KR100807692B1

KR100807692B1 - 혈전용해성 메탈로프로테아제 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR100807692B1
Application number: KR1020060109824A
Authority: KR
Inventors: 이상현; 이동근; 전정호; 장민경; 김남영; 이정현; 김상진
Original assignee: 신라대학교 산학협력단; 한국해양연구원
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2006-11-08
Publication date: 2008-02-28
Also published as: US20090317890A1; WO2008056840A1; US7867747B2

Abstract

본 발명은 신규한 단백질 분해효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 및 이를 포함하는 혈전용해제에 관한 것으로서, 본 발명은 메타지노믹 라이브러리 기술을 이용하여 신규한 유전기원(gene source)으로부터 유래된 분해효소를 제공하며, 또한 기존 혈전용해제를 대신할 수 있는 혈전용해 활성을 갖는 혈전용해제를 제공한다.

아조카제인(azocasein), 혈전용해의(fibrinolytic), 메타게놈(metagenome), 메탈로프로테아제(metalloprotease)

Description

혈전용해성 메탈로프로테아제 및 이를 포함하는 조성물 {FIBRIONOLYTIC METALOPROTEASE AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

도 1은 본 발명에 따른 메탈로프로테아제 클론의 핵산 서열 및 상기 효소의 추론된 아미노산서열을 나타내는 것으로서, 상기 프로테아제 유전자 및 인접 부위(its flanking regions)의 핵산서열을 포함하고, 아연 의존성 메탈로프로테아제(zinc-dependent metalloprotease)의 활성부위내에 있는 보존서열(conserved sequence)은 밑줄을 그어 표시하고, 몇몇의 독특한 제한부위도 표시한다.

도 2는 pES63H9pro3-ES63H9-MIC을 함유하는 E. coli로부터 얻은, 본 발명에 따른 프로테아제 의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 것으로서, 레인 M은 size marker이고, 레인 C는 무세포 추출액이며(cell-free extract), 레인P는 정제된 효소이다.

도 3은 본 발명에 따른 재조합 메탈로프로테아제의 활성에 미치는 온도 및 pH의 영향을 나타내는 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 재조합 메탈로프로테아제의 시간에 따른 혈전 가수분해 정도를 보여주는 SDS-PAGE 겔 분석결과이다.

도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 발현벡터 pES63H9pro3-MIC(약 4.1kb 크기)의 개열지도, 및 이의 제작과정을 나타내는 모식도이다.

도 6a 및 도 6b는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 프로테아제의 발현을 위한 재조합 발현 벡터 pES63H9pro3-ES63H9-MIC(5.2kb)의 개열지도, 및 이의 제작과정을 나타내는 모식도이다.

[기술분야]

[종래기술]

프로테아제 (protease)는 도처에서 발견할 수 있는 효소로서, 상기 효소는 식품산업, 피혁산업, 세제산업, 제약산업, 및 오수처리산업과 질병의 진단과 관련하여 중요한 역할을 하고 있다. 프로테아제 산업에서 사용되는 전체 효소량의 2/3에 해당되고, 이러한 사용량은 증가될 것으로 예상되고 있다.

또한, 혈액 항상성(blood homeostasis) 유지에 관여하는 많은 프로테아제가 다양한 기원(source)으로부터 정제되고 있으며, 그 특성이 규명되고 있다. 상기의 프로테아제중 몇몇 종류는 피브린(fibrin)을 용해할 수 있는 혈전용해 효소이다. 현재 임상치료(clinical use)에 사용되는 혈전용해제(fibrinolytic agent)는 대부분 조직 유래 플라스미노겐 활성제(tissue-type plasminogen activator), 유로키나 아제 유래 플라스미노겐 활성제(urokinase plasminogen activator), 상기 세균 유래 플라스미노겐 활성제(bacterial plasminogen activator) 인 스트렙토키나제(streptokinase)와 같은 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator)이다.

혈전용해효소(fibrinolytic enzyme)는 발효음식, 지렁이(Nakajima N. et al., Biosci . Biotechnol . Biochem. Vol. 57, pp1726-1730, 1993), 버섯 (Kim J. H. et al ., Biosci . Biotechnol . Biochem . Vol. 65, pp356-362, 2001) 및 뱀의 독 (Leonardi A. et al ., Toxicon. Vol. 40, pp55-62, 2002)으로 부터 분리되어 왔다. 세린 단백질 분해효소와 금속 단백질 분해효소로 구성된 상기 효소는 경구용 혈전용해 치료제를 위한 원료물질로 이용될 수 있다고 알려져 있다. 최근에, 상어의 연골 추출물내에 있는 혈전용해효소의 특성이 분류되었다. 상기 혈전용해효소의 활성은 추출물 내의 두 가지 프로테아제의 존재와 관련이 있으며, 1,10-페난트롤린에 의해 저해되어 금속프로테아제에 해당하는 것으로 분류되었다(Ratel D. et al ., Thromb. Res . Vol. 115, pp 143-152, 2005).

현재 임상적으로 사용되어지고 있는 혈전용해제인 sPA, uPA, tPA, APSAC 등은 모두 플라스미노겐(plasminogen)의 활성화제로 작용하여 플라스민(plasmin)을 만드는 기작에 의하여 혈전을 용해하며, 상기 치료제들은 피브린에 대한 낮은 특이성(low specificity)을 보이며, 바람직하지 못한 부작용(undesired side effects)를 야기하는 하는 등 각각의 단점을 수반하고 있다. 구체적으로, sPA는 발열, 알레르기, 저혈압 등의 부작용을 일으키게 되고, uPA는 출혈을 유발하기도 하고 또 주사투여 시간이 오래 걸려 환자의 고통이 심하다는 단점이 있다. 또한 tPA는 혈중에 서 반감기가 짧고 가격이 매우 높은 단점이 있다.

따라서, 이러한 부작용이 수반되지 않으면서 효능이 뛰어난 신규한 혈전용해제의 개발이 요망되고 있다.

이러한 문제점 때문에, 혈전증 치료제로 사용하기 위한 신규한 혈전용해효소(fibrinolytic enzyme)를 찾기 위한 연구가 다양한 기원을 대상으로 진행되고 있다.

프로테아제를 포함한 신규한 효소의 검색은 주로 세포배양에 근거한 접근법이 사용되어 왔다. 가치 있는 많은 효소가 배양가능한 미생물로부터 분리되었다. 그러나, 표준 배양방법이 사용되면서 이의 이는 높은 재발견율(high rediscovery frequency)로 인해 상기 접근법에 의한 신규한 효소의 검색율은 현저하게 감소된다(Strohl W. R. et al ., Drug Discov . Today, Vol. 5, pp39-41, 2000). 다양한 환경에서 존재하는 전체 미생물들의 1%도 되지는 않는 미생물만이 손쉽게 배양가능한 미생물(cultivable microorganism)에 해당된다. 상기와 같은 사실은 응용생물산업(bioprocess industry)을 위한 신규한 생촉매(biocatalyst)의 연구 범위를 제한한다. 따라서, 다양한 미생물 군락을 사용하기 위해서 배양이 어려운 미생물(non-cultivability)을 이용하기 위한 노력은 계속되고 있다.

본 발명의 목적은, 메타지노믹 라이브러리 기술을 이용하여 신규한 유전기원(gene source)으로부터 유래된 분해효소는 아연 의존성 메탈로프로테아제(zinc-dependent metalloprotease) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 혈전용해 프로테아제를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명이 추가적인 목적은 본 발명에 따른 아연 의존성 메탈로프로테아제을 코딩하는 핵산 분자의 자체 프로모터, 및 상기 프로모터를 포함하는 발현용 벡터를 제공하는 것이다.

상기와 같은 종래 혈전용해제의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 배양이 어려운 미생물(non-cultivability)을 이용하여 기존 혈전용해제를 대신할 수 있는 혈전용해 활성을 갖는 신규한 혈전용해제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 단백질, 이를 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 조성물과 그의 제조 및 사용방법을 기술하기 전에, 본 발명은 여기에 개시된 특정 형태, 제조단계와 재료로 한정되지 않으며 그러한 형태, 제조단계 및 재료는 변화될 수 있다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 특정 구체예를 기술하기 위한 목적으로만 사용되고 본 발명의 보호범위를 제한하는 의도는 아니다.

본 발명은 분자량이 약 39 내지 40KDa이고, 아연 의존성 메탈로프로테아제의 활성부위내 보존서열인 His-Glu-Phe-Gly-His을 포함하고, 작용 pH가 6-8이고, 작용온도가 40-60℃이고, 금속 킬레이트제에 의해 활성이 저해되며, Mg² ⁺ 및 Zn² ⁺ 이온에 의해 활성이 저해되며, 혈전용해활성을 가지는 아연 의존성 메탈로프로테아제(Zn- dependent metalloprotease) 단백질을 제공하는 것이다. 바람직하게는 상기 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 핵산서열에 의해 코딩되는 펩티드일 수 있다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 핵산분자를 포함하는 벡터는, 아연 의존성 메탈로프로테아제를 코딩하는 핵산분자의 5'-말단에 연결되며, SEQ ID NO: 3의 염기서열을 포함하고 542bp 내지 546 bp의 크기를 갖는 프로모터를 추가로 포함하는 것인 벡터일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 벡터는 상기 벡터는 아연 의존성 메탈로프로테아제를 코딩하는 핵산분자의 3'-말단에 연결되며, pTXB3의 NcoI 및 BamHI에 의해 절단되는 MxeIntein chitin binding domain (CBD) 단편을 추가로 포함하는 것인 벡터일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 벡터는SEQ ID NO: 8의 염기서열을 포함할 수 있으며, 예컨대 도 6a에 표시한 pES63H9pro3-ES63H9-MIC인 벡터이다.

또한, 본 발명은 상기 혈전용해활성을 가지는 아연 의존성 메탈로프로테아제(Zn-dependent metalloprotease) 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 프로모터 서열을 제공한다. 바람직하게는 상기 프로모터 서열은 SEQ ID NO: 3의 염기서열을 포함하고 542bp 내지 546 bp의 크기를 갖는 프로모터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 4의 염기서열을 갖는 것이다.

또한, 본 발명은 플라스미드 pUC에, SEQ ID NO: 3의 염기서열을 포함하고542bp 내지 546 bp의 크기를 갖는 프로모터; 및 pTXB3의 NcoI 및 BamHI 사이에 해당하는 853 bp의 MxeIntein chitin binding domain (CBD) 단편을 포함하는 발현 벡터를 제공하고, 바람직하게는 상기 발현벡터는 도 5a에 나타낸 pES63H9pro3-MIC 이다.

또한, 본 발명은 상기 아연 의존성 메탈로프로테아제를 포함하는 의약 조성물, 바람직하게는 혈전 용해제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따른 프로테아제는 약 39 내지 40KDa이고, 바람직하게는 약 39,490 Da(39,490 Da)이다. 바람직하게는 상기 프로테아제는 SEQ ID NO:2의 359개 아미노산 잔기(359 amino acid residues)을 포함하는 단백질이며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 1080 염기쌍의 해독틀(open reading frame)로 구성되어 있다.

상기 프로테아제는 작용 pH가 6-8이고, 작용온도가 40-60℃이며, 더욱 바람직하게는 상기 정제된 효소는 약 50℃에서 1시간 동안 최적활성을 나타냈으며, pH의 경우 약 7.0에서 최적활성을 나타낸다.

본 발명에 따른 프로테아제의 효소 활성은 EDTA, EGTA 및 1,10-페난트롤린과 같은 금속 킬레이트제에 의해 저해된다. 상기 효소 활성은 Co² ⁺, Ca² ⁺ and Ni² ⁺과 같은 금속이온에 의해서 강화되었으나, Mg² ⁺ 및 Zn² ⁺과 같은 금속이온에 의해서는 저해 된다. Lee 등(Lee S. H. et al ., Biosci . Biotech . Biochem. Vol. 58, 1490-1495, 1994) 은 아연의존성 카르복시펩티드 분해효소(zinc-dependent carboxypeptidase)는 Co² ⁺에 의해서는 활성화되나, 높은 농도의 아연 이온에 의해서는 저해된다.

상기 효소는 피브린(fibrin)을 가수분해할 수 있다. 따라서, 상기 효소는 혈전증(thrombosis)을 치료할 수 있는 치료제(therapeutic agent)로써 사용될 수 있을 것이다.

His-Glu-X-X-His 서열(X는 모든 비보존성 아미노산)은 아연 의존성 메탈로프로테아제의 활성부위내에 있는 보존서열이다. 이러한 결과로부터 상기 효소가 아연 의존성 엔도펩티다제 및 아미노펩티다제에 해당함을 확인하였다(Vallee B. L. et al ., Biochemistry Vol. 29, pp5647-5659, 1990).

본 발명에 따른 프로테아제는 아연 의존성 메탈로프로테아제(zinc-dependent metalloprotease)의 활성부위(active site)내에 있는 보존서열인 His-Glu-X-X-His 서열이 존재한다. 상기 단백질은 상기 아미노산 서열의 150번째부터 154번째에서 His-Glu-Phe-Gly-His 서열을 포함하고 있으며, 이는 상기 효소가 아연 의존성 금속프로테아제 (도 1). 아연을 촉매로 필요로 하는 펩티타제 패밀리 M12A에 속하는 천연의 아연 의존성 금속프로테아제(NCBI accession no. CDD16541) 및 가재의 아스타신(NCBI accession no. CDD24541)이 상기 효소와 가장 유사하였다. Bode 등(Bode . et al ., FEBS Let. Vol. 331, 134-140, 1993)은 아스타신, 금속프로테아제 및 뱀의 독은 모두 아연이 결합될 수 있는 동일한 환경을 가지고 있는 것으로 보고하였 다(His-Glu-X-X-His-X-X-Gly-X-X-His) 또한, 이는 아연 의존성 금속프로테아제의 수퍼패밀리의 다른 구성원인 메탈로프로테이즈 디스인테그린(metalloprotease disintegrins)의 보존서열이기도 하다(Poindexter K. et al ., Gene Vol. 237, pp61-70, 1999). 추가로, His-Glu-X-X-His-Ala-Leu-Gly-X-X-His-Glu 서열은 천연의 아연의존성 메탈로펩티다제 패밀리(NCBI accession no. CDD16541)의 보존서열이며, 상기 서열은 또한 본원 단백질 분해효소 안에서 발견된다.

상기 재조합 프로테아제는 벡터로 pES63H9pro3-MIC을 이용하고, 숙주세포로 E. coli DH5를 이용하여 제조하였다. 상기 프로테아제 유전자가 그 유전자의 0.5 kb 상위 부위에서 클론되었을 때(도 1), 상기 프로테아제는 IPTG 또는 미토마이신 C와 같은 다른 유도 물질의 필요없이, E. coli에서 구조적으로 발현될 수 있다(도 2). 상기 클론된 유전자가 E. coli에서 작용하는 그 자신의 프로모터를 가지고 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 단백질 분해능효소 활성이 있는 클론(positive clone)인 pES63H9는 잠정적 프로테아제에 대한 하나의 완전한 유전자를 가지고 있다. 하기 도 1에 기재된 염기서열과 핵산 서열을 아래에 기재한다.

GTCCGAACGCCGCTCTGGCTGCTCGGTCTCCGAGTGACGGC -491

GCCTGAGAGGGCGCGCTGGTGCGCTCTTCCGGGATTGCCTCCTGCGCCGATTCTTCCTTCTGTTCGCGGC -421

TACGGGAGAAGCCCTTTGGCAATTCTATTCCGCCGCTCTGCTGCGGATTGTCCTCCTGGCCCGGCAAAAT -351

GATTCCACTCATGTGAACATCTTCTTTCTTTTCAACGTTTTATCAAGTGAGCAAATAGTAATTTAAATAC -281

AGTTTAACCGAACCATTGTACCGTAAAACGGTGGACCTCAAAATTATTACCCATCCACAACTGCAATATC -211

TTTCGTTTGCCAGAATGGAGGGTTAATTCGGCATTGACCTTACTGTTAACCTGCGGTTATAATTTTGTTG -141

ACTTTCGTGACGTCTATGCAATCACCGTCCGTAGTAAGCGTTGTACCCGCCCGCCTGCAATAGCGCTAAA -71

GCGCAGACCACGGACGGTATTGTTGTCGAAGCCCAAGTGAACCACTACTTTGGATCGCAAAGGAGAAACC -1

ATGGAACCAGAACCGATCAAAACCTGCACCGTGCTCGAGAATCCCGGCTATCAGCCTATACACGCACCGA +70

NcoI XhoI

M E P E P I K T C T V L E N P G Y Q P I H A P +23

CAGATGTTTCACCCCAACCTGTGCTTGCGGCGATGGAAGCAGTCCCCGTGCCAACACCGCCGCCAACTGT +140

T D V S P Q P V L A A M E A V P V P T P P P T V +47

CGATGCGGTCATGCTCTTCCGCAAGAAGTGGCGCGATGGCAAGATACTGCGTGTCCACTTTATGGACGGC +210

D A V M L F R K K W R D G K I L R V H F M D G +70

GACCCGGATGTGCACCGCAAAGTGGAGGAAGTGGCTCACACCTGGAGCCGCCATGCCAATGTTCGCTTCA +280

D P D V H R K V E E V A H T W S R H A N V R F +93

AGTTCGTCGACGATCCAGCGGCGGATATCCGCATTTCGTTTACGCAACCGGGATCCTGGTCTTATCTGGG +350

BamHI

K F V D D P A A D I R I S F T Q P G S W S Y L G +117

AACGGATGCGCTTCGGATTGCCAGGTCCCAATCGACGATGAATTTTGGCTGGTTGACGCCGCGCTCTCCA +420

T D A L R I A R S Q S T M N F G W L T P R S P +140

GACAGCGAGTATAACCGAGTGGTTATTCACGAATTTGGGCACGCGCTCGGCCTTGTGCATGAACATCAAA +490

D S E Y N R V V I H E F G H A L G L V H E H Q +163

ATCCCGACAACGGCATTCCGTGGAACAAACCGGCGGTCTACGAATATTATAGTGGCCCGCCCAACAACTG +560

N P D N G I P W N K P A V Y E Y Y S G P P N N W +187

GTCCAAAGAACAGGTTGACACCAATCTGTTCCAACAATATTCAGAAGACCAGGTCCGTTTCACCGGCTTC +630

S K E Q V D T N L F Q Q Y S E D Q V R F T G F +210

GATCGCGAATCAATCATGCTCTACCCAATCCCGAATGAGTTCACTGTAGGTGATTTCGAAGTTGGTTGGA +700

D R E S I M L Y P I P N E F T V G D F E V G W +233

ACAGAGATCTCTCGGCTGATGACAAGGAGTTCATTGGCCGGATGTACCCCAAGCCGGCCAACGAGTTGAT +770

N R D L S A D D K E F I G R M Y P K P A N E L I +257

CGTCGATGATCCACCCCGCGCGTCCGAAATCAGCAGATATGGCGAAATCGACACCTATACATTTCTGGTC +840

V D D P P R A S E I S R Y G E I D T Y T F L V +280

ACCCAAAAAGGATCCTACCGCATTGAAACCGACGGCCGGACGGACCTGGTGATGCTGCTATACGGGCCGG +910

BamHI

T Q K G S Y R I E T D G R T D L V M L L Y G P +303

AAGATGACACCAAACTGATCGCCGCCGATGATGATAGTGGTCGCCGTCTGAACCCGCGTATCACTGAAGA +980

E D D T K L I A A D D D S G R R L N P R I T E E +327

ACTGGATTGGGGCAAATACACGGTGCGTTTGCAGCATTTCAGCCAACGCCAGACCGGTAAATACGCCGTT +1050

L D W G K Y T V R L Q H F S Q R Q T G K Y A V +350

GGCGTCTATAGGGATGACGCGGCGGAGTAAGGCGCTCCCAGAATAGAAAGTCACCGATCAACTCCCCGGG +1120

G V Y R D D A A E * SmaI +359

CACAGGCCACAGGTTACGCCATTGAGTAGGGCGCCTTTGACCCATGCCGGGGAGTTCAATTCCGGGGGCG +1190

GCCTTACAGCAAATCGCATGATACAATGTAACCCTTGACCACAAAGTGCATCCAACCTGTATGAAATCAT +1260

GTTCGCAACGGTATGCAGACCAGGGTTGAGGAAATGATCGAAAACATATTTAAGGCTTCGGTAAACACTA +1330

CATCCACCACCACTTCCATTACCGCGTTCTCCCGCGATCGCGGCGCGTCGAGTCATGGTCTACTTTTGAA +1400

ATTGGCGATTATCCTGGGCGCGCTCAGTCTATTGCTTTTCCTTTTCGGGGCATGTGGAGGTTCTTCTGCA +1470

PstI

GCCGCGCCAAGCGGTGAAGCGATTGCCTTTGAAGAGATGCCCGAAGGCATGGGCCGCGGCTACCCCAACG +1540

SacII

TTTCATTGGCCAATATCAATAACAACGGCACTGGCCTTGAGAACGGAGATCGGGCTCCTGGCTTCAACCT +1610

GCAGTTGGAGGATGGCGCCTACATTAATCTCGACGACCTGAAGGGTCGGCCGGTTATGCTCAATTTCTGG +1680

PstI

GCAACGTGGTGTCCGCCCTGCCGGGAAGAAATGCCCGACATTATCAAAGCCTATGAAGCGGACGATGAGT +1750

TGGTGGTGCTGGCCGTTAACGTGCGCGAAGAGATCGGCGCGGTGAATCCGTTTACAGAAGATTTCCAGAT +1820

TTCCATGCCGGTGTTGCTGGACCCAAACGCTGAGCTGTCCGAGCTCTTCGGCGTGCTTGGCATGC +1885

SacI SphI

본 발명의 프로테아제는 상술한 생화학적 특성으로 특정될 수 있지만, 아미노산 서열로도 특정할 수 있다. 본 발명의 혈전용해 프로테아제는 SEQ ID NO:2를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 혈전용해 프로테아제는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)를 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 98%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 혈전용해 프로테아제를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미이며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NO:1로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 혈전용해 프로테아제를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 98%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

메타게놈은 특정 환경의 미생물 군락에 존재하는 배양이 불가능한 미생물(non-cultivated microorganism)의 게놈을 의미한다. 따라서, 메타지노믹 라이브러리의 제조와 분석은 환경으로부터 얻을 수 있는 유전자원을 수집하고 획득하는데 있어서 유용한 접근법이다(Ferrer et al ., Curr . Opin . Biotechno . Vol. 16, pp588-593, 2005). 배양이 불가능한 환경 미생물을 생명공학에 응용하기 위한 다양한 방법 즉, 적절한 발현세포주를 이용하여 메타게놈을 클로닝하고 표현하기 위한 방법들이 개발되고 사용되고 있다. 메타지노믹 라이브러리로부터 신규한 프로테아제를 찾기 위하여, 본 발명자들은 삽입된 거대 DNA에 존재하는 환경시료의 DNA를 직접 클로닝하는 방법으로 상기 제조된 메타지노믹 라이브러리로부터 단백질분해능이 있는 효소를 코딩하는 유전자(gene)를 분리한다.

보다 상세하게는, 상기 신규한 아연 의존성 프로테아제를 코딩하는 유전자를 발견하고 서열분석을 한 후에, E. coli에서 발현시켜 그 특성을 확인하였다. 메타지노믹 라이브러리는 대한민국의 서해안의 심해 퇴적물로부터 추출된 전체 게놈 DNA를 사용하여 제조되었으며, 신규한 유전기원을 발견하기 위하여, 상기 메타지노믹 라이브러리는 포스미드 벡터인 pCC1FOS와 함께 사용되었다. 약 30,000개의 재조합 대장균 클론중 하나의 클론이 단백질 분해 활성을 나타내었다. 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)를 코드하는 상기 유전자는 pUC19를 이용하여 서브클론닝하여 서열을 확인하였으며, 상기 확인된 서열에 대한 데이터베이스(database)를 이용한 상동성 검색 결과, 상기 단백질 분해효소는 아연 의존성 메탈로프로테아제로 확인되었다. 상기 클로닝된 유전자는 신규한 메탈로프로테아제를 암호화하는 전체 유전자(intact coding gene)와 상기 효소의 프로모터(promoter)를 포함하고 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아연 의존성 메탈로프로테아제를 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로 서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일예어서, 상기 혈전용해성 단백질을 코딩하는 유전사를 포함하는 E.coli 발현벡터가 제공될 수 있으며, 예를 들면 발현벡터인 pES63H9pro-MIC이다. 상깅 pES63H9pro-MIC는 ES63H6 유전자의 프로모터 영역인 EcoRI 및 NcoI 사이에 해당하는546 bp의 DNA단편과 친화성 정제를 위해 삽입된 pTXB3의 NcoI 및 BamHI 사이에 해당하는 853 bp의 MxeIntein chitin binding domain (CBD) 단편을 포함하는 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

발명의 제약 조성물은 혈전에 직접 작용하여 피브린을 용해시키는 혈전 용해제로서 사용될 수 있으며, 당업자는 그러한 질병, 상태 및 이상으로부터 고통을 받는 것으로 추정되는 개인들을 표준 진단 기술을 사용하여 용이하게 파악할 수 있다. 본 발명의 혈전분해제를 적용할 수 있는 질환으로는, 이들에 한정되지 않고, 뇌혈전, 뇌색전증 등의 뇌질환, 폐색전, 폐경색증 등의 폐질환, 하지심부정맥 혈전증, 보행장애, 혈류장해성빈혈, 동맥경화성괴저증, 신경통, 고지혈증 등의 말초신경계질환, 신성고혈합, 신장병, 신부전 등의 신장질환, 협심증, 허혈성심장질환, 심근경색 등의 심장계 질환 등을 포함한다.

본 발명의 의약 조성물은 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화할 수 있다. 일반적으로는, 유효 성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등를 가하고, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 경구제나, 주사제, 점적용제 등의 비경구제 중의 어떠한 것에 의해서도 투여할 수 있다. 의약용 담체는, 상기 투여형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있고, 경구제의 경우는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 콘 스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다. 한 편, 비경구제의 경우는 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효성분인 단백분해효소를 포함하는 조성물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜서 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제된다.

본 발명의 의약 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법은 특히 한정할 필요는 없고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 그 제제형태, 투여방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 10㎍∼200 ㎎/㎏이다. 그러나, 당업자는 특정 시약의 약물동력학적인 특성 및 그의 투여 모드 및 경로; 수여자의 나이, 건강, 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과 등의 공지의 요인에 따라서 투여량이 변화함은 이해할 것이다.

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1: 단백질 분해효소 유전자의 스크리닝

심해 퇴적물의 메타지노믹 라이브러리(Deep-sea sediment library)를 제조하기 위하여, 숙주세포로 Escherichia coli EPI300(Epicentre, Madison, WI, USA)를 사용하였고, 벡터(vector)로 포스미드 벡터(fosmid vector)인 pCC1FOS (Epicentre)를 사용하였다.

1-1: 시료 DNA 분리

심해저평원의 미생물군락으로부터(from a clam bed community) 얻은 심해 퇴적물 시료를 포스미드 벡터(fosmid vector)인 pCC1FOS를 이용하여 메타지노믹 라이브러리(DNA library)를 만들었다.

더욱 자세하게는, 대한민국 서해안의 심해저 진흙에 생존하는 미생물군락으로부터(from a clam bed community) 얻은 심해 퇴적물 시료(Deep-sea sediment sample)는 Lee 등이 얻은 것을 사용하였다(Lee et al ., 2004, J. Microbiol . Biotechnol. Vol. 14, pp906-913, 2004). 상기 심해 퇴적물 시료로부터 DNA를 분리(isolation)하기 위하여, Hurt 등이 사용한 DNA 추출법(Hurt, R. A., et al., Appl. Environ . Microbiol . Vol. 67, pp4495-4503, 2001)을 사용하였으며, 상기 분리된 DNA를 정제하기 위하여 아가로스 겔(agarose gel)로부터 직접 추출(direct extraction)을 수행하였다.

1-2: 메타지노믹 라이브러리 제조

메타지노믹 라이브러리(metagenomic library)의 제조는 Epicentre사(Madison, USA)의 제품 프로토콜(manufacturer's protocol)에 따라 수행하였다. 비틀려지고 말단이 복원된 DNA(Sheared and end-repaired DNA)는 Pcc1FOS (Epicentre)에 결합(ligation)되었으며, 상기 결합된 DNA는 MaxPlax Lambda Packaging Extracts (Epicentre)를 이용하여 패키지(package)되었다. 상기 패키징된 DNA를 E. coli EPI300 (Epicentre)에 전환(infected)시켜 형질전환체를 제조하였다. 상기 제조된 형질전환체를 클로람페니콜(chloramphenicol) 12.5 mg/ml 및 탈지 우유 1%(w/v)가 첨가된 LB 아가 배지(LB agar medium)에 도말하여 프로테아제의 활성을 직접 검색하였다.

1-3: 단백질 분해효소 유전자의 서브클로닝 및 DNA 서열 분석

상기 시료의 분자 클로닝(molecular cloning)을 위하여, Sambrook 등이 저술한 Molecular cloning: a laboratory manual(2^nd)(Sambrook E, Fritsch F, Maniatis T, Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Labarotory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 기재된 방법을 사용하였다. 서브 클로닝(subcloning)을 위해서 벡터로 pUC19를 사용하였다.

상세하게는, 상기 도말된 형질전환체의 콜로니(colony) 중에서 양성반응을 나타낸 콜로니로부터 포스미드 DNA(Fosmid DNA)를 분리하고, 제한효소 즉, EcoRI 및 SphI으로 처리하였다. 상기 제한효소에 의해 처리된 2 내지 5 kb 크기의 DNA 단편을 각각의 대응 자리(corresponding site)를 이용하여 pUC19와 결합시켰다. 상기 결합된 DNA를 E. coli DH5a에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다.

상기 제조된 형질전환체의 단백질 분해능(proteolytic activity)을 확인하기 위하여, 암피실린(ampicillin) 100 mg/ml 및 카제인1%(w/v)가 첨가된 LB 아가 배지를 이용하였다. pUC-ES63H9(Plasmid DNA termed pUC-ES63H9)가 단백질 분해능이 있는 프로테아제-양성 클론(protease-positive clone)으로 분리되었고, 상기 분리된 플라스미드 DNA를 ㈜ 바이오넥스(Bionex Inc., Seoul, Korea)에 의뢰해서 DNA 염기서열을 결정하였다. 상기 pUC-ES63H9에 포함된 본 발명의 프로테아제 관련 염기서열을 SEQ ID NO: 5에 기재된 2427bp 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 단백질 코딩 유전자의 자체 프로모터 서열과, 3' 말단 서열을 포함하며, 이들 유전자 구성은 도 5B에 나타나 있다.

상기 서열결정을 통해 얻은 서열의 분석은 DS Gene 1.5 program (Accelrys Inc., San Diego, USA)을 이용하여 수행하였다. 즉, 상기 바이오넥스에 의뢰하여 얻어진 염기서열을 상기 염기서열 분석 소프트웨어를 이용하여 제한효소 절단부위 등의 분석, 아미노산 배열 확인, 기존에 보고된 서열들과의 상동성 검사 등, 활성중심에 관한 상동성 검사 등을 수행하였다. 상기 서열분석된 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 프로테아제 클론의 핵산 서열(Nucleotide sequence) 및 상기 효소의 추론된 아미노산서열(amino acid sequence)을 나타낸다. 상기 프로테아제 유전자 및 인접 부위(its flanking regions)의 핵산서열. 상기 유전자 산물의 추론된 아미노산서열(amino acid sequence)은 핵산서열아래 있는 1 글자 코드(single-letter code)로 표시되었다. 상기 아연 의존성 메탈로프로테아제(zinc-dependent metalloprotease)의 활성부위(active site) 내에 있는 보존서열(conserved sequence)은 밑줄을 그어 표시하였다. 몇몇의 독특한 제한부위도 표시하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 유전자는 GC 함량이 54.5 %(G+C content of 54.5 %)인 1,080 bp의 서열이었으며, 상기 유전자서열은 ATG로 시작하고 TAA로 종결되었다(도 1). 또한, 어떠한 전형적인 샤인-달가노 서열(typical Shine-Dalgarno)이나 연계된 역위 반복 서열(tandem inverted repeat sequence)이 5'-말단 및 3' 말단의 비코딩 부위에서 발견되지 않았다. 또한, 상기 유전자는 359개의 아미노산으로 이루어진 39,490 Da의 단백질을 암호화하였다(도 1). 상기 아미노산서열은 Dechloromonas aromatica(NCBI accession no.AAZ45577)로부터 분리된 메탈로펩티다제(metallopeptidase)와 46%의 상동성을 나타내었다.

보존 부위 조사(Marchler-Bauer, A. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 33, ppD192-196, 2005)에 의하면, His-Glu-X-X-His 서열(X는 모든 비보존성 아미노산중 어느 하나이다)이 상기 효소의 아미노산 서열의 150번째부터 154번째에서 발견되었다(도 1). 상기 서열은 아연 의존성 메탈로프로테아제(zinc-dependent metalloprotease)의 활성부위내에 있는 보존서열(conserved sequence)이다. 이러한 결과로부터 상기 효소가 아연 의존성 금속프로테아제 (zinc-dependent metalloproteinase)에 해당함을 확인하였다.

실시예 2: 재조합 단백질 분해효소의 생산

발현 플라스미드의 제조를 위하여, 벡터로 pUC19를 사용하였다. 상기 유전자의 조작 및 발현을 위해서 숙주세포로 E. coli DH5a (supE44, DlacU169( f80 lacZDM15), hsdR17, recA1, EndA1, gyrA96, thi-1, relA1)를 사용하였다. 상기 E. coli는 37℃에 LB 배지((Luria-Bertani (LB) broth)(Difco, USA)에서 통상의 방법으로 배양하였으며, 필요한 경우에는 암피실린을 100 mg /ml 첨가하였다.

2-1: 발현 벡터의 제조

상기 실시예 1에서 분리된 플라스미드 pUC-ES63H9를 EcoRI 및 BamHI로 절단하였다. 상기 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편중 0.9 kb 크기의 DNA 단편을 상기 제한효소에 의한 각각의 대응 자리를 이용하여 pUC19와 결합시켜서 신규한 플라스미드인 pUC-ES63H9pro를 제조하였다.

또한, 친화성 정제를 용이하게 하고자, pTXB3(New England Bio-labs Inc., Beverly, USA)를 제한효소 즉, NcoI 및 BamHI로 절단하였다. 상기 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편중 0.8 kb 크기의 DNA 단편을 상기 제한효소에 의한 각각의 대응 자리를 이용하여 pUC-ES63H9pro에 결합시켜 E. coli 발현벡터인 pES63H9pro3-MIC (4.1kb)를 제조하였다. 상기 벡터의 제조과정 및 개열지도는 도 5A 및 5B에 나타냈으며, pES63H9pro3-MIC 는 ES63H6 유전자의 프로모터 영역인 EcoRI 및 NcoI 사이에 해당하는546 bp의 DNA단편 (SEQ ID NO:4)과 친화성 정제를 위해 삽입된 pTXB3의 NcoI 및 BamHI 사이에 해당하는 853 bp의 MxeIntein chitin binding domain (CBD) 단편을 포함한다. 853 bp의 MxeIntein chitin binding domain (CBD) 단편은 첨부된 서열목록의 SEQ ID NO:9에 나타냈다. 546 bp의 DNA단편 (SEQ ID NO:4) 은 본 발명에 따른 프로테아제 자체의 프로모터 서열 542 bp 단편과, 이의 3'-말단에 4개의 염기로 구성된 NcoI 제한효소 인식자리를 추가로 포함하여 유전자 조작 및 클로닝을 용이하게 하였다.

2-2: 재조합 단백질 분해효소의 발현

상기 잠정적 프로테아제의 유전자(putative protease gene)를 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 이용하여 실시예 1에서 얻는 pUC-ES63H9 플라스미드를 주형(template)으로 하여 유전자증폭기(GeneAmp PCR System 2400, PerkinElmer, Inc., Wellesley, MA, USA)로 증폭하였다. 상기 증폭용 프라이머는 5'말단에 EcoRI 및 NcoI 의 제한효소 절단자리(하기 프라이머 서열에서 밑줄을 그은 부위)를 가지고 있는 ES63H9_E2-F와 5'말단에 NotI 의 제한효소 절단자리(하기 프라이머 서열에서 밑줄을 그은 부위)를 가지고 있는 ES63H9_E1-R 를 사용하였다.

* 정방향 프라이머 (SEQ ID NO; 6)

ES63H9_E2-F: (5'- GAATTCCATGG AACCAGAACCGATC-3'

* 역방향 프라미어 (SEQ ID NO; 7)

ES63H9_E1-R: 5'- GCGGCCGC GCTCCGCCGCGTCATCCCTATAG-3'

상기 증폭된 DNA를 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, WI, USA)에 결합시켜, pGEMTe-ES63H9_E21을 제조하였다. 상기 잠정적 프로테아제의 유전자를 운반하는 pGEMTe-ES63H9_E21를 NcoI 및 NotI 로 절단하였다. 상기 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편중 1.1 kb 크기의 DNA 단편을 상기 제한효소에 의한 각각의 대응자리를 이용하여 , 상기 실시예 2-1에서 얻은 발현벡터인 pES63H9pro3-MIC와 결합시켜 서 재조합 플라스미드를 제조하였다. 상기 벡터의 제조과정 및 개열지도는 도 5에 나타냈다.

상기 재조합 플라스미드를 E. coli DH5a 에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다. 상기 제조된 형질전환체를 12시간 동안 배양한 후에, 원심분리기를 이용하여 5,000 xg에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수득하여 재조합 플라스미드 제조를 위해 사용하였다. 상기 재조합 플라스미드에 상기 잠정적 프로테아제의 유전자(putative protease gene)가 포함되었는지 여부의 판단은 제한효소인 NcoI 및 NotI으로 처리하여 확인하였으며, 상기 잠정적 프로테아제의 유전자(putative protease gene)를 포함하고 있는 것으로 확인된 재조합 플라스미드는 pES63H9pro3-ES63H9-MIC(5.2kb)라고 명명하였다. 상기 플라스미드는 본 발명에 따른 프로테아제의 코딩서열 및 프로모터 서열을 포함하고, 상기 플라스미드의 개열지도 및 제작과정을 도 6A 및 6B에 나타냈다. 상기 pES63H9pro3-ES63H9-MIC 벡터에 도입된 염기서열은 SEQ ID NO: 8에 나타냈으며, 이는 본 발명에 따른 프로테아제 코딩 서열, 자체 프로모터 서열, 및 pTXB3의 NcoI 및 BamHI 사이에 해당하는 853 bp의 MxeIntein chitin binding domain (CBD)을 포함한다.

상기 재조합 플라스미드 즉, pES63H9pro3-ES63H9-MIC를 갖는 E. coli DH5a를 37 ℃에서 암피실린 100 mg/ml가 첨가된 LB배지 1L에 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포들은 원심분리기를 이용하여 5,000 xg에서 5분 동안 원심분리하여 수득되었으며, 상기 수득한 세포를 차가운 컬럼 완충액(ice-cold column buffer, 20 mM Tris HCl (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.2 % Triton X-100, 2 mM EDTA) 30 ml에 현탁하였다. 초음파파쇄기(Labsonic L., B. Braun International GmbH, Melsungen, Germany) 를 이용하여 초음파처리(30초 처리하고 30초 방치하는 초음파 처리를 5회 반복)에 의해 세포를 파괴(cell disruption)한 후에, 상기 파괴된 세포 시료를 원심분리기를 이용하여 20,000 xg에서 20분 동안 원심분리하였다.

2-3: 재조합 단백질의 정제

상기 원심분리에 의해 분리된 상등액을 정제하였다. 자세하게는, 상기 무세포추출물(cell-free extract)을 컬럼 완충액(column buffer)으로 평형화시킨 20 ml 분량의 키틴 비드 컬럼(chitin bead column, New England Biolabs Inc)에 투여하였다. 상기 컬럼을 상기 컬럼 완충액으로 씻은 후, 분리 완충액 즉, 30 mM DTT가 첨가된 컬럼 완충액(cleavage buffer, column buffer with 30 mM DTT) 30 ml로 평형시킨 후, 4 ℃에서 12시간 동안방치하였다. 상기 단백질들은 컬럼 완충액(column buffer)과 함께 용출되어 최종 부피가 총 50 ml가 되었다. 상기 단백질의 양은 BCA protein assay 시약(BCA protein assay reagent(Pierce biotechnology, USA)을 이용하여 측정하였으며, 기준 단백질(standard protein)로 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 이용하였다. 상기 재조합 프로테아제(recombinant protease)는 상기 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 6.3배로 정제되었으며,(purified 6.3-fold after affinity chromatography) 상기 효소의 특이적 활성은 76,000 U/mg이었고, 최종 수율은 4.4%이었다. 그 결과를 표 1에 기재하였다.

형질전환체로부터 메탈로프로테아제의 정제

정제 단계	전체 단백질 (mg/l)	전체 활성 (U)	특이적 활성 (U/mg)	수율 (%)
무세포 추출물	138	76,000	551	100
친화성 크로마토그래피	1	3,400	3,400	4

도 2는 pES63H9pro3-ES63H9-MIC를 가진 E. coli로부터 얻은 프로테아제 의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 결과를 나타내는 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, pES63H9pro3-ES63H9-MIC 를 갖는 E. coli DH5a(E. coli DH5a cells harbouring pES63H9pro3-ES63H9-MIC)는 많은 량의 프로테아제를 생산하였다(high amount of protease). 상기 SDS-PAGE는 11%의 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 이용하여 Laemmli 법(Laemmli method)으로 수행하였다. 상세하게는, 상기 효소용액을 시료완충액(sample buffer)과 혼합하여 5분 동안 끓인 후에 겔에 걸었다. 상기 겔내의 단백질을 GelCode Blue 염색시약(Pierce, Rockford, USA)을 이용하여 염색하였다. 도 2에서 레인 M은 크기 마커이고, 레인C는 무세포 추출액이며, 레인 P는 정제된 효소이다(표 1). 상기 화살표는 프로테아제의 위치를 나타낸다. 상기 정제된 효소의 SDS-PAGE 결과는 명백하게 39 kDa의 분자량에 해당하는 단일 밴드를 나타내었다. 상기 단백질의 크기는 DNA 서열로부터 예측된 결과와 일치하였다

실시예 3: 단백질 분해효소의 활성분석

3-1: 단백질 분해효소 활성 측정

프로테아제활성(protease activity)의 측정은 아조카제인(azocasein, Sigma, USA)으로부터 얻은 산성의 가용성 물질의 배출량(release of acid-soluble material)을 측정하여 수행하였다(Windle, H. J. P. et al ., Infect . Immun . Vol. 65, pp3132-3137, 1997).

상기 효소활성의 측정은 상세하게는 하기와 같다. 상기 효소활성의 측정은 50 mM Tris HCl (pH 7.0) 완충액(50 mM Tris HCl (pH 7.0) buffer)에서 수행하였다. 상기 효소활성의 측정은 상기 효소시료 즉, 상기 실시예에서 얻은 정제액 100 ml를 1% (w/v)의 아조카제인(azocasein) 100 ml에 첨가한 후, 50 ℃에서 1시간 동안 반응시키고 10%의 (w/v) 트리콜로아세틴산(trichloroacetic acid) 400 ml를 첨가하여 반응을 종결 시킨 후에, 상기 반응을 종결시킨 반응물(reaction mixture)를 원심분리기를 이용하여 12,000xg에서 5분간 원심분리하여 단백질(precipitated protein)을 제거하고, 상기 단백질이 제거된 상등액(the resulting supernatant)을 525 mM NaOH가 700 ml 포함되어 있는 클린 튜브(clean tube)에 옮긴 후, 442 nm에서 상기 클린 튜브로 옮긴 시료의 흡광도(Absorbance)를 측정하였다. 프로테아제활성을 측정하는 단위는 아조카제인(azocasein)으로부터 충분한 양의 산성의 가용성 물질의 배출량(amount required to produce enough release of acid-soluble material) 즉, 50 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 경우, 442 nm에서 흡광도를 측정하였을 때, 0.1이 나오는 값으로 정하였다.

3-2: 효소의 활성 및 안정성에 온도 및 pH 가 미치는 영향

온도에서의 프로테아제의 활성은 상기 효소 활성의 단위를 측정할 때 사용한 완충액(in the buffer used in the standard assay)을 이용하여 확인하였다. 50 ℃ 에서 1시간 동안 반응시켰을 때의 효소활성을 기준 즉, 100%로 하여 각각의 온도에서의 활성을 백분율로 나타내었다. 상기 실험결과를 도 3A에 나타냈다. 상기 프로테아제의 최적활성(optima activity)을 나타내는 온도(temperature)는 1시간 동안 50℃이었다(도 3A). 40℃에서의 효소활성은 최대활성의 26%이었고, 60℃에서의 효소활성은 최대활성의 18%이었다. 따라서, 상기 효소는 최적 온도의 좁은 영역에서 최적 활성을 갖는다.

상기 프로테아제의 최적활성 pH(optimal pH)는 50℃에서 다양한 종류의 완충액을 이용하여 확인하였다. 상기 사용된 완충액은 아세트산 나트륨 완충액(비어 있는 직사각형, pH 5.0-6.0), Tris HCl 완충액(비어 있는 삼각형, pH 6.0-8.0) 및 글리신 NaOH 완충액(비어있는 원, pH 8.0-9.0)이었다. pH 7.0에서 관찰된 프로테아제의 활성을 기준 즉, 100%로 하여, 각각의 pH에서의 활성을 백분율로 나타내었다. 상기 실험결과를 도 3B에 나타냈다. 상기 프로테아제의 최적pH(optima activity) pH 7.0이었다(도 3B).

3-2: 효소의 활성에 금속 이온 및 시약이 미치는 영향

본 발명의 효소에 미치는 금속인이온의 효과를 측정하기 위하여 CoCl₂, CaCl₂, MgCl₂, NiSO₄, CuSO₄, ZnSO₄, 및 FeSO₄가 사용되었다. 또한, 본 발명의 효소에 미치는 화학시약(chemical reagent)의 효과를 측정하기 위하여 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)- N,N,N'N'테트라아세트산(ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N'tetraacetic acid (EGTA)), 1,10-페난트롤린(1,10- phenanthroline), 소디움도데실설페이트(sodium dodecyl sulphate, SDS), 구아니딘 염산((guanidine hydrochloride) 및 페닐메틸설포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)을 사용하였다. 상기의 모든 화확시약은 SIGMA(USA)로부터 구입하였다. 상기 정제된 효소는 금속이온 또는 화학시약의 첨가하거나 하지 않고 25 ℃에서 50 Mm의 Tris HCl 완충액(pH 7.0)에 30분간 처리하였다. 상기 30분간 전처리한 후에, 남아있는 프로테아제(residual protease)를 1 % (w/v)의 아조카제인(azocasein)에 반응시켜 본 발명의 효소활성을 측정하였다. 대조군으로는 전처리를 하지 않은 효소를 동일한 금속 또는 화학시약의 존재하에 반응시켜 효소활성을 측정하였다. 상기 효소활성에 대하여 여러 금속 이온이 미치는 영향을 표 2에 나타내었다.

금속이온 및 시약의 영향 (3,400 U/mg)

Metal ion or reagent	Concentration (mM)	Relative activity (%)
None		100
CoCl₂	1	280
CaCl₂	1	200
NiSO₄	1	140
CuSO₄	1	100
FeSO₄	1	100
ZnCl₂	1	80
MgCl₂	1	20
EDTA	1	27
EGTA	1	21
1,10-페난트롤린	1	55
SDS	17	9
Guanidine hydrochloride	500	22
PMSF	1	104

표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 효소활성은 Co² ⁺, Ca² ⁺ 및 Ni² ⁺ 이온에 의하여 강화되었으나, Mg² ⁺ 및 Zn² ⁺ 이온에 의하여 저해되었다. 또한 상기 효소활성은 잘 알려진 메탈로프로테아제 저해제인 1 mM EDTA, EGTA 및1,10-페난트롤린에 의해 저해되었다. 상기 효소는 또한 0.05% SDS에 의해 쉽게 변성되었고(denatured by 0.05% SDS), 0.5 M 구아니딘 염산(0.5 M guanidium hydrochloride)에 의해 강하게 저해되었다. 그러나, 세린 프로테아제 저해제(serine protease inhibitor)인 PMSF는 상기 효소활성에 어떠한 영향을 미치지 못하였다.

실시예 4: 혈전용해활성 측정( fibrinolytic assay )

혈전용해능(fibrinolytic activity)의 측정은 Datta et al .(Datta, et al., Arch. Biochem . Biophys . Vol. 317, pp365-373, 1995)가 사용한 방법으로 수행하였다.

보다 상세하게는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 20 mM Tris HCl 완충액(pH 7.4)에서 제조한 1% (w/v) 인간 피브리노겐(Sigma) 10 ml에 인간유래 트롬빈(human thrombin, 0.05 NIH unit, Sigma)을 첨가한 후, 25℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기의 방법에 의해 제조된 피브린 혈병(clot)에 상기 정제된 효소용액(17 U)를 가한 후, 37℃에서 120분간 반응시켰다. 각 시간별로 상기 반응액 중 5 ml를 취하고 11% SDS-PAGE 겔(11% SDS-PAGE gel)을 이용하여 혈전용해능을 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4는 메탈로프로테아제의 시간에 따른 혈전 가수분해 정도를 나타내는 반응물은 SDS-PAGE 겔 분석결과를 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 정제된 효소는 37 ℃에서 1시간 동안 반응하여 상기 피브린의 α-사슬과 γ-γ-사슬을 완전히 가수분해하였다. 그러나, β-사슬의 경우 상기 효소는 30분간 반응하여 부분적으로 가수분해하기는 하였으나, 2시간 동안 반응시킨 경우에도 완전히 가수분해하지는 못하였으며, 24시간 반응시킨 경우에서 조차 완전히 분해하지 못하였다.

본 발명은 메타지노믹 라이브러리 기술을 이용하여 신규한 유전기원(gene source)으로부터 유래된 분해효소를 제공하며, 또한 기존 혈전용해제를 대체할 수 있는 혈전용해 활성을 갖는 혈전용해제를 제공하는 장점이 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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혈전용해활성을 갖고 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열로 이루어지는 아연 의존성 메탈로프로테아제(Zn-dependent metalloprotease) 단백질.
제 2 항에 있어서, 상기 메탈로프로테아제는 SEQ ID NO:1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것인 단백질.
SEQ ID NO:2의 아미노산 서열로 이루어지는 아연 의존성 메탈로프로테아제 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO:1의 핵산 서열로 이루어지는 핵산 분자.
제 4 항 또는 제5항에 따른 아연 의존성 메탈로프로테아제를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
삭제
제6항에 있어서, 상기 벡터는 아연 의존성 메탈로프로테아제를 코딩하는 핵산 분자의 5'-말단에 연결되고, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 염기서열로 이루어지는 프로모터를 추가로 포함하는 것인 발현벡터.
제8항에 있어서, 상기 벡터는 아연 의존성 메탈로프로테아제를 코딩하는 핵산분자의 3'-말단에 연결되고, pTXB3의 NcoI 및 BamHI에 의해 절단되는 MxeIntein chitin binding domain(CBD) 단편을 추가로 포함하는 것인 발현벡터.
SEQ ID NO:5의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 발현벡터.
제9항에 있어서, 상기 벡터는 도 6a에 나타낸 pES63H9pro3-ES63H9-MIC인 발현벡터.
플라스미드 pUC에 추가로 SEQ ID NO:3의 염기서열로 이루어지는 프로모터; 및 pTXB3의 NcoI 및 BamHI 사이에 해당하는 853 bp의 MxeIntein chitin binding domain (CBD) 단편을 포함하고, 도 5a에 나타낸 pES63H9pro3-MIC의 개열지도로 표시된 발현벡터.
SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 염기서열로 이루어지고, 아연 의존성 메탈로프로테아제 단백질을 코딩하는 핵산분자의 프로모터.
제2항 또는 제3항에 따른 아연 의존성 메탈로프로테아제(Zn-dependent metalloprotease) 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물.
제14항에 있어서, 상기 조성물은 혈전용해제용으로 사용되는 의약 조성물.