JPH09157300A - プロテアーゼインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来知られているプロテアーゼインヒビター
と、プロテアーゼに対する特異性が異なる新規なプロテ
アーゼインヒビターを提供する。 【解決手段】 プロテアーゼに対する反応部位のアミノ
酸配列が、Gly-Ile-Thr-Phe-Met-Ser-Arg-Pro-Lys-Glu
で表されるアミノ酸配列中に含まれるものであり、トリ
プシン及びエラスターゼに対して阻害作用を有し、トロ
ンビンに対して阻害作用を有しないタンパク質性のプロ
テアーゼインヒビターとする。具体的には、前記プロテ
アーゼインヒビターは、プロテアーゼに対する反応部位
のアミノ酸配列がMet-Serである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼイン
ヒビター（タンパク質分解酵素阻害物質）に関し、詳し
くは、プロテアーゼに対する特異性が従来のプロテアー
ゼインヒビターとは異なるプロテアーゼインヒビターに
関する。

【０００２】

【従来の技術】プロテアーゼインヒビターに関しては、
従来から多くのものが知られており、特に動植物界には
タンパク質性のプロテアーゼインヒビターが多く存在す
ることが知られている。そのうち、動物由来のものにつ
いては、血清中のものが最も詳しく研究され、その生理
的意義も、血液凝固やキニン形成反応の制御因子等とし
て理解されている。例えば、α１−アンチトリプシンは
血清中に最も多く存在するプロテアーゼ阻害物質の一つ
であり、トリプシン、エラスターゼなどの作用を阻害
し、これらによる組織障害を防御する機能を有すると考
えられている。

【０００３】このように、プロテアーゼインヒビターに
ついては従来から多くの研究がなされており、その生理
的意義や有用性について興味が持たれている。プロテア
ーゼインヒビターがプロテアーゼ（タンパク質分解酵
素）活性を阻害する機構としては、プロテアーゼインヒ
ビターの反応部位とプロテアーゼの活性中心が結合して
安定な複合体を形成するものと考えられている。プロテ
アーゼに対する阻害活性が異なるプロテアーゼインヒビ
ターは、新たな生物学的意義を有する可能性があり、有
用と考えられるため、プロテアーゼに対する特異性が従
来のものとは異なるプロテアーゼインヒビターが望まれ
ている。

【０００４】ところで、シマリス、ヤマネ等の哺乳動物
が、冬期に活動性を失い水や食餌をほとんど摂取せずに
生命を維持する、いわゆる冬眠現象については、その生
理機構に対して多くの研究者の興味が向けられてきた。

【０００５】本発明者らは、先に、シマリスの血清中に
冬眠時に特異的に発現が消失するタンパク質群が存在す
ることを見出し、これを解析することにより、冬眠中に
血中からほとんど消失する数種のタンパク質（それぞれ
の分子量が２０、２５、及び２７ｋＤ）を見出した。そ
して、それぞれのタンパク質を単離し、さらに、常法に
よりクローニングした該タンパク質のｃＤＮＡの塩基配
列からアミノ酸配列を決定し、新規なタンパク質である
ことを見出した（特開平４−４６１９７号公報、特開平
４−４６１９８号公報、及び特開平４−４６１９９号公
報）。

【０００６】また、本発明者らは、これらのタンパク質
により形成されたタンパク質複合体（ＨＰ−２０Ｃ）に
会合しているタンパク質として、新規なタンパク質（以
下、「ＨＰ−５５」という）を見い出した。そして、Ｈ
Ｐ−５５に対するｃＤＮＡの取得を試み、ＨＰ−５５の
部分アミノ酸配列に基づいて作成した合成オリゴヌクレ
オチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングを行った結果、ＨＰ−５５とともに、配列が類
似した新たなタンパク質が存在することを見出し、さら
にこれをコードするｃＤＮＡを単離してその構造を発表
している。しかし、このタンパク質の生理的意義やその
有用性については未だ十分に知られてはいない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、プロテアー
ゼに対する特異性が、プロテアーゼに対する反応部位の
アミノ酸配列が同じである従来のプロテアーゼインヒビ
ターとは異なる新規なプロテアーゼインヒビターを提供
することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ＨＰ−５５
の部分アミノ酸配列に基づいて作成した合成オリゴヌク
レオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングにより見い出された新たなタンパク質のアミ
ノ酸配列の解析から、本タンパク質は、α１−アンチト
リプシンと構造が類似し、且つプロテアーゼに対する反
応部位のアミノ酸配列として既に知られているアミノ酸
配列を有するものであることを見出し、一方において、
同じプロテアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列を有
する従来のプロテアーゼインヒビターとは異なるプロテ
アーゼインヒビター活性を有することを見出し、本発明
に到達した。

【０００９】すなわち、本発明は、下記（イ）及び
（ロ）に示す性質を有するタンパク質性のプロテアーゼ
インヒビターに関する。 （イ）プロテアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列
が、Gly-Ile-Thr-Phe-Met-Ser-Arg-Pro-Lys-Gluで表さ
れるアミノ酸配列中に含まれる。 （ロ）トリプシン及びエラスターゼに対して阻害作用を
有し、トロンビンに対して阻害作用を有しない。

【００１０】本発明は、上記プロテアーゼインヒビター
の具体的態様として、プロテアーゼに対する反応部位の
アミノ酸配列がMet-Serであるプロテアーゼインヒビタ
ーを提供する。また、本発明のプロテアーゼインヒビタ
ーは、トリプシンに対する阻害作用はヒトα１−アンチ
トリプシンと同程度であり、エラスターゼに対する阻害
作用はヒトα１−アンチトリプシンより弱い。このよう
なプロテアーゼインヒビターとして具体的には、配列番
号２に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２５〜４
１３で表されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼイン
ヒビターが挙げられる。また、このアミノ酸配列におい
て、トリプシン及びエラスターゼに対する阻害作用を害
さない１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置
換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明
のプロテアーゼインヒビターに含まれる。さらに、これ
らのタンパク質の一部であって、プロテアーゼに対する
阻害活性を有するペプチドも、本発明のプロテアーゼイ
ンヒビターに含まれる。

【００１１】また、本発明は、このようなプロテアーゼ
インヒビターを含有するプロテアーゼ阻害剤を提供する
ものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て、詳細に説明する。本発明のプロテアーゼインヒビタ
ーは、プロテアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列が
Gly-Ile-Thr-Phe-Met-Ser-Arg-Pro-Lys-Gluで表される
アミノ酸配列中に含まれるものであり、そのうち、プロ
テアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列はMet-Serで
あると考えられる。反応部位のアミノ酸配列がMet-Ser
であるプロテアーゼインヒビターとしては、エラスター
ゼに対する阻害作用を有するものが既に知られている。
本発明のプロテアーゼインヒビターとしては、配列番号
２に示すアミノ酸配列のうちアミノ酸番号２５〜４１３
で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、
「５５ＭＳ」という）又はその部分ペプチドもしくはこ
れらを含む融合タンパク質が挙げられる。

【００１３】上記タンパク質をコードするｃＤＮＡは本
発明者により既に取得されており、その塩基配列からア
ミノ酸配列の解析を行ったところ、ヒトやラットのα１
−アンチトリプシンと約７０％の相同性を有しているこ
とが判明した。この５５ＭＳ前駆体をコードするｃＤＮ
Ａの塩基配列を、この塩基配列がコードするアミノ酸配
列とともに配列番号１に示す。また、このアミノ酸配列
のみを配列番号２に示す。前記アミノ酸配列のうち、ア
ミノ酸番号１〜２４で表されるアミノ酸配列はシグナル
ペプチドに相当し、アミノ酸番号２５〜４１３で表され
るアミノ酸配列は成熟タンパクであることが、精製５５
ＭＳのＮ−末端アミノ酸配列からわかっている。このア
ミノ酸配列中、３７７番目のメチオニン残基及び３７８
番目のセリン残基が反応部位の配列が、既知であるα１
−アンチトリプシンのアミノ酸配列との比較から、プロ
テアーゼに対する反応部位であると考えられる。

【００１４】５５ＭＳは、冬眠期でないシマリスの血中
から精製することによって得られる。精製は、通常のタ
ンパク質の精製法、すなわち、ゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、電気泳動、塩析などの方法を適宜組
み合わせて行えばよい。得られたタンパク質が５５ＭＳ
であることの確認は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動などによる分子量の測定や、トリプシン及びエ
ラスターゼに対する阻害活性によって行うことができ
る。

【００１５】また、すでに、５５ＭＳのｃＤＮＡが取得
されているので、このｃＤＮＡを大腸菌などの微生物細
胞中、あるいは動物培養細胞中などで発現させることに
よっても、５５ＭＳを取得することができる。

【００１６】５５ＭＳをコードするｃＤＮＡは、シマリ
スからフェノール−クロロホルム法やグアニジンイソチ
オシアネート法等の方法によってＲＮＡを調製し、この
ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）−セルロース又はポリ（Ｕ）
−セファロース（ファルマシア(Pharmacia)社）を用い
てｍＲＮＡ画分を精製し、これを鋳型としてｃＤＮＡラ
イブラリーを作製し、配列番号１に示す塩基配列の一部
を有する合成オリゴヌクレオチドをプローブとするハイ
ブリダイゼーションにより選択することによって得られ
る。

【００１７】また、上記のようにして調製したＲＮＡ又
はｃＤＮＡから、配列番号１に示す塩基配列の一部を有
する１組の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとする
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(ＰＣＲ)法によ
り増幅することによっても、５５ＭＳのｃＤＮＡを得る
ことができる。

【００１８】尚、シマリスについては、５５ＭＳと類似
したタンパク質がＨＰ−５５を含めて少なくとも３種存
在し、これらはいずれもプロテアーゼインヒビター活性
を有することが本発明者により見い出されている。上記
の方法により、これらのｃＤＮＡが取得される可能性が
あるが、これらの類似タンパク質のプロテアーゼに対す
る反応部位の配列はMet-Leu、Met-Met又はArg-Serと考
えられ、プロテアーゼに対する反応部位を含むアミノ酸
配列が相互に異なっているので、５５ＭＳのプロテアー
ゼに対する反応部位を含むアミノ酸配列、特に配列番号
２で表されるアミノ酸配列中の３７７番目のメチオニン
残基及び３７８番目のセリン残基によって、５５ＭＳの
ｃＤＮＡであることを確認することができる。

【００１９】得られたｃＤＮＡを、宿主微生物、例えば
大腸菌細胞内で自律複製可能なプラスミドベクターに挿
入し、ｃＤＮＡの上流に大腸菌で機能するプロモーター
を連結し、得られた組換えプラスミドで大腸菌を形質転
換する。得られた形質転換体をプロモーターが発現する
条件下で培養し、産生された５５ＭＳを菌体タンパク質
から精製することによって、５５ＭＳが得られる。用い
るｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列は、トリプシン及
びエラスターゼに対する阻害作用を実質的に害さない１
又は２以上のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有し
ていてもよい。

【００２０】上記の方法において、５５ＭＳのｃＤＮＡ
を他のペプチドをコードするＤＮＡと連結し、融合タン
パク質として発現させてもよい。また、５５ＭＳのｃＤ
ＮＡの一部のみを用いて部分ペプチドとして発現させて
もよい。

【００２１】上記のようにして得られる５５ＭＳもしく
は融合タンパク質は、プロテアーゼインヒビターとして
用いることができる。尚、５５ＭＳの部分ペプチドは、
少なくともプロテアーゼに対する反応部位及びその隣接
領域を含むことが、プロテアーゼインヒビターとして必
要である。

【００２２】５５ＭＳのプロテアーゼに対する特異性は
次のとおりである。 トリプシン及びエラスターゼに対して阻害作用を有す
る。トリプシンに対する阻害作用はヒトα１−アンチト
リプシンと同程度であり、エラスターゼに対する阻害作
用はヒトα１−アンチトリプシンより弱い。 トロンビンに対して阻害作用を実質的に有しない。

【００２３】本発明のプロテアーゼインヒビターは、プ
ロテアーゼ阻害剤として、炎症、血液凝固等の活性化を
仲介するプロテアーゼを制御し、組織を損傷や崩壊から
保護する生体防御薬としての用途、具体的には、若年性
の肺気腫や小児肝硬変症等に対する医薬の有効成分とし
ての用途が期待できる。

【００２４】

【実施例】以下に、本発明を実施例によってさらに具体
的に説明する。５５ＭＳの大腸菌での発現、精製及び活
性の測定を、以下に示す方法で行った。

【００２５】＜５５ＭＳを含む組み換えタンパク質の大
腸菌での発現及び精製＞５５ＭＳのｃＤＮＡは、これを
含むファージクローンからＰＣＲ法で増幅することによ
って取得した。５５ＭＳのｃＤＮＡを含むファージクロ
ーンは、シマリス血漿から単離された冬眠関連タンパク
質（ＨＰ−５５）のアミノ酸配列を基に、このタンパク
質をコードするｃＤＮＡのクローニングを行った際に、
類似タンパク質をコードするｃＤＮＡとして取得された
数種類の内の１つである。ここで、ＨＰ−５５のｃＤＮ
Ａのクローニングは次のようにして行った。

【００２６】アメルシャム（Amersham）社のｃＤＮＡ合
成キットを用いて、非冬眠シマリスの肝臓から調製した
ポリＡ−ＲＮＡから、オリゴｄＴプライマー法により二
本鎖ｃＤＮＡを合成、ＥｃｏＲＩアダプターを付加した
後、ＥｃｏＲＩ消化したファージベクターλＺＡＰＩＩ
（ストラタジーン（Stratagene）社）に連結、インビト
ロパッケージングを行ってｃＤＮＡライブラリーを作製
した。

【００２７】シマリス血漿中から精製したＨＰ−５５か
ら決定した部分アミノ酸配列Phe-Leu-Val-Val-Ile-Tyr-
Glu-His-Asn-Thr-Lys（成熟タンパク質の３６５番目〜
３７５番目）に基づいて、配列番号３に示す配列（５’
−TTTGTGTTGTGTTCGTAGATGACGACTAGGAA−３’）のＤＮＡ
を合成した。尚、この合成ＤＮＡは、アミノ酸配列の各
アミノ酸についてコドンの中から１つの塩基配列を選ん
で組み合わせたもので、アンチセンスな配列である。

【００２８】Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼと［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰでアイソトープ標識下、この合成ＤＮＡを
プローブとして用いて、プラーク・ハイブリダイゼーシ
ョン法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、目的のｃＤＮＡクローンを得た。尚、ハイブリダイ
ゼーションの条件は、Takamatsu, N., Ohba, K., Kond
o, J., Kondo, N. and Shiba, T., Mol. Cell. Biol. 1
3, 1993, p1516-1521に従った。

【００２９】上記のようにして得られた数種類のｃＤＮ
Ａのうちの１つは、ＨＰ−５５のｃＤＮＡであったが、
他のｃＤＮＡはＨＰ−５５と類似性の高いタンパク質を
コードするものであった。その内の１つは、配列番号２
に示すアミノ酸配列を有し、５５ＭＳと命名された。

【００３０】こうして得られた５５ＭＳのｃＤＮＡを含
むファージクローンから、成熟タンパク質をコードする
領域を、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列CATATGを含む配列
番号４に示す配列（GAAGGTCGTCATATGCAGGATGCTCAGGAGAC
AGA）を有する合成ＤＮＡと、制限酵素ＢａｍＨＩの認
識配列GGATCCを含む配列番号５の配列（TTAGCAGCCGGATC
CATCAGGGAGGGGCCCAGGCA）を有する合成ＤＮＡ、の２つ
の合成ＤＮＡをプライマーとして、遺伝子増幅法（ＰＣ
Ｒ法）により増幅した。上記のプライマーを用いること
によって、５５ＭＳ（前駆体）のｃＤＮＡ配列のうち、
成熟タンパク部分、すなわちＮ−末端から２５番目のグ
ルタミン残基から３’非コード領域までの配列が増幅さ
れる。

【００３１】具体的には、５５ＭＳのｃＤＮＡを含む前
記ファージクローン（２０ｎｇ）と、上記２種のプライ
マー用合成ＤＮＡ（各々１μｇ）と、１０倍濃度のＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（１０μｌ）と、各々２
５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰ（１
μｌ）と水とを加えて９９μｌとし、９５℃で５分間変
性した後、５８℃で３０秒間アニールした。次いで、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（ベーリンガー
マンハイム(Boehringer Mannheim)社）を１μｌ加え、
７０℃で３分間反応させた。この、９５℃で１分間（変
性）、５８℃で３０秒間（アニール）、７０℃で３分間
（ＤＮＡ合成）のサイクルを３０回繰り返した。

【００３２】その後、フェノール抽出によりタンパク質
除去を行ってから、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を
回収し、さらに制御酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化し
て、目的のＤＮＡ断片を得た。

【００３３】得られたＤＮＡ断片を、大腸菌用の発現ベ
クターｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン(Novagen)社）のＢａ
ｍＨＩ部位とＮｄｅＩ部位との間に挿入し、５５ＭＳ発
現用プラスミドを作製した。このようにｐＥＴ１６ｂを
用いることによって、大腸菌で発現した組み換えタンパ
ク質のＮ末端には、ヒスチジン・タッグが付加される。
尚、このプラスミドには、更に、発現した組み換えタン
パク質からヒスチジン・タッグを切り離して目的とする
タンパク質（５５ＭＳ）を精製できるようにするため、
第Ｘ_a因子（ＦａｃｔｏｒＸ_a）の切断配列を挿入してあ
る。従って、大腸菌で発現した組み換えタンパク質のＮ
末端には、ＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＥＧＲＨ
Ｍ（配列番号６）の２１アミノ酸が付加するものと予想
される。

【００３４】次に、これらのプラスミドを用いて、大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。形質
転換株をＭ９ＺＢ培地で２５℃で振盪培養し、６００ｎ
ｍでの吸光度が０．５〜０．６になった後、イソプロピ
ル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを終濃度が
１ｍＭになるように添加してｐＥＴ１６ｂ由来のｌａｃ
プロモーターの発現を誘導し、さらに４時間、振盪培養
を行った。次いでこれを遠心し、集菌した大腸菌を緩衝
液Ｉ（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール）に懸濁し、ソ
ニケーションにより菌体を破砕した。

【００３５】これを更に遠心して菌体の破砕物を除いた
上清に、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄレジン（インビトロジェン(I
nvitrogen)社）を加え、３時間、４℃で穏やかに混和
し、ヒスチジン・タッグをもつ組み換えタンパク質をＨ
ｉｓ−Ｂｉｎｄレジンに吸着させた。次いでこれを遠心
してＨｉｓ−Ｂｉｎｄレジンを回収後、再び緩衝液Ｉに
懸濁し、１５分間、４℃で穏やかに撹拌してから、遠心
して溶液を除き、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄレジンを洗浄した。
この洗浄操作をさらに２回行ってから、回収したＨｉｓ
−Ｂｉｎｄレジンを緩衝液ＩＩ（２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイ
ミダゾール）に懸濁し、４℃で１時間穏やかに撹拌し
て、５５ＭＳを含む組換えタンパク質をレジンから溶出
させた。

【００３６】遠心後、溶出した組み換えタンパク質を含
む溶液を回収し、プロテアーゼ阻害活性測定用の緩衝液
に対して、４℃で１時間透析を行ってから、−８０℃に
保存した。

【００３７】＜プロテアーゼ阻害活性の測定＞上記方法
で大腸菌から精製した組み換えタンパク質のプロテアー
ゼ阻害活性を、一定量のプロテアーゼと種々の量の組み
換えタンパク質を一定時間混和した後の残存しているプ
ロテアーゼ活性により測定した。また、比較として、エ
ラスターゼ及びトリプシンに対する阻害活性を有するこ
とが知られているヒトα１−アンチトリプシンについて
も同様にプロテアーゼ阻害活性を測定した。以下にその
具体的方法を示す。

【００３８】（１）エラスターゼに対する阻害活性 上記方法で大腸菌から精製した組み換えタンパク質（０
〜３０μｇ）に、ブタ膵臓由来のエラスターゼ（エラス
チンプロダクト(Elastin Product)社）０．０３μｇと
牛血清アルブミン１０μｇを加え、さらに１ＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μｌと水とを加えて全量
を１９８μｌとし、３７℃で１５分間保温した。

【００３９】これに、エラスターゼの切断配列を有する
合成基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−ｐＮＡを２μｌ加え、組み換えタンパク質の最終
濃度が０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、及び３ｍＭに
なるように調整し、さらに３７℃で２０分間保温後、酢
酸を５０μｌ加えて反応を停止してから、４１０ｎｍで
の吸光度により残存プロテアーゼ活性を測定した。

【００４０】（２）トリプシンに対する阻害活性 上記方法で大腸菌から精製した組み換えタンパク質（０
〜３０μｇ）に、ブタ膵臓由来のトリプシン（シグマ(S
igma)社）０．５μｇと牛血清アルブミン１０μｇを加
え、さらに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０
μｌと水とを加えて全量を１９８μｌとし、３７℃で１
５分間保温した。

【００４１】これに、トリプシンの切断配列を有する合
成基質Ｎα−Ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＬ−Ａｒｇ−ｐＮＡを
２μｌ加え、組み換えタンパク質の最終濃度が０．１ｍ
Ｍ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、及び３ｍＭになるように調整
し、さらに３７℃で３０分間保温後、酢酸を５０μｌ加
えて反応を停止してから、４１０ｎｍでの吸光度により
残存プロテアーゼ活性を測定した。

【００４２】（３）トロンビンに対する阻害活性 上記方法で大腸菌から精製した組み換えタンパク質（０
〜３０μｇ）にヒト血漿由来のトロンビン（Ｓｉｇｍａ
社）２５ｍＵを加え、さらに１０×トロンビン用緩衝液
（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２
ＭのＮａＣｌ）２０μｌと水とを加えて全量を１９８μ
ｌとし、３７℃で５分間保温した。

【００４３】これに、トロンビンに対する基質Ｃｈｒｏ
ｍｏｚｙｍ ＴＨ（ベーリンガーマンハイム(Boehringe
r Mannheim)社）を２μｌ（１５ｍＭ）加え、さらに３
７℃で６０分間保温後、４０５ｎｍでの吸光度により残
存プロテアーゼ活性を測定した。

【００４４】＜結果＞上記方法により測定した組み換え
タンパク質のプロテアーゼ阻害活性のうち、エラスター
ゼに対する阻害活性の測定結果を図１に示す。また、ト
リプシンに対する阻害活性の測定結果を図２に示す。
尚、各々について、ヒトα１−アンチトリプシンのプロ
テアーゼ阻害活性の測定結果を併せて示した。尚、ヒス
チジン・タッグ自体にはプロテアーゼ阻害活性はなく、
ここで観察された組み換えタンパク質の阻害活性は５５
ＭＳによるものであると考えられる。

【００４５】これらの結果から分かるように、５５ＭＳ
はタンパク質分解酵素であるエラスターゼ及びトリプシ
ンに対して阻害活性を持つ。エラスターゼに対する阻害
活性は、ヒトα１−アンチトリプシンのそれより弱い。
トリプシンに対する阻害活性は、ヒトα１−アンチトリ
プシンのそれと同等程度である。

【００４６】尚、トロンビンに対する阻害活性を測定し
た結果、トロンビンに対する阻害活性は認められなかっ
た。

【００４７】

【発明の効果】本発明の新規なプロテアーゼインヒビタ
ーは、α１−アンチトリプシンに類似した新規な構造と
プロテアーゼに対する新たな選択的、特徴的な阻害作用
を有するものである。

【００４８】一方、α１−アンチトリプシンの欠損症
や、そのアミノ酸配列の先天的異常による機能壊失は、
若年性の肺気腫や小児肝硬変症と深く関わることが報告
されている。さらに、α１−アンチトリプシンを含むセ
リンプロテアーゼインヒビターが炎症、血液凝固、補体
系の活性化を仲介するプロテアーゼを制御することが明
らかにされ、組織を損傷や崩壊から保護する因子として
注目されている。

【００４９】よって、ここで見いだされた新規な性質を
有するプロテアーゼインヒビターは、特異的なプロテア
ーゼ阻害剤の開発に有用であるとともに、組織を損傷や
崩壊から保護する生体防御薬としての用途や、各種プロ
テアーゼの活性中心構造の研究に役立つことが期待でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例における５５ＭＳのエラスタ
ーゼ阻害活性の測定結果を示す図である。

【図２】 本発明の実施例における５５ＭＳのトリプシ
ン阻害活性の測定結果を示す図である。

【符号の説明】

１・・・５５ＭＳの阻害活性 ２・・・ヒトα１−アンチトリプシンの阻害活性

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1242 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：シマリス（Tamias asiaticus） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1239 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 ATG CCA TCC TCC ATC TCC TGG GGC CTC CTG CTG CTG GCA GCC CTG AGC 48 Met Pro Ser Ser Ile Ser Trp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 TGC CTG GGC CCT GGC TCC CTG GCT CAG GAT GCT CAG GAG ACA GAG GCA 96 Cys Leu Gly Pro Gly Ser Leu Ala Gln Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala 20 25 30 TCC AAG CAG GAC CAG GAG CAC CCG GCC TCC CAC AGG ATC GCC CCG CAC 144 Ser Lys Gln Asp Gln Glu His Pro Ala Ser His Arg Ile Ala Pro His 35 40 45 CTG GCC GAG TTT GCC CTC AGC CTC TAC CGC GTG CTG GCC CGT CAG TCC 192 Leu Ala Glu Phe Ala Leu Ser Leu Tyr Arg Val Leu Ala Arg Gln Ser 50 55 60 AAC ACC ACC AAC ATC TTC TTC TCC CCC GTG AGC ATC GCC ACC GCC TTG 240 Asn Thr Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Leu 65 70 75 80 GCC ATG CTC TCT CTG GGC ACC AAG GGT GAC ACT CAC ACC CAG ATC CTG 288 Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Gly Asp Thr His Thr Gln Ile Leu 85 90 95 GAG GGC CTG GAC TTC AAC CTC ACG GAG ATG GCG GAG GCT GAC ATC CAC 336 Glu Gly Leu Asp Phe Asn Leu Thr Glu Met Ala Glu Ala Asp Ile His 100 105 110 CAG GGC TTC CAG CAT CTT CTC CAA ACC CTC AAC AGG CCC AAC ACC CAG 384 Gln Gly Phe Gln His Leu Leu Gln Thr Leu Asn Arg Pro Asn Thr Gln 115 120 125 CTG CAG CTG ACC TCC GGC AAC GGC CTC TTC ATC CAC CAG AAT CTG AAG 432 Leu Gln Leu Thr Ser Gly Asn Gly Leu Phe Ile His Gln Asn Leu Lys 130 135 140 CTC CTG GAC AAG TTT CTG GAG GAC GTC AAG AGC CTG TAC CAC TCA GAG 480 Leu Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Ser Leu Tyr His Ser Glu 145 150 155 160 GCC TTC CCC ACC AAC TTC ACC AAC ATG GAA GAG GCC AGG CAG CAG ATC 528 Ala Phe Pro Thr Asn Phe Thr Asn Met Glu Glu Ala Arg Gln Gln Ile 165 170 175 AAC AGT TAT GTG GAA AAA GGG ACC CAG GGG AAA ATT GTG GAG CTG GTG 576 Asn Ser Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Glu Leu Val 180 185 190 AAA GAG CTG GAC AGC GAC ACA GTT CTT GCC CTG GTG AAC TAC ATC TTC 624 Lys Glu Leu Asp Ser Asp Thr Val Leu Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe 195 200 205 TTT AAA GGC AAA TGG CTG AAG CCC TTC AAT GAG GAG CAC ACC AGG GAA 672 Phe Lys Gly Lys Trp Leu Lys Pro Phe Asn Glu Glu His Thr Arg Glu 210 215 220 GAA GAC TTC CAC GTG GAC GAG GCC ACC ACC GTG AGG GTG CCC ATG ATG 720 Glu Asp Phe His Val Asp Glu Ala Thr Thr Val Arg Val Pro Met Met 225 230 235 240 AAC CGC GAG GGC AGG TTC CAC CTG CAC CAC TGC AGC ACG CTG GCC AGC 768 Asn Arg Glu Gly Arg Phe His Leu His His Cys Ser Thr Leu Ala Ser 245 250 255 TGG GTG CTA CAG ATG GAC TAC CTG GGC AAC GCC ACC GCC ATC TTC CTC 816 Trp Val Leu Gln Met Asp Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Leu 260 265 270 CTG CCT GAT GAG GGC AAA ATG CAG CAC CTG GAG GAC ACG GTC TCT ACG 864 Leu Pro Asp Glu Gly Lys Met Gln His Leu Glu Asp Thr Val Ser Thr 275 280 285 GAG ATC CTC TCC AAG TTC CTG AAA AAC AGG CAA ACC ACG AGA GTC AGT 912 Glu Ile Leu Ser Lys Phe Leu Lys Asn Arg Gln Thr Thr Arg Val Ser 290 295 300 TTA TAC TTC CCC AAA GTG TCC ATC TCT GGA ACC TAT GCT CTG AAG ACT 960 Leu Tyr Phe Pro Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Ala Leu Lys Thr 305 310 315 320 GTC CTC AGC AGC CTG GGC ATC ACC AAG GTC TTT AGC AAT GCA GCT GAC 1008 Val Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Ala Ala Asp 325 330 335 CTG TCG GGG GTC ACT GAG GAG GCT CCC CTG ATT GTC TCC AAG GCC CTG 1056 Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Ile Val Ser Lys Ala Leu 340 345 350 CAT AAG GCT GTG CTG GAC ATC GAT GAG GAG GGC ACG GAG GCT GCA GGG 1104 His Lys Ala Val Leu Asp Ile Asp Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Gly 355 360 365 GCC ACG GTT GGG GGA ATC ACG TTC ATG TCT CGT CCC AAA GAG GTG ATA 1152 Ala Thr Val Gly Gly Ile Thr Phe Met Ser Arg Pro Lys Glu Val Ile 370 375 380 TTC GAC AGG CCC TTC CTC GTG GTC ATC TAT GAG CAC CAC ACC AAG AGC 1200 Phe Asp Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Tyr Glu His His Thr Lys Ser 385 390 395 400 CCC CTC TTT GTG GGG AAG GTG GTG AAC CCC ACA CAA CAG TAG 1242 Pro Leu Phe Val Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Gln 405 410 配列番号：２ 配列の長さ：413 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Pro Ser Ser Ile Ser Trp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Gly Pro Gly Ser Leu Ala Gln Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala 20 25 30 Ser Lys Gln Asp Gln Glu His Pro Ala Ser His Arg Ile Ala Pro His 35 40 45 Leu Ala Glu Phe Ala Leu Ser Leu Tyr Arg Val Leu Ala Arg Gln Ser 50 55 60 Asn Thr Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Leu 65 70 75 80 Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Gly Asp Thr His Thr Gln Ile Leu 85 90 95 Glu Gly Leu Asp Phe Asn Leu Thr Glu Met Ala Glu Ala Asp Ile His 100 105 110 Gln Gly Phe Gln His Leu Leu Gln Thr Leu Asn Arg Pro Asn Thr Gln 115 120 125 Leu Gln Leu Thr Ser Gly Asn Gly Leu Phe Ile His Gln Asn Leu Lys 130 135 140 Leu Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Ser Leu Tyr His Ser Glu 145 150 155 160 Ala Phe Pro Thr Asn Phe Thr Asn Met Glu Glu Ala Arg Gln Gln Ile 165 170 175 Asn Ser Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Glu Leu Val 180 185 190 Lys Glu Leu Asp Ser Asp Thr Val Leu Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Trp Leu Lys Pro Phe Asn Glu Glu His Thr Arg Glu 210 215 220 Glu Asp Phe His Val Asp Glu Ala Thr Thr Val Arg Val Pro Met Met 225 230 235 240 Asn Arg Glu Gly Arg Phe His Leu His His Cys Ser Thr Leu Ala Ser 245 250 255 Trp Val Leu Gln Met Asp Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Leu 260 265 270 Leu Pro Asp Glu Gly Lys Met Gln His Leu Glu Asp Thr Val Ser Thr 275 280 285 Glu Ile Leu Ser Lys Phe Leu Lys Asn Arg Gln Thr Thr Arg Val Ser 290 295 300 Leu Tyr Phe Pro Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Ala Leu Lys Thr 305 310 315 320 Val Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Ala Ala Asp 325 330 335 Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Ile Val Ser Lys Ala Leu 340 345 350 His Lys Ala Val Leu Asp Ile Asp Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Ala Thr Val Gly Gly Ile Thr Phe Met Ser Arg Pro Lys Glu Val Ile 370 375 380 Phe Asp Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Tyr Glu His His Thr Lys Ser 385 390 395 400 Pro Leu Phe Val Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Gln 405 410 配列番号：３ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列 TTTGTGTTGT GTTCGTAGAT GACGACTAGG AA 32 配列番号：４ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列 GAAGGTCGTC ATATGCAGGA TGCTCAGGAG ACAGA 35 配列番号：５ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列 TTAGCAGCCG GATCCATCAG GGAGGGGCCC AGGCA 35 配列番号：６ 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile 1 5 10 15 Glu Gly Arg His Met 20

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 高松 信彦 神奈川県相模原市相模大野４−５−１− 306 (72)発明者 渡辺 真理子 神奈川県相模原市下溝2068 第一いずみ荘 ２−５

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（イ）及び（ロ）に示す性質を有す
   るタンパク質性のプロテアーゼインヒビター。 （イ）プロテアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列
   が、Gly-Ile-Thr-Phe-Met-Ser-Arg-Pro-Lys-Gluで表さ
   れるアミノ酸配列中に含まれる。 （ロ）トリプシン及びエラスターゼに対して阻害作用を
   有し、トロンビンに対して阻害作用を有しない。
2. 【請求項２】 プロテアーゼに対する反応部位のアミノ
   酸配列がMet-Serである、請求項１記載のプロテアーゼ
   インヒビター。
3. 【請求項３】 トリプシンに対する阻害作用はヒトα１
   −アンチトリプシンと同程度であり、エラスターゼに対
   する阻害作用はヒトα１−アンチトリプシンより弱いこ
   とを特徴とする請求項１又は２記載のプロテアーゼイン
   ヒビター。
4. 【請求項４】 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
   アミノ酸番号２５〜４１３で表されるアミノ酸配列、又
   はこのアミノ酸配列においてトリプシン及びエラスター
   ゼに対する阻害作用を害さない１又は２以上のアミノ酸
   残基の欠失、挿入又は置換を有するアミノ酸配列を有す
   る請求項１〜３のいずれかに記載のプロテアーゼインヒ
   ビター。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のプロテ
   アーゼインヒビターを含有するプロテアーゼ阻害剤。