JP3012928B1

JP3012928B1 - 植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼｃＤＮＡおよび遺伝子

Info

Publication number: JP3012928B1
Application number: JP10327537A
Authority: JP
Inventors: 正緒美荒平; 親房深澤
Original assignee: 農林水産省食品総合研究所長
Priority date: 1998-11-04
Filing date: 1998-11-04
Publication date: 2000-02-28
Anticipated expiration: 2018-11-04
Also published as: US6107471A; JP2000139472A; DE19952969A1; DE19952969B4

Abstract

【要約】【課題】アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ
の遺伝的情報を得て、本酵素の量産化を可能にするこ
と。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する植物由来の
アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡおよび配列表の配列番号２記載のアミノ酸配
列を有する植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼをコードする遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物由来のアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼｃＤＮＡおよび遺
伝子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アスパラギン残基特異的エンドプロテア
ーゼとは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の
うち、アスパラギン残基のＣ−末端でペプチド等を切断
する酵素である。この中でも、特に植物由来のアスパラ
ギン残基特異的エンドプロテアーゼをレグマチュレイン
と称されている。これまでに、レグマチュレインは種々
の高等植物において酵素活性が確認されているが、非常
に不安定なため、本発明者らの他には高度に精製した例
がない。

【０００３】植物の貯蔵タンパク質は、当初プレプロタ
ンパク質として合成され、レグマチュレインの作用によ
りはじめて成熟タンパク質の形となる。この植物の貯蔵
タンパク質は、安全性の点で心配がない上に、優れた蛋
白資源であることから、食品工業界では大量生産が要望
されている。したがって、この貯蔵タンパク質の合成に
必要な純度の高いレグマチュレインの量産も強く望まれ
ている。しかし、前述した理由から、レグマチュレイン
の精製は極めて困難であり、未だ要望には応えられてい
ない状況である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】レグマチュレインのｃ
ＤＮＡおよび遺伝子が取得され、これらを利用すること
ができれば、本酵素の大量生産への道が開かれる可能性
がある。また、部位特異的変異法を利用して本酵素の安
定性の増大や酵素活性の改良等にも利用できる。したが
って、本発明の目的は、レグマチュレインの遺伝的情報
を得て、本酵素の量産化を可能とすることである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、レグマチ
ュレインを高度に精製し、そのアミノ酸配列を基にし
て、レグマチュレインのｃＤＮＡおよび遺伝子のクロー
ニングを試みた。その結果、そのｃＤＮＡおよび遺伝子
の全構造を解明することに成功し、本発明に到達した。

【０００６】すなわち、高度に精製されたレグマチュレ
インのアミノ酸配列の解析から、縮重のある合成オリゴ
ヌクレオチドを作成した。次に、ダイズ登熟初期の種子
よりｍＲＮＡを抽出し、それに相補的なｃＤＮＡを合成
した。作成した合成オリゴヌクレオチドとｃＤＮＡとの
間でＰＣＲを行い、レグマチュレインの部分的なｃＤＮ
Ａをクローニングした。

【０００７】一方、同じダイズ登熟初期の種子のｍＲＮ
Ａを用いて、２本鎖ｃＤＮＡを合成し、ファージベクタ
ーにアダプターを介して組み込み、ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築した。このｃＤＮＡライブラリーより、ＰＣＲ
法により得た部分的なレグマチュレインｃＤＮＡをラベ
ルし、これをプローブとしてスクリーニングを行って、
完全長のレグマチュレインｃＤＮＡをクローニングし
た。このｃＤＮＡの一次構造解析により、シグナルペプ
チドの配列を含むレグマチュレインの全アミノ酸配列が
決定された。

【０００８】ｃＤＮＡの配列を基にしたオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成し、発芽したダイズより各ＤＮＡ
を抽出・精製し、これを鋳型としてＰＣＲ法を行い、レ
グマチュレイン遺伝子をクローニングした。

【０００９】すなわち、請求項１記載の本発明は、以下
の（ａ）又は（ｂ）の植物由来のアスパラギン残基特異
的エンドプロテアーゼをコードするｃＤＮＡである。（ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列からなる
植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ（ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列に対し１
もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換または付加が
なされたアミノ酸配列からなり、かつ植物由来のアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性を有するタン
パク質また、請求項２記載の本発明は、以下の（ａ）又
は（ｂ）の植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼをコードする遺伝子である。（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなる
植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列に対し１
もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換または付加が
なされたアミノ酸配列からなり、かつ植物由来のアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性を有するタン
パク質

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明について以下に詳しく説明
する。請求項１記載の本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）の植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロ
テアーゼをコードするｃＤＮＡである。（ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列からなる
植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ（ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列に対し１
もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換または付加が
なされたアミノ酸配列からなり、かつ植物由来のアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性を有するタン
パク質

【００１１】本発明の対象とする植物由来のアスパラギ
ン残基特異的エンドプロテアーゼ、すなわちレグマチュ
レインは、上述したように、ペプチドやタンパク質のア
ミノ酸配列のうち、アスパラギン残基のＣ−末端側でペ
プチド等を切断する作用を有している酵素である。

【００１２】本発明者らは、以下のようにして請求項１
記載のｃＤＮＡの取得に成功した。まず、植物中に含まれるレグマチュレインを抽出、
精製した。レグマチュレインは各種の植物、特に種子中
に含まれる貯蔵タンパク質に含まれている。例えば、ダ
イズの種子からレグマチュレインを抽出する場合は、登
熟初期から完熟期まで、特に登熟初期から登熟後期まで
のものを用いることが好ましい。

【００１３】ここで、レグマチュレインのみを得るため
には、材料である植物を高度に精製する必要がある。１
例を示すと、登熟初期から完熟期までの植物種子を粉砕
し、これを適当な緩衝液で抽出し、その可溶性画分を透
析後、固液分離する。得られる粗酵素液を疎水クロマト
グラフィー、ゲルろ過等にかけることにより、ほぼ純粋
なレグマチュレインまで精製することが可能である。

【００１４】得られた精製レグマチュレインのアミ
ノ酸配列のうち、Ｎ−末端のアミノ酸配列を決定した。
アミノ酸配列の決定は、Edman 分解により行うことがで
き、自動アミノ酸シークエンサーを用いると簡便に行う
ことができる。

【００１５】一方、上記とは別に、精製レグマチ
ュレインの部分アミノ酸配列を得た。まず、レグマチュ
レインを短いペプチドに酵素分解し、それぞれのペプチ
ドサンプルを高速液体クロマトグラフィー等により分画
した上で、各サンプルのアミノ酸配列、すなわちレグマ
チュレインの内部のアミノ酸配列を決定した。アミノ酸
配列の決定は、上記と同様の方法により行うことがで
きる。各アミノ酸配列のうち、縮重のあるオリゴヌクレ
オチド２つを選択し、後述のＰＣＲ反応でプライマーと
して用いた（配列表の配列番号３および４参照）。

【００１６】次に、植物の種子よりＲＮＡを抽出
し、これに相補的なｃＤＮＡを合成した。植物からのＲ
ＮＡ抽出は、Fukazawa C. et al., Journal of Biologi
cal Chemistry, 200, 6234-6239 (1985)に従い、ＳＤＳ
−フェノール法を用いて行うことができる。抽出した全
ＲＮＡからＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製し、これにオ
リゴ（ｄＴ）をプライマーとした逆転写酵素による逆転
写反応を行って、１本鎖ｃＤＮＡを得た。

【００１７】この１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、先
に作成した合成オリゴヌクレオチド（配列表の配列番号
３および４参照）との間でＰＣＲを行い、レグマチュレ
インの部分的なｃＤＮＡ（４００ｂｐ）をクローニング
した。得られたバンドをベクターにサブクローニング
し、先に決定したレグマチュレインの内部のアミノ酸配
列を含んでいるかどうか解析した。その結果、該バンド
は、レグマチュレインの部分的なｃＤＮＡであることが
確認された。

【００１８】次に、同じ植物種子のｍＲＮＡを用い
て２本鎖ｃＤＮＡを合成し、ファージベクターにアダプ
ターを介して組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを構築し
た。ｃＤＮＡライブラリーの作成には、岡山−Berg法、
ガブラー−ホフマン（Gubler-Hoffman）法を採用できる
が、簡略な点から後者の方が好ましい。以下、ガブラー
−ホフマン法を採用した場合について述べる。

【００１９】まず、先述のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから
２本鎖のｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡに、Ｅｃｏ
ＲＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ等の制限酵素部位を含むア
ダプターをライゲーションし、制限酵素によりｃＤＮＡ
を切断する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
５００ｂｐ以上の長さのものだけをゲルから切り出して
集めると共に、アダプターを除去する。その後、得られ
たヌクレオチドの５’位にリン酸基を導入し、制限酵素
で切断し、脱リン酸化してあるλｇｔ１０ファージベク
ターアーム（宝酒造社製）にライゲーションする。これ
をλファージにパッケージングした。こうして、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作成した。

【００２０】上記のＰＣＲ法により得た部分的な
レグマチュレインｃＤＮＡをラベルし、これをプローブ
として、のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニング
を行った。次いで、完全長のレグマチュレインｃＤＮＡ
をクローニングした。スクリーニングは、先に得たレグ
マチュレイン部分ｃＤＮＡを放射標識等したものをプロ
ーブとして、約１０万プラークのｃＤＮＡライブラリー
にプラークハイブリダイゼーションすることにより行う
ことができる。その結果、約１０万プラークのうち、数
個のプラークが陽性を示したので、これを分離した。

【００２１】分離した陽性プラークを純化し、大腸菌に
感染させファージを増やした後に、ファージ粒子を精製
した。ファージＤＮＡの精製は、ＣｓＣｌステップワイ
ズ密度勾配を用いた超遠心法等により行うことができ
る。精製したファージＤＮＡから制限酵素でインサート
を切り出し、アガロースゲル等で精製した。これをプラ
スミドベクターにサブクローニングした後、ＤＮＡシー
クエンスを行った。

【００２２】その結果、配列表の配列番号１記載のアミ
ノ酸配列を有するｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡ
が、請求項１記載の本発明のｃＤＮＡである。該配列は
レグマチュレインの全長を含んでいる。また、ＥＭＢ
Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースと比較したとこ
ろ、全く新規な配列であることが明らかとなった。

【００２３】請求項１記載の本発明のｃＤＮＡは、全長
１０５５ｂｐからなり、うち１４ｂｐがｐｏｌｙＡで
あった。アミノ酸数は、開始メチオニンからの全体で２
４１残基、シグナルペプチドは２１残基であり、成熟型
タンパク質のＮ−末端配列からクローニングされたｃＤ
ＮＡから推定されるアミノ酸のＣ−末端まで２２０残基
であった。Ｃ−末端解析から得られた結果およびイオン
スプレーマススペクトロメトリーで得られた分子量の結
果から、レグマチュレインは、Ｃ−末端側でプロセスを
受けるプレプロ型のタンパク質であることが明らかとな
った。

【００２４】この配列中、レグマチュレイン活性に関与
する糖鎖の結合部位は、配列表の配列番号１記載のアミ
ノ酸配列のうち、７１〜７８番目の部分であった。この
部分の構造は、Ｎ−末端側から、塩基性アミノ酸−疎水
性アミノ酸−アスパラギン（糖鎖）−疎水性アミノ酸−
スレオニン／セリン−疎水性アミノ酸−酸性アミノ酸−
システインとなっている。この糖鎖結合部位は、アスパ
ラギン残基のＣ−末端側でアミノ酸を特異的に切断する
活性を有するレグマチュレインの安定化に関与すると考
えられる。この糖鎖が欠失すると、酵素活性の急速な低
下がみられる。

【００２５】次に、請求項２記載の本発明について説明
する。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の本発明
のｃＤＮＡの一次構造解析により得られるレグマチュレ
インの全遺伝子である。まず、配列表の配列番号１記載
のｃＤＮＡの塩基配列をもとに、２５ｍｅｒと２６ｍｅ
ｒの２つのオリゴヌクレオチドプライマー（配列表の配
列番号５、６参照）を合成した。

【００２６】一方、ダイズの芽生えから合成したＤＮＡ
を調製した。調製は、ＣＴＡＢ法 [Fukazawa C. et a
l., Journal of Biological Chemistry, 200, 6234-623
9 (1985)] 等により行うことができる。このＤＮＡを鋳
型にして配列表の配列番号５、６記載のプライマーを用
いてＰＣＲ法を行った。

【００２７】その結果、約３．１ｂｐの単一バンドが得
られた。このバンドをＴＡベクター[ｐＣＲ２．１](Inv
itrogen社製) にサブクローニング後、上記の方法でＤ
ＮＡシークエンスを行った。その結果、配列表の配列番
号２に示す塩基配列が得られた。

【００２８】請求項２記載の本発明の遺伝子の全長（配
列表の配列番号２参照）は３０７７ｂｐで、４つのイン
トロンにより５つのエクソンに分断されている。各イン
トロンの塩基数は、第１イントロンよりそれぞれ６７、
７０５、１１１３、２００ｂｐであった。一方、各エク
ソンの塩基数は、第１エクソンよりそれぞれ３２１、６
６、１４１、９３、４２０ｂｐであった（配列表の配列
番号２参照）。前記ｃＤＮＡに存在した活性に関与する
糖鎖結合部位は、第１エクソン上に存在していた（配列
表の配列番号２記載のアミノ酸配列の７１〜７８番目参
照）。

【００２９】請求項２記載の本発明は、以下の（ａ）又
は（ｂ）の植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼをコードする遺伝子である。（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなる
植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列に対し１
もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換または付加が
なされたアミノ酸配列からなり、かつ植物由来のアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性を有するタン
パク質

【００３０】このようにして得られた請求項１記載の本
発明のｃＤＮＡおよび請求項２記載の本発明の遺伝子を
利用することによって、アスパラギン残基特異的エンド
プロテアーゼ（レグマチュレイン）を大量に、しかも効
率よく生産することが可能となる。

【００３１】なお、配列表の配列番号１記載のアミノ酸
配列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置
換または付加がなされたアミノ酸配列を有するものであ
っても、同様の作用効果を奏するものは、本発明に包含
される。同じく、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配
列に対して１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換
または付加がなされたアミノ酸配列を有するものであっ
ても、同様の作用効果を奏するものは、本発明に包含さ
れる。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらにより何ら制限を受けるものではな
い。実施例１〔レグマチュレインのアミノ酸配列の決定およ
びＰＣＲ法を用いた部分ｃＤＮＡのクローニング〕（１）鋳型の作成開花後１３日目のダイズの種子より、Fukazawa C. et a
l., Journal of Biological Chemistry, 200, 6234-623
9 (1985)に従い、ＳＤＳ−フェノール法を用いて全ＲＮ
Ａを抽出した。抽出した全ＲＮＡからＰｏｌｙＡＴ
ｒａｃｔキット（プロメガ社製）により、Ｐｏｌｙ
（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。

【００３３】調製したＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ１μｇに
つき、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、逆転写酵素Ｒ
ＡＶ−２（宝酒造社製）１００Ｕを用いて４２℃、６０
分間逆転写反応を行い、１本鎖のｃＤＮＡを得た。残存
するＲＮＡを分解するため、終濃度０．５Ｎ−ＮａＯＨ
で２５℃、一晩アルカリ分解した。アルカリ分解後、終
濃度０．５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２で中和後、
セファデックスＧ−５０（アマシャム−ファルマシア社
製）を充填したゲルろ過カラム（φ０．８ｃｍ×２７ｃ
ｍ）を通し、分解したＲＮＡを除去した。こうして得ら
れる１本鎖のｃＤＮＡを以下のＰＣＲに用いた。

【００３４】（２）プライマーの作成高度に生成したレグマチュレインのＮ−末端アミノ酸配
列を、気相式アミノ酸シークエンサー（パーキンエルマ
ー社製４７７Ａ型）により決定した。一方、Arahira M.
and Fukazawa C., Plant Molecular Biology, 25, 597
-605(1994) の方法に従い、Ｖ８プロテアーゼ（宝酒造
社製）およびリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社
製）により、レグマチュレインを分解した。

【００３５】分解後、それぞれのサンプルを逆相カラム
（東ソー社製、ＳｉｌｉｃａＯＤＳ１２０Ｔ φ
４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を接続した高速液体クロマト
グラフィー（島津社製ＬＣ−６ＡＤ）を用いて、０．１
％ＴＦＡ−０．１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリルの直
線濃度勾配をかけた溶媒系で分画した。得られたペプチ
ドを、Ｎ−末端のアミノ酸配列決定と同様に、気相式ア
ミノ酸シークエンサー（パーキンエルマー社製、４７７
Ａ型）で決定し、内部のアミノ酸配列とした。このアミ
ノ酸配列のうち、ＰＣＲのプライマーとして適する配列
を検討し、２０ｍｅｒと３２ｍｅｒの２つの縮重のある
プライマーを合成した（配列表の配列番号３および４参
照）。

【００３６】（３）ＰＣＲによるレグマチュレインの部
分ｃＤＮＡクローニング上記（２）で合成したオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて、前記（１）で合成した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの条件としては、Ｔａ
ｑポリメラーゼは TaKaRa ExTaq(宝酒造社製) を１反応
当たり２．５Ｕ用いた。また、プライマーは終濃度０．
４μＭ、ｄＮＴＰｍｉｘは０．２ｍＭ、鋳型となる一本
鎖ｃＤＮＡは１０ｎｇ使用した。遺伝子増幅装置は、 T
aKaRa PCR Thermal Cycler 480 (宝酒造社製) を用い、
変性温度９５℃、３０秒、アニーリング温度５６℃、３
０秒、伸長反応７２℃、１分３０秒、３５サイクルの条
件で行った。

【００３７】その結果、約４００ｂｐの単一のバンドが
得られたので、これをＴＡベクター[ｐＣＲ２．１] (In
vitrogen 社製) にサブクローニングした。クローン化
した大腸菌から、プラスミドＤＮＡを常法 [Maniatis
T. et al., "Molecular cloning" Cold Spring Harber
Labo. (1982)]に従い調製した。

【００３８】調製したプラスミドについて、島津社製、
ＤＮＡシークエンサーＤＳＱ１０００を用いた蛍光オ
ートシークエンスを行った。その結果、サブクローニン
グしたバンドは、前記（２）で決定したレグマチュレイ
ンの内部のアミノ酸配列を含んでいることが明らかとな
った。このことから、クローニングしたバンドは、レグ
マチュレインの部分ｃＤＮＡであることが確認された。

【００３９】実施例２〔登熟初期のｃＤＮＡライブラリ
ーの作成〕実施例１の（１）で得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ
２．５μｇを、ガブラー−ホフマン（Gubler-Hoffman）
法の原理に基づいたｃＤＮＡ合成キット（アマシャム−
ファルマシア社製）を用いて、 [³²Ｐ]-ｄＣＴＰを加え
て合成をモニターしながら２本鎖ＤＮＡを合成した。

【００４０】１ｎｍｏｌのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−Ｂａ
ｍＨＩアダプター（宝酒造社製）をニッポンジーン社
製、ライゲーションパックでライゲーションした。この
ｃＤＮＡをFukazawa C. et al., Journal of Biologica
l Chemistry, 200, 6234-6239(1985)の方法に従い、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法により、５００ｂｐ以
上の長さのものをゲルから切り出して集めると共に、ア
ダプターを除去した。アダプターには、５’位にリン酸
がないので、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニッポン
ジーン社製）を用いてリン酸基を導入した。

【００４１】その後、ＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸化
してあるλｇｔ１０ファージベクターアーム（宝酒造社
製）に、上記と同様に、ニッポンジーン社製、ライゲー
ションパックでライゲーションし、in vitro パッケー
ジングキット（アマシャム−ファルマシア社製）でラム
ダファージにパッケージングを行った。このようにし
て、開花後１３日目のダイズ登熟種子ｃＤＮＡライブラ
リーを作成した。

【００４２】実施例３〔完全長レグマチュレインｃＤＮ
Ａのクローニング〕実施例１で得たレグマチュレイン部分ｃＤＮＡを、ＰＣ
Ｒ法を用いて [³²Ｐ]-ｄＣＴＰで、Arahira M. and Fuk
azawa C., Plant Molecular Biology, 25, 597-605 (19
94) の方法に従いラベルした。これをプローブとして、
実施例２で作成した開花後１３日目のダイズの登熟種子
ライブラリーから、Arahira M. and Fukazawa C., Plan
t Molecular Biology,25, 597-605 (1994) の方法に従
って、プラークハイブリダイゼーションを実施した。そ
の結果、ｃＤＮＡ約１０万プラークから、数個の陽性プ
ラークが分離できた。

【００４３】陽性プラークを純化し、大腸菌に感染させ
てファージを増やした後に、ファージ粒子をＣｓＣｌス
テップワイズ密度勾配を用いた超遠心法により精製し、
ファージＤＮＡを精製した。精製したファージＤＮＡか
ら、ＢａｍＨＩでインサートを切り出し、アガロースゲ
ルから精製した後に、ｐＵＣ１９プラスミドベクターに
サブクローニングした。その後、実施例１と同様の方法
で、ＤＮＡシークエンスを行った。解析の結果、得られ
たｃＤＮＡは、レグマチュレインの全長を含んでおり、
配列表の配列番号１に示す塩基配列およびアミノ酸配列
を有していた。このｃＤＮＡは、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａ
ｎｋ等のデータベースとの比較により、全く新規な配列
であることが明らかとなった。

【００４４】本ｃＤＮＡの全長は、１０５５ｂｐ、うち
１４ｂｐがｐｏｌｙＡであった。アミノ酸数は、開始
メチオニンからの全体で２４１残基、シグナルペプチド
は、２１残基であり、成熟型タンパク質のＮ−末端配列
からクローニングされたｃＤＮＡから推定されるアミノ
酸のＣ−末端まで２２０残基であった。Ｃ−末端解析か
ら得られた結果およびイオンスプレーマススペクトロメ
トリーで得られた分子量の結果から、レグマチュレイン
は、Ｃ−末端側でプロセスを受けるプレプロ型のタンパ
ク質であることが明らかとなった。

【００４５】また、活性に関与する糖鎖の結合部位は１
ヵ所（配列表の配列番号１のアミノ酸配列の７１〜７８
番目）であった。結合部位の配列は、塩基性アミノ酸
（アルギニン）−疎水性アミノ酸（アラニン）−アスパ
ラギン（糖鎖）−疎水性アミノ酸（アラニン）−スレオ
ニン／セリン−疎水性アミノ酸（フェニルアラニン）−
酸性アミノ酸（アスパラギン酸）−システインであっ
た。

【００４６】実施例４〔レグマチュレイン遺伝子のクロ
ーニング〕実施例３で得られたｃＤＮＡの塩基配列を基に、２５ｍ
ｅｒと２６ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプライマーを合
成した（配列表の配列番号５および６参照）。ダイズの
芽生えからＣＴＡＢ法 [Fukazawa C. et al., Nucleic
Acid Research, 8117-8117 (1987)]により核ＤＮＡを調
製した。このＤＮＡ１０ｎｇを鋳型として、実施例１と
同じ条件でＰＣＲ法を行った。

【００４７】その結果、約３．１ｋｂｐの単一バンドが
得られた。ＴＡベクター [ｐＣＲ２．１](Invitrogen社
製) にサブクローニングした後、実施例３に記載した方
法でＤＮＡシークエンスを行った。解析の結果、クロー
ニングした遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に示
す通りであった。

【００４８】該遺伝子の全長は３０７７ｂｐで、４つの
イントロンにより５つのエクソンに分断されていた。各
イントロンの塩基数は、第１イントロンよりそれぞれ、
６７、７０５、１１１３、２００ｂｐであった。一方、
各エクソンの塩基数は、第１エクソンよりそれぞれ３２
１、６６、１４１、９３、４２０ｂｐであった（配列表
の配列番号２参照）。なお、活性に関与する糖鎖結合部
位は、第１エクソン上に存在していた。

【００４９】

【発明の効果】本発明のｃＤＮＡおよび遺伝子を利用す
ることにより、不安定なために精製が困難と考えられて
いたアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ（レグ
マチュレイン）の大量、かつ効率的な生産が可能とな
る。また、部位特異的変異法を利用してレグマチュレイ
ンの安定性の増大や酵素活性の改良等に寄与することが
できる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Food Research Institute, Ministry of Agricult ure, Forestry and Fisheries <120> cDNA and genomic sequence of asparagin-bond specific endoprotease <130> P100997K <160> 6 <210> 1 <211> 1055 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (85)...(810) <400> 1 ttggtggtag ctgttacgag tcagcaagag agaaatatct tgttgagttg atttctgatc 60 ccaaattgag tttgagtttc agcc atg gta tct gtt tct ctg ctc tta ttc 111 Met Val Ser Val Ser Leu Leu Leu Phe 1 5 cta tct ttc ttt gcc ttc ttt gca ccc tct gaa tct cac gac aaa gtc 159 Leu Ser Phe Phe Ala Phe Phe Ala Pro Ser Glu Ser His Asp Lys Val 10 15 20 25 tcg ttg gaa ttg tac tac gaa agc tta tgc ccc tac agc gcc aac ttc 207 Ser Leu Glu Leu Tyr Tyr Glu Ser Leu Cys Pro Tyr Ser Ala Asn Phe 30 35 40 atc gtg aat cac ctc cca aaa atc ttc acc cca gat ctt gcc cca atc 255 Ile Val Asn His Leu Pro Lys Ile Phe Thr Pro Asp Leu Ala Pro Ile 45 50 55 gtt cac ctc aaa ctc gtt cct tgg ggc aat gcc aaa ctc cgt gcc aac 303 Val His Leu Lys Leu Val Pro Trp Gly Asn Ala Lys Leu Arg Ala Asn 60 65 70 gcc acc ttt gac tgc cag cat ggg cca tat gag tgc ttg ctg aac aca 351 Ala Thr Phe Asp Cys Gln His Gly Pro Tyr Glu Cys Leu Leu Asn Thr 75 80 85 gtt gaa gcc tgt gca att cac atc tgg cct caa ctc agc aaa cat ttt 399 Val Glu Ala Cys Ala Ile His Ile Trp Pro Gln Leu Ser Lys His Phe 90 95 100 105 cct ttc atc tac tgt gtt gag gat ctg gtg ttt cag agt aag cgt gag 447 Pro Phe Ile Tyr Cys Val Glu Asp Leu Val Phe Gln Ser Lys Arg Glu 110 115 120 gaa tgg gaa tct tgt ttt gag aaa ctg gat ctt gat tcg gaa cct att 495 Glu Trp Glu Ser Cys Phe Glu Lys Leu Asp Leu Asp Ser Glu Pro Ile 125 130 135 aat cag tgt tat aat agt gaa cat gga aaa cag ttg gag cta caa tat 543 Asn Gln Cys Tyr Asn Ser Glu His Gly Lys Gln Leu Glu Leu Gln Tyr 140 145 150 gca gct gaa aca agt gct ctg gag cct cct cac aag tat gtt cct tgg 591 Ala Ala Glu Thr Ser Ala Leu Glu Pro Pro His Lys Tyr Val Pro Trp 155 160 165 gta gtt gtg gat gga gaa cca ctc tat gag gat tat gag aac ttc tta 639 Val Val Val Asp Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asp Tyr Glu Asn Phe Leu 170 175 180 185 agc tat ctt tgt aag gct tat aaa ggc act gtt aca ccc caa agt tgc 687 Ser Tyr Leu Cys Lys Ala Tyr Lys Gly Thr Val Thr Pro Gln Ser Cys 190 195 200 acc caa gca tca tac cta aga gaa gtg aat gca aag cct aag cat tcg 735 Thr Gln Ala Ser Tyr Leu Arg Glu Val Asn Ala Lys Pro Lys His Ser 205 210 215 gtt tgc tac aag gac agt ggg att atg cta aca tgg gaa aaa gtg agg 783 Val Cys Tyr Lys Asp Ser Gly Ile Met Leu Thr Trp Glu Lys Val Arg 220 225 230 tca acc att gca tca tgg atg cac tag atgaatcttg gcagtgcatt 830 Ser Thr Ile Ala Ser Trp Met His Stop 235 240 ttagatgtgc caatgctgca tttagtagca gtttgttcgt gttatcttgt gtgtagttgt 890gttgatccct ccaaaagtgc aaatagaact tgtgatgcac ataaaaccat atcgtactct 950 cataaaaaaa ataaaaccat gatgtgtatg tgtatgaggt acttaagtac aatatatata 1010 gagagagaaa aaaaaaagta agtgcaattc taaaaaaaaa aaaaa 1055 <210> 2 <211> 1055 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (85)-(321), (389)-(454), (1160)-(1300), (2414)-(2506), (2707)-(289 5) <400> 2 ttggtggtag ctgttacgag tcagcaagag agaaatatct tgttgagttg atttctgatc 60 ccaaattgag tttgagtttc agcc atg gta tct gtt tct ctg ctc tta ttc 111 Met Val Ser Val Ser Leu Leu Leu Phe 1 5 cta tct ttc ttt gcc ttc ttt gca ccc tct gaa tct cac gac aaa gtc 159 Leu Ser Phe Phe Ala Phe Phe Ala Pro Ser Glu Ser His Asp Lys Val 10 15 20 25 tcg ttg gaa ttg tac tac gaa agc tta tgc ccc tac agc gcc aac ttc 207 Ser Leu Glu Leu Tyr Tyr Glu Ser Leu Cys Pro Tyr Ser Ala Asn Phe 30 35 40 atc gtg aat cac ctc cca aaa atc ttc acc cca gat ctt gcc cca atc 255 Ile Val Asn His Leu Pro Lys Ile Phe Thr Pro Asp Leu Ala Pro Ile 45 50 55 gtt cac ctc aaa ctc gtt cct tgg ggc aat gcc aaa ctc cgt gcc aac 303 Val His Leu Lys Leu Val Pro Trp Gly Asn Ala Lys Leu Arg Ala Asn 60 65 70 gcc acc ttt gac tgc cag gtactctctt ctccaatctt atacacactc 351 Ala Thr Phe Asp Cys Gln 75 ttcacctatt tttatttaat tctgatgaca attgcag cat ggg cca tat gag tgc 406 His Gly Pro Tyr Glu Cys 80 85 ttg ctg aac aca gtt gaa gcc tgt gca att cac atc tgg cct caa ctc 454 Leu Leu Asn Thr Val Glu Ala Cys Ala Ile His Ile Trp Pro Gln Leu 90 95 100 gtaagtaaca attgctgtgc ctttgcccct ttctttcttt ctttcttttt tcttttttct 514 ttgatttggg atcagaactt aagaatgctt tttttattat tataatatta tgttattatt 574 acggattatt cagcatcgat tttttcagat gattaatttt tattggattt tgattaggtt 634 attttcttcc aattattttt tttatccaaa aaggagatga agttgttggt gaacttagga 694 gtgcctttat tattattgtt attatgttat tgttaaggag tattcattga ttttatagat 754 gattaatttt cattggatca cctttgatta ggttatttcc tttcaattat tttatttttt 814 atgaaaaagg agatgaagtc tggtgccacc tggacgaatg agttgttggt gaacttagaa 874 gtactattat aattatgata aattttgaaa aataaaaata aaaaaggagt acttttggtc 934 agtgtaacag tgctttagaa agatgctcta gcttgagcac tgtgcttaag ttgctataaa 994 ttcctgttat ccgagtttga ttcctatgga taaagttgtt attataaatt cttggcacct 1054 gagttcgagt tcaatttgta cggataaaaa agtttagcag tgctttgcat gtgtacctcg 1114 gtatctctgt tatgagtgtt ttatgtaaat cacactcttt tgcag agc aaa cat ttt 1171 Ser Lys His Phe 105 cct ttc atc tac tgt gtt gag gat ctg gtg ttt cag agt aag cgt gag 1219 Pro Phe Ile Tyr Cys Val Glu Asp Leu Val Phe Gln Ser Lys Arg Glu 110 115 120 gaa tgg gaa tct tgt ttt gag aaa ctg gat ctt gat tcg gaa cct att 1267 Glu Trp Glu Ser Cys Phe Glu Lys Leu Asp Leu Asp Ser Glu Pro Ile 125 130 135 aat cag tgt tat aat agt gaa cat gga aaa cag gttggtgttt ttctctgatt 1320 Asn Gln Cys Tyr Asn Ser Glu His Gly Lys Gln 140 145 tcgctcttgt ccttgcttga gctaccatgt tgtgattgag atagtattat gtacattagt 1380 ttagttttca tgccctccga gtgtaagtat gacttgtaaa ctagttacta caaagtattc 1440 taagatccta tttggataaa atttgttaca aatacttgca ggtgaagaaa ataagaagat 1500 aaaataaatt gagtttttct tccgtgagtt aaaatcaaat caacttcggc acctcggatt 1560 ttggaagagt taaatgagac tgagaacttt tatggaagtt tagtgttaag ttgattttag 1620 cttgtgagag aagctcaatt tattttactt tcttattttc tcatcttata agtgcttatg 1680 aaaaagttga tctaaacagg acttaaaatg tttttaacta acctttctct tctatggttg 1740 ttttttatga accttaaagt tatactaaca ttgctaaatg atacaagcta gtggaaagtt 1800 gggaattaga aaatttgaac agttatacag ttacagggtt ggtggtgact tctcaattcc 1860 ttatttaaac taatcttaag tgtcatagat aattgaatct tcttcgaggt gagatataat 1920 ccatgtcaac tagccgtaac tgggctctgt tatgtgaaac ttggatggta aggtctggta 1980 tttgttatgt gccggtctac tactttgctt ttattcttca agacaacaaa atgaaatagc 2040 taatgagaag taattttaac ttattccagc aattacttca aaaattggtc atgttcttca 2100 tttttacaaa actctaaagc agtgtaatat gatctacaaa ttaccttatt gtcatacatg 2160 attgctcttt gctacagata ctgccacacg atctaataga actgccaatt tgtagcttct 2220 gaacattcat ctttcttcaa gctaatttct caaaatcctt tttcaatctt gctgaatgtg 2280 aagactatct cttgatgaaa aacaaaacat atgacagatg tgctgaatac atcattgttt 2340 gactggaatt ttgtctcaag tagcatttac tatcttgttt tgatcattag taacatttac 2400 tatctttatg tag ttg gag cta caa tat gca gct gaa aca agt gct ctg 2449 Leu Glu Leu Gln Tyr Ala Ala Glu Thr Ser Ala Leu 150 155 160 gag cct cct cac aag tat gtt cct tgg gta gtt gtg gat gga gaa cca 2497 Glu Pro Pro His Lys Tyr Val Pro Trp Val Val Val Asp Gly Glu Pro 165 170 175 ctc tat gag gtca gttttgcaat tttatatcgg ctgaaccaag ccccattccc 2550 Leu Tyr Glu agtgtttgga attttcacta aaaaatactt ctaattaaca aataacttat aacactgaaa 2610 tttgtgtttt acatatgtaa gttgtgttat attaatgaat cgaattagaa gtgtacagga 2670 aattcaaaaa gaacttgcaa atttcttttg ctgcag gat tat gag aac ttc tta 2724 Asp Tyr Glu Asn Phe Leu 180 185 agc tat ctt tgt aag gct tat aaa ggc act gtt aca ccc caa agt tgc 2772 Ser Tyr Leu Cys Lys Ala Tyr Lys Gly Thr Val Thr Pro Gln Ser Cys 190 195 200 acc caa gca tca tac cta aga gaa gtg aat gca aag cct aag cat tcg 2820 Thr Gln Ala Ser Tyr Leu Arg Glu Val Asn Ala Lys Pro Lys His Ser 205 210 215 gtt tgc tac aag gac agt ggg att atg cta aca tgg gaa aaa gtg agg 2868 Val Cys Tyr Lys Asp Ser Gly Ile Met Leu Thr Trp Glu Lys Val Arg 220 225 230 tca acc att gca tca tgg atg cac tag atgaa tcttggcagt gcattttaga 2920 Ser Thr Ile Ala Ser Trp Met His Stop 235 240 tgtgccaatg ctgcatttag tagcagtttg ttcgtgttat cttgtgtgta gttgtgttga 2980 tccctccaaa agtgcaaata gaacttgtga tgcacataaa accatatcgt actctcataa 3040 aaaaaataaa accatgatgt gtatgtgtat gaggtac 3077 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on legumaturain amino acid sequence. <400> 3 gcnaayttya thgtnaayca 20 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificia Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on legumaturain amino acid sequence. <400> 4 tcnccrtcna cnacnaccca nggnacrtay tt 32 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificia Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on legumaturain cDNA sequence. <400> 5 ttggtggtag ctgttacgag tcagc 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificia Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on legumaturain cDNA sequence. <400> 6 gtacctcata cacatacaca tcatgg 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）の植物由来のア
スパラギン残基特異的エンドプロテアーゼをコードする
ｃＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列からなる
植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ（ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列に対し１
もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換または付加が
なされたアミノ酸配列からなり、かつ植物由来のアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性を有するタン
パク質
【請求項２】以下の（ａ）又は（ｂ）の植物由来のア
スパラギン残基特異的エンドプロテアーゼをコードする
遺伝子。（ａ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなる
植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ（ｂ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列に対し１
もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換または付加が
なされたアミノ酸配列からなり、かつ植物由来のアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性を有するタン
パク質