JPH09157299A - プロテアーゼインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来知られているプロテアーゼインヒビター
と、プロテアーゼに対する特異性が異なる新規なプロテ
アーゼインヒビターを提供する。 【解決手段】 プロテアーゼに対する反応部位のアミノ
酸配列が、Gly-Ala-Glu-Ala-Met-Leu-Gln-Ala-Pro-Ile
で表されるアミノ酸配列中に含まれるものであり、エラ
スターゼに対して阻害作用を有し、トリプシンおよびト
ロンビンに対して阻害作用を有しないタンパク質性のプ
ロテアーゼインヒビターとする。具体的には、前記プロ
テアーゼインヒビターは、プロテアーゼに対する反応部
位のアミノ酸配列がMet-Leuである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なプロテアー
ゼインヒビター（タンパク質分解酵素阻害物質）に関
し、詳しくは、プロテアーゼに対する反応部位（reacti
ve site）のアミノ酸配列が新規なプロテアーゼインヒ
ビターに関する。

【０００２】

【従来の技術】プロテアーゼインヒビターに関しては、
従来から多くのものが知られており、特に動植物界には
タンパク質性のプロテアーゼインヒビターが多く存在す
ることが知られている。そのうち、動物由来のものにつ
いては、血清中のものが最も詳しく研究され、その生理
的意義も、血液凝固やキニン形成反応の制御因子等とし
て理解されている。例えば、α１−アンチトリプシンは
血清中に最も多く存在するプロテアーゼ阻害物質の一つ
であり、トリプシン、エラスターゼなどの作用を阻害
し、これらによる組織障害を防御する機能を有すると考
えられている。

【０００３】このように、プロテアーゼインヒビターに
ついては従来から多くの研究がなされており、その生理
的意義や有用性について興味が持たれている。プロテア
ーゼインヒビターがプロテアーゼ（タンパク質分解酵
素）活性を阻害する機構としては、プロテアーゼインヒ
ビターの反応部位とプロテアーゼの活性中心が結合して
安定な複合体を形成するものと考えられている。したが
って、反応部位が異なれば、プロテアーゼに対する挙動
が異なると推定されることから、新規な反応部位を有す
るプロテアーゼインヒビターは新たな生物学的意義を有
する可能性があり、有用と考えられる。

【０００４】ところで、シマリス、ヤマネ等の哺乳動物
が、冬期に活動性を失い水や食餌をほとんど摂取せずに
生命を維持する、いわゆる冬眠現象については、その生
理機構に対して多くの研究者の興味が向けられてきた。

【０００５】本発明者らは、先に、シマリスの血清中に
冬眠時に特異的に発現が消失するタンパク質群が存在す
ることを見出し、これを解析することにより、冬眠中に
血中からほとんど消失する数種のタンパク質（それぞれ
の分子量が２０、２５、及び２７ｋＤ）を見出した。そ
して、それぞれのタンパク質を単離し、さらに、常法に
よりクローニングした該タンパク質のｃＤＮＡの塩基配
列からアミノ酸配列を決定し、新規なタンパク質である
ことを見出した（特開平４−４６１９７号公報、特開平
４−４６１９８号公報、及び特開平４−４６１９９号公
報）。

【０００６】また、本発明者らは、これらのタンパク質
により形成されたタンパク質複合体（ＨＰ−２０Ｃ）に
会合しているタンパク質として、新規なタンパク質（以
下、「ＨＰ−５５」という）を見い出し、さらにこれを
コードするｃＤＮＡを単離し、その構造を発表してい
る。このタンパク質は、冬眠現象の生理機構に関与する
タンパク質であると考えられているが、その生理的意義
や有用性については全く知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来知られ
ているプロテアーゼインヒビターと、プロテアーゼに対
する特異性が異なる新規なプロテアーゼインヒビターを
提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ＨＰ−５５
のアミノ酸配列の解析から、本タンパク質は、α１−ア
ンチトリプシンと構造が類似していることを見出し、さ
らに、プロテアーゼインヒビター活性を有し、従来知ら
れているプロテアーゼインヒビターと反応部位が異なる
ことを見出し、本発明に到達した。

【０００９】すなわち、本発明は、下記（イ）及び
（ロ）に示す性質を有するタンパク質性のプロテアーゼ
インヒビターに関するものである。 （イ）プロテアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列
が、Gly-Ala-Glu-Ala-Met-Leu-Gln-Ala-Pro-Ileで表さ
れるアミノ酸配列中に含まれる。 （ロ）エラスターゼに対して阻害作用を有し、トリプシ
ンおよびトロンビンに対して阻害作用を有しない。

【００１０】本発明は、上記プロテアーゼインヒビター
の具体的態様として、プロテアーゼに対する反応部位の
アミノ酸配列がMet-Leuであるプロテアーゼインヒビタ
ーを提供する。

【００１１】本発明のプロテアーゼインヒビターとして
具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、ア
ミノ酸番号２５〜４１３で表されるアミノ酸配列を有す
るタンパク質が挙げられる。また、このアミノ酸配列に
おいてエラスターゼに対する阻害作用を害さない１又は
２以上のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有するア
ミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のプロテアー
ゼインヒビターに含まれる。さらに、これらのタンパク
質の一部であって、プロテアーゼに対する阻害活性を有
するペプチドも、本発明のプロテアーゼインヒビターに
含まれる。

【００１２】また、本発明は、このようなプロテアーゼ
インヒビターを含有するプロテアーゼ阻害剤を提供する
ものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て、詳細に説明する。本発明のプロテアーゼインヒビタ
ーは、プロテアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列が
Gly-Ala-Glu-Ala-Met-Leu-Gln-Ala-Pro-Ileで表される
アミノ酸配列中に含まれるものであり、そのうち、プロ
テアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列はMet-Leuで
あると考えられる。反応部位のアミノ酸配列がMet-Leu
であるプロテアーゼインヒビターは従来知られておら
ず、新規なものである。このようなプロテアーゼインヒ
ビターとして、冬眠関連タンパク質の１つと考えられて
いるＨＰ−５５又はその部分ペプチドもしくはこれらを
含む融合タンパク質が挙げられる。

【００１４】ＨＰ−５５をコードするｃＤＮＡは本発明
者により既に取得されており、その塩基配列からアミノ
酸配列の解析を行ったところ、ヒトやラットのα１−ア
ンチトリプシンと約７０％の相同性を有していることが
判明した。このＨＰ−５５前駆体をコードするｃＤＮＡ
の塩基配列を、この塩基配列がコードするアミノ酸配列
とともに配列番号１に示す。また、このアミノ酸配列の
みを配列番号２に示す。前記アミノ酸配列のうち、アミ
ノ酸番号１〜２４で表されるアミノ酸配列はシグナルペ
プチドであり、アミノ酸番号２５〜４１３で表されるア
ミノ酸配列は成熟タンパクであることが、精製ＨＰ−５
５のＮ−末端アミノ酸配列からわかっている。このアミ
ノ酸配列中、３７７番目のメチオニン残基と３７８番目
のロイシン残基との間がプロテアーゼによって切断され
ることが確認されたことから、この３７７番目のメチオ
ニン残基及び３７８番目のロイシン残基がプロテアーゼ
に対する反応部位であると考えられる。

【００１５】ＨＰ−５５は、冬眠期でないシマリスの血
中又は肝臓から精製することによって得られる。すなわ
ち、血中又は肝臓から分子量１４０ｋｄのタンパク質複
合体（ＨＰ−２０Ｃ）を精製し、さらにその複合体に会
合している分子量５５ｋｄのタンパク質を単離すればよ
い。精製は、通常のタンパク質の精製法、すなわち、ゲ
ル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、塩
析などの方法を適宜組み合わせて行えばよい。得られた
タンパク質がＨＰ−５５であることの確認は、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによる分子量の測
定や、エラスターゼに対する阻害活性によって行うこと
ができる。

【００１６】また、すでに、ＨＰ−５５のｃＤＮＡが取
得されているので、このｃＤＮＡを大腸菌などの微生物
細胞中、あるいは動物培養細胞中などで発現させること
によっても、ＨＰ−５５を取得することができる。

【００１７】ＨＰ−５５をコードするｃＤＮＡは、シマ
リスからフェノール−クロロホルム法やグアニジンイソ
チオシアネート法等の方法によってＲＮＡを調製し、こ
のＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）−セルロース又はポリ
（Ｕ）−セファロース（ファルマシア(Pharmacia)社）
を用いてｍＲＮＡ画分を精製し、これを鋳型としてｃＤ
ＮＡライブラリーを作製し、配列番号１に示す塩基配列
の一部を有する合成オリゴヌクレオチドをプローブとす
るハイブリダイゼーションにより選択することによって
得られる。

【００１８】また、上記のようにして調製したＲＮＡ又
はｃＤＮＡから、配列番号１に示す塩基配列の一部を有
する１組の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとする
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(ＰＣＲ)法によ
り増幅することによっても、ＨＰ−５５のｃＤＮＡを得
ることができる。

【００１９】尚、シマリスについては、ＨＰ−５５と類
似したタンパク質が他に少なくとも３種存在し、これら
はいずれもプロテアーゼインヒビター活性を有すること
が本発明者により見い出されている。上記の方法によ
り、これらのｃＤＮＡが取得される可能性があるが、こ
れらのＨＰ−５５類似タンパク質のプロテアーゼに対す
る反応部位の配列はMet-Met、Met-Ser又はArg-Serと考
えられ、プロテアーゼに対する反応部位を含むアミノ酸
配列が相互に異なっているので、ＨＰ−５５のプロテア
ーゼに対する反応部位を含むアミノ酸配列、特に配列番
号２で表されるアミノ酸配列中の３７７番目のメチオニ
ン残基及び３７８番目のロイシン残基によって、ＨＰ−
５５のｃＤＮＡであることを確認することができる。

【００２０】得られたｃＤＮＡを、宿主微生物、例えば
大腸菌細胞内で自律複製可能なプラスミドベクターに挿
入し、ｃＤＮＡの上流に大腸菌で機能するプロモーター
を連結し、得られた組換えプラスミドで大腸菌を形質転
換する。得られた形質転換体をプロモーターが発現する
条件下で培養し、産生されたＨＰ−５５を菌体タンパク
質から精製することによって、ＨＰ−５５が得られる。
用いるｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列は、エラスタ
ーゼに対する阻害作用を実質的に害さない１又は２以上
のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有していてもよ
い。

【００２１】上記の方法において、ＨＰ−５５のｃＤＮ
Ａを他のペプチドをコードするＤＮＡと連結し、融合タ
ンパク質として発現させてもよい。また、ＨＰ−５５の
ｃＤＮＡの一部のみを用いて部分ペプチドとして発現さ
せてもよい。

【００２２】上記のようにして得られるＨＰ−５５もし
くは融合タンパク質は、プロテアーゼインヒビターとし
て用いることができる。尚、ＨＰ−５５の部分ペプチド
は、少なくともプロテアーゼに対する反応部位及びその
隣接領域を含むことが、プロテアーゼインヒビターとし
て必要である。

【００２３】ＨＰ−５５のプロテアーゼに対する特異性
は次のとおりである。 エラスターゼに対して阻害作用を有する。この阻害作
用は、ヒトα１−アンチトリプシンよりも弱い。 トリプシンおよびトロンビンに対して阻害作用を実質
的に有しない。

【００２４】本発明の新規なプロテアーゼインヒビター
は、プロテアーゼ阻害剤として、炎症、血液凝固等の活
性化を仲介するプロテアーゼを制御し、組織を損傷や崩
壊から保護する生体防御薬としての用途、具体的には、
若年性の肺気腫や小児肝硬変症等に対する医薬の有効成
分としての用途が期待できる。

【００２５】

【実施例】以下に、本発明を実施例によってさらに具体
的に説明する。ＨＰ−５５の大腸菌での発現、精製及び
活性の測定を、以下に示す方法で行った。

【００２６】＜ＨＰ−５５を含む組み換えタンパク質の
大腸菌での発現及び精製＞アメルシャム（Amersham）社
のｃＤＮＡ合成キットを用いて、非冬眠シマリスの肝臓
から調製したポリＡ−ＲＮＡから、オリゴｄＴプライマ
ー法により二本鎖ｃＤＮＡを合成、ＥｃｏＲＩアダプタ
ーを付加した後、ＥｃｏＲＩ消化したファージベクター
λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン（Stratagene）社）に連
結、インビトロパッケージングを行ってｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。

【００２７】シマリス血漿中から精製したＨＰ−５５か
ら決定した部分アミノ酸配列Phe-Leu-Val-Val-Ile-Tyr-
Glu-His-Asn-Thr-Lys（成熟タンパク質の３６５番目〜
３７５番目）に基づいて、配列番号３に示す配列（５’
−TTTGTGTTGTGTTCGTAGATGACGACTAGGAA−３’）のＤＮＡ
を合成した。尚、この合成ＤＮＡは、アミノ酸配列の各
アミノ酸についてコドンの中から１つの塩基配列を選ん
で組み合わせたもので、アンチセンスな配列である。

【００２８】Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼと［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰでアイソトープ標識下、この合成ＤＮＡを
プローブとして用いて、プラーク・ハイブリダイゼーシ
ョン法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、目的のｃＤＮＡクローンを得た。尚、ハイブリダイ
ゼーションの条件は、Takamatsu, N., Ohba, K., Kond
o, J., Kondo, N. and Shiba, T., Mol. Cell. Biol. 1
3, 1993, p1516-1521に従った。

【００２９】このようにして得られたＨＰ−５５のｃＤ
ＮＡを含むファージクローンから、成熟タンパク質をコ
ードする領域を、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列CATATGを
含む配列番号４に示す配列（GAAGGTCGTCATATGCAGGATGCT
CAGGAGACAGA）を有する合成ＤＮＡと、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩの認識配列GGATCCを含む配列番号５の配列（TTAGCA
GCCGGATCCATCAGGGAGGGGCCCAGGCA）を有する合成ＤＮ
Ａ、の２つの合成ＤＮＡをプライマーとして、遺伝子増
幅法（ＰＣＲ法）により増幅した。上記のプライマーを
用いることによって、ＨＰ−５５（前駆体）のｃＤＮＡ
配列のうち、成熟タンパク部分、すなわちＮ−末端から
２５番目のグルタミン残基から３’非コード領域までの
配列が増幅される。

【００３０】具体的には、ＨＰ−５５のｃＤＮＡを含む
前記ファージクローン（２０ｎｇ）と、上記２種のプラ
イマー用合成ＤＮＡ（各々１μｇ）と、１０倍濃度のＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（１０μｌ）と、各々
２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰ
（１μｌ）と水とを加えて９９μｌとし、９５℃で５分
間変性した後、５８℃で３０秒間アニールした。次い
で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（ベーリ
ンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)社）を１μｌ
加え、７０℃で３分間反応させた。この、９５℃で１分
間（変性）、５８℃で３０秒間（アニール）、７０℃で
３分間（ＤＮＡ合成）のサイクルを３０回繰り返した。

【００３１】その後、フェノール抽出によりタンパク質
除去を行ってから、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を
回収し、さらに制御酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化し
て、目的のＤＮＡ断片を得た。

【００３２】得られたＤＮＡ断片を、大腸菌用の発現ベ
クターｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン(Novagen)社）のＢａ
ｍＨＩ部位とＮｄｅＩ部位との間に挿入し、ＨＰ−５５
発現用プラスミドを作製した。このようにｐＥＴ１６ｂ
を用いることによって、大腸菌で発現した組み換えタン
パク質のＮ末端には、ヒスチジン・タッグが付加され
る。尚、このプラスミドには、更に、発現した組み換え
タンパク質からヒスチジン・タッグを切り離して目的と
するタンパク質（ＨＰ−５５）を精製できるようにする
ため、第Ｘ_a因子（ＦａｃｔｏｒＸ_a）の切断配列を挿入
してある。従って、大腸菌で発現した組み換えタンパク
質のＮ末端には、ＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＥ
ＧＲＨＭ（配列番号６）の２１アミノ酸が付加するもの
と予想される。

【００３３】次に、これらのプラスミドを用いて、大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。形質
転換株をＭ９ＺＢ培地で２５℃で振盪培養し、６００ｎ
ｍでの吸光度が０．５〜０．６になった後、イソプロピ
ル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを終濃度が
１ｍＭになるように添加してｐＥＴ１６ｂ由来のｌａｃ
プロモーターの発現を誘導し、さらに４時間、振盪培養
を行った。次いでこれを遠心し、集菌した大腸菌を緩衝
液Ｉ（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール）に懸濁し、ソ
ニケーションにより菌体を破砕した。

【００３４】これを更に遠心して菌体の破砕物を除いた
上清に、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄレジン（インビトロジェン(I
nvitrogen)社）を加え、３時間、４℃で穏やかに混和
し、ヒスチジン・タッグをもつ組み換えタンパク質をＨ
ｉｓ−Ｂｉｎｄレジンに吸着させた。次いでこれを遠心
してＨｉｓ−Ｂｉｎｄレジンを回収後、再び緩衝液Ｉに
懸濁し、１５分間、４℃で穏やかに撹拌してから、遠心
して溶液を除き、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄレジンを洗浄した。
この洗浄操作をさらに２回行ってから、回収したＨｉｓ
−Ｂｉｎｄレジンを緩衝液ＩＩ（２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイ
ミダゾール）に懸濁し、４℃で１時間穏やかに撹拌し
て、ＨＰ−５５を含む組み換えタンパク質をレジンから
溶出させた。

【００３５】遠心後、溶出した組み換えタンパク質を含
む溶液を回収し、プロテアーゼ阻害活性測定用の緩衝液
に対して、４℃で１時間透析を行ってから、−８０℃に
保存した。

【００３６】＜組み換えタンパク質のプロテアーゼ阻害
活性の測定＞上記方法で大腸菌から精製した組み換えタ
ンパク質のプロテアーゼ阻害活性を、一定量のプロテア
ーゼと種々の量の組み換えタンパク質を一定時間混和し
た後の残存しているプロテアーゼ活性により測定した。
また、比較として、エラスターゼ及びトリプシンに対す
る阻害活性を有することが知られているヒトα１−アン
チトリプシンについても同様にプロテアーゼ阻害活性を
測定した。以下にその具体的方法を示す。

【００３７】（１）エラスターゼに対する阻害活性 上記方法で大腸菌から精製した組み換えタンパク質（０
〜３０μｇ）に、ブタ膵臓由来のエラスターゼ（エラス
チンプロダクト(Elastin Product)社）０．０３μｇと
牛血清アルブミン１０μｇを加え、さらに１ＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μｌと水とを加えて全量
を１９８μｌとし、３７℃で１５分間保温した。

【００３８】これに、エラスターゼの切断配列を有する
合成基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−ｐＮＡを２μｌ加え、組み換えタンパク質の最終
濃度が０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、及び３ｍＭに
なるように調整し、さらに３７℃で２０分間保温後、酢
酸を５０μｌ加えて反応を停止してから、４１０ｎｍで
の吸光度により残存プロテアーゼ活性を測定した。結果
を図１に示す。

【００３９】（２）トリプシンに対する阻害活性 上記方法で大腸菌から精製した組み換えタンパク質（０
〜３０μｇ）に、ブタ膵臓由来のトリプシン（シグマ
(Ｓｉｇｍａ)社）０．５μｇと牛血清アルブミン１０μ
ｇを加え、さらに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）１０μｌと水とを加えて全量を１９８μｌとし、３
７℃で１５分間保温した。

【００４０】これに、トリプシンの切断配列を有する合
成基質Ｎα−Ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＬ−Ａｒｇ−ｐＮＡを
２μｌ加え、組み換えタンパク質の最終濃度が０．１ｍ
Ｍ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、及び３ｍＭになるように調整
し、さらに３７℃で３０分間保温後、酢酸を５０μｌ加
えて反応を停止してから、４１０ｎｍでの吸光度により
残存プロテアーゼ活性を測定した。結果を図２に示す。

【００４１】（３）トロンビンに対する阻害活性 上記方法で大腸菌から精製した組み換えタンパク質（０
〜３０μｇ）にヒト血漿由来のトロンビン（Sigma社）
２５ｍＵを加え、さらに１０×トロンビン用緩衝液
（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２
ＭのＮａＣｌ）２０μｌと水とを加えて全量を１９８μ
ｌとし、３７℃で５分間保温した。

【００４２】これに、トロンビンに対する基質Ｃｈｒｏ
ｍｏｚｙｍ ＴＨ（ベーリンガーマンハイム(Boehringe
r Mannheim)社）を２μｌ（１５ｍＭ）加え、さらに３
７℃で６０分間保温後、４０５ｎｍでの吸光度により残
存プロテアーゼ活性を測定した。

【００４３】＜血漿から精製したＨＰ−５５のプロテア
ーゼ阻害活性の測定＞シマリス血漿から精製したＨＰ−
５５タンパク質（０〜５μｇ）に、ブタ膵臓由来のエラ
スターゼ２．０μｇを加え、さらに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８．５）５μｌと水とを加えて全量を５
０μｌとし、３７℃で５分間保温した。

【００４４】これに、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
に溶解した、エラスターゼの切断配列を有する合成基質
Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡを４５０μｌ
（２２μＭ）加え、３７℃で１０分間保温後、５０％酢
酸を５００μｌ加えて反応を停止してから、水２ｍｌを
加えた後、励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで
の蛍光強度により残存プロテアーゼ活性を測定した。結
果を図３に示す。

【００４５】また、ここで得られたシマリス血漿から精
製したＨＰ−５５タンパク質５μｇを含むエラスターゼ
反応物を、それぞれ減圧乾固したのち、水５００ｍｌに
溶解し、２０％アセトニトリルを含む０．１％トリフル
オロ酢酸水溶液で平衡化した逆相高速液体クロマトグラ
フィーカラム（ＹＭＣｐａｃｋ Ｃ８、０．４ｘ１５ｃ
ｍ、株式会社ワイエムシイ）に添加した後、４０分間で
８０％アセトニトリルまでの直線濃度勾配により溶出し
た。流速、１．０ｍｌ／分、検出は２１５ｎｍの吸光度
で行った。測定結果を図４に示す。

【００４６】溶出時間１６．７分のピークを分取した
後、減圧乾固し、そのＮ末端アミノ酸配列をＰＰＳＱ−
１０シーケンサー（島津製作所）にて解析した。その結
果、１６．７分のピークに相当するペプチドのＮ末端ア
ミノ酸配列は、Leu-Gln-Ala-Pro-Ile-Met-Lys-Phe-Asp-
Arg-Pro-Phe-Leu-Val-Val-Ile-Tyr-Glu-His-Asnであっ
た。即ち、該ピークに相当するペプチドのアミノ酸配列
は、ＨＰ−５５の成熟タンパク質の３５４番目のロイシ
ン残基（配列番号２で表されるアミノ酸配列中、３７８
番目のロイシン残基）からカルボキシル末端側のもので
あり、３５３番目のメチオニン残基（配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列中、３７７番目のメチオニン残基）と
３５４番目のロイシン残基の間で切断されたことを確認
した。

【００４７】＜結果＞上記方法により測定した組み換え
タンパク質のプロテアーゼ阻害活性のうち、エラスター
ゼに対する阻害活性の測定結果を図１に示す。また、ト
リプシンに対する阻害活性の測定結果を図２に示す。各
々について、ヒトα１−アンチトリプシンのプロテアー
ゼ阻害活性の測定結果を比較のため併せて示した。

【００４８】尚、ヒスチジン・タッグ自体にはプロテア
ーゼ阻害活性はなく、ここで観察された組み換えタンパ
ク質の阻害活性はＨＰ−５５自身によるものであると考
えられる。

【００４９】一方、シマリス血漿から精製したＨＰ−５
５についてプロテアーゼ阻害活性を測定した結果を図３
に示す。これによれば、ここで精製されたＨＰ−５５タ
ンパク質は、上記組み換えタンパク質の場合と同様にエ
ラスターゼに対する阻害活性を示している。

【００５０】これらの結果から、上記組み換えタンパク
質はＨＰ−５５を含むものであり、ＨＰ−５５はタンパ
ク質分解酵素であるエラスターゼに対して阻害活性を持
つことが確認された。しかし、トリプシンに対しては阻
害活性を有しない。また、トロンビンに対する阻害活性
を測定した結果、トロンビンに対する阻害活性は認めら
れなかった。

【００５１】また、シマリス血漿から精製したＨＰ−５
５がエラスターゼによって３５３番目のメチオニン（配
列番号２で表されるアミノ酸配列中、３７７番目のメチ
オニン残基）と３５４番目のロイシン残基（配列番号２
で表されるアミノ酸配列中、３７８番目のロイシン残
基）の間で切断されたことから、ＨＰ−５５のプロテア
ーゼに対する反応部位のアミノ酸配列はMet-Leuである
ことが示唆されている。

【００５２】

【発明の効果】本発明の新規なプロテアーゼインヒビタ
ーは、α１−アンチトリプシンに類似した新規な構造と
プロテアーゼに対する新たな選択的、特徴的な阻害作用
を有するものである。

【００５３】一方、α１−アンチトリプシンの欠損症
や、そのアミノ酸配列の先天的異常による機能壊失は、
若年性の肺気腫や小児肝硬変症と深く関わることが報告
されている。さらに、α１−アンチトリプシンを含むセ
リンプロテアーゼインヒビターが炎症、血液凝固、補体
系の活性化を仲介するプロテアーゼを制御することが明
らかにされ、組織を損傷や崩壊から保護する因子として
注目されている。

【００５４】よって、ここで見いだされた新規なプロテ
アーゼインヒビターは、特異的なプロテアーゼ阻害剤の
開発に有用であるとともに、組織を損傷や崩壊から保護
する生体防御薬としての用途や、各種プロテアーゼの活
性中心構造の研究に役立つことが期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例における組み換えタンパク質のエラス
ターゼ阻害活性の測定結果を示す図である。

【図２】 実施例における組み換えタンパク質のトリプ
シン阻害活性の測定結果を示す図である。

【図３】 実施例におけるシマリス血漿中から精製した
ＨＰ−５５タンパク質のエラスターゼ阻害活性の測定結
果を示す図である。

【図４】 実施例におけるシマリス血漿中から精製した
ＨＰ−５５タンパク質のエラスターゼ反応物の、逆相高
速液体クロマトグラフィーの溶出分画に対する吸光度測
定結果を示す図である。

【符号の説明】

１・・・組み換えタンパク質の阻害活性 ２・・・ヒトα１−アンチトリプシンの阻害活性

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1242 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：シマリス（Tamias asiaticus） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1239 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 ATG CCA TCC TCC ATC TCC TGG GGC CTC CTG CTG CTG GCA GCC CTG AGC 48 Met Pro Ser Ser Ile Ser Trp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 TGC CTG GGC CCT GGC TCC CTG GCT CAG GAT GCT CAG GAG ACA GAG GCA 96 Cys Leu Gly Pro Gly Ser Leu Ala Gln Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala 20 25 30 TCC AAG CAG GAC CAG GAG CAC CCG GCC TCC CAC AGG ATC GCC CCG CAC 144 Ser Lys Gln Asp Gln Glu His Pro Ala Ser His Arg Ile Ala Pro His 35 40 45 CTG GCC GAG TTT GCC CTC AGC CTC TAC CGC GTG CTG GCC CGT CAG TCC 192 Leu Ala Glu Phe Ala Leu Ser Leu Tyr Arg Val Leu Ala Arg Gln Ser 50 55 60 AAC ACC ACC AAC ATC TTC TTC TCC CCC GTG AGC ATC GCC TCC GCC TTG 240 Asn Thr Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Ser Ala Leu 65 70 75 80 GCC ATG CTC TCT CTG GGC ACC AAG GGT GAC ACT CAC ACC CAG ATC CTG 288 Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Gly Asp Thr His Thr Gln Ile Leu 85 90 95 GAG GGC CTG GAC TTC AAC CTC ACG GAG ATG GCG GAG GCT GAC ATC CAC 336 Glu Gly Leu Asp Phe Asn Leu Thr Glu Met Ala Glu Ala Asp Ile His 100 105 110 CAG GGC TTC CAG AAT CTT CTC CAA ACC CTC AAC AGG CCC AAC ACC CAG 384 Gln Gly Phe Gln Asn Leu Leu Gln Thr Leu Asn Arg Pro Asn Thr Gln 115 120 125 CTG CAG CTG ACC TCT GGC AAC GTC CTC TTC ATC CAC CAG AAT CTG AAG 432 Leu Gln Leu Thr Ser Gly Asn Val Leu Phe Ile His Gln Asn Leu Lys 130 135 140 CTC CTG GAC AAG TTT CTG GAG AAC ATC AAG AGC CTG TAC CAC TCA GGG 480 Leu Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Tyr His Ser Gly 145 150 155 160 GCC TTC CCC ACC AAC TTC ACC AAC ACC GAA GAG GCC AGG CAG CAG ATC 528 Ala Phe Pro Thr Asn Phe Thr Asn Thr Glu Glu Ala Arg Gln Gln Ile 165 170 175 AAC AGT TAT GTG GAA CAA GGG ACC CAG GGG AAA ATT GTG GAG TTG GTG 576 Asn Ser Tyr Val Glu Gln Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Glu Leu Val 180 185 190 AAA GAG CTG GAC AGA GAC ACA GTT CTT GCC CTG GTG AAC TAC ATC TTC 624 Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Leu Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe 195 200 205 TTT AAA GGC AAA TGG CTG AAG CCC TTC AAT GTG AAA AAC ATC AGG GAA 672 Phe Lys Gly Lys Trp Leu Lys Pro Phe Asn Val Lys Asn Ile Arg Glu 210 215 220 GAA GAC TTC CAC GTG GAC GAG GCC ACC ACC GTG AGG GTG CCC ATG ATG 720 Glu Asp Phe His Val Asp Glu Ala Thr Thr Val Arg Val Pro Met Met 225 230 235 240 TAC CGC GTG GGC ATG TTC CCT GTG CAC TAC TGC AGA ACG CTG GCC AGC 768 Tyr Arg Val Gly Met Phe Pro Val His Tyr Cys Arg Thr Leu Ala Ser 245 250 255 CTG GTG CTA CAG ATG GAC TAC CTG GGC AAC GCC ACC GCC ATC TTC CTC 816 Leu Val Leu Gln Met Asp Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Leu 260 265 270 CTG CCC GAC AAG GGT AAA ATG CAG CAC CTG GAG GAC ACG ATC TCT ACA 864 Leu Pro Asp Lys Gly Lys Met Gln His Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr 275 280 285 GAG ATC CTC TCC AAG CTC CTG AAG GAC AGG CAA ACC TCG AAA TAC CAG 912 Glu Ile Leu Ser Lys Leu Leu Lys Asp Arg Gln Thr Ser Lys Tyr Gln 290 295 300 GTA TAC TTC CCC AGA GTG TCC ATC TCT GGA ACC TAC GAT CTG AAG GAT 960 Val Tyr Phe Pro Arg Val Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Asp 305 310 315 320 GTG CTG AGC AGC CTG GGC ATC ACC AGG GTC TTC AGC CGT GTG GCT GAC 1008 Val Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Arg Val Phe Ser Arg Val Ala Asp 325 330 335 CTG TCG GGG GTC ACT GAA GAT GCT CCC CTG ACT GTC TCC AAG GTC CTG 1056 Leu Ser Gly Val Thr Glu Asp Ala Pro Leu Thr Val Ser Lys Val Leu 340 345 350 CAT AAG GCT GTG CTG GAC ATG GAT GAG GAA GGC ACG GAG GCT GCA GGG 1104 His Lys Ala Val Leu Asp Met Asp Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Gly 355 360 365 GGC ACA GTT TTG GGA GCC GAG GCC ATG CTG CAG GCC CCT ATT ATG AAA 1152 Gly Thr Val Leu Gly Ala Glu Ala Met Leu Gln Ala Pro Ile Met Lys 370 375 380 TTC GAC AGG CCC TTC CTC GTG GTC ATC TAT GAG CAC AAC ACC AAG AGC 1200 Phe Asp Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Tyr Glu His Asn Thr Lys Ser 385 390 395 400 CCC CTC TTT GTG GGG AAG GTG GTG AAC CCC ACA CAA CAG TAG 1242 Pro Leu Phe Val Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Gln 405 410 配列番号：２ 配列の長さ：413 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Pro Ser Ser Ile Ser Trp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Gly Pro Gly Ser Leu Ala Gln Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala 20 25 30 Ser Lys Gln Asp Gln Glu His Pro Ala Ser His Arg Ile Ala Pro His 35 40 45 Leu Ala Glu Phe Ala Leu Ser Leu Tyr Arg Val Leu Ala Arg Gln Ser 50 55 60 Asn Thr Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Ser Ala Leu 65 70 75 80 Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Gly Asp Thr His Thr Gln Ile Leu 85 90 95 Glu Gly Leu Asp Phe Asn Leu Thr Glu Met Ala Glu Ala Asp Ile His 100 105 110 Gln Gly Phe Gln Asn Leu Leu Gln Thr Leu Asn Arg Pro Asn Thr Gln 115 120 125 Leu Gln Leu Thr Ser Gly Asn Val Leu Phe Ile His Gln Asn Leu Lys 130 135 140 Leu Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Tyr His Ser Gly 145 150 155 160 Ala Phe Pro Thr Asn Phe Thr Asn Thr Glu Glu Ala Arg Gln Gln Ile 165 170 175 Asn Ser Tyr Val Glu Gln Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Glu Leu Val 180 185 190 Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Leu Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Trp Leu Lys Pro Phe Asn Val Lys Asn Ile Arg Glu 210 215 220 Glu Asp Phe His Val Asp Glu Ala Thr Thr Val Arg Val Pro Met Met 225 230 235 240 Tyr Arg Val Gly Met Phe Pro Val His Tyr Cys Arg Thr Leu Ala Ser 245 250 255 Leu Val Leu Gln Met Asp Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Leu 260 265 270 Leu Pro Asp Lys Gly Lys Met Gln His Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr 275 280 285 Glu Ile Leu Ser Lys Leu Leu Lys Asp Arg Gln Thr Ser Lys Tyr Gln 290 295 300 Val Tyr Phe Pro Arg Val Ser Ile Ser Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Asp 305 310 315 320 Val Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Arg Val Phe Ser Arg Val Ala Asp 325 330 335 Leu Ser Gly Val Thr Glu Asp Ala Pro Leu Thr Val Ser Lys Val Leu 340 345 350 His Lys Ala Val Leu Asp Met Asp Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Gly Thr Val Leu Gly Ala Glu Ala Met Leu Gln Ala Pro Ile Met Lys 370 375 380 Phe Asp Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Tyr Glu His Asn Thr Lys Ser 385 390 395 400 Pro Leu Phe Val Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Gln 405 410 配列番号：３ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列 TTTGTGTTGT GTTCGTAGAT GACGACTAGG AA 32 配列番号：４ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列 GAAGGTCGTC ATATGCAGGA TGCTCAGGAG ACAGA 35 配列番号：５ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列 TTAGCAGCCG GATCCATCAG GGAGGGGCCC AGGCA 35 配列番号：６ 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile 1 5 10 15 Glu Gly Arg His Met 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高松 信彦 神奈川県相模原市相模大野４−５−１− 306 (72)発明者 渡辺 真理子 神奈川県相模原市下溝2068 第一いずみ荘 ２−５

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（イ）及び（ロ）に示す性質を有す
   るタンパク質性のプロテアーゼインヒビター。 （イ）プロテアーゼに対する反応部位のアミノ酸配列
   が、Gly-Ala-Glu-Ala-Met-Leu-Gln-Ala-Pro-Ileで表さ
   れるアミノ酸配列中に含まれる。 （ロ）エラスターゼに対して阻害作用を有し、トリプシ
   ンおよびトロンビンに対して阻害作用を有しない。
2. 【請求項２】 プロテアーゼに対する反応部位のアミノ
   酸配列がMet-Leuである請求項１記載のプロテアーゼイ
   ンヒビター。
3. 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
   アミノ酸番号２５〜４１３で表されるアミノ酸配列、又
   はこのアミノ酸配列においてエラスターゼに対する阻害
   作用を害さない１又は２以上のアミノ酸残基の欠失、挿
   入又は置換を有するアミノ酸配列を有する請求項１又は
   ２記載のプロテアーゼインヒビター。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のプロテ
   アーゼインヒビターを含有するプロテアーゼ阻害剤。