KR100265417B1

KR100265417B1 - 토끼 프로트롬빈 크링글-2를 코드하는 cDNA 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열

Info

Publication number: KR100265417B1
Application number: KR1019970082346A
Authority: KR
Inventors: 임태연; 이태희
Original assignee: 김승수
Priority date: 1997-12-31
Filing date: 1997-12-31
Publication date: 2004-03-20
Also published as: KR19990062038A

Abstract

본 발명은 신규한 토끼 프로트롬빈 크링글-2를 코드하는 cDNA의 염기 서열 및 그로부터 유래한 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 뉴질랜드산 흰 토끼(Newzealand white rabbit)를 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-guerin: BCG)으로 감작시키고 내독소인 LPS (lipopolysaccharide)로 처리한 토끼의 혈청으로부터 분리한 신규한 프로트롬빈 크링글-2(prothrombin kringle-2)을 코드하는 cDNA 염기 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 cDNA 서열은 재조합 대장균에서 확립된 발현 시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 생산된 토끼 프로트롬빈 크링글-2는 맥관 형성을 저해하여 류마치스나 암의 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 한편으로 혈액응고시의 프로트롬비나제 콤플렉스의 활성을 억제함으로서 혈전에 의한 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

토끼 프로트롬빈 크링글-2를 코드하는 cDNA 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열

본 발명온 토끼 프로트롬빈 크링글-2로 명명된 신규한 단백질을 코드하는 cDNA의 염기 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 뉴질랜드산 흰 토끼(Newzealand white rabbit)를 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-guerin: BCG)으로 감작시키고 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)로 처리한 토끼의 혈청으로부터 분리한 신규한 프로트롬빈 크링글-2(prothrombin kringle-2)을 코드하는 cDNA 염기 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다.

혈액응고 과정의 주 조절 물질인 트롬빈의 전구체인 프로트롬빈은 분자량이 72,000 kDa인 혈장내 당단백질로, 간세포에서 합성되어 글리코실화(glycosylation), γ-카르복실화(carboxylation) 등의 전사 후 변성과정을 거쳐 혈관으로 분비된다. 혈액응고가 시작되면 비활성 형태의 프로트롬빈은 factor Xa에 의하여 두 개의 크링글(kringle) 구조를 갖는 N-말단부와 활성형의 트롬빈으로 가수분해되는데, 이때 생성된 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 변화시킴으로써 혈액응고를 유도한다. 이 과정에서 프로트롬빈의 N-말단을 이루는 프로트롬빈 프래그먼트 1과 2가 절단되는데, 프래그먼트 1 부분은 전사 후 변형을 통해 글리코실화크링글이란 혈액의 응고와 혈전의 용혈 등에 관여하는 세린 프로티아제(serine protease)계 단백질에서 공통적으로 발견되는 도메인을 일컫으며, 특유의 3차 구조를 형성하게 하는 세 개의 이황화결합(disulfide bond)을 포함하는, 80여개의 아미노산 잔기로 구성되어 있다(참조: Furie, B. and Furie, C.B.,Cell, 53, 505-518 (1988)). 이러한 구조는 혈액응고 과정에서 중요한 역할을 하는 프로트롬빈에서 처음 발견되고 보고되었는데, 이외에도 프라즈미노겐(plasminogen), 유로키나제(urokinase), TPA(tissue-type plasminogenactivator) 및 factor XII 등의 혈액응고 및 응혈과정에 관여하는 단백질 가수 분해 효소들과 지방 전달과정에 중요한 역할을 하는 아포리포프로테인 a(apolipoprotein a) 및 사람 간세포 성장 인자(human hepatocyte growth factor) 등 혈액 내에 존재하는 매우 다양한 종류의 단백질에서 발견되고 있다. 이러한 크링글 구조는 단백질간에서 만이 아니라 종간에서도 유사성이 높아, 적어도 5억년 이상 보존되어 온 구조로 알려져 있다. 한편, 크링글 구조가 혈액 단백질에서 집중적으로 발견되고 있는 점으로 미루어, 크링글 구조는 혈액응고 조절 및 세포간 인식과정의 도구물질일 가능성이 매우 높을 것으로 추측되어지고 있으나, 크링글의 구조 및 기능에 관한 연구는 많이 수행된 바 없었다.

그러나, 최근에 이르러 포크만(Folkman, J) 등을 중심으로 한 연구진은 안지오스태틴(angiostatin)과 엔도스태틴(endostatin) 등, 크링글 구조를 갖는 단백질들이 내피세포의 성장을 억제하는 기능이 있다는 보고를 하여 주목을 받고 있다. 이들에 의하면, 4개의 크링글 구조를 포함하는 분자량이 38 kDa의 안지오스태틴은 물론, 이 단백질을 구성하는 각각의 크링글 부위 또한, bFGF(basic fibroblast growth factor)에 의존하여 성장하는 내피세포의 성장을 50%정도 억제한다는 보고를 하였는데(참조: Cao, Y., Ji, et al.,J. Biol. Chem.,271, 29461-29467(1996)), 내피세포의 성장은 비정상적인 혈관형성 과정(angiogenesis)과 직접적으로 연관되어 있어, 더욱 주목을 끌고 있다.

일반적으로, 일련의 발생 과정을 거친 정상적인 성체의 경우, 내피세포가 분열하거나 자라나는 경우는 거의 없다(참조: Engerman, R.L,, et al.,Lab Invest.,17, 738-743(1967)). 그러나, 상처의 치료 및 여성의 생식과 관련하여 새로운 혈관형성이 필요한 경우 또는 악성종양 세포의 성장과 전이가 일어나기 위해서는 특정한 성장인자(growth factor)가 분비되어야 하고, 이 인자는 성장이 거의 멈춰 있는 내피세포를 자극하여 분열과 성장을 유도하므로써, 새로운 혈관형성이 일어나게 된다(참조: Auerbach, W. and Auerbach, R.,Pharmacol. Ther.,63, 265-311(1994); Cockerill, G.W., et al.,Int. Rev. Cytol., 159, 113-160(1995); Adams, J.M. and Cory, S.,Science,254, 1161-1167(1991)). 한편, 분화가 끝난 성체에서 일어나는 비정상적인 혈관생성은 류마티스 관절염, 혈관종 등과 같이 비교적 발병율이 높고, 치료가 어려운 질환과 아주 밀접하게 연관되어 있다는 사실들이 알려지면서, 혈관형성의 조절에 대한 관심은 급속하게 증가하고 있는 것이 당분야의 추세이다.

따라서, 일단의 조작을 통한 혈관형성 과정의 인위적인 조절이 가능하다면, 전기한 여러 질환에 대한 대비책이 될 수 있을 것으로 당분야에서는 판단하고 있다. 특히, 악성종양의 경우, 종양세포의 성장 및 전이에 혈관형성 과정은 필수적이기 때문에, 혈관생성 억제물질의 개발은 악성종양에 대한 효과적인 대응이 될 수 있을 것으로 예측되고 있다. 실제로 이사야(Isaiah, J.) 등의 연구진은 혈관형성의 억제를 통해 암 전이를 막는 방법을 개발 중에 있다(참조: Isaiah, J. and Ellis, L.M.,Cell, 79,185-188(1994); Wu, Z., et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 651-654(1997); Abraham, J.A., et al.,Science,233, 545-548(1986)).

한편, 본 발명자들은 뉴질랜드 흰 토끼를 바실러스 칼메트-게린으로 감작시키고 내독소로 처리한 토끼의 혈청으로부터 내피 세포의 성장을 억제하는 프로트롬빈 크링글-2 단백질을 발견하고, 프로트롬빈 크링글-2 단백질을 순수 분리하여 특성을 규명하고, 단백질의 아미노산 서열을 조사한 결과, 신규한 것을 알아내고, 본 출원과 동일자로 "토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질 및 그의 정제방법"에 대한 특허를 출원한 바 있다. 그러나, 토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질의 보다 정확한 생리학적 연구와 토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질의 다량생산을 위해서는, 유전자 수준에서의 보다 정밀한 연구가 요청되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA를 분리하고 이 유전자 서열을 결정하여, 데이터베이스 탐색을 한 결과, 이 유전자의 염기 서열이 신규한 것임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 전술한 안지오스태틴 보다 우월한 내피세포 성장 억제활성을 갖는, 토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질을 코드하는 유전자 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 유전자 서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공하는데 있다.

도 1은 토끼의 혈액으로 부터 분리 정제한 토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질의 아미노산 서열,

도 2는 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 아미노산 서열을 기본으로 하여, 제작한 PCR 프라이머의 염기 서열,

도 3은 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA를 함유하는 pNR12를 제한효소로 잘라, 본 발명의 cDNA가 pNR12에 삽입되었음을 보여주는 아가로즈 겔 전기영동 사진,

도 4는 토끼 프로트롬빈 크링글-2를 코드하는 유전자의 염기 서열,

도 5는 토끼 프로트롬빈 크링글-2 유전자 서열을 번역한 아미노산 서열,

도 6은 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 유전자 서열에 따른 신규한 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 아미노산 서열과 유사한 다른 단백질의 서열을 비교한 그림.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

우선, 토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질을 유도하기 위해 뉴질랜드 흰 토끼(Newzealand white rabbit) 2 내지 3 kg의 토끼에 BCG균과 내독소를 주사하였다. 이어, 토끼를 해부하여 간을 떼어내고, 막자사발에서 분해하여, 이 간 분쇄물을 유기추출 한 후, 상충액에 동일 부피의 이소프로판올(isopropanol)을 가하고, 원심분리하여 전체 RNA를 침전시켰다. 그런 다음, 이 침전물에 에탄올을 가하고, 이 침전물을 건조시킨 후, 물에 용해시켰다. 이렇게 수득한 전체 RNA에 랜덤 프라이머와 물을 가하여 고온에서 10분간 방치한 후, 급속히 냉각하고, 완충용액과 dNTP를 가하여 미리 반응(preincubation)시켰다. 이렇게 준비된 반응액에 역전사효소를 가한 후, 고온에서 5분간 두어 반응을 정지시켜 첫 번째 cDNA 가닥을 제조하였다. 이렇게 얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 프로트롬빈 크링글-2의 N-말단과 C-말단 아미노산 서열을 기초로 제조한 올리고 뉴크레오티드를 연쇄중합반응(polymerase chain reaction)의 프라이머로 삼아 연쇄중합반응을 수행하여 토끼 프로롬빈 크링글-2의 cDNA를 얻었다.

상기한 과정에서 수득한 cDNA를 pGEM-T 벡터(Promega, U.S.A.)에 DNA 연결효소를 이용하여 재조합시킨 후, 대장균에 형질전환시키고, 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. 이 콜로니에서 각각 플라즈미드를 분리하고, 클로닝 자리에 인접한 곳에 잘리는 자리가 있는 제한효소인 PstI과 ApaI을 처리한 후, 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여, 삽입된 DNA가 있는 콜로니를 분별하였다. 이렇게 구축한 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA를 갖고 있는 벡터를 pNR12라 명명하였다.

한편, 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA 염기서열을 결정하기 위하여, 플라즈미드 pNR12를 정제한 후, 수산화나트륨으로 변성시키고, 아세트나트륨(sodium acetate)로 중화시켰다. 이어, 에탄올 침전방법으로 변성된 DNA를 수거한 후, 소량의 서열결정 프라이머(sequencing primer)와 반응완충용액을 첨가하였다. 그런 다음, 이 혼합액을 ¼으로 나누어 각각 0.5mM ddATP,ddTTP,ddGTP 및 ddCTP(dideoxynucleotide)용액에 넣어 반응시킨 후 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 다음, X선 필름을 사용하여 감광시키고 현상하여 염기서열을 결정하였다.

DNA서열을 결정한 결과, 이 DNA는 111개의 아미노산을 코드 하는 333 뉴크레오티드의 개방 해독틀 부위에 해당하는 것으로 확인되었고, 사람과 생쥐 그리고 소에서 알려진 프로트롬빈 프래그먼트 2번 부분과 상당히 유사한 양상을 보이고 있음을 확인할 수 있었다. 한편, 현재까지 토끼의 프로트롬빈 프래그먼트 2 부분에 대해서는 연구가 전혀 이루어지지 않아, 토끼 프로롬빈 크링클-2의 아미노산 서열과 본 발명의 토끼 프로롬빈 크링클-2의 cDNA 염기 서열 모두 새로운 신규의 물질임을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 유도

토끼 프로트롬빈 크링글-2는 뉴질랜드 흰 토끼(Newzealand white rabbit)로부터 유도하였다. 2 내지 3 kg의 토끼에 BCG균을 4 내지 5 x 10⁸세포를 인산완충등장액(pH 7.2, phosphate buffered saline)에 용해하여 귀정맥에 주사하였다. 이어,14일이 경과한 후 150 μg의 내독소를 인산완충등장액에 용해시켜 귀정맥에 주사하였다.

실시예 2: 신규 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA 클로닝

토끼를 해부하여 간을 떼어내고, 조직 1 g당 RNAzol(Cinna/Biotex, USA) 2㎖을 가하여 막자사발에서 분해하였다. 여기에 클로로포름 200㎕를 가하여 유기추출을 한 후, 상충액에 동일 부피의 이소프로판올(isopropanol)을 가하였다. 10,000 × g에서 10분간 원심분리하여 전체 RNA를 침전시키고, 침전물에 70% 에탄올을 가하여 1회 세척하였다. 침전물을 잠시 건조시킨 후 소량의 물에 용해시키고, UV/VIS 흡광계를 사용하여 분리한 전체 RNA의 순도 및 양을 측정하였다. 50μg 전체 RNA에 1.2μg의 랜덤 프라이머(random primer, Gibco BRL, cat no. 48190-011, U.S.A.)와 멸균된 물을 가하여 70℃에서 10분간 방치한 후, 얼음에서 급속히 냉각하고 5× 반응 완충용액(250mM Tris-HCl, 375mM KCl, 15mM MgCl₂, 5mM DTT, pH 8.3)과 dNTP를 가하여 37℃에서 미리 반응(preincubation)시켰다. 이렇게 준비된 반응액에 역전사 효소(Gibco BRL, U.S.A.) 10unit을 가하고 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 95℃에서 5분간 두어 반응을 정지시켜 첫 번째 cDNA 가닥을 제조하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)). 이렇게 얻어진 cDNA 1∼2mg/㎖를 주형으로 하고, 도 1에 개시한 프로트롬빈 크링글-2 단백질의 N-말단과 C-말단 아미노산 서열에 따라 제작된 4종의 프라이머를 이용하여 연쇄중합반응(polymerase chain reaction)을 수행하고 이로부터 반응산물을 수득하는데, 이때, 5' 말단 부위 프라이머-1 및 3' 말단부위 프라이머-1(참조: 도 2)을 이용하여 94℃, 60℃, 73℃에서 각각 1분씩 35회 동안 1차 연쇄중합반응을 수행하고 이로부터 1차 반응산물을 수득한 후, 전기 수득한 1차 반응산물을 주형으로 하고, 5' 말단 부위 프라이머-2 및 3' 말단 부위 프라이머-2(참조: 도 2)를 이용하여 전기 반응조건과 동일한 조건에서 2차 연쇄중합반응을 수행하고 이로부터 최종 반응산물을 수득한다. 도 1 및 도 2에서 기호는 IUPAC 명명법에 따른 것이고, 도 1에서 * 표시는 아미노산 분석으로 밝히지 못했던 잔기를 표시하며, 도 2의 괄호안의 기호는 4종의 프라이머를 제조하기 위하여 사용된 N-말단과 C-말단의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 한편, 이 과정에서 얻어진 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA를 pGEM-T 벡터(Promega, U.S.A.)에 T4 DNA ligase(Gibco BRL, U.S.A.)를 이용하여 재조합시킨 후, 대장균(E.coliXL1 Blue)에 형질전환(transformation)시키고, 앰피실린(ampicillin)에 저항성이 있는 12개의 콜로니를 선별하였다. 이 콜로니에서 각각 플라즈미드를 분리하고, 클로닝 자리에 인접한 곳에 잘리는 자리가 있는 제한효소인 PstI과 ApaI을 처리한 후, 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하여, 삽입된 DNA가 있는 콜로니를 분별하였다(참조: 도 3). 이렇게 구축한 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA를 갖고 있는 벡터는 pNR12라 명명하였다.

실시예 3 : cDNA 염기 서열의 결정

DNA 염기서열은 디데옥시 염기 서열(dideoxy-mediated sequencing)방법 (참조: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463(1977))을 사용하여 결정하였다. 플라즈미드 pNR12를 정제한 후, 0.2 N 수산화 나트륨으로 변성시키고 0.5 M 소디움아세테이트(sodium acetate)로 중화시켰다. 에탄올 침전방법으로 변성된 DNA를 수거한 후, 1~5 pmole의 서열결정 프라이머(SP6 promoter primer, T7 promoter primer, Promega, U.S.A.)와 반응완충용액(75 mM 디티오트레이톨, 10 μCi [³⁵S] ATP를 함유하는 0.5 mM dNTP 표지혼합물)을 첨가하였다. 이 혼합액을 ¼으로 나누어 각각 0.5 mM ddATP,ddTTP,ddGTP 및 ddCTP(dideoxynucleotide) 용액에 넣고 반응시킨 후, 6% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(60 W, 30×40 cm, 1600V))한 다음, X선 필름을 사용하여 -70℃에서 24시간 감광시키고 현상하여 전체 333 bp의 염기 서열킨 후, 6% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(60 W, 30×40 cm, 1600V))한 다음, X선 필름을 사용하여 -70℃에서 24시간 감광시키고 현상하여 전체 333 bp의 염기 서열을 결정하였다(참조: 도 4). 이에, DNA서열을 결정한 결과, 이 DNA는 111개의 아미노산을 코드 하는 333 뉴크레오티드의 개방 해독틀 부위에 해당하는 것으로 확인되었다. 전기 염기 서열을 기초로 하여, 토끼의 혈청으로부터 분리정제한 토끼 프로트롬빈 크링글-2를 코드하는 cDNA의 전체 염기서열을 번역할 수 있었는 바, 서열이 결정된 부분은 전기 단백질의 N-말단부터 C-말단까지의 모든 아미노산을 코드한다(참조: 도 5). 한편, 미국 NIH에서 제공되는 DNA와 단백질 아미노산 서열의 데이터 베이스를 이용하여 신규 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 1차적 구조 유사성을 비교한 결과, 사람과 생쥐 그리고 소에서 알려진 프로트롬빈 프래그먼트 2번 부분과 상당히 유사한 양상을 보였다(참조: 도 6). 그러나, 현재까지 프로트롬빈 프래그먼트 2 부분은 토끼에서 연구가 전혀 이루어지지 않아 단백질 아미노산 서열과 cDNA 염기서열 모두 새로운 신규의 물질임이 확실한 것으로 나타났다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 토끼 프로트롬빈 크링글-2로 명명된 신규한 단백질을 코드하는 cDNA의 염기 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의 cDNA 서열은 재조합 대장균에서 확립된 발현 시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 생산된 토끼 프로트롬빈 크링글-2-는 혈관 형성을 저해하여 류마치스나 암의 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 한편으로 혈액응고시의 프로트롬비나제 콤플렉스의 활성을 억제함으로써 혈전에 의한 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims

뉴질랜드 흰 토끼에서 분리된 다음과 같은 서열 전체를 가지는 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 cDNA:
제 1항에 개시된 cDNA의 제작을 위해 사용하는 다음과 같은 염기 서열을 갖는 프라이머:
제 1항에 개시된 cDNA로부터 유래한 다음과 같은 서열 전체를 가지는 아미노산 서열: