KR100256040B1

KR100256040B1 - 토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질 및 그의 정제방법

Info

Publication number: KR100256040B1
Application number: KR1019970082347A
Authority: KR
Inventors: 임태연; 이태희
Original assignee: 김승수
Priority date: 1997-12-31
Filing date: 1997-12-31
Publication date: 2000-05-01
Also published as: KR19990062039A

Abstract

본 발명은 신규한 토끼 프로트롬빈 크링글-2(rabbit prothrombin Kringle-2)와 그의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명의 토끼 프로트롬빈 크링글-2는 뉴질랜드 흰 토끼(Newzealand white rabbit)를 BCG로 감작하고, LPS로 유도하여 얻어진 혈청을 시료로 하여 DEAE-세파셀 이온교환 크로마토그래피, 세파크릴 S-200겔 여과 크로마토그래피,FPLC 모노-Q 이온교환 크로마토그래피,CM-시바크론 블루3GA 크로마토그래피 및 FPLC-수퍼로즈 12H/R 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 정제한다. 본 발명의 토끼 프로트롬빈 크링글-2는 내피세포의 성장을 억제하고 맥관형성을 저해함으로써 류마치스나 암의 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 혈액응고시의 프로트롬비나제 콤플폐스의 활성을 억제함으로써 혈전에 의한 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질 및 그의 정제방법

본 발명은 토끼 프로트롬빈 크링글-2로 명명된 신규한 단백질 및 그의 정제 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 뉴질랜드 흰 토끼(Newzealand white rabbit)를 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-guerin: BCG)으로 감작시키고, 내독소로 처리한 토끼의 혈청으로부터 분리한 단백질인 프로트롬빈 크링글-2(prothrombin kringle-2) 및 그의 정제방법에 관한 것이다.

혈액응고 과정의 주 조절 물질인 트롬빈의 전구체인 프로트롬빈은 분자량이 72,000 kDa인 혈장내 당단백질로, 간세포에서 합성되어 글리코실화(glycosylation), γ-카르복실화(carboxylation) 등의 전사 후 변성과정을 거쳐 혈관으로 분비된다. 혈액응고가 시작되면 비활성 형태의 프로트롬빈은 factor Xa에 의하여 두 개의 크링글(kringle) 구조를 갖는 N-말단부와 활성형의 트롬빈으로 가수분해되는데, 이때 생성된 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 변화시킴으로써 혈액응고를 유도한다. 이 과정에서 프로트롬빈의 N-말단을 이루는 프로트롬빈 프래그먼트 1과 2가 절단되는데, 프래그먼트 1부분은 전사 후 변형을 통해 글리코실화가 되는 반면, 프래그먼트 2부분은 변형되지 않은 크링글 구조를 그대로 가지고 있다(참조: Esmon, C. T., et al., J. Biol. Chem., 249, 8045(1974)).

크링글이란 혈액의 응고와 혈전의 용혈 등에 관여하는 세린 프로티아제(serine protease)계 단백질에서 공통적으로 발견되는 도메인을 일컫으며, 특유의 3차 구조를 형성하게 하는 세 개의 이황화결합(disulfide bond)을 포함하는, 80여개의 아미노산 잔기로 구성되어 있다(참조: Furie, B. and Furie, C.B., Cell, 53, 505-518 (1988)). 이러한 구조는 혈액응고 과정에서 중요한 역할을 하는 프로트롬빈에서 처음 발견되고 보고되었는데, 이외에도 프라즈미노겐(plasminogen), 유로키나제(urokinase)나 TPA(tissue-type plasminogen activator), 및 factor XII 등의 혈액응고 및 용혈과정에 관여하는 단백질 가수 분해 효소들에서 뿐만 아니라, 지방 전달과정에서 중요한 역할을 하는 아포리포프로테인 a(apolipoprotein a ) 및 사람 간세포 성장 인자(human hepatocyte growth factor)에 이르기까지 혈액 내에 존재하는 매우 다양한 종류의 단백질에서 발견되고 있다. 이러한 크링글 구조는 단백질간에서 만이 아니라 종간에서도 유사성이 높아, 적어도 5억년 이상 보존되어 온 구조로 알려져 있다. 따라서, 크링글 구조는 혈액 단백질에서 집중적으로 발견되고 있는 점으로 미루어, 혈액응고 조절 및 세포간 인식과정의 도구물질일 가능성이 매우 높을 것으로 생각되고 있을 뿐, 독립된 크링글의 구조 및 기능에 관한 연구는 많이 수행된 바 없었다.

그런, 최근에 이르러 포크만(Folkman, J) 등을 중심으로 한 연구진은 앤지 오스태틴(angiostatin)과 엔도스태틴(endostatin) 등, 크링글 구조를 갖는 단백질들이 내피세포의 성장을 억제하는 기능이 있다는 보고를 하여 주목을 받고 있다. 이들에 의하면, 4개의 크링글 구조를 포함하는 분자량이 38 kDa의 안지오스태틴은 물론, 이 단백질을 구성하는 각각의 크링글 부위 또한, bFGF(basic fibroblast growth factor)에 의존하여 성장하는 내피세포의 성장을 50%정도 억제한다는 보고를 하였는데(참조: Cao, Y., Ji, et al., J. Biol. Chem., 271, 29461-29467(1996)), 내피세포의 성장을 비정상적인 혈관형성 과정(angiogenesis)과 직접적으로 연관되어 있어, 더욱 주목을 끌고 있다. 일반적으로, 일련의 발생 과정을 거친 정상적인 성체의 경우, 내피세포가 분열하거나 자라나는 경우는 거의 없다(참조: Engerman, R.L., et al., Lab Invest., 17, 788-743(1967)). 그러나, 상처의 치료 및 여성의 생식과 관련하여 새로운 혈관형성이 필요한 경우 또는 악성종양 세포의 성장과 전이가 일어나기 위해서는 특정한 성장인자(growth factor)가 분비되어야 하고, 이 인자는 성장이 거의 멈춰 있는 내피세포를 자극하여 분열과 성장을 유도하므로써, 새로운 혈관형성이 일어나게 된다(참조: Auerbach, W. and Auerbach, R., Pharmacol. Ther., 63, 265-311(1994); Cockerill, G.W., et al., Int, Rev. Cytol., 159, 113-160(1995); Adams, J.M. and Cory, S., Science, 254, 1161-1167(1991)). 한편, 분화가 끝난 성체에서 일어나는 비정상적인 혈관생성은 류마티스 관절염, 혈관종 등과 같이 비교적 발병율이 높고, 치료가 어려운 질환과 아주 밀접하게 연관되어 있다는 사실들이 알려지면서, 혈관형성의 조절에 대한 관심은 급속하게 증가하고 있는 것이 당분야의 추세이다.

따라서, 일단의 조작을 통한 혈관형성 과정의 인위적인 조절이 가능하다면, 앞서 언급한 여러 질환에 대한 대비책이 될 수 있을 것으로 당 분야에서는 판단하고 있다. 특히, 악성종양의 경우, 종양세포의 성장 및 전이에 혈관형성 과정은 필수적이기 때문에, 혈관생성 억제물질의 개발은 악성종양에 대한 효과적인 대응이 될 수 있을 것으로 예측되고 있다. 실제로 이사야(Isaiah, J.) 등의 연구진은 혈관형성의 억제를 통해 암 전이를 막는 방법을 개발 중에 있다(참조: Isaiah, J. and Ellis, L.M., Cell, 79, 185-188(1994); Wu, Z., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 651-654(1997); Abraham, J.A., et al., Science, 233, 545-548 (1986)).

이에, 본 발명자들은 종양세포의 성장 및 전이를 방해하는 생물학적 물질을 탐색하고자 예의 연구 노력한 결과, 뉴질랜드 흰 토끼를 바실러스 칼메트-게린으로 감작시키고 내독소로 처리한 토끼의 혈청으로부터 내피세포의 성장을 억제하는 프로트롬빈 크링글-2 단백질을 분리하였는 바, 전기 단백질의 아미노산 서열이 신규한 것임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 토끼의 혈청으로부터 분리한 내피세포 성장 억제활성을 갖는 프로트롬빈 크링글-2 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 프로트롬빈 크링글-2를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

제1도는 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청의 DEAE-세파셀(Sephacel) 이온교환 크로마토그램.

제2도는 제1도의 DEAE-세파셀 이온교환 크로마토그래피에 의해 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 분획의 세파크릴(Sephacryl) S-200 겔 여과 크로마토그램,

제3도는 제2도의 세파크릴 S-200 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 분획의 FPLC 모토(mono)-Q 이온교환 크로마토그램.

제4도는 제3도의 FPLC 모노-Q 이온교화 크로마토그래피에 의해 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 분획의 CM-시바크론 블루(CM-cibacron Blue) 3GA 크로마토그램.

제5도는 제4도의 CM-시바크론 블루 3GA 크로마토그래피에 의해 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 분획의 FPLC-수퍼로즈(Superose) 12H/R 겔 여과 크로마토그램.

제6도는 제5도의 FPLC-수퍼로즈 12H/R 겔 여과 크로마토그래피로부터 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 SDS-PAGE 사진.

제7도는 제5도의 FPLC-수퍼로즈 12H/R 겔 여과 크로마토그래피로부터 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2와 앤지오스태틴(angiostation)의 내피세포 성장 억제활성을 비교한 그래프.

제8도는 정제된 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분자량을 나타내는 SDS-PAGE 사진 및 질량분석기 분석결과를 나타내는 질량분석 스펙트럼.

제9도는 본 발명에서 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 등전점 분석결과를 나타내는 그래프.

제10도는 본 발명에서 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 아미노산 서열을 나타낸다.

이하에서는, 본 발명의 토끼 프로트롬빈 크링글-2를 정제하는 방법을 공정별로 상세히 설명한다:

제1공정: 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청의 유도

뉴질랜드 흰 토끼(Newzealand white rabbit)에 BCG균을 인산완충등장액(pH 7.2, phosphate buffered saline)에 용해하여 귀정맥에 주사하였다. 이어, 내 독소를 인산완충등장액에 용해시켜 귀정맥에 주사하고 심장을 찔러(heart puncture) 전혈을 얻었다. 이어, 수득한 전혈을 방치하여 혈액이 응고되게 하고, 이 응고된 혈액을 원심분리하여 상등액의 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청을 얻었다.

제2공정: 황산암모늄에 의한 분별침전, DEAE-세파셀(Sephacel) 이온교환 크로마토그래피

전술한 방법으로 얻은 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청을 황산암모늄으로 50내지 90%, 가장 바람직하게는 약 80%에서 포화시켰다. 이어, 포화용액을 원심분리하여 얻어지 침전물을 최소부피의 인산 1완충용액(pH 7.0, 10mM sodium phosphate, 50mM NaCl)에 용해시킨 다음, 동일 완충용액으로 투석하였다. 그런 다음, 투석된 용액을 원심분리하고, 상등액을 DEAE-세파셀 컬럼에 로딩(loading)하였다. 한편, 단백질 용출은 50~500mM NaCl로 농도구배를 형성시키면서 수행하였고, 후술하는 방법으로 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 확인하고 농축하였다.

제3공정: 세파크릴(Sephacryl) S-200 겔 여과 크로마토그래피

전기 공정에서 수득한 농축된 내피세포 성장 억제활성 분획을 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 인산 2완충용액(pH 7.0, 50mM sodium phosphate)으로 평형화된 세파크릴 S-200 컬럼에 로딩하였다. 이어, 동일 완충용액을 사용하여 단백질을 용출시키고, 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 모아서 농축하였다.

제4공정: FPLC 모노(mono)-Q 이온교환 크로마토그래피

전기 공정에서 수득한 내피세포 성장 억제활성 분획을 원심분리하여, 불용성 침전물을 제거한 다음, 전기 인산 2완충용액으로 평형화된 FPLC 모노-Q 컬럼에 로딩하였다. 이어, 125-300mM NaCl로 직선 농도구배를 형성시키면서 단백질을 용출 시켰고, 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 모아서 40mM Tris-HCl 완충용액(50mM NaCl, 0.5mM PMSF 함유, pH 7.8)을 이용하여 투석하였다.

제5공정: CM-시바크론 블루(cibacron blue) 3GA 크로마토그래피

전기 공정에서 수득한 내피세포 성장 억제활성 분획을 원심분리하여, 불용성 침전물을 제거한 다음, 40mM Tris-HCl 완충용액(50mM NaCl, 0.5mM PMSF 함유, pH 7.8)으로 평형화된 CM-시바크론 블루 3GA 컬럼에 로딩하였다. 이어, 동일 완충용액을 사용하여 단백질을 용출시키고, 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 모아서 농축하였다.

제6공정: FPLC 수퍼로즈(Superose) 12H/R 겔 여과 크로마토그래피

전기 공정에서 수득한 내피세포 성장 억제활성 분획을 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 40mM Tris-HCl 완충용액(200mM NaCl, 0.5mM PMSF 함유, pH 7.8)으로 평형화된 FPLC 수퍼로즈 12H/R 겔 여과 컬럼에 로딩하였다. 이어, 동일완충용액을 사용하여 단백질을 용출시키고, 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 모아서 농축하였다.

한편, 전술한 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 정제과정에 있어서, 내피세포 성장 억제활성의 조사는 다음과 같이 수행하였다: 우선, 활성측정에 사용되는 소의 모세혈관 내피세포(BCE cell)를 열처리된 10% 소 혈청과 3ng/ml 농도의 재조합 사람 bFGF(R&D Inc., U.S.A.)를 포함하는 성장배지에서 유지하였다. 젤라틴이 입혀진 6개의 웰에서 자란 소의 모세혈관 세포들을 0.05% 트립신(trypsin) 용액으로 떼어낸 다음, 10% 소 혈청을 포함하는 성장배지로 희석하였다. 0.5ml 당 약 12,500개의 세포를 젤라틴이 입혀진 24개의 웰이 있는 플레이트의 각 웰에 넣어준 후, 37℃에서 24시간 동안 키웠다. 이어, 5% 소 혈청을 포함하는 신선한 성장 배지 0.25ml로 치환한 후, 내피세포 성장 억제활성을 조사할 시료를 각 웰에 처리하였다. 30분 후, 배지의 부피를 0.5ml로 맞춘 다음, bFGF를 최종 1ng/ml의 농도로 처리하였다. 이어, 72시간 후, 세포들을 트립신으로 떼어 내고 세포수를 측정하여 내피세포 성장 억제활성을 조사하였다.

본 발명에서 분리된, 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분자량을 조사한 결과 SDS-PAGE에 의해서는 22,000Da, 질량분석기에 의해서는 12,600Da으로 확인되었다. 또한, 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 등전점은 pH 5.0이고, 당 단백질이 아님을 확인 하였으며, 전체 아미노산 서열을 조사하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

토끼 프로트롬빈 크링글-2의 유도

2 내지 3 kg의 뉴질랜드 흰 토끼(Newzealand white rabbit)에 BCG균을 4 내지 5 x 10⁸세포를 인산완충등장액(pH 7.2,phosphate buffered saline)에 용해하여 귀정맥에 주사하였다. 이어, 14일이 경과한 후 150μg의 내독소인 LPS(lipopolysaccharide, Sigma Chemical Co., U.S.A.)를 인산완충등장액에 용해시켜 귀정맥에 주사하고, 1시간 후 심장을 찔러(heart puncture) 전혈을 얻었다. 이어, 수득한 전혈을 37⁰C에서 30분간 방치하여 혈액이 응고되게 하고, 4⁰C, 2,500 xg에서 1시간 동안 원심분리하여 맑은 상등액의 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청을 얻었다.

[실시예 2]

황산암모늄에 의한 분별침전, DEAE-세파셀 이온교환 크로마토그래피

실시예 1에서 얻은 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청을 4⁰C에서 황산암모늄으로 80% 포화시켰다. 이 포화용액을 13,000 x g에서 30분동안 원심분리하고, 이때 얻어진 침전물을 최소부피의 인산 1완충용액(pH 7.0, 10mM sodium phosphate, 50mM NaCl)에 용해시킨 다음, 동일 완충용액 300배 부피로 투석하였다. 이어, 투석된 용액을 10,000 x g에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질인 침전물을 제거하고, 인산 1완충용액으로 이미 평형화되어 있는 DEAE-세파셀 컬럼(4 x 18.5 ㎝)에 로딩(loading)하였다. 10배 부피의 동일 완충용액을 사용하여 280nm에서의 흡광도가 0.1이하가 될 때까지 충분히 세척한 다음, 50 내지 500mM 염화나트륨으로 농도 구배를 형성시키면서 단백질을 용출시켰다. 이때, 유속은 시간당 18ml 정도로 유지하였으며, 5ml의 각 분획마다 내피세포 성장 억제활성을 측정한 다음, 활성이 있는 부분을 모아서 YM10 멤브레인(Amicon, U.S.A)을 사용하여 농축하였다. 한편, 제1도는 DEAE-세파셀 이온교환 크로마토그래피에서 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분포 및 단백질의 용출을 나타내는 크로마토그램이다.

[실시예 3]

세파크릴 S-200 겔 여과 크로마토그래피

실시예 2에서 수득한 농축된 내피세포 성장 억제활성 분획을 10,000 x g에서 10분간 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 인산 2완충용액(pH 7.0, 50mM sodium phosphate)으로 이미 평형화되어 있는 세파크릴 S-200 컬럼(1.2 x 140㎝)에 로딩하고, 동일 완충용액을 사용하여 시간당 15ml의 속도로 단백질을 용출시켜 2ml씩 분획을 수집하였다. 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 모아서 YM10 멤브레인(Amicon, U.S.A)을 사용하여 농축하였다. 제2도는 세파크릴 S-200 겔 여과 크로마토그래피에서 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분포 및 단백질의 용출을 나타내는 크로마토그램이다.

[실시예 4]

FPLC 모노-Q 이온교환 크로마토그래피

실시예 3에서 수득한 농축된 내피세포 성장 억제활성 분획을 10,000 x g에서 원심분리하여, 불용성 침전물을 제거한 다음, 인산 2완충용액(pH 7.0)으로 이미 평형화되어 있는 FPLC 모노-Q 컬럼(0.5 x 5㎝)에 로딩하였다. 이어, 125-300mM NaCl로 직선 농도구배를 형성시키면서 단백질을 용출시켰다. 이때, 유속은 시간당 30ml 정도이며, 1ml 씩 분획을 수집하였다. 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 모아서 40mM Tris-HCl 완충용액(50mM NaCl, 0.5mM PMSF 함유, pH 7.8)에 대하여 300배 부피로 투석하였다. 제3도는 FPLC 모노-Q 이온교환 크로마토그래피에서 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분포 및 단백질의 용출을 나타내는 크로마토그램이다.

[실시예 5]

CM-시바크론 블루 3GA 크로마토그래피

실시예 4에서 수득한 농축된 내피세포 성장 억제활성 분획을 10,000 x g에서 10분간 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 40mM Tris-HCl 완충용액(50mM NaCl, 0.5mM PMSF 함유, pH 7.8)으로 이미 평형화되어 있는 CM-시바크론 블루 3GA 컬럼(0.5 x 2㎝)에 로딩하고, 동일 완충용액을 사용하여 시간당 15ml의 속도로 단백질을 용출시켰다. 흡착된 단백질은 40mM Tris-HCl 완충용액(1.5M NaCl 함유, pH 7.8)을 사용하여 용출시켰다. 이어, 내피세포 성장 억제활성이 있는 부분을 모아서 centricon (Amicon, U.S.A)을 사용하여 농축하였다. 제4도는 CM-시바크론 블루 3GA 크로마토그래피에서 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분포 및 단백질의 용출을 나타내는 크로마토그램이다.

[실시예 6]

FPLC 수퍼로즈 12H/R 겔 여과 크로마토그래피

실시예 5에서 수득한 농축된 내피세포 성장 억제활성 분획을 10,000 x g에서 10분간 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 40mM Tris-HCl 완충용액(200mM NaCl, 0.5mM PMSF 함유, pH 7.8)으로 이미 평형화되어 있는 FPLC 수퍼로즈 12 H/R 겔 여과 컬럼(125ml)에 로딩하였다. 이어, 동일 완충용액을 사용하여 시간당 30ml으로 단백질을 용출시키고, 1.4ml 분획을 수집하여다. 내피세포 성장 억제 활성이 있는 부분을 centricon(Amicon, U.S.A)을 사용하여 농축하였다. 제5도는 FPLC 수퍼로즈 12H/R 겔 여과 크로마토그래피에서 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분포 및 단백질의 용출을 나타내는 크로마토그램이다. 한편, 제6도는 실시예 2에서부터 실시예 6까지의 정제과정을 통하여 토끼 프로트롬빈 크링글-2가 정제되었음을 확인하는 겔 사진이다. 제6도에서 1번 레인은 분자량 표준물질을 로딩한 레인이고, 2번 레인은 FPLC 수퍼로즈 12H/R 겔 여과 크로마토그래피를 거친 활성분획을 로딩한 레인이다. 2번 레인에서 단일의 띠가 나타남으로써 토끼 프로트롬빈 크링글-2가 정제되었음을 알 수 있었다.

[실시예 7]

앤지오스태틴과의 내피세포 성장 억제활성의 비교

본 발명에서 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2와 내피세포 성장 억제활성을 갖는 대표적 물질인 앤지오스태틴과의 내피세포 성장 억제활성을 비교하였다. 내피세포 성장 억제활성은 동일한 방법으로 측정하였다. 제7도에서 보듯이, 앤지오스태틴과 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 농도를 달리하면서 내피세포 성장 억제활성을 측정한 결과 전체적으로 농도 의존적 내피세포 성장 억제활성을 나타내었으며, 앤지오스태딘 보다 토끼 프로트롬빈 크링글-2가 내피세포 성장 억제활성이 우수함을 알 수 있었다.

[실시예 8]

SDS-PAGE 및 질량분석기(mass-spectroscophy)에 의한 분자량 결정 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 분자량을 측정하기 위하여, SDS-PAGE 및 질량분석기를 이용하였다. 실시예 6에서 얻어진 내피세포 성장 억제활성이 있는 토끼 프로트롬빈 크링클-2의 SDS-PAGE 결과, 제8도의 전기영동 사진에서 보는 바와 같이 분자량이 약 22,000Da임을 확인할 수 있었다. 제8도의 전기영동 사진에서 M 레인은 분자량 표준물질을 로딩한 것이고, A 레인은 실시예 6에서 분리된 토끼 프로트롬빈 크링글-2를 로딩한 것이다. 한편, 질량분석기로 분석한 결과는 제8도의 질량분석 스펙트럼에서 보는 바와 같이 분자량이 약 12,600Da으로 확인되었다. 이처럼 두측정방법에 따라 분자량이 달라지는 이유는, 토끼 프로트롬빈 크링글-2가 SDS-PAGE 수행할 때 변성이 되어 이중체(dimer)를 형성하기 때문일 것으로 추측되며, 이 현상은 크링클 구조를 갖는 여러 단백질에서 관찰되는 것이다.

[실시예 9]

등점점, 당단백질 여부 및 아미노산 성분 조사

프로트롬빈 크링글-2의 등전점을 측정하기 위하여, 실시예 6에서 최종적으로 정제된 프로트롬빈 크링글-2 10μg을 pH 4 내지 6에 해당하는 앰폴라이트(ampholyte) 용액에 혼합한 다음, Rotofor 등전점 분석 킷트(isoelectric focusing kit, Bio-Rad, U.S.A.)에 로딩하였다. 이어, 4℃에서 12 watt로 4시간 동안 전기 초점화(electrofocusing)를 수행하였고, 분획된 시료의 흡광도와 내피세포 성장 억제활성 구간을 결정하고 가장 활성이 높은 구간의 pH를 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 등전점으로 결정하였다(참조: 제9도). 이 실험결과, 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 등전점이 pH 5.0임을 확인할 수 있었다. 한편, 실시예 6에서 최종적으로 정제된 프로트롬빈 크링글-2를 환원된 상태에서 전기영동을 수행한 다음, 겔을 7.5% 초산용액에 1시간 동안 담그고, 이어, 4℃에서 0.2% 페리오드산(periodic acid)에 45분 동안 담근 후, 겔을 10%초산 용액에서 3번 헹구면서 발색을 유도하여 결정한 결과, 아무런 발색도 관찰할 수 없었으므로, 토끼 프로트롬빈 크링글-2가 당단백질이 아니라는 사실을 알 수 있었다.

또한, 정제된 프로트롬빈 크링글-2의 전체 아미노산 성분을 분석하기 위해서, 카복시메틸화(carboxymethylation)한 다음, 단백질을 단백질 가수분해 용액(6NHCl, 0.01% phenol, 0.005% 2-mercaptoethanol) 0.2ml에 용해시킨 후, 110℃에서 24시간 동안 반응시키고, Beckman 6300 아미노산 분석기기(Beckman, U.S.A)에 로딩하였다. 그 결과 밝혀진 토끼 프로트롬빈 크링글-2의 아미노산 성분은 하기 표 1과 같다.

*: 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.

**: Cms는 카르복실 메틸화(carboxyl methylated) 시스테인을 나타낸다.

[실시예 10]

토끼 프로트롬빈 크링글-2의 아미노산 서열 결정

N-말단 아미노산 서열을 결정하기 위해 정제된 단백질 2nmole을 폴리비닐디플로라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane)에 전기부착하였다. 이 종이를 쿠마시 브릴리언트 블루 R(Coomassie brilliant blue R) 용액에 3초동안 염색하고, 50% 메탄올에 탈색한 후, 단백질을 포함하는 부분을 절단하였다. 이어, 단백질 서열 결정기(Model 477A protein sequencer, Applied Biosystem Inc., U.S.A)에 로딩하여 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다.

한편, 단백질 내부의 아미노산 서열을 결정하기 위해 정제된 단백질을 카복시메틸화(carboxymethylation)시킨 다음, 20mM Tris-HCl 완충용액(100mM NaCl, 5% acetonitrile, 함유, pH 7.8) 100μl에 용해시키고, 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), V8 프로티아제(V8 protease), Arg-C 엔도펩티다제(Arg-C endopeptidase), Lys-C 엔도펩티다제(Lys-C endopeptidase)등을 가지고 절단하였다. 이때, 단백질 분해효소 대기질 프로트롬빈 크링글-2의 몰비는 1:50이었고, 반응온도 및 반응시간은 각각 37℃, 12시간이었다. 또한, 동일한 조건에서 12시간 동안 한번 더 반응시켰다. 이어, HPLC(Waters Inc., U.S.A.)에 장착된 C₁₈-RP컬럼으로 절단된 단백질조각을 분리하고, 단백질 서열 결정기(Model 477A protein sequencer, Applied biosystem Inc., U.S.A.)에 로딩하여 아미노산 서열을 결정하였다.

끝으로, C-말단 아미노산 서열을 결정하기 위해 정제된 단백질을 카복시펩티다제 Y(carboxypeptidase Y)와 함께 1:50의 몰비로 각각 5분, 30분, 60분간 반응 시켰다. 이어, 반응액을 직접 Beckman 6300 아미노산 분석기기(Beckman, U.S.A) 에 로딩하여 아미노산 성분을 분석한 결고, C-말단 아미노산이 글리신임을 알 수 있었다.

한편, 제11도는 N-말단 아미노산 서열, 단백질 내부의 아미노산 서열 및 C-말단 아미노산 서열의 분석결과를 연결하여, 토끼 트로트롬빈 크링클-2의 전체 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 제11도에서, 아미노산은 IUPAC 명명법에 따라 기재되었으며, *는 미정의 아미노산을 나타낸다. 한편, 본 발명의 토끼 프로트롬빈 크링클-2의 전체 아미노산 서열을 미국 NIH에서 제공되는 단백질 아미노산 서열 데이터 베이스를 이용하여 검색한 결과, 신규한 것임을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증한 바와 같이, 본 발명은 토끼의 혈청으로부터 내피세포의 성장을 억제하는 프로트롬빈 크링글-2 및 그의 정제방법을 제공한다. 본 발명의 토끼 프로트롬빈 크링글-2는 앤지오스태틴 보다 우월한 내피세포성장 억제활성을 갖고 있으므로, 맥관형성을 저해함으로써 류마치스나 암의 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 혈액응고 시의 프로트롬비나제 콤플렉스의 활성을 억제함으로써, 혈전에 의한 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims

뉴질랜드 흰 토끼의 혈청에서 분리된 다음과 같은 특성을 가지는 토끼 프로트롬빈 크링글-2 단백질: (i) SDS-PAGE에 의해 결정된 분자량은 22,000Da이며, 질량분석기에 의해 결정된 분자량은 12,600Da이고: (ii) 등전점이 pH 5.0이며; (iii) 다음과 같은 아미노산 조성을 가지고; 및,

(iv) 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
(i) 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-guerin)으로 감작시킨 뉴질랜드 흰 토끼의 귀정맥에 내독소를 주사하고, 심장을 찔러 전혈을 얻은 다음, 이를 원심분리하여 상등액의 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청을 유도하는 과정; (ii) 전기에서 수득한 토끼 프로트롬빈 크링글-2 함유 혈청을 50내지 90% 황산암모늄에 의해 분별침전하고, DEAE-세파셀 이온교환 크로마토그래피하는 공정; (iii) 전기에서 수득한 내피세포 성장 억제활성 분획을 세파크릴 S-200 겔 여과 크로마토그래피하는 공정; (iv) 전기에서 수득한 내피세포 성장 억제활성 분획을 FPLC 모노-Q 이온교환 크로마토그래피하는 공정; (v) 전기에서 수득한 내피세포 성장 억제활성 분획을 CM-시바크론 블루 3GA 크로마토그래피하는 공정; 및, (vi) 전기에서 수득한 내피세포 성장 억제활성 분획을 FPLC 수퍼로스 12H/R 겔 여과 크로마토그래피하는 공정을 포함하는 제1항의 토끼 크로트롬빈 크링글-2 단백질을 정제하는 방법.