벡터 pwtPA를 나타낸다.

도 4는 실시예3에서 천연형 tPA단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드서열의 대장균 코돈 활용도(codon usage)를 나타낸다.

도5는 실시예 4에서 tPA 단백질의 코돈 활용도를 대장균에서 극대화한 재조합 유전자로 치환하는 반응을 나타낸다.

도 6는 실시예4를 통하여 tPA 단백질의 코돈 활용도를 대장균에서 극대화한 재조합 유전자로 변형시킨 전후의 염기서열 변화를 나타낸다.

도 7은 실시예4에서 변형된 재조합 tPA유전자를 이용하여 단백질 생산에 사용되는 발현벡터 pMtPA를 나타낸다.

도 8은 실시예4조성된 발현벡터 pMtPA에 삽입된 재조합 tPA유전자의 전체 염기서열을 나타낸다.

도 9는 실시예 5에서 재조합 발현벡터pMtPA를 이용하여 대장균에서 tPA 단백질을 발현시킨 SDS-PAGE 및 tPA항체를 이용한 면역블롯 결과를 나타낸다.

도 10은 실시예 6에서 생산된 tPA의 단백질을 재구성시에 다양한 첨가제에 의한 tPA의 활성 최적화를 선별해낸 조건을 나타낸다.

도 11은 실시예 6에서 생산된 tPA 단백질의 재구성시 다양한 pH에 의한 tPA의 활성 최적화를 선별해낸 조건을 나타낸다

도 12은 실시예 6에서 생산된 tPA 단백질의 재구성시 다양한 리독스 커플 비율에 의한 tPA의 활성 최적화를 선별해낸 조건을 나타낸다

도 13은 실시예 6에서 생산된 tPA 단백질의 재구성시 온도에 의한 tPA의 활성 최적화를 선별해낸 조건을 나타낸다

도 14는 실시예 6에서 생산된 tPA 단백질의 재구성시 샤페론 비율에 의한 tPA의 활성 최적화를 선별해낸 조건을 나타낸다

도 15은 실시예 7에서 재구성된 재조합 tPA와 동량의 천연형 tPA의 피브린 분해능을 비교한 것을 나타낸다.

생체내 혈액속에는 출혈에 의한 혈액 손실을 방지하기 위한 혈액 응고계와 이를 조절하는 혈전 용해계의 정밀한 조절에 의한 균형을 유지하고 있다. 혈액응고계는 내인적 경로와 외인적 경로가 제10인자 (factor X)을 공통으로 경유하여 프로 트롬빈을 활성화하고 활성화된 트롬빈에 의해 피브리노젠을 피브린으로 전환시켜 형성되는 피브린 중합체을 중심으로 혈전이 생성된다. 이렇게 형성된 혈전은 생성 부위에서 손상조직의 재건이 이루어 진 후에는 제거되어야 하는데 이때 혈전 용해계가 작용을 하게 된다. 인체에서 혈전을 형성하는 피브린을 단백질 분해하는 효소인 플라스민은 전구 물질인 플라스미노젠이 플라스미노젠 활성화 인자들인 tPA 또는 uPA에 의하여 활성형으로 전환 된다. 인체의 경우 혈중에 존재하는 플라스미노젠은 분자량 약90kDa의 세린계 단백질 분해효소(serine protease)의 전구효소(zymogen)로서 561번 알기닌 (arginine)과 562번 발린(valine) 아미노산 서열이 플라스미노젠 활성화 인자들에 의하여 절단되어 활성형의 플라스민으로 전환된다. 이때 피브린 혈전에 결합된 플라스미노젠을 선택적으로 전환 시키는 것이 혈전용해 효율 을 증가 시키고 비특이적 전신출혈을 방지하는 관건이 된다.

tPA는 콜렌 (Collen D, Nature 301(5897), 214-221, 1983)등에 의하여 인체 유래의 단백질과 유전자가 분리되었다. 이후에 여러 연구진들에 의하여 재조합 대장균, 효모 및 동물세포등에서 재조합 단백질의 생산이 시도되었으며, 주로 재조합 대장균 또는 동물세포로부터 생산된 tPA들이 임상에서 혈전 용해 치료제로 상용화 되어 전세계적으로 이용되는 의약품이 되었다. 지난 10여년간에 걸친 임상적용에서 재기된 문제점들인 혈전 특이성, 혈액 내에서 반감기 등을 개선한 변이체들의 개발이 오늘날까지 이어지고 있다. 또한 tPA를 재조합 단백질로 생산하기 위한 다양한 발현체계가 개발 되어왔고 이러한 발현 체계는 크게 미생물과 동물세포배양을 이용하는 체계로 양분되어 개발이 이루어져 왔다. 특히 최근에까지 임상에서 상용화 되어 있는 치료제의 경우 동물세포 배양을 이용한 생산방식의 제품들이 시장을 점유하고 있는데 이는 고비용의 생산 원가에도 불구하고 tPA의 단백질 3차 구조를 효율적으로 구성(folding)할 수 있고 당쇄(glycosylation)를 형성하여 천연형에 가깝게 발현이 되기 때문이다. 이에 비하여 미생물을 이용한 tPA의 단백질 발현 체계 중에서 재조합 대장균은 단백질 발현 시에 진핵생물 유래의 유전자인 tPA의 전사(transcription)후의 번역(translation)과정 중에 원핵세포 (prokaryotic cell)인 대장균에서 단백질로의 번역효율이 유전자 코돈의 빈도 차이로 인해 낮은 단백질 발현 현상을 나타낸다. 이를 해결하기 위하여 대장균에서 낮은 빈도의 아미노산 코딩 중에서 알기닌을 인식할 수 있는 외래tRNA 유전자를 갖는 재조합 대장균 균주를 이용하여 단백질의 번역을 향상시키는 방법등( Semin Thromb Hemost; 2001:27: 325-336)이 연구 되었다. 재조합 대장균을 이용하여 발현된 tPA의 단백질은 대부분 3차 구조가 비활성 상태의 봉입체(inclusion body)형태로 생산되는 이를 다시 시험관내에서 단백질 구조의 재구성(refolding)하는 단계에서 여러 가지 비활성의 중간체를 형성하여 발현 이후의 공정에서 생산경비가 증가하는 경우가 보고 되고 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 대장균에서 대량 발현이 가능한 재조합 tPA 유전자 및 그 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 대장균에서 발현된 재조합 tPA 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 조직형 플라스미노젠 활성화인자(tPA)의 성숙형 단백질의 아미노말단의 염기서열 내에서 코돈이 치환된 서열목록 1의 조직형 프라스미노겐 활성화 인자 재조합 유전자를 제공한다.

또 본 발명은 서열목록 1의 서열과 제한 효소 BamHI부위를 포함하는 서열목록 2의 재조합 tPA 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 서열목록2의 재조합 유전자를 포함하는 발현벡터 pMtPA를 제공하며, 본 발현벡터로 형질 전환된 대장균 세포를 제공한다. 본 발명은 숙주세포로 대장균세포 외에도 Bacillus 류가 바람직하며, 대장균세포 EMtPA (KCCM 10479)가 가장 바람직하다.

또한 본 발명은 (a) 제4항 또는 제5항의 대장균에서 재조합 tPA 봉입체를 대량 발현시키는 단계; (b) 상기 대장균에서 발현된 재조합 tPA 봉입체를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 단백질 봉입체에 단백질 해체 용액을 처리하는 단계; 및 (d) 상기 해체용액에 용해된 재조합 단백질을 리폴딩 반응 혼합물을 처리하고 리폴 딩 조건을 진행하는 단계를 포함하는 tPA단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에서 상기의 리폴딩 반응은 pH 8.5~9.5, 수크로스, 아르기닌 및 트윈 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제 하에서 수행하는 것이 바람직하며, 또 상기의 리폴딩 반응은 10 mM GSH :1~3 mM GSSG의 리독스 커플 및/또는 20~30℃에서 수행하는 것이 바람직하다.

또한 본 제조방법에서 (d)과정의 리폴딩 반응혼합물에 샤페론(PDI)을 더욱 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명을 간단히 설명한다.

본 발명은 인간 유래 tPA재조합 단백질을 원래 단백질의 성질에는 아무런 영향을 미치지 않으면서도 대장균 내에서 대량 발현 할 수 있도록 tPA 유전자를 변형시킨 재조합 유전자와 그로부터 대량 생산된 단백질의 활성을 복원하는 방법에 관한 것이다.

즉 본 발명은 인간유래 조직형 플라스미노겐 활성화 인자 (tissue plasminogen activator, 이하 tPA)를 미생물 균주에서 대량 발현 시킬 수 있는 재조합 유전자와 그로부터 생산된 tPA단백질의 제조방법에 관한 것이다. 인간 유래 천연형 tPA의 유전자는 재조합 대장균에서 발현 효율이 극히 낮아 대량생산에 사용이 불가능한 것에 착안하여 재조합tPA단백질의 번역효율을 저해하는 성숙형 tPA 유전자의 아미노 말단부 코돈을 대장균에 최적화한 변이체를 만든 결과 단백질 아미노산 서열에는 변화를 주지 않으면서도 대장균에서 대량 발현이 가능한 tPA재조합 유전자를 개발하였다. 또한 이를 이용하여 발현된 tPA단백질을 활성화시킬 수 있는 재구성(refolding)조건을 색출하여 처리한 결과 기존의 천연형과 동등한 혈전 용해능을 갖는 재조합tPA생산체계를 완성하였다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: 인간 유래 tPA의 cDNA 유전자 클로닝

인간 유래 tPA를 재조합 단백질로 발현시키기 위하여 그의 cDNA 유전자를 인간 유래 제대 정맥 내피세포로부터 RNA를 추출하여 이로부터 cDNA를 합성하였다. 인간 유래 제대 정맥 내피세포(HUVEC: hunan umverical vein endothelial cell)를 20% 우혈청 배지에서 5% 이산화탄소 37℃조건하에서 배양한 후(1.2x10⁷ cell)에 배양액을 제거하고 세포에 PBS완충용액을 첨가하여 1회 세척하고RNA 추출용액(Ultraspec II, Biotecx Lab. Inc. USA)용액을 직접 가한다. RNA 추출용액에 녹은 세포용액을 4℃에 5분간 보관하고 RNA 추출용액 1ml당 0.2ml의 클로로포름을 첨가한 후 15초간 섞어 준다. 다시 이를 4℃에 5분간 보관하고 12,000g로 15분간 원심분리 한다. 분리된 상층액을 취하여 그 체적의 0.5배의 이소프로필알콜을 첨가하고 전체 체적의 0.05배의 RNA 결합 수지(RNAtrackTM resin)를 30초간 섞어준다. 1분간에 걸쳐 수지를 원심분리하고 액체를 제거한 후75% 에틸알콜로 2회 세척을 한다. 알코올제거하고 긴급히 수지를 건조 시킨 다음 수지에 RNAase 제거 처리된 정제 증류수를 가하여 RNA를 용출 시킨 다음 분광광도계를 이용하여RNA의 정량 및 순도를 측정한다. 이로부터 정제한 인간 제대정맥 내피세포의 RNA를 이용 하여 cDNA를 합성하기 위해 total RNA 1ug에 25mM MgCl₂, 10X 역전사반응 완충용액, 10mM dNTP, RNAse 저해제, 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 AMV역전사효소등(Reverse Transcription System , Promega Co. USA)을 가하여 cDNA합성반응을 42℃에서 15분간 수행한다. 반응 후 99℃에서 5분간 가열하고 반응물을 0-5℃에서 보관하여 AMV역전사효소를 불활성화시키고 또한 합성된 cDNA와의 결합을 억제 시킨다. 이를 -20 ℃에 보관하거나 목표유전자의 중합효소 연쇄반응(PCR)증폭의 주형(template)로 사용한다. 이 프라이머들의 염기서열은 tPA 분비 펩티드 프라이머(S) 5'-ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGT-3'(서열목록 3) 및 성숙형 tPA아미노말단 (N): 5'-TCTTACCAAGTGATCTGCAGAGATGAA-3'(서열목록 4)이며 단백질의 카르복실 말단의 안티센스 프라이머인 (C): 5'- TCACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCA -3'(서열목록 5)로 합성한 후 전술한 tPA cDNA를 주형으로 하여 프라이머 S와 C(분비펩티드를 포함한 tPA) 또는 N과 C(성숙형 tPA)를 각각 반응 최종농도0.2pmole, dNTP 0.2nM, 1x ExTaq DNA중합효소반응 완충용액( Takara Co. JAPAN) 및 1 unit의 ExTaq DNA중합효소를 섞은 후 중합효소 연쇄 반응 장치 (PCR, Robo Cycler, Stratagene USA)에서 94℃ 1분 55℃ 1분, 72℃ 1분30초의 30주기로 반응을 수행한다. 이들 각각 반응에서 얻은 약 1.6kbp의 DNA절편들을 분리하여 pGEMT easy (3.01kbp)의 TA-클로닝 좌위에 T4DNA 연결효소를 이용하여 삽입하고 DNA염기서열 분석한 결과 인간유래 tPA의 성숙형 단백질(527a.a)을 코딩하는cDNA임을 확인하였다 (도 2).

실시예 2: 조직형 플라스미노젠 활성화 인자 cDNA 유전자의 발현벡터 조성

조직형 플라스미노젠 활성화 인자 cDNA 유전자를 재조합 단백질로 발현시키기 위하여 재조합 단백질 발현용 벡터인 pET22b(5.4kbp)의 T7 프로모터의 하류(down-stream)에 tPA cDNA 유전자를 삽입하였다. 이를 위해 이를 위해서tPA cDNA에서 단백질 분비서열(secretion sequence)를 제거한 아미노말단의 첫번째 아미노산인 세린(serine) 앞에 번역 개시 메티오닌(methionine)코돈인 ATG서열과 클로닝을 용이하게 하는 NdeI 제한효소 좌위가 형성될 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. tPA cDNA의 절편을 올리고 뉴클레오티드 프라이머 NdeI (5'-CATATGTCTTACCAAGTGATCTGCAGAGATGAA-3';서열목록 6)와HindIII (5'-AAGCTTATCACGGTCGCATgTTGTCACGAATC-3';서열목록 7)를 이용하여 PCR을 수행하고 tPA 유전자에 NdeI과 HindIII 제한효소 서열을 형성시킨 후 pGEMTeasy 벡터에 삽입하고 이 벡터 DNA를 제한효소 NdeI과 HindIII로 절단한 약 1.6kb의 tPA cDNA절편을 pET-22b발현벡터의 NdeI과 HindIII부위로 삽입하였다. (도 3참조) 이 과정으로 완성된 벡터를 pwtPA(7.0kbp)라고 명명하였다.

실시예 3: 천연형 조직형 플라스미노젠 활성화 인자 cDNA 유전자의 발현

실시예2에서 조성한 플라스미드(pwtPA )를 대장균 BL21 DE3(PlyS) 균주에 루비디움 클로라이드(RbCl2)를 이용하여 형질전환 시키고 항생제 앰피실린 첨가된 루리아 보태니(LB) 고체배지에서 선별하였다. 이를 통해 얻어진 단일 콜로니를 LB 액상 배지에서 세포밀도가 600nm 에서 약 0.2~0.3 흡광도에 도달하는 시점에서 최 종 0.5~1mmM의 이소프로필-베타-갈락토피라노사이드(IPTG )를 첨가한 후 약 3시간 더 37 ℃에서 진탕 배양을 실시한다. IPTG를 첨가한 배양체외 비첨가한 대조군의 대장균 세포를 일부 수획하여 세포를 깬 후 SDS-폴리아크릴아마이드 단백질 전기영동을 실시한 후 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색을 통해IPTG 첨가를 통해 약 59kDa크기의 신생 단백질 밴드의 생성을 기준으로 발현 여부를 판단하였다. 아울러 이 단백질 전기영동 젤을 웨스턴 블롯을 실시하여 tPA 단백질에 대한 항체를 반응시켜 단백질의 발현 여부를 재확인 하였다. 그 결과 천연형의 tPA 단백질 코딩 유전자는 대장균 발현 체계에 원핵생물 대 진핵 생물간의 단백질 번역에 있어서 상이한 빈도를 갖는 유전자 코돈으로 이루어져 단백질의 번역 효율이 대장균 내에서 현저히 저하됨을 추정할 수 있었다. 특히 인간 유래 tPA 단백질 내의 아미노산 코돈에서 아미노말단 부위에 알기닌(argine; AGG/AGA), 이소루신 (isolecine: ATA), 세린 (serineTCA )등의 아미노산이 대장균 내에서는 사용 빈도가 3 ~ 10 % 미만으로 단백질 번역(translation) 효율 매우 낮은 코돈으로 이루어져 있음을 확인하였다. (도 4)

실시예 4:조직형 플라스미노젠 활성화 인자 cDNA 유전자의 단백질 번역 효율을 증대 시키기 위한 유전자 변형.

실시예3에서 확인한 인간 유래 tPA 단백질 번역 효율을 증대시키기 위해 tPA의 초기 아미노산 약 40개서열 내에 속하는 코돈들을 목표로 하여 낮은 번역효율을 갖는 (AGA), (ATA), (TCA), (CGG)코돈에 대한 대장균의 전이RNA (transfer RNA)가 선호하는 아미노산 알기닌(argine:CGC), 이소루신 (isolecine: ATT), 세린 (serine;AGC )등의 코돈으로치환할 수 있는 변형 뉴클레오티드 프라이머를 설계 합성하였다. 그림 도 5에 묘사된 바와 같이 프라이머 들은 분비 신호펩티드(secretion signal peptide)를 제거한 tPA의 아미노산 제40번의 글라이신(glycine: GGC)코돈으로부터 5'-말단을 중합반응 연쇄반응을 통하여 프라이머를 연장시키면서 아미노산 코돈을 대장균 세포에서 고빈도로 작용하는 코돈으로 치환하게 설계하였다. 이때 사용된 프라이머들의 염기서열은 프라이머 1번(methionine1번- methionine14번 : 5'- CAT ATG TCT TAC CAA GTG ATC TGC CGC GAT GAA AAA ACG CAG ATG -3';서열목록 8), 2번(glutamine 4번-tyrosine16번: 5'-CAA GTG ATC TGC CGCGAT GAA AAA ACG CAG ATG ATT TAC-3';서열목록 9), 3번(arginine 8번- glutamine 20번: 5'- CGC GAT GAA AAA ACG CAG ATG ATT TAC CAG CAA CAT CAG -3';서열목록 10), 4번(isoleucine 15번-leucine 20번: 5'- ATT TAC CAG CAA CAT CAG AGC TGG CTG CGC CCT GTG CTC -3';서열목록 11), 5번 (serine 21번- tyrosine 34번: 5'- AGC TGG CTG CGC CCT GTG CTC CGC AGC AAC CGC GTG GAA TAT -3';서열목록 12), 6 번(leucine 27번- glycine 40번: 5'- CTC CGC AGC AAC CGC GTG GAA TAT TGC TGG TGC AAC AGT GGC -3';서열목록 13)으로 합성하였다. 이를 실시 예2)의 pwtPA벡터DNA를 주형으로 합성프라이머들 중에서 6번 프라이머와 실시 예2의 HindIII 프라이머: 5'-AAGCTTATCACGGTCGCATGTTGTCACGAATC-3'를 중합반응 연쇄반응은 함께 30번 주기로 반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 약1.6kbp의 절편을 1% 아가로스 전기영동으로 분리하고 회수하여 다시 이 중합효소 연쇄반응 산물을 주형으로 프라이머5번과 역시 프라이머HindIII로 30번 주기의 중합효소 연쇄반응을 수행하고 증폭산물을 1% 아가로스 전기영동으로 회수하는 방식으로 프라이머 4번에서 1번까지의 각각의 프라이머들과 프라이머 HindIII와의 PCR반응을 시켜서 전체 123bp내에 포함된 아미노산 코돈을 치환하였다(제5도). 최종 프라이머1번과 HindIII로 증폭된 DNA절편을 pGEMTeasy 클로닝 벡터에 삽입 시킨 후 DNA염기서열 분석을 확인하였고 그 염기서열은 제6도(서열목록 1)와 같다. 더불어 mutant tPA 유전자 내부에 제한효소 BamHI 좌위를 생성시켜 wild type클론과 제한효소 절단을 통한 확인을 용이하게 하기 위하여 186 Glycine (GGG)과 187 Serine (TCA)을 GGA TCC로 치환할 수 있는 프라이머 BHN (5'-GGATCCATTCCCAAAGTAGCAGTCAC-3';서열목록 14)과 BHC(5'-GGATCCTACCGTGGCACGCACAG-3';서열목록 15)를 합성하였다. 이들을 이용하여 mutant tPA를 주형으로 프라이머 NdeI-BHN 과 BHC-HindIII 조합의 PCR반응을 각각 수행하여 tPA N-말단부의564bp와 C-말단부 1023bp에 해당하는 PCR 산물을 각각 얻은 후 이를pET22b벡터의 NdeI-HindIII벡터절편에 NdeI-BamHI 564bp절편과 BamHI-HindIII 1023절편을 섞어 T4 DNAligase와 반응을 시킨 후 얻어진 벡터를 제한효소 분석하고 pMtPA(도 7) 이라 명명하였고 염기서열 분석(도 8, 서열목록 2)으로 최종 확정하였다.

실시예5: 단백질 번역효율 최적화된 조직형 플라스미노젠 활성화 인자 cDNA 유전자의 발현

실시예4에서 완성된 벡터를 pMtPA를 대장균 BL21 DE3(plyS) 균주에 루비디움 클로라이드(RbCl2)방법을 이용하여 형질전환 시키고 항생제 앰피실린 첨가된 루리아 보태니(LB) 고체배지에서 선별하였다. 이를 통해 얻어진 단일 콜로니를 LB 액상 배지에서 세포밀도가 600nm 에서 약 0.2~0.3 흡광도에 도달하는 시점에서 최종 0.5~1mmM의 이소프로필-베타-갈락토피라노사이드(IPTG )를 첨가한 후 약 3시간 더 37 ℃에서 진탕배양을 실시한다. IPTG를 첨가한 배양체외 비첨가한 대조군의 대장균 세포를 일부 수획하여 세포를 깬 후 SDS-폴리아크릴아마이드 단백질 전기영동을 실시한 후 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색을 하고 IPTG 첨가를 통해 약 59kDa크기의 신생 단백질 밴드의 생성을 기준으로 발현 여부를 판단하였다. 아울러 이 단백질 전기영동 젤을 웨스턴 블롯을 실시하여 tPA 단백질에 대한 항체를 반응시켜 단백질의 발현 여부를 재확인 하였다 . 이와 같이 단백질의 발현을 수행하고 실시의 예4에서 발현에 이용된 천연형 유전자 발현 벡터(pwtPA)와 단백질 발현 양을 비교하였다. 그 결과 제9도에 나타난 바와 같이 SDS-PAGE 상에서 레인 1은 분자량 마커 (BioRad, USA), 레인2는 천연형 cDNA를 갖는 pwtPA, 레인 3 재조합 클론인 pMtPA 레인4는 동물세포유래 tPA (Actilyse)를 나타낸다. 이와 같이 tPA 단백질이 천연형 유전자 (pwtPA)에서는 발현이 되지 않던 59kDa 신생 단백질을 재조합 유전자(pMtPA)클론에서 확인하였다. 또한 이를 대조군으로 천연형의 동물세포주 유래 tPA인 Actilyse (Boehringer Ingelhei, Germany)와 비교 면역블롯 (Western Blot)에서도 레인 1은 pwtPA 레인 2는 pMtPA 레인 3은 Actilyse로서 발현이된 pMtPA와 대조군 Actilyse만이 tPA항체(American Diagnostica, USA)와 반응함을 확인하였다. 이때 반응한 두 tPA 단백질간의 분자량 차이는 대장균 유래의 재조합 단 백질이 당쇄화(glycosylation)되어 있지 않음을 나타낸다. 이와 같이 재조합 단백질의 발현이 확인된 tPA 발현 벡터 pMtPA로 형질전환된 대장균 균주(EpMtPA)를 국제기탁기관인 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 유림빌딩 사단법인 한국 미생물보존센터에 2003년 3월 25일 기탁번호(KCCM 10479)로 기탁하였다.

실시예6: 조직형 플라스미노젠 활성화 인자 재조합 단백질의 분리.

실시예6에서 발현된 tPA 재조합 단백질은 대장균 내에서 발현되어 천연형의 단백질과는 달리 단백질의 활성을 갖지 못하는 불활성 상태의 3차 구조를 갖는 비수용성(water-insoluble) 봉입체(inclusion body)를 형성한다. 이러한 단백질을 다시 해체하고 최적의 재구성(refolding)반응 조건을 선별하여 tPA의 활성을 회복시킨 후 천연형 단백질과의 효소 활성을 비교 분석하였다. 이를 위해 재조합 tPA의 봉입체를 대장균에서 대량 발현 시킨 후 배양 균체를 회수하여 그람 세포 당 2ml의50mM Tris.HCl pH7.8, 0.1mM EDTA, 25% sucrose완충용액을 가하고 라이소자임 (lysozyme)0.2mg /ml을 첨가 한 후 약 90분간 얼음 욕조에서 반응시킨다. 이 반응체에 20mM의 MgCl₂와 50ug/ml의 DNase I을 첨가하고 약 90분간 얼음 욕조에서 반응시킨다. 반응 총 체적의 1.5배의 파쇄용액 (lysis buffer: 20mM Tris.HCl pH 7.8, 0.2M NaCl, 1% Deoxycholic acid, 1.6% Nonidet P-40, 2mM EDTA, 0.5mM DTT)을 가하여 15분간 얼음 욕조에서 반응시킨다. 반응을 마친 후 12,000rpm으로 20분간 원심 분리하여 상층액과 침전된 봉입체를 분리한다. 비수용성 단백질 봉입체를 다시2% Deoxycholic acid, 1mM EDTA, 0.5mM DTT 용액으로 세척하고 원심 분리한다. 다음 0.5% Titon X-100 1mM EDTA 0.5mM DTT로 세척하고 원심 분리한 후 3차 증류수로 1회 세척하여 단백질 봉입체 침전물을 분리한다. 분리된 단백질 침전물을 단백질 해체용액(unfolding solution: 8M Urea, 50 mM DTT(pH 8.0)를 초기 배양세포 그람 당 1ml을 가하여 침전물이 완전히 용해될 때까지 4℃에서 반응 시킨다. 육안으로 불용성 부유물이 최소화 된 시점에 다시 원심 분리하여 상등액을 회수하고 단백질 정량을 실시한다. 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 통해 분리된 tPA의 분자량과 추출한 단백질의 순도를 쿠마시 브릴리언트 블루 염색과 웨스턴 블럿으로 확인하였다.

실시예7: 조직형 플라스미노젠 활성화 인자 재조합 단백질의 재구성 조건 탐색

단백질 해체용액에 용해된 재조합 tPA단백질의 3차 구조 재구성(refolding ) 반응 을 수행하기 위하여, refolding 시의 적정 농도를 50~500㎍/ml의 조건에서 검색한 결과 100㎍/ml의 조건에서 가장 좋은 효율을 나타내었으며, refolding 조건 선별 키트(EasyFolder 3.1 , BioBud Co. 대한민국)에서 100㎍/ml농도의 단백질 농도로 재구성 조건을 탐색하였다. 그 결과로 찾아진 재구성 조건을 바탕으로 하여, 단백질 3차 구조 재구성에 영향을 미치는 요소들로 알려진 pH, 리독스 커플 (redox couple), 온도, 첨가제, 샤페론(Protein disulfide isomerase (PDI)등의 세부조건을 달리하여 가장 좋은 재구성 조건을 찾았다. 도 10에 나타낸 다섯 가지 리폴딩 첨가제(비첨가, 아르기닌, 수크로스, 프롤린, 트윈 20)와 도 11의 pH 조건 (pH 7~10)과 도 12의 리독스 커플 (비첨가, 10 mM GSH :1~3 mM GSSG)과 도 13의 온도 조건(4~37℃) 그리고 도 14의 샤페론(PDI) (1:1~10(PDI:Unfolded protein))을 처리한 조건을 조합한 조건에서 가장 좋은 재구성 조건을 탐색하였다. 이상의 조건을 처리한 반응물들에 대하여 재구성 효율을 분석하기 위한 방법으로, tPA가 인식하는 펩티드 기질의 서열을 지니는 chromogenic substrate(H-D-Ile-Pro-Arg-pNA)를 첨가하여 분해 시 나타내는 흡광도를 측정하는 방법을 사용하였으며, 리폴딩 반응 후 3, 6, 12, 24 그리고 48 시간이 지났을 때 효소의 활성도를 분석해 보았다.

The parameters, V = Total volume, v = sample volume, A = absorbance at 405nm,

The extinction coefficient of pNA at 405 nm = 9600 mol ^-1 · l · cm ^-1

1 nkat = the conversion rate of 1 x 10 ^-9 mol/sec

그 결과로 tPA는 pH 8.5~9.5, 첨가제 (수크로스, 아르기닌, 트윈 20)의 첨가, 리독스 커플의 존재(10 mM GSH :1~3 mM GSSG) 시 그리고 20~30℃에서 가장 좋 은 재구성 효율을 나타내었다. 또한 그리고 샤페론(PDI)의 첨가 시 첨가 농도에 비례하여 재구성 효율이 증가하였다.

실시예8 : 재조합 tPA와 천연형 tPA와의 피브린 분해능 비교

실시예7로부터 단백질 재구성된 재조합 tPA의 피브린 분해능을 비교해 보기 위해 기존에 상품화 되어 있는 천연형 tPA와 동량 단백질 대비 피브린 용해 활성을 비교하였다. 0.7% 피브리노젠(녹십자, 한국)에 트롬빈(Sigma, USA)을 1unit/ml로 첨가하여 피브린을 형성시킨 플레이트에 재조합 tPA와 천연형 tPA를 동량의 단백질을 희석하여 점적 한 후 37℃에서 30분간 반응하여 분해된 피브린의 면적을 서로 비교하였다 (도 15). 또한 비특이적 반응 여부를 확인할 수 있는 대조군으로 플라스미노젠이 제거된 피브리노젠(Sigma.USA)으로 만든 피브린 플레이트에서 반응시킨 결과 두 종류의 tPA모두 피브린을 분해하지 않음을 확인하였다. 도 15에서 나타난 바와 같이 대장균에서 생산되어 분리 및 재구성과정을 거친 재조합tPA는 천연형의 tPA와 동등한 활성을 갖고 있음을 확인하여 형전용해 치료제로 이용이 가능함을 재확인하였다.

본 발명은 이상의 구성들에서 알 수 있는 바와 같이, 천연형의 tPA 단백질의 아미노 말단의 염기서열을 대장균에서 단백질 코돈 활용도를 최적화한 재조합 tPA 유전자 변이체를 이용하여 대장균에서 대량 발현이 가능하도록 하였으며 이를 이용해 tPA 재조합 단백질의 활성이 천연형과 동등한 생물학적 활성을 유지함으로 인해 tPA의 대량생산을 가능케 하였으며 이를 이용한 혈전용해제의 경제적인 생산 방법을 제공할 수 있다.

<110> BIOBUD Co., Ltd.:CHUNG KWANG HOE <120> Recombinant gene for mass production of Human tissue type plasminogen activator and protein refolding method thereof <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant tPA gene comprising substituted codon <400> 1 catatgtctt accaagtgat ctgccgcgat gaaaaaacgc agatgattta ccagcaacat 60 cagagctggc tgcgccctgt gctccgcagc aaccgcgtgg aatattgctg gtgcaacagt 120 ggc 123 <210> 2 <211> 1590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant tPA gene comprising BamHI site <400> 2 atgtcttacc aagtgatctg ccgcgatgaa aaaacgcaga tgatttacca gcaacatcag 60 agctggctgc gccctgtgct ccgcagcaac cgcgtggaat attgctggtg caacagtggc 120 agggcacagt gccactcagt gcctgtcaaa agttgcagcg agccaaggtg tttcaacggg 180 ggcacctgcc agcaggccct gtacttctca gatttcgtgt gccagtgccc cgaaggattt 240 gctgggaagt gctgtgaaat agataccagg gccacgtgct acgaggacca gggcatcagc 300 tacaggggca cgtggagcac agcggagagt ggcgccgagt gcaccaactg gaacagcagc 360 gcgttggccc agaagcccta cagcgggcgg aggccagacg ccatcaggct gggcctgggg 420 aaccacaact actgcagaaa cccagatcga gactcaaagc cctggtgcta cgtctttaag 480 gcggggaagt acagctcaga gttctgcagc acccctgcct gctctgaggg aaacagtgac 540 tgctactttg ggaatggatc cgcctaccgt ggcacgcaca gcctcaccga gtcgggtgcc 600 tcctgcctcc cgtggaattc catgatcctg ataggcaagg tttacacagc acagaacccc 660 agtgcccagg cactgggcct gggcaaacat aattactgcc ggaatcctga tggggatgcc 720 aagccctggt gccacgtgct gaagaaccgc aggctgacgt gggagtactg tgatgtgccc 780 tcctgctcca cctgcggcct gagacagtac agccagcctc agtttcgcat caaaggaggg 840 ctcttcgccg acatcgcctc ccacccctgg caggctgcca tctttgccaa gcacaggagg 900 tcgcccggag agcggttcct gtgcgggggc atactcatca gctcctgctg gattctctct 960 gccgcccact gcttccagga gaggtttccg ccccaccacc tgacggtgat cttgggcaga 1020 acataccggg tggtccctgg cgaggaggag cagaaatttg aagtcgaaaa atacattgtc 1080 cataaggaat tcgatgatga cacttacgac aatgacattg cgctgctgca gctgaaatcg 1140 gattcgtccc gctgtgccca ggagagcagc gtggtccgca ctgtgtgcct tcccccggcg 1200 gacctgcagc tgccggactg gacggagtgt gagctttccg gctacggcaa gcatgaggcc 1260 ttgtctcctt tctattcgga gcggctgaag gaggctcatg tcagactgta cccatccagc 1320 cgctgcacat cacaacattt acttaacaga acagtcaccg acaacatgct gtgtgctgga 1380 gacactcgga gcggcgggcc ccaggcaaac ttgcacgacg cctgccaggg cgattcggga 1440 ggccccctgg tgtgtctgaa cgatggccgc atgactttgg tgggcatcat cagctggggc 1500 ctgggctgtg gacagaagga tgtcccgggt gtgtacacca aggttaccaa ctacctagac 1560 tggattcgtg acaacatgcg accgtgataa 1590 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tPA secreted peptide primer(S) <400> 3 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature type tPA N-terminal primer <400> 4 tcttaccaag tgatctgcag agatgaa 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal antisense primer <400> 5 tcacggtcgc atgttgtcac gaatcca 27 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer NdeI <400> 6 catatgtctt accaagtgat ctgcagagat gaa 33 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer HindIII <400> 7 aagcttatca cggtcgcatg ttgtcacgaa tc 32 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No.1(Met 1-Met 14) <400> 8 catatgtctt accaagtgat ctgccgcgat gaaaaaacgc agatg 45 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No.2(Glu 4-Tyr 16) <400> 9 caagtgatct gccgcgatga aaaaacgcag atgatttac 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No.3(Arg 8- Gln 20) <400> 10 cgcgatgaaa aaacgcagat gatttaccag caacatcag 39 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No.4(Ile 15-leu 20) <400> 11 atttaccagc aacatcagag ctggctgcgc cctgtgct 38 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No.5(Ser 21- Tyr 34) <400> 12 agctggctgc gccctgtgct ccgcagcaac cgcgtggaat at 42 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer No.6(leu 27- Gly 40) <400> 13 ctccgcagca accgcgtgga atattgctgg tgcaacagtg gc 42 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BHN <400> 14 ggatccattc ccaaagtagc agtcac 26 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BHC <400> 15 ggatcctacc gtggcacgca cag 23

Claims

인간 조직형 프라스미노겐 활성화 인자(tPA)의 성숙형 단백질을 아미노산 변화없이 대량 발현하게 하게 하기 위하여 코드하는 폴리뉴크레오타이드의 5‘말단 염기서열이 서열목록 1에 기재된 염기서열로 변형된 서열을 함유하는 조직형 프라스미노겐 활성화 인자 재조합 유전자.
제1항의 서열과 제한 효소 BamHI부위를 함유하는 서열목록 2의 재조합 tPA 유전자.
제2항의 재조합 유전자를 함유하는 도 7에 기재된 발현벡터.
제3항의 발현벡터로 형질 전환된 대장균 세포.
제 4항에 있어서,

상기의 세포는 EMtPA (KCCM 10479).
(a) 제4항 또는 제5항의 대장균에서 재조합 tPA 봉입체를 대량 발현시키는 단계;

(b) 상기 대장균에서 발현된 재조합 tPA 봉입체를 분리하는 단계;

(c) 상기 분리된 단백질 봉입체에 단백질 해체 용액을 처리하는 단계; 및

(d) 상기 해체용액에 용해된 재조합 단백질을 리폴딩 반응 혼합물을 처리하고 리폴딩 조건을 진행하는 단계를 포함하는 tPA단백질의 제조방법.
제 6항에 있어서,

상기의 리폴딩 반응은 pH 8.5~9.5, 수크로스, 아르기닌 및 트윈 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 tPA단백질의 제조방법.
제6항에 있어서,

상기의 리폴딩 반응은 10 mM GSH :1~3 mM GSSG의 리독스 커플 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 tPA단백질의 제조방법.
제6항에 있어서,

상기의 리폴딩 반응은 20~30℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 tPA단백질의 제조방법.
제6항에 있어서,

상기의 (d)과정의 리폴딩 반응혼합물에 샤페론(PDI)을 더욱 첨가하는 것을 특징으로 하는 tPA단백질의 제조방법