JP4357044B2 - クロロフィラーゼをコードするｄｎａ及びそれにより形質転換された植物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡ及びそれにより形質転換された植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クロロフィラーゼ（EC 3.1.1.14）は、加水分解によりクロロフィルをより水溶性のクロロフィリドとフィトールに分解する酵素であり、クロロフィル分解の第一段階を触媒する鍵酵素と考えられている。
【０００３】
クロロフィラーゼは、通常、組織中の存在量が少なく、また、疎水的なタンパク質であり、界面活性剤なしでは不安定であるため、その取り扱いが困難である。これまでに、種々の組織からの単離・精製の報告があり、1993年にT. Trebitshらのグループがクロロフィラーゼ活性の比較的高いオレンジの果皮から(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9441-9445 (1993))、1997年に本発明者らが、これもクロロフィラーゼ活性の高いシロザ葉から(Plant Cell Physiol. 38(9): 1026-1031 (1997))、それぞれクロロフィラーゼの精製を行い、そのＮ末端配列の決定について報告している。しかし、そのような状況にもかかわらず、クロロフィラーゼ遺伝子の単離は報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、そのＤＮＡで形質転換された植物を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シロザ葉から単離したクロロフィラーゼの主要な二つのイソ酵素のＮ末端配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、シロザｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行ったが、クロロフィラーゼ遺伝子を単離することはできなかった。そこで、すでに報告した精製方法をさらにスケールアップして、大量精製を試みたところ、すでに報告したイソ酵素に加えて、もう一つのマイナーなイソ酵素を均一に精製することに成功した。そして、このイソ酵素の部分内部アミノ酸配列の解析結果から得られた配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを作成し、このプローブを用いて、シロザ成葉から作成したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、相当する遺伝子の単離に成功した。さらに、決定された塩基配列に基づいて、データベースを検索したところ、２つの塩基配列が得られた。得られた３つの塩基配列にコードされるアミノ酸配列には保存領域が認められた。これらの塩基配列を有するＤＮＡを大腸菌で発現させたところ、生じたタンパク質にクロロフィラーゼ活性が認められた。以上の知見に基づき、本発明は完成された。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（８）のＤＮＡを提供する。
（１）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【０００７】
（２）下記の(a)または(b)のＤＮＡ。
(a)配列番号１に示す塩基配列のうち塩基番号１９〜１０５９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
(b)(a)のＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００８】
（３）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ（但し、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列を含むＤＮＡを除く）。
(a) 配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【０００９】
（４）下記の(a)のＤＮＡ。
(a)配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列を含むＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
（５）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ（但し、配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡを除く）。
(a) 配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
（６）下記の(a)のＤＮＡ。
(a)配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
（７）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a) 配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１３】
（８）下記の(a)または(b)のＤＮＡ。
(a)配列番号１９に示す塩基配列のうち塩基番号３１〜１０９２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
(b)(a)のＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
また、本発明は、配列番号２、４及び６に示す３つのアミノ酸配列において保存されているアミノ酸配列に基づいて作成されたプローブがストリンジェントな条件においてハイブリダイズし得るＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、上記ＤＮＡのいずれか、または、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列もしくは配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された植物を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
＜１＞クロロフィラーゼをコードするＤＮＡ
クロロフィラーゼをコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）としては、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００１７】
本発明ＤＮＡは、コードされるクロロフィラーゼの活性が損なわれない限り、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または付加を含むクロロフィラーゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、アミノ酸が変化しても、タンパク質の立体構造に大きな影響を与えない位置があること、および、イソロイシンとバリンあるいはセリンとスレオニンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。
【００１８】
また、上記のような欠失、置換または付加には、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantまたはvariant）も含まれる。
【００１９】
１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列は、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列全体に対し、通常には、６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有し、クロロフィラーゼ活性を有するものであってもよい。なお、本明細書において、相同性の値は、マキシマム・マッチング（J. Mol. Biol. 48: 443(1970)）により算出されるものである。
【００２０】
本発明ＤＮＡとして、より具体的には、配列番号１に示す塩基配列のうち塩基番号１９〜１０５９からなる塩基配列、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列、配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列、または、配列番号１９に示す塩基配列のうち塩基番号３１〜１０９２からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。なお、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列、および、配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列は、配列自体は知られていたが、その機能は未知であったものである。
【００２１】
本発明ＤＮＡは、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、上記に挙げた塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
【００２２】
ストリンジェントな条件としては、５５℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト／0.1%ＳＤＳ溶液中でハイブリダイゼーションを行い、５５℃において、２×ＳＳＣ／0.1%ＳＤＳで洗浄するという条件、および、この条件でハイブリダイズするＤＮＡ同士が特異的にハイブリダイズするような類似の条件が挙げられる。
【００２３】
本発明ＤＮＡは、本発明によりその塩基配列が明らかにされたので、その塩基配列に基づき作成したプライマーを用い、シロザ、シロイヌナズナなどの植物から調製されたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことなどにより得ることができる。
【００２４】
適切なプライマーの設計は、市販の塩基配列解析ソフトウェアなどを利用すれば一層容易に行うことができる。植物体からのｃＤＮＡの調製は公知の方法が使用できる。ＰＣＲの条件は、慣用の条件でよい。配列番号２及び２０に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得る場合には、シロザ、配列番号４及び６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得る場合には、シロイヌナズナからｃＤＮＡを調製することが好ましい。
【００２５】
また、本発明ＤＮＡは、その塩基配列に基づき合成により得ることもできる。
【００２６】
配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むように、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びクロロフィラーゼをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のクロロフィラーゼ活性を調べることにより、上記改変されたＤＮＡが得られる。
【００２７】
クロロフィラーゼ活性の測定方法は特に限定されないが、例えば、Plant Cell Physiol. 38: 1026-1031(1997)に記載された方法が挙げられる。具体的には、以下の方法が挙げられる。25 mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)-NaOH (pH 7.0)、50μM ラウリルジメチルアミンN-オキシド及び50μM クロロフィル（250μMのクロロフィルの無水アセトン溶液を反応混合液に20%(v/v)の最終アセトン濃度で用いる）並びに酵素溶液を含む1 mlの反応混合液を、30℃で10分間インキュベートし、3 mlのアセトン／n-ヘキサン（１：２(v/v)）及び0.1 mlの2 M Tris-HCl(pH 9.0)を添加して反応を停止するとともに、クロロフィリドをイオン化する。次いで、反応混合液をよく振り、酵素反応で生成したクロロフィリドが下層の水層に分配されるようにする。水層における667 nmでの吸光度（クロロフィリドａの吸収）の増加を測定し、酵素活性を算出する。改変ＤＮＡのコードするタンパク質のクロロフィラーゼ活性は、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のクロロフィラーゼ活性に対して、通常には１０％以上、好ましくは４０％以上であればよい。
【００２８】
また、変異（上述の天然に存在する変異を含む）を有するクロロフィラーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９〜１０５９からなる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、上記改変ＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であり、上述のストリンジェントな条件と同一でよい。
【００２９】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎクロロフィラーゼ活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００３０】
本発明によって明らかにされたクロロフィラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸配列には保存されている部分がある（図１）。従って、この部分に基づいてプローブを作成し、これを用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡが容易に取得されると予測される。従って、本発明は、配列番号２、４及び６に示す３つのアミノ酸配列において保存されているアミノ酸配列に基づいて作成されたプローブがストリンジェントな条件においてハイブリダイズし得るＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００３１】
保存されたアミノ酸配列は、配列番号２０に示すアミノ酸配列においても保存されているものであることが好ましい。
【００３２】
保存されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２においてアミノ酸番号１６０〜１７３、特にアミノ酸番号１６０〜１６６のアミノ酸配列が挙げられる。プローブの設計は、市販の塩基配列解析ソフトウェアなどを利用して行うことができる。ハイブリダイゼーションの手法は公知のものでよく、ストリンジェントな条件としては、３７℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液中でハイブリダイゼーションを行い、４０℃において、６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄するという条件、または、これと同等な条件が挙げられる。
【００３３】
＜２＞クロロフィラーゼをコードするＤＮＡにより形質転換された植物
形質転換の方法は、植物に適用可能であれば特に制限されず、公知の方法を用いることができる（例えば、C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316: 1194-1199(1993)参照）。
【００３４】
植物としては、シロイヌナズナ、タバコ、トマト等が挙げられる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
【００３６】
【実施例１】
シロザのクロロフィラーゼをコードするＤＮＡの取得
（１）シロザ由来の０型クロロフィラーゼの精製及び部分アミノ酸配列の決定
Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)に記載されたクロロフィラーゼの精製方法を、スケールアップする他は同様に行った。すなわち、5000 gのシロザ(Chenopodium album)凍結葉から精製を開始した。1000 gのアセトン抽出物（アセトン粉末）が得られた。クロマトグラフィーは、分離能を確保するため、アセトン抽出物を分けて、上記文献に記載された方法に近い以下の条件（カラムの大きさ及び流速）で繰り返し行った。Toyopearl HW-55(東ソー社製)カラム（5×20 cm、400 ml/h）、ConA Sepharose(ファルマシアバイオテク社製)カラム（1×10 cm、6 ml/h）、ヘパリンアフィニティーカラム(バイオラッドラボラトリーズ社製)（1×5 cm、8 ml/h）、Mono Q HR 5/5カラム(ファルマシアバイオテク社製)（0.5×5 cm、18 ml/h）、Superdex 200 HR 10/30カラム(ファルマシアバイオテク社製)（1×30 cm、18 ml/h）。
【００３７】
得られた精製画分を、Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)に記載されたようにして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に付し、次いでＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。精製画分に含まれる３つのクロロフィラーゼの中、Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)においてマイナー成分とされたクロロフィラーゼ（０型）をＰＶＤＦ膜上で、直接、アクロモバクター(Acromobacter)プロテアーゼＩにより、Electorophoresis 13: 142-147(1992)に記載の条件で消化した。生じたペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣで分離し、アミノ酸配列を気相シークエンサー（モデルPPSQ23、島津製作所製）を用いて決定した。
【００３８】
決定されたアミノ酸配列は以下の通りであった。
【００３９】
【表１】
ペプチド名 アミノ酸配列 配列番号
ＡＰ−１ (K)LAISGHSRGGK ７
ＡＰ−２ (K)EXSSHFV ８
ＡＰ−３ (K)ITDVFHK ９
ＡＰ−４ (K)GNFQVTNNPIR １０
【００４０】
（２）シロザ成葉から作成したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
シロザの成葉から、グアニジンイソチオシアネート法（Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)）により全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡからpoly(A)+を、oligo(dT)-Latex（宝酒造製）を用いて単離した。単離されたpoly(A)+から、ZAP-cDNA合成キット（ストラタジーン社製）を用いて製造者の指示書に従い、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４１】
上記（１）で決定されたアミノ酸配列に基づいて種々の縮重オリゴＤＮＡプローブを合成した。これらを用いて上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、5'-ACRAARTGISWISWRTTYTCYT-3'（IUPACコード、配列番号１１）を用いたときに陽性クローンが得られた。このプローブはアミノ酸配列KENSSHFV（配列番号１２）に対応する。
【００４２】
スクリーニングは以下の条件で行われた。ハイブリダイゼーションは、３７℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液で行った。メンブランは、４０℃において、６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。検出はオートラジオグラフィーで行った。
【００４３】
陽性λファージクローンから、pBluescript（ストラタジーン社製）を用いてin vivo切り出し法により、挿入物を有するpBluescriptファージミドを得た。
【００４４】
塩基配列の決定は、サーモシークエナーゼサイクルシークエンシングキット（Thermo Sequenase cycle sequencing kit、アマーシャムファルマシアバイオテク社製）及びＤＮＡシークエンサー（モデル4000L、LI-COR製）を用いて行った。
【００４５】
得られた塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。アミノ酸配列より、セリンを活性部位にもつリパーゼの活性部位モチーフ(Lipase motif)及びｐループ(p-loop)が存在することが分かった（図１）。また、Ｎ−末端シグナル配列は、小胞体移行型であった。
【００４６】
【実施例２】
他の植物のクロロフィラーゼをコードするＤＮＡの取得
（１）データベース検索
実施例１で決定された塩基配列に基づき、データベース（DDBJ、EMBL等）を検索した。この結果、アラビドプシス由来の塩基配列２件が検索された（AF021244及びAF005802）。これらの塩基配列の機能は不明であった。
【００４７】
（２）ｃＤＮＡの単離
これらの塩基配列を有するＤＮＡをシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから単離した。シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーは、連続光下で４〜５週間生育したシロイヌナズナのロゼット葉から、実施例１（２）のシロザ成葉の場合と同様にして構築した。検索された塩基配列に基づいてＰＣＲで作成したプローブを用いて、以下の条件でスクリーニングを行った。すなわち、ハイブリダイゼーションは、65℃において100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ／５×デンハルト／0.1%ＳＤＳ中で行い、メンブレンは65℃において０．２×ＳＳＣ／0.1%ＳＤＳで洗浄した。
【００４８】
陽性クローンについて、実施例１（２）と同様にして、塩基配列を決定した。決定された塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３及び４並びに配列番号５及び６に示す。
【００４９】
二つのイソ酵素は、そのＮ−末端のシグナル配列に顕著な差が見られた。一方は典型的な移行配列をもっておらず、もう一方は典型的な葉緑体型移行配列をもっている。また、シロイヌナズナの根を10μMのジャスモン酸メチルに暴露するジャスモン酸メチル処理に対する応答において顕著な差が見られた。前者は、ジャスモン酸メチルに素早く応答しロゼット葉中のｍＲＮＡレベルの上昇が見られたが、後者はジャスモン酸メチルに全く応答しなかった。葉の老化やクロロフィル分解を促進する成長制御物質としても知られるジャスモン酸メチルへの応答の違いは、クロロフィル分解時にイソ酵素制御が異なっていることを示している。
【００５０】
（３）アミノ酸配列の比較
シロザ由来のクロロフィラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）及びシロイヌナズナ由来の二つのクロロフィラーゼのアミノ酸配列（配列番号４及び６）を比較した結果を図１に示す。配列番号２においてアミノ酸番号１６０〜１７３に１４アミノ酸中１２アミノ酸が一致する保存された配列が認められた。特にアミノ酸番号１６０〜１６６は、連続する７つのアミノ酸が保存されている。
【００５１】
【実施例３】
クロロフィラーゼをコードするＤＮＡの大腸菌での発現
実施例１及び２で得られた、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡを、pET発現系（ノバゲン社製）を用いて大腸菌(Escherichia coli)で過剰発現させた。
【００５２】
クロロフィラーゼ発現プラスミドはＰＣＲにより構築した。フォワードプライマーは、5'端に新たなＮｄｅＩ制限部位を含むように設計され、リバースプライマーは、終止コドン及び新たなＸｈｏＩ制限部位を含むように設計された。具体的には以下の通りである。
【００５３】
【表２】
シロザクロロフィラーゼ(C. album Chlase)
5'-CATATGTCTGAAAAAATTACTGATGTTTTCCATAAG-3'（配列番号１３）
5'-CTCGAGTTAAAGTTGAGCATAAGTTGTTGCAAAC-3' （配列番号１４）
シロイヌナズナクロロフィラーゼ１(A. thaliana Chlase1)
5'-CATATGGCGGCGATAGAGGACAG-3' （配列番号１５）
5'-CTCGAGCTAGACGAAGATACCAGAAGCTTCTTC-3' （配列番号１６）
シロイヌナズナクロロフィラーゼ２(A. theliana Chlase 2)
5'-CATATGTCCTCTTCTTCATCAAGAAAC-3' （配列番号１７）
5'-CTCGAGTTACATGATAACCTCAAACTCTTG-3' （配列番号１８）
【００５４】
テンプレートとしてはpBluescript SK-プラスミドにクローニングした全長ｃＤＮＡを用いた。その他のＰＣＲの条件は製造者の指示書に従った。
【００５５】
ＰＣＲ産物を配列決定し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素により消化した。消化断片をＴ７ポリメラーゼ発現ベクターpET-24bにサブクローニングした。E. coli BL21(DE3)株をこれらのプラスミドで形質転換し、発現に用いた。対照のE. coliは、挿入物を持たないpET-24bで形質転換した。形質転換体を、50μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、37℃において、ＯＤ600が適切な値になるまで培養した。組換えクロロフィラーゼを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加（最終濃度１ｍＭ）により誘導した。発現を２０℃で１６時間行わせ、４℃で１００００×ｇ、１０分間の遠心分離により細胞を回収した。細胞を50 mM MOPS緩衝液(pH 7.8)に懸濁し、繰り返し超音波処理し、抽出物の一部をアッセイした。
【００５６】
クロロフィラーゼ活性は、Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)に記載のように、相分離した水性アセトン層におけるクロロフィリドａの生成をＡ667の増加により測定して決定した。
【００５７】
この結果、クロロフィラーゼ活性がＩＰＴＧで誘導した細胞で確認された（図２）。
【００５８】
【実施例４】
全長ｃＤＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング上記実施例１（２）で取得されたｃＤＮＡ全長をプローブとして、上記のシロザ成葉ｃＤＮＡライブラリーを、以下の条件のハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、６５℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト／0.1%ＳＤＳ溶液で行った。メンブランは、６５℃において、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。検出以降の操作は上記実施例１（２）と同様に行った。
【００５９】
この結果、配列番号１の塩基配列と異なる塩基配列を有するクローンがさらに検出された。その塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号１９及び２０に示す。
【００６０】
得られたクロロフィラーゼをコードするＤＮＡを用いて、実施例３と同様に大腸菌で発現させた。なお、用いたプライマーは以下の通りであった。
【００６１】
【表３】
5'-CATATGTCTGACAATTCTTCTTTTGTAATCGG-3' （配列番号２１）
5'-CTCGAGTTAAGCTTGAGCATAACTTGCTACAAA-3' （配列番号２２）
【００６２】
この結果、大腸菌で発現させたタンパク質のクロロフィラーゼ活性は、155 nmol/分/mgタンパク質で、実施例１で得られたものに比べ、約半分であった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡが提供される。このＤＮＡの導入により形質転換された植物を作出することによって、生体内でのクロロフィラーゼの機能を分子生物学レベルで解明することが可能になる。また、農産物の脱緑などを制御した商品価値の高い形質転換作物を作出できる可能性がある。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 シロザ(C. album)由来のクロロフィラーゼ(Chlase)のアミノ酸配列及びシロイヌナズナ(A. thaliana)由来の二つのクロロフィラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】 シロザ由来のクロロフィラーゼ及びシロイヌナズナ由来の二つのクロロフィラーゼの大腸菌における発現の結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡ及びそれにより形質転換された植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クロロフィラーゼ（EC 3.1.1.14）は、加水分解によりクロロフィルをより水溶性のクロロフィリドとフィトールに分解する酵素であり、クロロフィル分解の第一段階を触媒する鍵酵素と考えられている。
【０００３】
クロロフィラーゼは、通常、組織中の存在量が少なく、また、疎水的なタンパク質であり、界面活性剤なしでは不安定であるため、その取り扱いが困難である。これまでに、種々の組織からの単離・精製の報告があり、1993年にT. Trebitshらのグループがクロロフィラーゼ活性の比較的高いオレンジの果皮から(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9441-9445 (1993))、1997年に本発明者らが、これもクロロフィラーゼ活性の高いシロザ葉から(Plant Cell Physiol. 38(9): 1026-1031 (1997))、それぞれクロロフィラーゼの精製を行い、そのＮ末端配列の決定について報告している。しかし、そのような状況にもかかわらず、クロロフィラーゼ遺伝子の単離は報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、そのＤＮＡで形質転換された植物を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シロザ葉から単離したクロロフィラーゼの主要な二つのイソ酵素のＮ末端配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、シロザｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行ったが、クロロフィラーゼ遺伝子を単離することはできなかった。そこで、すでに報告した精製方法をさらにスケールアップして、大量精製を試みたところ、すでに報告したイソ酵素に加えて、もう一つのマイナーなイソ酵素を均一に精製することに成功した。そして、このイソ酵素の部分内部アミノ酸配列の解析結果から得られた配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを作成し、このプローブを用いて、シロザ成葉から作成したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、相当する遺伝子の単離に成功した。さらに、決定された塩基配列に基づいて、データベースを検索したところ、２つの塩基配列が得られた。得られた３つの塩基配列にコードされるアミノ酸配列には保存領域が認められた。これらの塩基配列を有するＤＮＡを大腸菌で発現させたところ、生じたタンパク質にクロロフィラーゼ活性が認められた。以上の知見に基づき、本発明は完成された。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（８）のＤＮＡを提供する。
（１）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【０００７】
（２）下記の(a)または(b)のＤＮＡ。
(a)配列番号１に示す塩基配列のうち塩基番号１９〜１０５９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
(b)(a)のＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００８】
（３）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ（但し、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列を含むＤＮＡを除く）。
(a) 配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【０００９】
（４）下記の(a)のＤＮＡ。
(a)配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列を含むＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
（５）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ（但し、配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡを除く）。
(a) 配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
（６）下記の(a)のＤＮＡ。
(a)配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
（７）下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a) 配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１３】
（８）下記の(a)または(b)のＤＮＡ。
(a)配列番号１９に示す塩基配列のうち塩基番号３１〜１０９２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
(b)(a)のＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
また、本発明は、配列番号２、４及び６に示す３つのアミノ酸配列において保存されているアミノ酸配列に基づいて作成されたプローブがストリンジェントな条件においてハイブリダイズし得るＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、上記ＤＮＡのいずれか、または、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列もしくは配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された植物を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
＜１＞クロロフィラーゼをコードするＤＮＡ
クロロフィラーゼをコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）としては、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００１７】
本発明ＤＮＡは、コードされるクロロフィラーゼの活性が損なわれない限り、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または付加を含むクロロフィラーゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、アミノ酸が変化しても、タンパク質の立体構造に大きな影響を与えない位置があること、および、イソロイシンとバリンあるいはセリンとスレオニンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。
【００１８】
また、上記のような欠失、置換または付加には、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantまたはvariant）も含まれる。
【００１９】
１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列は、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列全体に対し、通常には、６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有し、クロロフィラーゼ活性を有するものであってもよい。なお、本明細書において、相同性の値は、マキシマム・マッチング（J. Mol. Biol. 48: 443(1970)）により算出されるものである。
【００２０】
本発明ＤＮＡとして、より具体的には、配列番号１に示す塩基配列のうち塩基番号１９〜１０５９からなる塩基配列、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列、配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列、または、配列番号１９に示す塩基配列のうち塩基番号３１〜１０９２からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。なお、配列番号３に示す塩基配列のうち塩基番号４９〜１０２０からなる塩基配列、および、配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列は、配列自体は知られていたが、その機能は未知であったものである。
【００２１】
本発明ＤＮＡは、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、上記に挙げた塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
【００２２】
ストリンジェントな条件としては、５５℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト／0.1%ＳＤＳ溶液中でハイブリダイゼーションを行い、５５℃において、２×ＳＳＣ／0.1%ＳＤＳで洗浄するという条件、および、この条件でハイブリダイズするＤＮＡ同士が特異的にハイブリダイズするような類似の条件が挙げられる。
【００２３】
本発明ＤＮＡは、本発明によりその塩基配列が明らかにされたので、その塩基配列に基づき作成したプライマーを用い、シロザ、シロイヌナズナなどの植物から調製されたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことなどにより得ることができる。
【００２４】
適切なプライマーの設計は、市販の塩基配列解析ソフトウェアなどを利用すれば一層容易に行うことができる。植物体からのｃＤＮＡの調製は公知の方法が使用できる。ＰＣＲの条件は、慣用の条件でよい。配列番号２及び２０に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得る場合には、シロザ、配列番号４及び６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得る場合には、シロイヌナズナからｃＤＮＡを調製することが好ましい。
【００２５】
また、本発明ＤＮＡは、その塩基配列に基づき合成により得ることもできる。
【００２６】
配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むように、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びクロロフィラーゼをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のクロロフィラーゼ活性を調べることにより、上記改変されたＤＮＡが得られる。
【００２７】
クロロフィラーゼ活性の測定方法は特に限定されないが、例えば、Plant Cell Physiol. 38: 1026-1031(1997)に記載された方法が挙げられる。具体的には、以下の方法が挙げられる。25 mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)-NaOH (pH 7.0)、50μM ラウリルジメチルアミンN-オキシド及び50μM クロロフィル（250μMのクロロフィルの無水アセトン溶液を反応混合液に20%(v/v)の最終アセトン濃度で用いる）並びに酵素溶液を含む1 mlの反応混合液を、30℃で10分間インキュベートし、3 mlのアセトン／n-ヘキサン（１：２(v/v)）及び0.1 mlの2 M Tris-HCl(pH 9.0)を添加して反応を停止するとともに、クロロフィリドをイオン化する。次いで、反応混合液をよく振り、酵素反応で生成したクロロフィリドが下層の水層に分配されるようにする。水層における667 nmでの吸光度（クロロフィリドａの吸収）の増加を測定し、酵素活性を算出する。改変ＤＮＡのコードするタンパク質のクロロフィラーゼ活性は、配列番号２、４、６または２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のクロロフィラーゼ活性に対して、通常には１０％以上、好ましくは４０％以上であればよい。
【００２８】
また、変異（上述の天然に存在する変異を含む）を有するクロロフィラーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９〜１０５９からなる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、上記改変ＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件であり、上述のストリンジェントな条件と同一でよい。
【００２９】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎクロロフィラーゼ活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００３０】
本発明によって明らかにされたクロロフィラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸配列には保存されている部分がある（図１）。従って、この部分に基づいてプローブを作成し、これを用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡが容易に取得されると予測される。従って、本発明は、配列番号２、４及び６に示す３つのアミノ酸配列において保存されているアミノ酸配列に基づいて作成されたプローブがストリンジェントな条件においてハイブリダイズし得るＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００３１】
保存されたアミノ酸配列は、配列番号２０に示すアミノ酸配列においても保存されているものであることが好ましい。
【００３２】
保存されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２においてアミノ酸番号１６０〜１７３、特にアミノ酸番号１６０〜１６６のアミノ酸配列が挙げられる。プローブの設計は、市販の塩基配列解析ソフトウェアなどを利用して行うことができる。ハイブリダイゼーションの手法は公知のものでよく、ストリンジェントな条件としては、３７℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液中でハイブリダイゼーションを行い、４０℃において、６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄するという条件、または、これと同等な条件が挙げられる。
【００３３】
＜２＞クロロフィラーゼをコードするＤＮＡにより形質転換された植物
形質転換の方法は、植物に適用可能であれば特に制限されず、公知の方法を用いることができる（例えば、C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316: 1194-1199(1993)参照）。
【００３４】
植物としては、シロイヌナズナ、タバコ、トマト等が挙げられる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
【００３６】
【実施例１】
シロザのクロロフィラーゼをコードするＤＮＡの取得
（１）シロザ由来の０型クロロフィラーゼの精製及び部分アミノ酸配列の決定
Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)に記載されたクロロフィラーゼの精製方法を、スケールアップする他は同様に行った。すなわち、5000 gのシロザ(Chenopodium album)凍結葉から精製を開始した。1000 gのアセトン抽出物（アセトン粉末）が得られた。クロマトグラフィーは、分離能を確保するため、アセトン抽出物を分けて、上記文献に記載された方法に近い以下の条件（カラムの大きさ及び流速）で繰り返し行った。Toyopearl HW-55(東ソー社製)カラム（5×20 cm、400 ml/h）、ConA Sepharose(ファルマシアバイオテク社製)カラム（1×10 cm、6 ml/h）、ヘパリンアフィニティーカラム(バイオラッドラボラトリーズ社製)（1×5 cm、8 ml/h）、Mono Q HR 5/5カラム(ファルマシアバイオテク社製)（0.5×5 cm、18 ml/h）、Superdex 200 HR 10/30カラム(ファルマシアバイオテク社製)（1×30 cm、18 ml/h）。
【００３７】
得られた精製画分を、Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)に記載されたようにして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に付し、次いでＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。精製画分に含まれる３つのクロロフィラーゼの中、Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)においてマイナー成分とされたクロロフィラーゼ（０型）をＰＶＤＦ膜上で、直接、アクロモバクター(Acromobacter)プロテアーゼＩにより、Electorophoresis 13: 142-147(1992)に記載の条件で消化した。生じたペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣで分離し、アミノ酸配列を気相シークエンサー（モデルPPSQ23、島津製作所製）を用いて決定した。
【００３８】
決定されたアミノ酸配列は以下の通りであった。
【００３９】
【表１】
ペプチド名 アミノ酸配列 配列番号
ＡＰ−１ (K)LAISGHSRGGK ７
ＡＰ−２ (K)EXSSHFV ８
ＡＰ−３ (K)ITDVFHK ９
ＡＰ−４ (K)GNFQVTNNPIR １０
【００４０】
（２）シロザ成葉から作成したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
シロザの成葉から、グアニジンイソチオシアネート法（Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)）により全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡからpoly(A)+を、oligo(dT)-Latex（宝酒造製）を用いて単離した。単離されたpoly(A)+から、ZAP-cDNA合成キット（ストラタジーン社製）を用いて製造者の指示書に従い、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４１】
上記（１）で決定されたアミノ酸配列に基づいて種々の縮重オリゴＤＮＡプローブを合成した。これらを用いて上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたところ、5'-ACRAARTGISWISWRTTYTCYT-3'（IUPACコード、配列番号１１）を用いたときに陽性クローンが得られた。このプローブはアミノ酸配列KENSSHFV（配列番号１２）に対応する。
【００４２】
スクリーニングは以下の条件で行われた。ハイブリダイゼーションは、３７℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液で行った。メンブランは、４０℃において、６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。検出はオートラジオグラフィーで行った。
【００４３】
陽性λファージクローンから、pBluescript（ストラタジーン社製）を用いてin vivo切り出し法により、挿入物を有するpBluescriptファージミドを得た。
【００４４】
塩基配列の決定は、サーモシークエナーゼサイクルシークエンシングキット（Thermo Sequenase cycle sequencing kit、アマーシャムファルマシアバイオテク社製）及びＤＮＡシークエンサー（モデル4000L、LI-COR製）を用いて行った。
【００４５】
得られた塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。アミノ酸配列より、セリンを活性部位にもつリパーゼの活性部位モチーフ(Lipase motif)及びｐループ(p-loop)が存在することが分かった（図１）。また、Ｎ−末端シグナル配列は、小胞体移行型であった。
【００４６】
【実施例２】
他の植物のクロロフィラーゼをコードするＤＮＡの取得
（１）データベース検索
実施例１で決定された塩基配列に基づき、データベース（DDBJ、EMBL等）を検索した。この結果、アラビドプシス由来の塩基配列２件が検索された（AF021244及びAF005802）。これらの塩基配列の機能は不明であった。
【００４７】
（２）ｃＤＮＡの単離
これらの塩基配列を有するＤＮＡをシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから単離した。シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーは、連続光下で４〜５週間生育したシロイヌナズナのロゼット葉から、実施例１（２）のシロザ成葉の場合と同様にして構築した。検索された塩基配列に基づいてＰＣＲで作成したプローブを用いて、以下の条件でスクリーニングを行った。すなわち、ハイブリダイゼーションは、65℃において100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ／５×デンハルト／0.1%ＳＤＳ中で行い、メンブレンは65℃において０．２×ＳＳＣ／0.1%ＳＤＳで洗浄した。
【００４８】
陽性クローンについて、実施例１（２）と同様にして、塩基配列を決定した。決定された塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３及び４並びに配列番号５及び６に示す。
【００４９】
二つのイソ酵素は、そのＮ−末端のシグナル配列に顕著な差が見られた。一方は典型的な移行配列をもっておらず、もう一方は典型的な葉緑体型移行配列をもっている。また、シロイヌナズナの根を10μMのジャスモン酸メチルに暴露するジャスモン酸メチル処理に対する応答において顕著な差が見られた。前者は、ジャスモン酸メチルに素早く応答しロゼット葉中のｍＲＮＡレベルの上昇が見られたが、後者はジャスモン酸メチルに全く応答しなかった。葉の老化やクロロフィル分解を促進する成長制御物質としても知られるジャスモン酸メチルへの応答の違いは、クロロフィル分解時にイソ酵素制御が異なっていることを示している。
【００５０】
（３）アミノ酸配列の比較
シロザ由来のクロロフィラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）及びシロイヌナズナ由来の二つのクロロフィラーゼのアミノ酸配列（配列番号４及び６）を比較した結果を図１に示す。配列番号２においてアミノ酸番号１６０〜１７３に１４アミノ酸中１２アミノ酸が一致する保存された配列が認められた。特にアミノ酸番号１６０〜１６６は、連続する７つのアミノ酸が保存されている。
【００５１】
【実施例３】
クロロフィラーゼをコードするＤＮＡの大腸菌での発現
実施例１及び２で得られた、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡを、pET発現系（ノバゲン社製）を用いて大腸菌(Escherichia coli)で過剰発現させた。
【００５２】
クロロフィラーゼ発現プラスミドはＰＣＲにより構築した。フォワードプライマーは、5'端に新たなＮｄｅＩ制限部位を含むように設計され、リバースプライマーは、終止コドン及び新たなＸｈｏＩ制限部位を含むように設計された。具体的には以下の通りである。
【００５３】
【表２】
シロザクロロフィラーゼ(C. album Chlase)
5'-CATATGTCTGAAAAAATTACTGATGTTTTCCATAAG-3'（配列番号１３）
5'-CTCGAGTTAAAGTTGAGCATAAGTTGTTGCAAAC-3' （配列番号１４）
シロイヌナズナクロロフィラーゼ１(A. thaliana Chlase1)
5'-CATATGGCGGCGATAGAGGACAG-3' （配列番号１５）
5'-CTCGAGCTAGACGAAGATACCAGAAGCTTCTTC-3' （配列番号１６）
シロイヌナズナクロロフィラーゼ２(A. theliana Chlase 2)
5'-CATATGTCCTCTTCTTCATCAAGAAAC-3' （配列番号１７）
5'-CTCGAGTTACATGATAACCTCAAACTCTTG-3' （配列番号１８）
【００５４】
テンプレートとしてはpBluescript SK-プラスミドにクローニングした全長ｃＤＮＡを用いた。その他のＰＣＲの条件は製造者の指示書に従った。
【００５５】
ＰＣＲ産物を配列決定し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素により消化した。消化断片をＴ７ポリメラーゼ発現ベクターpET-24bにサブクローニングした。E. coli BL21(DE3)株をこれらのプラスミドで形質転換し、発現に用いた。対照のE. coliは、挿入物を持たないpET-24bで形質転換した。形質転換体を、50μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、37℃において、ＯＤ600が適切な値になるまで培養した。組換えクロロフィラーゼを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加（最終濃度１ｍＭ）により誘導した。発現を２０℃で１６時間行わせ、４℃で１００００×ｇ、１０分間の遠心分離により細胞を回収した。細胞を50 mM MOPS緩衝液(pH 7.8)に懸濁し、繰り返し超音波処理し、抽出物の一部をアッセイした。
【００５６】
クロロフィラーゼ活性は、Plant Cell Pysiol. 38(9): 1026-1031(1997)に記載のように、相分離した水性アセトン層におけるクロロフィリドａの生成をＡ667の増加により測定して決定した。
【００５７】
この結果、クロロフィラーゼ活性がＩＰＴＧで誘導した細胞で確認された（図２）。
【００５８】
【実施例４】
全長ｃＤＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング上記実施例１（２）で取得されたｃＤＮＡ全長をプローブとして、上記のシロザ成葉ｃＤＮＡライブラリーを、以下の条件のハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、６５℃において、100μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含む６×標準クエン酸食塩水（ＳＳＣ）／５×デンハルト／0.1%ＳＤＳ溶液で行った。メンブランは、６５℃において、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。検出以降の操作は上記実施例１（２）と同様に行った。
【００５９】
この結果、配列番号１の塩基配列と異なる塩基配列を有するクローンがさらに検出された。その塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号１９及び２０に示す。
【００６０】
得られたクロロフィラーゼをコードするＤＮＡを用いて、実施例３と同様に大腸菌で発現させた。なお、用いたプライマーは以下の通りであった。
【００６１】
【表３】
5'-CATATGTCTGACAATTCTTCTTTTGTAATCGG-3' （配列番号２１）
5'-CTCGAGTTAAGCTTGAGCATAACTTGCTACAAA-3' （配列番号２２）
【００６２】
この結果、大腸菌で発現させたタンパク質のクロロフィラーゼ活性は、155 nmol/分/mgタンパク質で、実施例１で得られたものに比べ、約半分であった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、クロロフィラーゼをコードするＤＮＡが提供される。このＤＮＡの導入により形質転換された植物を作出することによって、生体内でのクロロフィラーゼの機能を分子生物学レベルで解明することが可能になる。また、農産物の脱緑などを制御した商品価値の高い形質転換作物を作出できる可能性がある。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 シロザ(C. album)由来のクロロフィラーゼ(Chlase)のアミノ酸配列及びシロイヌナズナ(A. thaliana)由来の二つのクロロフィラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】 シロザ由来のクロロフィラーゼ及びシロイヌナズナ由来の二つのクロロフィラーゼの大腸菌における発現の結果を示す。
Claims (7)
- 下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。 - 下記の(a)または(b)のＤＮＡ。
(a) 配列番号１に示す塩基配列のうち塩基番号１９〜１０５９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
(b) (a)のＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ（但し、配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡを除く）。
(a) 配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。 - 下記の(a)のＤＮＡ。
(a) 配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 下記(a)または(b)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a) 配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b) 前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質。 - 下記の(a)または(b)のＤＮＡ。
(a) 配列番号１９に示す塩基配列のうち塩基番号３１〜１０９２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
(b) (a)のＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、クロロフィラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または配列番号５に示す塩基配列のうち塩基番号４３〜９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡにより形質転換された植物。
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