JPH09505733A

JPH09505733A - エンドテリン変換酵素

Info

Publication number: JPH09505733A
Application number: JP7514199A
Authority: JP
Inventors: クレーガーブルクハルト; ゾイルベルガーハーラルト; マイアートーマス; シュミットマルティン; ヤーコプエーラルト; オッターライナー; ズプコフスキートーマス; ヒレンハインツ
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1997-06-10
Also published as: BR9408077A; CN1141651A; NO962023L; EP0728209B1; SK59896A3; NO962023D0; DE59410427D1; HU9601298D0; CZ139496A3; AU8107094A; FI962047A; CA2176507A1; KR960705934A; HUT75554A; NZ275817A; ATE315656T1; FI962047A0; WO1995014095A1; EP0728209A1; US6066502A

Abstract

(57)【要約】本発明は、エンドテリン変換酵素、この場合このエンドテリン変換酵素は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０またはＳＥＱＩＤＮＯ：３６に記載のポリペプチド配列またはその官能性断片を含有し、および該エンドテリン変換酵素をコード化する遺伝子ならびにその製造法および使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】エンドテリン変換酵素本発明は、エンドテリン変換酵素、その製造法およびその使用に関する。高められたエンドテリン濃度は、数多くの疾病、例えば本質的な高血圧症、心筋梗塞、急性腎機能不全、ショックまたは心機能不全と関連している。このような関連に対して、エンドテリン抗体により達成可能な結果を推論することもできる。それによれば、動物のモデルにおいて心筋梗塞の程度は、投与量に応じて減少させることができ（Watanabe 他、Nature 344，114(1990)）、腎機能にプラスの影響を及ぼし（Kon 他、J．Clin．Invest．83，1762(1989)）、かつシクロスポリンの腎毒性を減少させることができる（Kon 他、Kidney Int．37，1487(199 0)）。エンドテリン変換酵素（ＥＣＥ−１）は、３８個のアミノ酸からなる前駆物質の分子ビッグ−エンドテリン−１からエンドテリン１を放出する。エンドテリン −１によって惹起される望ましくない生物学的作用は、例えばエンドテリン変換酵素、ひいてはエンドテリン−１の阻害によって生物合成に不利に作用しうる。酵素活性は、エンドテリンもしくはエンドテリン類似の分子を相応する前駆物質の分子、ビッグ−エンドテリンから放出させ、種々の細胞系列から単離されたものである（Takeda他、Bi ochem．Biophys．Res．Comm．176，860(1991)，Ohnaka他、Biochem．Biophys．R es．Comm．168，1128(1990)；Matsumura他、FEBS Lett．293，45(1992)，Ahn他、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，8606(1992)，PCT WO 92/13944，Ohnaka他、 Clip．Exp．Hypertension A 14；No．4(1992)，Okada他、Biochem．Biophys．Re s．Comm．180，1019(1991)，Takada他、Biochem．Biophys．Res．Comm．182，13 83(1992)，Opgenrth他、FASEB 6，2653(1992)）。しかし、この酵素活性は、これまで不十分に特徴付けられてきた。この酵素活性は、僅かに含量が増大された酵素混合物として存在する。しかし、このような純粋でない酵素混合物は、特異的なＥＣＥ−阻害剤を見い出すための試験方法での使用には、あまり適していない。それというのも、生理的に重要でない別の異質タンパク質は、酵素試験を著しく損なうからである。即ち、ビッグ−エンドテリンは、例えばセリンプロテアーゼのキモトリプシンならびにパパイン、テルモリシンおよびＮＥＰ２４．１１によってもエンドテリンおよびエンドテリン類似の生産物に分解され、このエンドテリンおよびエンドテリン類似の生産物は、間違った方法で酵素ＥＣＥに共属される。従って、刊行物中のエンドテリン変換酵素の記載は、矛盾している。エンドテリン変換酵素の分子量についての記載は、６５キロドルトン〜５４０キロドルトンの間で変動し；Ｋｍおよびｖｍａｘの値の記載は、同様に互いに著しく偏倚している（Opgenorth他、FASEB 6，2653(1992)；Sawamura他、Biochem ．Biophys．Acta 1161，295(1993)）。また、エンドテリン変換酵素がアスパラギン酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼの系統群に共属されているか否かは、異論の存在するところである（Sawamura他、Biochem．Biophys．Acta 1161 ，295(1993)；Biochem．Pharmacol．43，845(1992)）。更に、刊行物には、メタロプロテアーゼが細胞質酵素または膜結合酵素であるか否か、および如何なる基質がそれぞれのＥＣＥによって変換されるのかについての特性を示す記載に関して矛盾した報告が見い出される：（Big-Et-1; Big-Et-3）：マツムラ（Matsumur a）他（FEBS Lett．293，45(1992)）；タカハシ（Takahashi）他（J．Biol．Che m．268; 21394(1993)）；オカダ（Okada）他（Biochem．Biophys．Res．Comm．1 80，1019（1991）；オーナカ（Ohnaka）他（Clin．Exp．Hypertension A 14; No ．4(1992)））；マツムラ（Matsumura）他（FEBS Lett．305，86(1992)）。これまでに、ＥＣＥの定義を申し分なく可能にするようなＥＣＥについての明瞭な記載は、示されていなかった。このような定義は、可能な限りまず一次構造、アミノ酸配列、ＥＣＥを規定することによって行なうことができる。このために、ＥＣＥを最初に純粋な形で得ることが必要とされる。従って、エンドテリン変換酵素を純粋な形で調製するという課題が存在した。２５００００ドルトンの分子量およびアミノ酸部分配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１によって特徴付けられるエンドテリン変換酵素が見い出された。本発明によるエンドテリン変換酵素は、次の特徴を有している：このエンドテリン変換酵素は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動法により非還元条件下で測定された約２５００００ドルトンの分子量を有する。このエンドテリン変換酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法において１２５０００ドルトンのバンドを示し；これは、ホモダイマーからなるものと思われる。エンドテリン変換酵素は、グリコシル化されている。糖基の酵素的除去により、見掛け分子量１２５０００ドルトンから約８２０００ドルトンへの変化が生じる。エンドテリン変換酵素のトリプシンペプチドの配列決定により、次のアミノ酸部分配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１、２、３、４、５、６が生じる。更に、本発明によるエンドテリン変換酵素の特性決定は、実施例において行なわれている。本発明のもう１つの対象は、約２５００００ドルトンの分子量およびＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも８０％の類似体を有するアミノ酸部分配列によって特徴付けられるエンドテリン変換酵素である。このようなエンドテリン変換酵素は、ウシとは別の有機体、例えばヒトの細胞から単離することができる。更に、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０およびＳＥＱＩＤＮＯ：３６に記載されたポリペプチド配列またはその官能性断片を含有するエンドテリン変換酵素に関する。官能性断片は、なおエンドテリン変換酵素の酵素活性、抗原の性質または配位子、例えば結合タンパク質に対する親和力を有する部分配列である。更に、官能性断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０またはＮＯ：３６から出発し、アミノ酸またはペプチドの挿入、欠落または置換によって得ることができ、かつなお本質的にエンドテリン変換酵素の酵素活性を有しおよび／または式ＳＥＱＩＤＮＯ：３０またはＮＯ：３６のエンドテリン変換酵素と免疫的に交差反応するポリペプチド配列である。更に、本発明の対象は、エンドテリン変換酵素をコード化し、かつａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９またはＳＥＱＩＤＮＯ：３５において記載された構造を有するＤＮＡ−配列、ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０またはＳＥＱＩＤＮＯ：３６において記載された構造を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ−配列、およびｃ）標準条件下でＤＮＡ−配列ａ）またはｂ）を用いてハイブリッド化するＤＮＡ−配列、ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０または３６のタンパク質またはその断片に対して形成された抗体によって認識されるタンパク質生産物をコード化するＤＮＡ−配列によって形成される群から選択されているＤＮＡ−配列である。標準条件とは、例えば０．１〜１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：ＮａＣｌ０．１５モル、クエン酸ナトリウム１５ミリモル、ｐＨ７．２）の濃度を有する緩衝水溶液中での温度が４２〜５８℃であることである。ＤＮＡ−ハイブリッド化の実験条件は、遺伝子技術の教科書、例えばサムブルック（Sambrook）他、“モレキュラークローニング（Molecular Cloning）”、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８９に記載されている。このようなＤＮＡの製造は、例８に記載されている。ＳＥＱＩＤＮＯ：３０または３６のタンパク質またはその断片に対して形成された抗体によってタンパク質生産物が認識されるようなＤＮＡ配列は、良好に記載された方法により取得することができる。このようなタンパク質に対する抗体の製造は、例えばハドソン（L．Hudson）およびヘイ（F.C．Hay）、“プラクティカル・イムノロジー（Practical Immuno logy）”、ブラックウェル・サイエンス社（Blackwell Sci．Pub.、オックスフォード在）刊、１９８０に記載されている。この抗体と交差反応するタンパク質をコード化するｃＤＮＡ−配列を見い出すための抗体の使用は、例えば次のものに記載されている：“ＤＮＡクローニング（Cloning）第Ｉ巻”、グーバー（D.M．Glover）編、アイ・アール・エル社（IR L Press、オックスフォード在）刊、１９８５。更に、本発明は、エンドテリン変換酵素の製造法に関し、この方法は、哺乳動物の細胞、有利に内皮細胞をエンドテリン変換酵素−過生産物に対するエンドテリン変換酵素の阻害剤で刺激し、かつこの細胞からエンドテリン変換酵素をタンパク質の常用の化学的方法で単離することによって特徴付けられる。哺乳動物の細胞中でＥＣＥを誘発させるためには、全てのＥＣＥ−阻害剤を使用することができる。このために適したＥＣＥ−阻害剤は、例えば特許第１４６７３７号公報；特開昭５１−４８２７７号公報（Ａ１）；日本のジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Jpn J．Biochem.）６４；（８）アブストラクツ（Abs t.）２３６７（１９９２）；ダーウェント（Derwent）ＮＣＥ−９３−０９５６（１９９３）；ダーウェント（Derwent）ＮＣＥ−９３−０９７１（１９９３）；ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J．Med．Chem.）３６、１７３（１９９３）；欧州特許出願公開第５１８２９９号明細書（Ａ２）に記載されている。有利には、ホスホラミドンが使用される。前記細胞は、培養の際に阻害剤を細胞培地に添加することによって６時間ないし６日間刺激される。しかし、刺激は、有利には２ないし３日間に亘って実施される。使用される阻害剤濃度は、１０^-2モル〜１０^-7モル、特に１０^-3モル〜１０^-4モルである。しかし、本発明によるエンドテリン変換酵素の製造は、遺伝子技術的方法でも可能である。記載されたアミノ酸部分配列に基づいて、この配列をコード化するかまたはそのためのコード化する配列を補充する合成オリゴヌクレオチドを製造することができる。このオリゴヌクレオチドは、遺伝子プール、例えば遺伝しバンクまたはｃＤＮＡ−プールから相応する遺伝子またはｃＤＮＡ−分子を単離するためのハイブリッド化試料として使用されることができる。この種の遺伝子単離は、分子生物学の教科書、例えばサムブルック（Sa mbrook）、フリッチュ（Fritsch）、マニアティス（Maniatis）、“モレキュラークローニング（Molecular Cloning）”、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９、ＵＳＡの記載から当業者に知られている。適当な合成オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ−鎖−反応（ＰＣＲ）により、同様に遺伝子の一部は、例えばｃＤＮＡ−バンクまたは一重鎖ｃＤＮＡから得ることができる（PCR-Protocols; Academic Press; San Diego; USA; 1990）。このために適したオリゴヌクレオチドは、ＳｅｑＩＤＮｏ．１〜Ｎｏ．６に記載されたペプチドから、アミノ酸配列を二重鎖ＤＮＡ−配列（センスおよびアンチセンスを有する）に翻訳することによって誘発させることができる。この場合には、退行変性された遺伝子コードのために、退行変性されたオリゴヌクレオチド混合物は、ペプチドから導出されることができ、かつプライマーとして使用することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチドから所謂“コドンの使用 ”；１つの種、この場合ウシ、における好ましい使用を配慮しながらアミノ酸の一定のヌクレオチド−三重項によって導き出すことができる。更に、ＰＣＲは、プライマーとしての２つの種々のオリゴヌクレオチドを用いて実施され、この場合ＰＣＲに使用される２個のプライマーは、オリゴヌクレオチドのストランド（センス）およびアンチセンスストランド（アンチセンス）から構成させることができる。同様に、ｃＤＮＡ−ベクターの一部から導き出されるオリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡの３′−部分に対するオリゴ−ｄＴを使用することもできる。更に、この遺伝子部分は、遺伝子単離の方法を用いて完全遺伝子または完全ｃＤＮＡを得るために再び使用してもよい。前記方法により、正確にＳＥＱＩＤＮＯ：１に記載されたアミノ酸部分配列を有するエンドテリン変換酵素のための遺伝子だけを単離することができるのではなく、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対するタンパク質平面上に類似体少なくとも８０％を有する、別の有機体、例えばヒトからの変種もしくはエンドテリン変換酵素のための遺伝子をも単離することができる。本発明によるエンドテリン変換酵素は、相応する遺伝子を単離し、かつこの遺伝子を宿主有機体中で常用の遺伝子技術的方法を用いて発現させることにより、特に良好に得ることができる。本発明によるＥＣＥまたはそれから導き出されたペプチドは、抗体、または例えばＥＣＥの測定のためにＥＣＥ−阻害剤の同定のための試験方法で使用することができるかまたはＥＣＥ−阻害剤として使用することができるＦｖ−断片のような抗体断片の製造に使用することができる。このような抗体は、一般にエンドテリン変換酵素が関与するような疾病の診断において有用な助剤である。また、この目的のためには、例えばＥＣＥ−転写を測定するかまたは遺伝子タイプを測定するために、本発明によるＤＮＡ−配列から導き出されるＰＣＲ−プライマーを使用することもできる。得られた遺伝子を用いた場合には、当業者に知られた方法で動物は、その遺伝物質の点で、この動物が前記遺伝子の１つまたはそれ以上のエキストラコピーを生じるかまたは標準のＥＣＥ−遺伝子を遮断するように変化されることができる。この形質転換された動物は、特に試験目的に適している。また、エンドテリン変換酵素それ自体は、例えばＥＣＥ−基質、例えばブラジキニン、物質Ｐ、ソマトスタチン、神経ペプチドＹの高められた濃度が存在するような疾病の場合に、医薬を製造するための作用物質として適している。このような疾病は、例えば炎症、喘息、片頭痛、リウマチ、細胞機転および成長因子としてのペプチドの関与下に進行する細胞増殖である。また、ＥＣＥは、ＥＣＥの投与によって除去することができる血管拡張が存在するような疾病、例えば敗血性ショック、片頭痛、能力障害の場合にも医薬品として使用することができる。ＥＣＥを医薬品として使用するためには、場合によってはＥＣＥの一部を突然変異により変化させることが必要である。この突然変異による変化は、例えばグリコシル化されていないかまたは膜の足場を全く含有していない（可溶性ＥＣＥ）ＥＣＥ誘導体を導きうる。膜の足場をもはや全く含有していない可溶性ＥＣＥは、例えば細胞外の触媒反応作用を有するドメインを含有するＥＣＥ−断片の発現によって得ることができる。このようなＥＣＥ−断片は、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２５からのアミノ酸２０〜７０３、特にＳＥＱＩＤＮＯ：２５からの２７〜７０３のコード化する配列を生体内で分解可能な信号ペプチドと希有号され、かつ真核生物細胞中の当業者に知られた適当な発現ベクター中にもたらされることにより、取得することができる。信号ペプチドとしては、例えばアミノ酸位置−３５〜−４のヒトの”組織プラスミノーゲン活性体”の配列が適当である（Collen，D.，Nature 301，214〜221(1983)）。この場合、変化は、例えば特異性、作用時間、吸収率に影響を及ぼしうる。更に、ＥＣＥの機能部分は、医薬として使用される新しいタンパク質を製造するために、別のタンパク質の一部と結合させることができる。また、ＥＣＥは、例えばＰＥＧ、デキストラン、脂肪酸のような非ペプチド分子で共有結合修飾させることによって変化させることができる。また、本発明によるＤＮＡ−配列は、例えば遺伝子治療薬を製造するために、遺伝子治療での使用に適している。高められたエンドテリン値を有する疾病は、ＥＣＥ−ＤＮＡ−配列によって導き出されるオリゴヌクレオチドを用いて処理することもできる。このオリゴヌクレオチドは、コード化されていないＤＮＡ−ストランド（アンチセンス）から導き出されており、かつ医薬品として使用することができる。このことに基づくアンチセンス−治療には、特にオリゴヌクレオチドによって導き出される安定な化学的誘導体が利用される。例えば、位置３１〜１００によってＳｅｑＩＤ３５が定義されている範囲から合成されているアンチセンス−オリゴヌクレオチドを利用することができる。このアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、特に１５〜３０個の基の長さを有している。ＥＣＥ−阻害のような同じ適応症における疾病、例えば脳の虚血；クモ膜下出血；血管鎮痙；冠状虚血；細胞増殖過程を生じるような疾病、例えば前立腺過形成、例えば粥状硬化症、例えばレステノース（Restenose）；喘息；高血圧症；肺高血圧；器官障害、例えば心臓障害および腎障害；腎虚血；腎毒性；心筋梗塞；冠状心臓疾患；敗血症の治療または予防に使用される。また、ＤＮＡ−配列から、触媒反応によりＲＮＡ−分子を発生させることができるような配列、所謂”リボザイム”を導き出すこともできる。この触媒反応によるＲＮＡ−分子は、これを使用後にＥＣＥ−ＲＮＡまたはＥＣＥ−ＤＮＡを切断するか、または不活性化し、かつそれによってＥＣＥのタンパク質合成を阻害することにより生じる。ＥＣＥ−ＤＮＡ−配列は、前記酵素を発現させる酵素を適当な発現ベクターを用いて確立させるために利用することができる。この細胞は、特に医薬として使用される。有利には、エンドテリン変換酵素がＥＣＥ−阻害物質の同定のための試験方法で使用される。この試験方法は、一般に基質のＥＣＥ−触媒反応による切断が潜在の阻害剤の存在下に測定されるような酵素反応である。本発明のもう１つの対象は、酵素試験で本発明によるエンドテリン変換酵素を使用しながら同定されるエンドテリン変換酵素に対する阻害剤である。また、公知の化合物を本発明によるエンドテリン変換酵素を使用しながらの酵素試験で使用し、阻害作用を有するようなものを同定し、かつこのように同定された化合物を常用の担持剤および助剤と一緒に医薬品として調製することにより、エンドテリン変換酵素を阻害する医薬を製造する方法も本発明に属する。実施例１ホスホラミドンによる一次牛内皮細胞中のＥＣＥ−１の刺激凍結乾燥したＦＢＨＥ−牛内皮細胞（ATCC CRL 139 5）を有する３個の小管を第１４の過程で解凍し、かつそれぞれ成長媒体ＤＭＥＭ４０ｍｌ（Gibco No.041-01965）＋グルタミン５ｍｌ／５００ｍｌ（２００ｍＭ；Gibco 043-05030）＋ゲンタマイシン１ｍｌ／５００ｍｌ（Gibco 043-05750）＋非必須アミノ酸；最終濃度：１×（Gibco No.043-01140）＋ＦＣＳ１０％（Gibco No.011-06290；５６℃で３７分間不活性化）＋塩基性ＦＧＦ２５ｎｇ／ｍｌ（遺伝子間４１２５−８０）を有する３個のＴ１７５−細胞培養フラスコ（Satstedt社）中に入れる。前記細胞を標準法により３７℃でＣＯ₂７％からなる大気中で空気湿度１００％で恒温保持した。その翌日に、媒体の交換を行なった。細胞密集の達成後（この場合には、４日後）、細胞を標準法によりトリプシン処理に通過させ、９個のＴ−１７５−フラスコ中に分配させ、かつ成長のために記載のように３７℃で恒温保持した。３日経ってから細胞密集の達成後、この細胞を再び標準法によりトリプシン処理により２０個のＴ−フラスコ上に分配させた。更に、３日後に細胞を４０個のＴ−フラスコ上に分配させることができた。更に、３日後、３９個の前記Ｔ− フラスコを７８個のＴ−フラスコ上に分配させた。この７８個のＴ−フラスコは細胞の収穫のために使用されるので、このために適した細胞培養フラスコ（Costar社；Accell; No.3155）が利用される。これらのＴ −フラスコへの接種後に、６８個のフラスコにホスホルアミド（Peptide Instit ute社；No.4082; PHAM として冷却された）を１０^-4モルの最終濃度で添加した（＋ＰＨＡＭ）。この処理は、ＥＣＥ−活性の誘発を生じる。残りの１０個のＴ −フラスコを誘発されていない対照細胞として連行させた（−ＰＨＡＭ）。更に、記載した条件下で２日間の恒温保持後、ＰＨＡＭ−誘発された細胞および対照細胞（−ＰＨＡＭ）を別々に収穫した。このために、フラスコを開放させ、媒体を流出させた。細胞をＴ−フラスコ中でＰＢＳそれぞれ１０ｍｌ（Boehringer M annheim No.210331）を用いて洗浄した（即ち、細胞芝上で注意深く振盪させた）。ＰＢＳを流出させた。再び、１個のフラスコにつきＰＢＳ５ｍｌを与えた。細胞をセル−スクレーパー（Cell-Scraper）（Costar No.3010）を用いて培養フラスコの底面から掻き取り、細胞懸濁液として遠心分離小管１５０ｍｌ（Falcon No.2076）中に移し、そこでこの遠心分離小管を氷上で保存した。全てのＴ−フラスコをＰＢＳ１０ｍｌでさらに洗浄した。後洗浄による細胞懸濁液を遠心分離小管中で存在する細胞懸濁液と合わせた。細胞を遠心分離（1200RPM; １０分間；Heraeus Christ Minifuge GL No.4400; Rotor2150）によって沈降させた。細胞を含まない上澄液を廃棄し、ペレットを細胞沈降物の３倍の容量のＰＢＳ中に収容させた。再度の遠心分離後、細胞を含まない上澄液を再び廃棄した。ペレットを後処理まで氷上に留めた。実施例２刺激されてない牛内皮細胞、ＦＢＨＥ、とホスホルアミドで刺激された牛内皮細胞、ＦＢＨＥ、との含量増大の比較；タンパク質の同定ホスホラミドン−誘導を有する実施例１により得られたＦＢＨＥ−細胞およびホスホラミドン−誘導を有しない実施例１により得られたＦＢＨＥ−細胞（それぞれ湿潤物質５００μｌ）をＰＢＳ−緩衝液１５ｍｌ、ジイソプロピルフルオロホスフェート０．５ミリモル中で２０分間氷浴中で超音波を用いて処理した。遠心分離（２０分間、１０００ｇ）後、膜を上澄液へのプルリオール（Pluriol）Ｆ６８（登録商標）５％の添加によって沈殿させ、かつ再度に遠心分離によって１００００ｇで取得する。膜をトリス緩衝液２ｍｌ１００ミリモル、ｐＨ８．０で調製し、かつトリトン（Triton）Ｘ−１００（登録商標）１％で可溶化する。可溶化質（それぞれ２．５ｍｌ）を遠心分離し、残留物を廃棄した。モノ−Ｑ（Mono-Q（登録商標））−クロマトグラフィー＋／−ホスホラミドンにより誘発された細胞の可溶化質を別々にモノ−Ｑ（登録商標）ＨＲ５／５カラム（Pharnacia社）上で正確に同じ条件下でクロマトグラフィー処理した。このカラムをトリス緩衝液５０ｍｌ、ｐＨ８．０、トリトン（Triton）Ｘ−１０００．１％（Ａ緩衝液）を用いて平衡にさせた。可溶化質の塗布後、１５分間Ａ緩衝液で洗浄し、５０分の勾配を線状にＢ緩衝液（Ａ緩衝液＋ＮａＣｌ１モル）を用いて実施した（流量０．２ｍｌ／ｍｉｎ）。２０個の画分ａ０．５ｍｌを捕集し、かつ基質としてのヒトのビッグＥｔ−１を用いて試験した。形成されたＥｔ−１を逆相−ＨＰＬＣを用いて記載された方法（実施例３）で検出させ、かつ定量化した。最も高い酵素活性を有する２つの画分をそれぞれ合わせた。スペロース１２（Superose 12（登録商標））−ゲルクロマトグラフィーモノＱ−クロマトグラフィーからの溶出液をセントリコン（Centricon（登録商標））−小管（Amicon社）を用いて２５０μｌに濃縮させ、かつそれぞれスペロース１２ＨＲ１０／３６上でゲルクロマトグラフィー処理する。条件：緩衝液：燐酸ナトリウム２０ｍＭＮａＣｌ２５０ｍＭ、ｐＨ７．４トリトンＸ０．０５％×１００流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ画分：０．５ｍｌ実施例３に記載された試験後に、画分を試験し、最も高い酵素活性を有するそれぞれ２個の画分を合わせる。全ての画分のタンパク質測定は、ブラッドフォード（Bradford）（Anal．Bioc hem．72，248(1976)）の方法により行なわれた。結果：刺激された細胞および刺激されていない細胞の精製により、精製の種々の工程で次の結果が生じた：スペロース１２（Superose 12(登録商標)）−クロマトグラフィーの２つの活性画分を比較のために８％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。ホスホラミドン処理された細胞からの精製されたＥＣＥ−１のゲルひな形は、処理されていない細胞との比較で付加的なバンドを２５００００ドルトンで示す。タンパク質が還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で担持されている場合には、比較において付加的なバンドは、１２５０００ドルトンで明らかになる。実施例３ＨＰＬＣによるＥＣＥ−１活性試験エンドテリン変換酵素（ＥＣＥ−１）を用いてのエンドテリン−１へのビッグ −エンドテリン−１の変換実施例４により得られる酵素溶液１μｌにトリス２１μｌ、５０ｍＭ、イミダゾール５０ｍＭ、ＮａＣｌ２５０ｍＭ、緩衝液ｐＨ７．４およびヒトのビッグ− エンドテリン（水中の０．１％の酢酸２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。２時間後、この反応を形成されたエンドテリンの分析のために０．５％のトリフルオル酢酸７２μｌを用いて停止させた。試料を遠心分離し、上澄液を逆相−高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、(J．Takada他、Biochem．Biophys． Res．Comm．176，860(1991)，K．Ohnaka他、Biochem．Biophys．Res．Comm．168 ，1128(1990))の記載と同様にして同定し、かつエンドテリン標準との比較によってＵＶ検出（２０５ｎｍ）により定量化された。更に、酵素活性は、活性の式で計算することができる。この方法により、ＦＢＨＥ−細胞の後処理のＥＣＥ活性を精製の種々の工程に対して測定した。同時に、タンパク質量をブラッドフォード（Bradford）（Anal． Biochem．72，248(1976)）の方法により測定した。実施例４牛内皮細胞、ＦＢＨＥ、からのＥＣＥ−１の精製ａ）膜の取得、異質タンパク質のトリプシン化ＦＢＨＥ−細胞ペレット６ｍｌ（実施例１による）をＰＢＳ−緩衝液２５ｍｌ中で調製し、かつ超音波浴中で氷冷却下に分解させる。細胞断片を遠心分離によって１００００ｇで２０分間除去した。上澄液に撹拌しながらトリプシン３．６ｍｇを添加し、かつ室温で１．５時間撹拌した。試料を１０００００ｇで１時間遠心分離し、残留物中に存在する膜を１００ｍＭのトリス緩衝液２５ｍｌ、ｐＨ８．０と一緒に懸濁させた。ｂ）ＥＣＥ−１の可溶化膜懸濁液２５ｍｌをジイソプロピルフルオルホスフェート０．５ｍＭで調節し、かつ引続き０．５％トリトンＸ−１００（登録商標）で調節し、かつ一晩に亘って氷浴中で保存した。ｃ）モノ−Ｑ（Mono-Q（登録商標））−クロマトグラフィーモノ−Ｑ（Mono-Q（登録商標））−ＦＰＬＣカラム、ＨＲ１６／１０、ファルマシア社（Pharmacia）をトリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ８．０；０．０５％トリトンＸ１００（Triton X 100（登録商標））（Ａ−緩衝液）で平衡にさせる。可溶化質の塗布後、３０分間Ａ−緩衝液で洗浄し、その後に線状勾配を用いて１００分間で緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋ＮａＣｌ１ｍｌ）により溶離させた。３０個の画分を１０ｍｌずつ捕集する。試料のタンパク質含量をブラッドフォードの方法により測定し、ＥＣＥ−１活性を実施例３により測定する。最も高い比活性を有する２つの画分を合わせた。ｄ）ゲル濾過４ｃ）により合わせたモノ−Ｑ（Mono-Q（登録商標））−溶離液を３０ＫＤａ −セントリコン（Centricon）膜（Amicon社）を介して５００μｌ上で濃縮させた。スペロース１２（Superose 12（登録商標））ＨＲ１０／３０−カラム（Pharm acia社）をＮａ−燐酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ２５０ｍＭ、０．０５％トリトン×１００で平衡にし、濃縮された試料を塗布する。０．５ｍｌの流量の場合、平衡緩衝液でクロマトグラフィー処理し、かつ画分０．５ｍｌを捕集する。画分の比活性の測定は、４ｃ）の場合と同様に行なう。最も高い比活性を有する画分は、ｅ）に記載されており；この画分は、約２５００００ドルトンで溶離され、同じクロマトグラフィー条件下で標準タンパク質につき較正される。ｅ）結果実施例５ＦＢＨＥ細胞からの精製されたＥＣＥ−１のＳＤＳ−ゲル分析実施例４により精製されたＥＣＥ−１を８％のＳＤＳゲル上でレムリ（Laemml i）（Nature 227，680(1979)）により非還元条件下および還元条件下（＋ＤＴＴ）で分析する。その後に、ＥＣＥ−１は、非還元条件下で２５００００ドルトンの分子量を有し、かつ還元度に１２５０００ドルトンの幅広のバンドで分解する。実施例６ＥＣＥ−１の脱グリコシル化実施例４により精製されたＥＣＥ−１溶液５０μｌを１０％のＳＤＳ溶液で０．２５％−ＳＤＳ−含量に調節した。試料を室温で２０分間恒温保持し、かつ１％のトリトンＸ−１００で調節した。室温で２０分後、２５０ｍＭのＮａ−燐酸塩緩衝液５μｌ、ｐＨ４．７を添加した。その後に、ＰＮＧアーゼ０．２５μｌおよびＥｎｄｏＦ０．５ μｇを添加した。試料を３７℃で８時間恒温保持した。引続き、同じ酵素量を再び添加し、かつ３７℃でさらに８時間恒温保持した。その後に、試料を５０μｌに濃縮し、かつ４〜１２％のＳＤＳゲル中で分析した。結果：還元状態で、１２５０００ドルトンの見掛け分子量は、糖基をＰＮＧアーゼＦ／ＥｎｄｏＦの混合物で約８２０００ドルトンに分解することによって変化する。実施例７牛内皮細胞からのＥＣＥ−１の部分配列実施例４により得られるＥＣＥ−１溶液１６×２５μｇを４〜１２％のＳＤＳ −ポリアクリルアミド−勾配ゲル中で調製して塗布した。クーマシーブルーに通常通りに呈色した後、ゲルを脱色させ、かつ４×４０分間純粋な水中で洗浄した。２５０ＫＤａで呈色したバンドを解剖刀で切断し、かつ１００ｍＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液２００μｌで調製した。トリプシン０．５μｇの添加後、一晩に亘って恒温保持し、その後に上澄液を除去した。残留物を再びトリプシン０．５μｇと一緒にして室温で５時間１００ｍＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃緩衝液２００μｌ中で恒温保持した。その後に、試料を高速真空濃縮装置（speed-vac-Konzentrator）中で乾燥物質に濃縮させる。残留物を水４０μｌ中に入れ、かつ４０ｍＭのジチオトレイトール溶液４μｌと一緒に３０分間撹拌する。その後に、３７℃でヨードアセトアミド溶液４μｌを添加した。２時間後、試料を乾燥物質に濃縮させる。生成されたペプチドを逆相−ＨＰＬＣ−カラム１ｍｍ×１５ｃｍ上で水中のトリフルオル酢酸０．５％の線状の３時間の勾配でアセトニトリル９０％中のトリフルオル酢酸０．５％で分離した。ＵＶ活性画分を捕集し、一次配列を気相−シークエンサー上で測定した。結果：次の部分配列を測定した：括弧内に記載されたアミノ酸は、必ずしも確実に同定されたものではない。ＳＥＱＩＤＮＯ：１は、ＥＣＥ−１が金属プロテアーゼの系統群からの新規のタンパク質であることを証明する。それというのも、このＳＥＱＩＤＮＯ：１は、金属エンドペプチダーゼＮＥＰ２４．１１およびテルモリシンの配列と比較して７２％もしくは４０％の重要な類似体を有しているからである。実施例８エンドテリン変換酵素をコード化するｃＤＮＡ−配列の製造ａ）ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ−バンクの製造実施例１によりホスホラミドンで刺激されたＦＢＨＥからの全ＲＮＡまたは実施例１によりホスホラミドンで刺激されたＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡをグアニジニウムチオシアネート中への溶解によって取得した。この場合には、ストレータジェン社（Stratagene）、米国カリフォルニア州ラジョラ（La Jolla）在（カタログＮｏ．２００３４５）の”アール・エヌ・エー単離キット（RNA Isolatio n Kit）”の手引き書に記載された物質を用いて該刊行物の記載により作業した。ポリアデニル化されたメッセンジャーＲＮＡをＦＢＨＥ細胞からの上記の全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）−親和分離によって選択した。この方法を、プロメガ社（Promega）、米国ウィスコンシン州メディソン（Madison）在（カタログＮｏ．Ｚ５２００）の”ポリＡＴトラクトｍＲＮＡ単離系（PolyATtract mRNA Isolati on System）”の手引き書に記載された物質を用いて該刊行物の記載により実施した。ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡから、ストレータジェン社（Strata gene）、米国カリフォルニア州ラジョラ（La Jolla）在（カタログＮｏ．２００４００）の”Ｚａｐ−ｃＤＮＡ合成キット（Synthesis Kit）”の手引き書に記載された物質を用いて該刊行物の記載によりｃＤＮＡを合成させ、次にこのｃＤＮＡをストレータジェン社（Stratagene）、米国カリフォルニア州ラジョラ（La Jolla）在（カタログＮｏ．２３７６１１）の”Ｕｎｉ−ＺａｐＸＲギガパックＩＩクローニングキット（GigapackII Cloning Kit）”の手引き書に記載された物質を用いて該刊行物の記載によりλファージ中に包装した。ｂ）”ＲＡＣＥ”−ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチド試料の製造ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、”Molecular Cloning”、第２版（１９８９）、Sambrook，J.他、CSH-Press社、第１４．１頁以降参照）によりｃＤＮＡ断片をクローニングするために、ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＮＯ：６を有する実施例７に記載されたペプチドから出発した。遺伝コードを基礎にして、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、位置１６〜２２から核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：７を有するオリゴヌクレオチド混合物を誘導することができる：同様に、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、位置２〜８から核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：８を有するオリゴヌクレオチド混合物：を誘導することができ、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：６、位置９〜１６から核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：９を有するオリゴヌクレオチド混合物：を誘導することができる。この場合、ＳＥＱＩＤＮＯ：７〜ＮＯ：９は、コード化ＤＮＡ鎖の配列に相応する。遺伝コードの公知の退行変性のために、多数の位置で複数のヌクレオチドが使用されている。それによれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：７〜９に対して５１２倍までの混合複合体が明らかになる。記載された配列をオリゴヌクレオチドとして合成した。次のオリゴヌクレオチドを付加的に３′プライマーとして”ＲＡＣＥ”−ＰＣＲで合成した：Ａ−Ｂ−Ｔ１８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）Ａ（Ａ−Ｂ−Ｔ１８から）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）Ｂ（Ａ−Ｂ−Ｔ１８から）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）合成をアプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）型式３６０ＡＤＮＡ合成装置を用いて実施した。オリゴヌクレオチドを保護基の除去後にゲル電気泳動法によりアクリルアミド／尿素−ゲル上で精製した。ｃ）ＰＣＲのためのＤＮＡテンプレートの製造ホスホラミドン刺激されたＦＢＨＥ細胞からのａ）に記載のＲＮＡ調製物の全ＲＮＡ５μｇまたはポリ（Ａ）＋−ＲＮＡ１μｇをオリゴヌクレオチドＡ−Ｂ− Ｔ１８１μｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）および酵素リバーストランススクリプターゼを用いて一本鎖ｃＤＮＡ（１°ｃＤＮＡ）中に翻訳した。この場合には、ギブコＢＲＬ社（Gibco BRL）、ドイツ連邦共和国エッゲンシュタイン（Egg enstein）在（カタログＮｏ．８０８９ＳＡ）の”スーパースクリプト・プリアンプリフィケーション・システム（SuperScript preamplification System）） ”の手引き書に記載された物質を用いて該刊行物の記載により作業した。反応の終結後、この合成生成物をビー・アイ・オー社（BIO）１０１、米国カリフォルニア州ラジョラ（La Jolla）在、の”遺伝子クリーンＩＩキット（Geneclean II Kit）”を用いてよりいっそう小さな分子および過剰のオリゴヌクレオチドによって精製した。ｄ）ＰＣＲおよび部分−ｃＤＮＡ配列のクローニングポリメラーゼ連鎖反応を公知の実験記録により実施した（“モレキュラークローニング（Molecular Cloning）”、第２版（１９８９）、サムブルック（Sambr ook）他、CSH社刊、第１４．１頁以降）。このために、パーキンエルマー社（Pe rkin Elmer）の”ＤＮＡサーマルサイクラー（Thermal Cycler）”を利用した。この場合には、フローマン（M.A．Frohmann）他(Proc．Natl．Acad．Sci．USA（ 1988）85，8998〜9002)による”挿入プライマー”の原理を使用し、かつフリッツ（J.D．Fritz）他（Nucl．Acids Res．（1991）19，3747）による”挿入プライマー”の原理を変更して使用した。詳細には、ｃ）からの１°ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：８およびＡ（Ａ−Ｂ−Ｔ１８からの）それぞれ２０ピコモルと一緒に増幅させた。この場合には、条件は次の通りであった：３５回の作業周期に対して１′９５℃；２′５５℃；３′７２℃。ＰＣＲ生成物を電気泳動的に１．２％のＬＭＰ−アガロース／ＴＢＥゲル上で分離した。このゲルから、”グリース（Schmier）”の全長に亘ってゲル小板約１０個を切断し、これを分子量が増大するＤＮＡ断片を有する別々の画分として溶融した。次に、この画分のアリコートを別々にダイのＰＣＲでオリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：９およびＢ（Ａ−Ｂ−Ｔ１８からの）それぞれ２０ピコモルと一緒に装入した。この場合には、アガロース含量は、ＰＣＲ配合物の１／１０の容量を決して超えなかった。反応条件：３５回の作業周期に対して１′９５℃；２′５０℃；３′７２℃。この画分の増幅生成物のゲル電気泳動による分離は、第２のＰＣＲ後の約１０００ｂｐの長さの定義されたバンドに向かっての第１のＰＣＲの複重項生成物スペクトルの還元を明らかに認めることができた。このように選択されたＰＣＲ生成物を標準法により溶離した。牛エンドテリン変換酵素ｃＤＮＡの断片として１０００ｂｐの大きさのバンドの同定をさらにオリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：７およびＢ（Ａ−Ｂ−Ｔ１８）を用いる第３のＰＣＲ増幅によって試験した。このＰＣＲの生成物は、約９５０ｂｐの大きさのバンドであった。ベクターｐＣＲＩＩ中での第２のＰＣＲ反応による１０００ｂｐの大きさのバンドのサブクローニング(TAクローニングキット、Invitrogen Corp.，San Die go Cat．No．K2000-01)およびE.coli ＤＨ５α中でのプラスミドの増殖の後に、クローンの配列分析により１８９個のアミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、ＮＯ：１４）の開いた読取りラスターを生じた。また、同じ読取りラスター中には、ペプチドＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＮＯ：２およびＮＯ：４の配列が存在し、それによってｃＤＮＡ断片の同定を明らかに定義する。ｅ）エンドテリン変換酵素のための牛ｃＤＮＡのクローニング実施例１ａ）に記載されたプロトコールにより、統計的プライマー混合物を有するｃＤＮＡライブラリーを第１ストランド合成の過程で発生させた。このプライマーを配列：として合成した。上記のｃＤＮＡ合成プロトコールとは異なり、二本鎖ｃＤＮＡを２ｍｌのカラムＳ−１０００セファクリル（Sephacryl）（等級：”超微細（Superfine）”； P harmacia，Freiburg; カタログＮｏ．１７−０４７６−０１）上で分別した。少なくとも１ｋｂの大きさのｃＤＮＡ断片を有する画分をアルコール沈殿によって公知方法で濃縮し、かつ教示に相応してｃＤＮＡ合成キット中で再処理し、この場合ｃＤＮＡ調製物をＸｈｏＩを用いる代わりに制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩを用いてさらに切断し、かつλベクター中に組み込んだ。バンクのクローン２×１０６個をオリゴヌクレオチドを用いて部分的牛ｃＤＮＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、位置１３６〜１５６、もしくは３９１〜４１２から製造されたＤＮＡプローブを用いてナイロン膜上への移動後にハイブリッド化した。ＤＮＡプローブを、実施例１ｆ）の記載と同様に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でダイゴキシゲニン−ｄＵＴＰの存在下に標識化した。ハイブリッド化を過酷な条件下で実施し（実施例１ｆ）参照）、この場合には、最後の洗浄過程を０．１×ＳＳＣ中でのハイブリッド化の後に６０°で実施し、引続き結合したＤＮＡプローブの免疫学的検出を行なった。選択されたクローンの配列決定により、連続的な読取りフレーム、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９を有する牛ｃＤＮＡ配列Ｃ６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８が生じた。その後に、バンクのクローン２×１０６個をオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡクローンＣ６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、位置５００〜５２２、もしくは１４〜３５から上記のように製造されたＤＮＡプローブを用いて同じ条件下でハイブリッド化した。選択されたクローンの配列決定により、７０８個のアミノ酸の連続的な読取りフレーム（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）を有する牛ｃＤＮＡ配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２２が生じた。 λｇｔ１１中の市販の牛の肺ｃＤＮＡバンクのプラーク形成単位５×１０８（ Clontech Laboratories，Inc．; 4030 Fabian Way; Palo Alto CA 94303-4607， USA; カタログNo.BL1006b）をポリエチレングリコール６０００１０％、ＮａＣｌ１モルを用いての沈殿によって濃縮させ、２回蒸留した蒸留水１００μｌ中に再懸濁させ、かつ５分間７０℃に加熱した。このライゼート５μｌをプライマーｇｔ１１ｆｗｄおよび 5'-GGTGCTTGATGATGGCTTGGTTGT-3'(SEQ ID NO:26)との５０μｌの標準ＰＣＲ反応（実施例８ｄ）で使用した。プライマーｇｔ１１ｆｗｄは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の位置２９７９〜３００３（遺伝子バンク：ＥＣＬＡＣＺ）に相当し、かつ１個のＥｃｏＲＩ組換え位置の直前でクローニングベクターλｇｔ１１中に存在し、この場合この組換え位置は、バンク構成の際に利用された（Young，R .A．およびDavis，R.W．（1985）Genetic Engineering，Setlow，J．およびHoll ander，A．Plenum社（N.Y.在）刊、２９〜４１）。プライマーＳＥＱＩＤＮＯ：２６は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２の位置２８０〜３０３に相当する。増幅を４０回の作業周期に亘って実施した。ＰＣＲ生成物を３％”低融点”Ｎｕ篩ＧＴＧ−アガロースゲル（BioProducts，191 Thomaston Street，Rockland，ME 04 841，USA; カタログＮｏ．５００８２）上で分離し、４００〜６００の大きさの範囲の対塩基を個々のゲル断片を切断することによって分別した。ゲル円板を、実施例８ｄ）の記載と同様にして溶融し、かつ１．５μｌをプライマーｇｔ１１ｆｗｄおよび5'-AGATGGAGCTGGTCACCGAGATGC-3'(SEQ ID NO:27)との新しいＰＣＲ反応の５０μｌで使用した。プライマーＳＥＱＩＤＮＯ：２７は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２の位置１２７〜１５０に相当する。生成されたＰＣＲ断片をサブクローニング後にプラスミドベクターｐＵＣ１８（Yanisch-Perron，D.，Vieira，J．およびMessing，J．（1985）Gene 33，103 〜119）中で配列決定した（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）。この配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２を位置１〜１５０でヌクレオチド１７５〜３２４と重ねており、かつ１７４個のヌクレオチドだけ５′方向に延長している。生じる全配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）は、７５４個のアミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）の開いた読取りフレームをコード化する。ｆ）エンドテリン変換酵素のためのヒトｃＤＮＡのクローニングエンドテリン−１は、ヒトの胎盤中で検出されているので、エンドテリン変換酵素も胎盤中で発現されるものと仮定された。従って、標識された牛−ｃＤＮＡプローブを使用しながらヒトλｇｔ−１１胎盤ｃＤＮＡバンクをスクリーニングした。ダイゴキシゲニン−ｄＵＴＰの製造のために標識化された牛−ｃＤＮＡプローブをＰＣＲ反応（“モレキュラークローニング（Molecular Cloning）”、第２版（１９８９）、サムブルック（Sambrook J.）他、CSH社刊、第１４．１頁以降）で部分牛−ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）の”テンプレート ”１ｎｇ（１ｎｇ／ｍｌ）として使用した。”センス”−オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３中の位置１３６〜１５６のヌクレオチドを包含し、”アンチセンス”−オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３中の位置３９２〜４１２を包含していた。”ＤＮＡサーマルサイクラー（Therma l Cycler）”（Perkin Elmer）中で次の作業周期を３５回繰り返した：９４℃で２分間、６０℃で２分間および７２℃で３分間。引続き、標識化された２７６ｂｐの牛ｃＤＮＡプローブをアガロースゲル上で精製し、かつ煮沸することによって変性した。低級鎖の条件下で、ヒトの胎盤λｇｔ−１１ｃＤＮＡバンクの約６５００００個のクローン(ｃlontech．HL 1008b)を前記プローブと一緒にスクリーニングした。プローブを用いてのフィルター抽出液のハイブリッド化を、一晩に亘って５×ＳＳＣ、遮断試薬２％（Boehringer Mannheim; No.1096176）、Ｎ −ラウリルサルコシン０．１％、ＳＤＳ０．０２％中で６０℃で行なった。次に、フィルターを６０℃で２×５分間６０℃で２×ＳＳＣ、ＳＤＳ０．１％を用いて洗浄し、かつ引続き６０℃で２０分間０．５×ＳＳＣ、ＳＤＳ０．１％を用いて洗浄した。更に、結合したＤＩＧプローブの同定のためのフィルターをベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannheim）（DIG核酸デデクションキット（Nukleinsaeurendedektionkit）、No.1175041）のプロトコールに相応して行なった。ＳＥＱＩＤＮＯ：２４で記載されたｃＤＮＡ配列を有するクローンを単離した。ＳＥＱＩＤＮＯ：２４を有するｃＤＮＡ配列の位置１ないし位置２１０９のヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に記載されたアミノ酸配列をコード化する。アミノ酸配列は、エンドテリン変換酵素の一次配列の大部分に相応している。それというのも、ペプチドＳＥＱＩＤＮＯ：１ないしＳＥＱＩＤＮＯ：６は、単離されたエンドテリン変換酵素のトリプシンペプチド配列決定により配列中に再び見い出すことができる。また、金属プロテアーゼ共通配列ＨＥＸＸＨは、ＨＥＬＴＨとしてアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２５中の位置５４０〜５４４で同定されることができる。胎盤ポリＡ（＋）ＲＮＡ３μｇにより、実施例８ｅ）の記載と同様に、第１ストランドｃＤＮＡ合成プライマーとしてのオリゴヌクレオチド 5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGCCAAGCAGGCCACCAGTCCTG-3'(SEQ ID NO:31 )を用いてｃＤＮＡライブラリーを製造した。ヌクレオチド３２〜５３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４の位置３２〜５３に相応している。ｃＤＮＡ調製物を実施例８ａ）の記載と同様にλベクターＵｎｉ−ＺＡＰＸＲ中に組み込んだ。生じる４×１０５独立クローンを増幅させ、５×１０８個のプラーク形成単位を実施例８ｅ）の記載と同様に１００μｌのＰＣＲ反応に使用した。そのために、プライマーＳＥＱＩＤＮＯ：３１およびＣを使用した。プライマーＣは、ブルースクリプト（Bluescript）ＳＫ（−）部分、位置８８１〜９０４、配列ファイル遺伝子バンク：ＡＲＢＬＳＫＭ中のλベクター中に存在する。ＰＣＲ反応を６５℃のハイブリッド化温度で４０回の作業周期で実施した。反応生成物１μｌを新しいＰＣＲ反応配合物５０μｌ中に入れ、４０回の作業周期を６０℃のハイブリッド化温度で実施した。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤおよびを使用した。プライマーＤは、λＵｎｉ−ＺＡＰＸＲベクターのブルースクリプトＳＫ（ −）部分（位置８５７〜８８０、配列ファイル遺伝子バンク：ＡＲＢＬＳＫＭ）中に存在し、プライマーＳＥＱＩＤＮＯ：２４は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４中の位置１１〜３５に相応する。この反応生成物をプラスミドベクターｐＵＣ１８中で上記の記載と同様にサブクローン化した。選択されたクローンを配列決定した。配列として、３′末端範囲（位置１８８〜２２２）がＳＥＱＩＤＮＯ：２４の位置１〜３５と重なり合っているようなヒトＥＣＥｃＤＮＡの新規の５′ 含分が得られた（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）。この含分は、配列を１８７個のヌクレオチド分だけ５′の方向に延長させ、全体のヒトＥＣＥ配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３５を生じさせ、これは、７５３個のアミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）の開いた読取りフレームをコード化する。実施例９哺乳動物の細胞中での組換えＥＣＥの製造１．膜安定性のヒトＥＣＥのための発現ベクターの構成完全なヒトＥＣＥの発現のために、適当なアダプターを有するヌクレオチド２９〜２７２０のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）をＫｐｎＩ−制限位置とＸｂａＩ−制限位置との間でインビトロゲン社（Invitrogen）の発現ベクター（3985 B Sorrento Valley Blvd.，San Diego，CA 92121，USA; 製品No.V 790-20）中に挿入した。ＥＣＥ配列は、固有の翻訳開始配列および翻訳停止配列ならびに共通−コザク(Kozak)配列を伴なっている（Kozak，M．(1989)J．Cell B iol．108，229〜241）。ＥＣＥメッセンジャーＲＮＡの転写物は、強いサイトメガロウィルスプロモーターの対照の下で前記ベクター中に存在する。転移された細胞の選択をプラスミド中に存在するネオマイシン−耐性遺伝子上で実施し、Ｇ４１８−耐性コロニーだけが成長を可能にする。２．分離されたヒトＥＣＥのための発現系の構成ａ）インビトロゲン社（Invitrogen）（3985 B Sorrento Valley Blvd.，San Di ego，CA 92121，USA; 製品No.V790-20）から商業的に入手できる真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３ｎｅｏ中で実施された。そのために、ベクターをまず制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで切断した。ｂ）次に、ヒトＥＣＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）のｃＤＮＡから核酸断片位置２４１〜位置２３９６を適当なオリゴヌクレオチドプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応によって取得した。５′プライマーの配列の選択に応じて、位置２４１と位置２４５との間の核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）を塩基配列5'-A CGCG-3'に変える。位置２４６との関連で、前記過程によって制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩのための認識配列を発生させた。生成されたＥＣＥ断片を他の過程でＭｌｕＩで切断した。ｃ）更に、断片として２個の合成オリゴヌクレオチド（ストランド／アンチストランド）から刊行物（D．Collen，Nature 301，214〜221(1983)）に記載の配列のヌクレオチド７４とヌクレオチド１７６との間でヒト組織−プラスミノーゲン活性体（ｔ−ＰＡ）のコード化配列を製造した。記載された配列以外に、５′ＥｃｏＲＩおよび３′ＭｌｕＩ突出部を有するアダプターを合成オリゴヌクレオチドに備えさせた。共通のＭｌｕＩ制限切断位置上でのｂ）およびｃ）により発生された断片の連結反応によって、ヒトｔ−ＰＡ遺伝子の信号ペプチドの読取りフレームおよびヒトＥＣＥ遺伝子の細胞外ドメインの融合が生じる。ａ）からのＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ切断ｐｃＤＮＡ３ベクター中での前記融合生成物の連結反応により、分離されたヒトＥＣＥのための発現系が生じる。３．哺乳動物細胞中での発現発現ベクターのＤＮＡをリポフェクタミン（Lopifektamin）（Gibco社；Life Technologies GmbH; Dieselstrasse 5，76334 Eggenstein，Deutschland; No.53 0-8324SA）を用いて哺乳動物細胞中に転移させた。使用された細胞は、ＣＨＯ− Ｋ１（ATCC CCL61）；ＢＨＫ−２１（ATCC CCL 10）；２９３（ATCC CRL 1573）およびＣ１２７Ｉ（ATCC CRL 1616）。それぞれ細胞２×１０⁵を６個の凹所を有する培養板の皿１枚当たり３ｍｌの成長媒体中に播種した。翌日、トランスフェクションを実施した。このために、細胞を１回ＰＢＳで洗浄した。リポフェクタミンでのトランスフェクションを製造業者ギブコ（Gibco）の記載により実施した（Focus(1993)，15 No.3，73〜78 ）。全ての皿にＤＮＡ１μｇおよびリポフェクタミン６μｌを保持し、血清を含まない細胞培地１０００μｌを一緒にした。３７℃で６時間の恒温保持後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、かつ標準の成長媒体を用いて一晩に亘って恒温保持した。翌日、皿の細胞をトリプシンによる溶解後に１個、５個または１０個のペトリ皿（直径１０ｃｍ）上に分配した。その日の昼間、トランスフェクションされた細胞をＧ４１８（Gibco; K at．No.066-01811Y;商品名：Geneticin）を用いての処理によって選択した。即ち、成長媒体を、Ｇ４１８１．２ｍｇ／ｍｌを含有する媒体と交換した。７〜１０日後、ペトリ皿中にコロニーＧ４１８−耐性細胞を観察することができた。この細胞を”クローニング−シリンダー”の方法（DNA-cloning 第ＩＩ巻；D.M．G lover編、ＩＲＬ社、1985;第２２０頁）を用いて単離した。単離されたコロニーを、成長媒体約１．５ｍｌ（Ｇ４１８を含む）を有する２４個の皿のそれぞれの皿中に入れた。融合が達成された後、細胞をトリプシン化によって大きい培養容器中で変換させた。ａ）膜安定性ＥＣＥ膜安定性ＥＣＥを発現する細胞を、実施例１および２の記載と同様に、細胞の溶解および分別の後にＥＣＥの存在について試験した。（ホスホラミドン刺激は、行なわれない。）分析されたコロニーの比活性は、膜に対してタンパク質１５５０μＵ／ｍｇまでであった。コロニー３８の膜をさらに後処理した。この場合には、次の結果が得られた：ｂ）分離されたＥＣＥ融合された細胞の細胞上澄液をＥＣＥ活性について試験することにより、ＥＣＥを膜の足場なしに発現させかつ細胞媒体中に分離される細胞を、組換えＥＣＥの存在について試験した。このために、細胞上澄液を２日間の培養時間後に取り入れ、かつ１０００ｇでの遠心分離によって細胞の残骸を除去した。引続き、上澄液６ｍｌをセントリコン（Centricon）１００００（Amicon社，W.R．Grace＋C o.，Danver，Ma．01923，USA; 製品No.4206）および３２２０ｇ（約３０分間）での遠心分離により濃縮した。低分子量物質を有する通過する液体を廃棄した（ ”セントリコン溶出液（Centricon-Eluat）”）。このセントリコンを１回ＰＢＳ＋トリス１０ｍＭ＋ＮａＣｌ１５０ｍＭ；ｐＨ７．５で洗浄した。濃縮液を ”セントリコン溶出液（Centricon-Eluat）”３００μｌ中に入れた。この濃縮液１８μｌを実施例３の記載と同様にしてＥＣＥ試験に使用した。分離されたＥＣＥの容量活性は、組換え細胞の試験されたコロニーに応じて細胞培地１ｍｌ当たり１０μ単位までであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/43 ＡＢＥ 9152−4ＢＣ１２Ｎ 9/64 ＡＢＧ 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/573 ＡＡＢＮ 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 ＤＡＢＳ 9051−4Ｃ 48/00 ＡＢＲＡＢＵ 9051−4Ｃ 37/48 ＡＢＥＡＣＤＡＢＮＡＣＶＡＡＨＡＤＺＡＤＺＣ０７Ｈ 21/04 ＡＢＧＣ０７Ｋ 14/47 ＡＣＤＣ１２Ｎ 9/64 ＡＢＵＧ０１Ｎ 33/573 ＡＣＶ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＳ 48/00 ＡＢＲＡＡＭＣ１２Ｎ 5/10 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号Ｐ４４１２３７２．８ (32)優先日 1994年４月12日 (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＵ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者トーマスマイアードイツ連邦共和国Ｄ―67346 シュパイアークリスティアン―エーベルレ―シュトラーセ 10 (72)発明者マルティンシュミットドイツ連邦共和国Ｄ―64625 ベンスハイムミッテルシュトラーセ 49ベー (72)発明者エーラルトヤーコプドイツ連邦共和国Ｄ―67304 アイゼンベルクヘンデルシュトラーセ１ (72)発明者ライナーオッタードイツ連邦共和国Ｄ―69207 ザントハウゼンクレッセンヴィーゼンヴェーク 13 (72)発明者トーマスズプコフスキードイツ連邦共和国Ｄ―67112 ムッターシュタットルーフハイマーシュトラーセ１ (72)発明者ハインツヒレンドイツ連邦共和国Ｄ―67454 ハスロッホマックス―プランク―シュトラーセ 17

Claims

【特許請求の範囲】１．エンドテリン変換酵素において、該エンドテリン変換酵素がＳＥＱＩＤＮＯ：３６に記載のポリペプチド配列または該配列の、なおエンドテリン変換酵素の酵素活性、抗原の性質または配位子に対する親和力を有する部分配列を含有することを特徴とする、エンドテリン変換酵素。２．請求項１記載のエンドテリン変換酵素をコード化し、かつａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に記載の構造を有するＤＮＡ配列、ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３６に記載の構造を有するタンバク質をコード化するＤＮＡ配列によって形成される群から選択されているＤＮＡ配列。３．請求項２記載のＤＮＡ配列を使用しながらエンドテリン変換酵素を遺伝子技術的に製造するための方法。４．請求項１記載のエンドテリン変換酵素を製造する方法において、哺乳動物細胞をエンドテリン変換酵素の過剰生産のためにエンドテリン変換酵素の阻害剤で刺激し、この細胞からエンドテリン変換酵素を常用のタンパク質化学的方法で単離することを特徴とする、請求項１記載のエンドテリン変換酵素の製造法。５．阻害剤としてホスホラミドンを使用する、請求項４記載の方法。６．請求項１記載のエンドテリン変換酵素を製造方法において、エンドテリン変換酵素のための１つの遺伝子を遺伝子プールから単離するために、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６の部分配列をコード化するかまたは配列相補性にするオリゴヌクレオチドをハイブリッド化試料として使用し、この遺伝子を常用の遺伝子技術的方法で宿主有機体中で発現させることを特徴とする、請求項１記載のエンドテリン変換酵素の製造法。７．エンドテリン変換酵素の阻害剤の同定のための請求項１記載のエンドテリン変換酵素の使用。８．抗体の製造のための請求項１記載のエンドテリン変換酵素の使用。９．請求項２記載のＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のエクストラコピーを含有するかまたは標準のＥＸＥ遺伝子が遮断されているような形質転換された動物を得るための請求項２記載のＤＮＡ配列の使用。１０．医薬を製造するための請求項１記載のエンドテリン変換酵素の使用。