JP2000007699A - ウズラのｈ１ヒストン及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウズラのＨ１ヒストン及びそれをコードする
遺伝子を提供する。 【解決手段】 ウズラの染色体ＤＮＡライブラリーか
ら、Ｈ１ヒストン遺伝子間で保存されている塩基酸配列
に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲによっ
て、Ｈ１ヒストン遺伝子を増幅し、配列表配列番号２に
示すアミノ酸配列を有するＤＮＡを得、同ＤＮＡを発現
させてＨ１ヒストンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウズラのＨ１ヒス
トン及びそれをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｈ１ヒストンは、動物、植物、微生物な
どのあらゆる真核生物に広く存在するタンパクであり、
Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４と呼ばれる４種のヒストン
と共にクロマチン繊維の形成に寄与するタンパクとして
認識され、真核生物が細胞核内のＤＮＡを緻密にまとめ
る役割があると考えられている。

【０００３】また、Ｈ１ヒストンは、抗菌活性を有する
ことも報告されており（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．第
６１巻、３０３８頁−３０４６頁、１９９３年）、家禽
の細菌性下痢などの予防のための飼料への添加物とし
て、また抗生物質耐性細菌に効果が認められ、抗生物質
に代わる抗菌性物質として期待されている。

【０００４】これまでＨ１ヒストンをコードする遺伝子
（以下「Ｈ１ヒストン遺伝子」という）の塩基配列につ
いては、いくつか報告されており、脊椎動物において
は、例えば次のものなどが挙げられる。

【０００５】（１）ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌ
ｕｓ）由来Ｈ１ヒストン遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．第２６２巻、９６５６頁−９６６３頁、１９８７
年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．第１３巻、５
８５頁−５９４頁、１９８５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．第２５８巻、９００５頁−９０１６頁、１９８３
年）。

【０００６】（２）ジャコウアヒル（Ａｎａｓ ｐｌａ
ｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ）由来Ｈ１ヒストン遺伝子（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．第２５巻、３６１頁−３７０頁、１
９８７年）。

【０００７】（３）マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕ
ｓ）由来Ｈ１ヒストン遺伝子（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｒｅｓ．第２２巻、１４２１頁−１４２８頁、１９
９４年）。

【０００８】（４）ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
由来Ｈ１ヒストン遺伝子（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．第１０
巻、９４０頁−９４８頁、１９９１年）。

【０００９】（５）ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅ
ｇｉｃｕｓ）由来Ｈ１ヒストン遺伝子（Ｇｅｎｅ．第８
９巻、２６５頁−２６９頁、１９９０年）。

【００１０】（６）アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌ
ａｔｔａ）由来Ｈ１ヒストン遺伝子（Ｊ．ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．第５４巻、２１９頁−２３０頁、１９９
４年）。しかしながら、ウズラのＨ１ヒストンタンパク
は知られておらず、これをコードする遺伝子の単離や、
その利用についてもこれまで知られていなかった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ウズ
ラのＨ１ヒストン及びそれをコードする遺伝子を提供す
ることにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した。その結果、本発明を完
成するに至った。

【００１３】すなわち、本発明の要旨とするところは、
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮ
Ａである。 （Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するウ
ズラのＨ１ヒストン。 （Ｂ）配列表配列番号２において、１若しくは２個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつ、Ｈ１ヒストンの機能を有するタン
パク質。

【００１４】上記ＤＮＡとして具体的には、以下の
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基番号９７〜７５
３からなる塩基配列を有するＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基番号９７〜７５
３からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな
条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ１ヒストンの機能
を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 本発明はまた、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を
提供する。 （Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するウ
ズラのＨ１ヒストン。 （Ｂ）配列表配列番号２において、１若しくは２個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつ、Ｈ１ヒストンの機能を有するタン
パク質。 さらに本発明は、上記タンパク質を含む抗菌剤を提供す
る。

【００１５】尚、本発明における「Ｈ１ヒストンの機
能」とは、ヌクレオソームに結合したときに、クロマチ
ン繊維の形成に寄与するタンパク質の機能をいう。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質
をコードするＤＮＡである。このＤＮＡは、本発明を完
成するに際しては、後に述べるようにして、ウズラのゲ
ノムＤＮＡから、ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン（Polymerasechain reaction）法（以下「ＰＣＲ法」
という）により単離されたものであるが、その塩基配列
が明らかにされたので、配列番号１または２に示す配列
に基づいて化学合成することによっても取得することが
できる。また、前記配列に基づいて作製した合成オリゴ
ヌクレオチドプローブを用い、公知の方法でウズラ染色
体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーからハ
イブリダイゼーション等によって取得することもでき
る。

【００１７】以下にウズラのゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ
法によって本発明のＤＮＡを取得する方法を例示する。

【００１８】（１）ウズラゲノムＤＮＡの調製 ウズラの組織、例えば脾臓、直腸、盲腸、食道、十二指
腸、腎臓、膵臓、大腸、小腸、前胃、砂嚢、脳、心臓、
肺、好ましくは肝臓から、ゲノムＤＮＡを調製する。ウ
ズラの肝臓組織を磨砕し、プロテアーゼＫでタンパク質
を分解した後、フェノール処理などを行うことによりウ
ズラのゲノムＤＮＡを得ることができる。

【００１９】（２）本発明のＤＮＡ配列の選択 上記で得られたＤＮＡの中から、目的とするウズラのＨ
１ヒストン遺伝子のＤＮＡを単離するために、既知のＨ
１ヒストン遺伝子で保存されている塩基配列を基に設計
したプライマーを合成する。そのプライマーを用いたＰ
ＣＲ法によりゲノムＤＮＡを鋳型としてウズラのＨ１ヒ
ストン遺伝子をコードするＤＮＡを増幅する。プライマ
ーは、従来報告され、鳥類でよく保存されているＨ１ヒ
ストン遺伝子、例えばニワトリ由来のＨ１ヒストン遺伝
子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６２巻、９６５６頁
−９６６３頁、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ．Ｒｅｓ．第１３巻、５８５頁−５９４頁、１９８５
年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５８巻、９００５頁
−９０１６頁、１９８３年）などの塩基配列に基づいて
設計することができる。

【００２０】（３）ＤＮＡのシークエンシング 上記により得られたＨ１ヒストン遺伝子を含むＤＮＡを
プラスミドベクターあるいはファージベクターに挿入し
て、Ｈ１ヒストン遺伝子を含む組換えベクターを構築す
る。

【００２１】こうして得られる組換えプラスミドあるい
は組み換えファージを含む断片の塩基配列を公知のダイ
デオキシ法等により決定する。その塩基配列中のタンパ
ク質コード領域（オープンリーディングフレーム）から
規定されるアミノ酸配列を既知の鳥類のアミノ酸配列と
比較し相同性を確認することにより、目的とするウズラ
のＨ１ヒストン遺伝子に対応するＤＮＡ断片であること
を特定することができる。

【００２２】なお、一般に特定の機能や生理活性を有す
るタンパクをコードするアミノ酸配列において、１若し
くは２個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換された場
合であっても、その機能や生理活性が維持される場合が
あることは当業者において広く認識されているところで
ある。本発明には、このような修飾が加えられ、かつＨ
１ヒストンの機能を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ断片も含まれる。すなわち、配列番号２において、１
若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸からなり、かつ、Ｈ１ヒストンの機能
を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明の範
囲に含まれるものである。

【００２３】そのような改変されたＤＮＡは、例えば部
位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩
基配列とを改変することによって得られる。

【００２４】また、本発明のＤＮＡ又はこれを有する細
胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞か
ら、例えば配列表番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａとストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａを選択することによっても、改変されたＤＮＡを得る
ことができる。ここでいう「ストリジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高い核酸同士、例えば９９％以上の相同性
を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同
性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げら
れる。

【００２５】尚、後記実施例で得られたウズラのＨ１ヒ
ストン遺伝子のＤＮＡ断片はｐＣＲ２．１プラスミドベ
クターにクローニングされ、これを導入した大腸菌ＪＭ
１０９は、エシェリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＱＨ１−２５）と命名さ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年４
月２１日に、ＦＥＲＭ Ｐ−１６７７４の寄託番号で寄
託されている。

【００２６】本発明のＨ１ヒストン遺伝子は、クロマチ
ンや染色体の構造等の研究に用いることができる。ま
た、本発明の遺伝子を適当な宿主で発現させることによ
り、Ｈ１ヒストンを製造することができる。前記宿主と
しては、エシェリシア コリ、枯草菌等の細菌、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、昆虫培養細胞、動物
培養細胞、植物培養細胞等が挙げられる。これらの宿主
細胞に、その宿主細胞内で機能するプロモーター等の発
現調節配列の下流に発現可能に連結した本発明のＨ１ヒ
ストン遺伝子を導入する。Ｈ１ヒストン遺伝子の導入に
際しては、該遺伝子をプラスミドに挿入して組換えプラ
スミドを構築し、得られた組換えプラスミドで宿主を形
質転換するか、あるいは相同組換え等によってＨ１ヒス
トン遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込むことによって形質
転換する。得られる形質転換細胞を、発現調節配列が機
能する条件で培養することによって、Ｈ１ヒストンが産
生される。

【００２７】（４）本発明のタンパク質 本発明のタンパク質は、上記Ｈ１ヒストン遺伝子により
コードされるタンパク質であり、配列表配列番号２に示
すアミノ酸配列を有する。また、配列番号２において、
１若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは
付加されたアミノ酸からなるタンパク質であっても、Ｈ
１ヒストンの機能を有するタンパク質は、本発明のタン
パク質に含まれる。本発明のタンパク質は、大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）および
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓＡＴＣＣ６５３８Ｐ）等の微生物に対して抗菌
活性を有し、抗菌剤として利用することができる。

【００２８】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示してより具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００２９】以下の実験操作の手順は特に記述しない限
り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第２版
（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，１９
８９年）に記載されている方法に従った。

【００３０】（１）ウズラゲノムＤＮＡの調製 ウズラの肝臓４０ｍｇを、氷冷した４００μｌの磨砕緩
衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６００ｍＭＮａＣ
ｌ、４ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）中で、ポリトロン（Ｋ
ＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて、０℃で５分間磨砕
した。この磨砕液全量に、２０％のＳＤＳ溶液を３０μ
ｌ加え、さらにプロテアーゼＫ（ＭＥＲＣ社製）溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）を４０μｌ加えた後、６５℃で７時
間反応させて、タンパク質を消化した。この溶液にＴＥ
緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡｐ
Ｈ８．０）で飽和させたフェノール溶液を等量加えてよ
く撹拌した後、これを１５，０００ｒｐｍで３分間遠心
分離して水層を分取した。このフェノール処理を３回繰
り返し、タンパクを変性、除去した水層５００μｌに
７．５Ｍの酢酸アンモニウム溶液を２５０μｌ加え、さ
らに５２５μｌのイソプロピルアルコールを加え、これ
を１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、沈殿を
回収することによって、ウズラゲノムＤＮＡ５μｇを調
製した。

【００３１】（２）Ｈ１ヒストン遺伝子の単離 Ｈ１ヒストン遺伝子をＰＣＲ法を用いて単離するため
に、まずプライマーの設計を行った。ニワトリ由来のＨ
１ヒストン遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６２
巻、９６５６頁−９６６３頁、１９８７年、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．第１３巻、５８５頁−５９４
頁、１９８５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５８
巻、９００５頁−９０１６頁、１９８３年）、及びジャ
コウアヒル由来Ｈ１ヒストン遺伝子（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖ
ｏｌ．第２５巻、３６１頁−３７０頁、１９８７年）の
塩基配列を基に、下記の２種類のプライマーを作製し
た。プライマーの作製は、ＤＮＡ合成装置（Model ３９
１、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、オリ
ゴヌクレオチドを合成した後、イオン交換ＨＰＬＣによ
り精製して行った。

【００３２】（プライマー１：配列番号３） 5'-CGCACCAATCACCGCGCGGCTCCGCTCTATAAATACGAG-3' （プライマー２：配列番号４） 5'-GGGGTGGCTCTGAAAAGAGCCGTTGGGT-3'

【００３３】次にこれらのオリゴヌクレオチド各１００
ｐｍｏｌをプライマーとし、上記（１）で得られたウズ
ラのゲノムＤＮＡ ３μｌをテンプレイトとして、これ
らを含む反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＫＣ
ｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、４種のヌクレ
オチド ｄＮＴＰ 各４００μＭ ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｔ
ａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ２．５Ｕ）５０μｌで、増
幅反応を行った。反応液は、ＰＣＲキット（ＴａＫａＲ
ａ ＬＡ ＰＣＲキット Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）社
製））を用いて調製した。

【００３４】増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ＡＳＴＥＣ
社製、ＰＲＯＧＲＡＭＴＥＭＰ ＣＯＮＴＲＯＬ ＳＹ
ＳＴＥＭ ＰＣ−７００）を用いて、変性：９４℃、１
分、アニーリング：６８℃、２分、伸張（ｅｘｔｅｎｔ
ｉｏｎ）：７２℃、１０秒の３つの反応条件を３０回繰
り返すことによって行った。反応終了後、反応液５０μ
ｌに等量の飽和フェノールを加え、混合した後、１５，
０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上層５０μ
ｌを回収した。回収液の２分の１容の７．５Ｍ酢酸アン
モニウム溶液を加えた後、２．５倍容のエタノールを加
え、−２０℃に１５分放置した後、１５，０００ｒｐ
ｍ、４℃で１０分間遠心分離し、得られた沈殿を減圧下
で乾燥させ、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）に溶解させた。
この溶液全量を低融点アガロース電気泳動により分画
し、増幅産物ＤＮＡ断片として８００ｂｐのバンドをゲ
ルから切り出した。この断片にＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８）を等量加
え、６８℃、２０分間でアガロースを溶解後、飽和フェ
ノール抽出を２回行うことにより、アガロースを除い
た。この抽出液の１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム、
２倍容のエタノールを加え、−２０℃に６時間放置した
後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、
得られた沈殿を減圧下で乾燥させ、１０μｌの水に溶解
させることにより、ウズラＨ１ヒストンＤＮＡ断片を得
た。

【００３５】（３）ＤＮＡのシークエンシング 上記（２）で得られたＤＮＡの１０μｌをｐＣＲ２．１
プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の１
０μｌと混合した後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（宝酒造（株）社製）を用いて１６℃で３０分間連結
反応を行った。反応液に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に６時間放
置した後、この溶液を分離し、沈殿を乾燥させ、５μｌ
の水に溶解した。これを市販の大腸菌ＪＭ１０９コンピ
テントセル（宝酒造（株））１００μｌを入れた１．５
ｍｌ容チューブに入れ、氷中で３０分間、４２℃で３０
秒間、そして再び氷中で２分間置いた後、ＳＯＣ液体培
地（２％ バクト−トリプトン（ＤＩＦＣＯ社）、０．
５％ バクト−酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ社）、１０ｍＭ
ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ
₄、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ グルコース）９０
０μｌを加え、３７℃、１時間振盪培養した。

【００３６】この培養液の１００μｌを、アンピシリン
５０ｍｇ／Ｌ、Ｘ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈ
ｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔ
ｏｓｉｄｅ）２０ｍｇ／Ｌに、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏ
ｓｉｄｅ）２０ｍｇ／Ｌを添加したＬＢ寒天培地（１％
バクト−トリプトン、０．５％ バクト−酵母抽出
物、０．５％ ＮａＣｌ、０．１％ グルコース、ｐＨ
７．５、寒天１．５％）にプレーティングし、３７℃、
１６時間培養後、青色に発色しているコロニーを形質転
換された大腸菌として分離した。

【００３７】形質転換して得たアンピシリン耐性コロニ
ーを、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地で増殖
させた後、プラスミド精製キット（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社
製））を用いてプラスミドの精製を行った。精製は、上
記で得られた耐性コロニーを培養液５０ｍｌを用いて行
い、形質転換大腸菌から５０μｇ（５０μｌ）のプラス
ミドを得た。このプラスミド１０μｌを用い、ヘルパー
ファージ（ＶＣＳＭ１３ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ（Ｓ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））、塩基配列記決定キット
（Ａｕｔｏｒｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製））を用い
て、自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＬＦ ＤＮＡ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｒII（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
社製）で塩基配列の解析を行った。その結果、配列番号
１に記載の８２０塩基のＤＮＡが決定された。このＤＮ
Ａは配列番号１に記載の６５７塩基の単一のオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このＯＲＦは９
６塩基の５’非翻訳領域と６７塩基の３’非翻訳領域に
挟まれている。

【００３８】よって、本発明によるウズラのＨ１ヒスト
ンをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１に記載
の単一のオープンリーディングフレームの６５７塩基か
らなる。また本発明によるウズラのＨ１ヒストン遺伝子
の塩基配列は、配列番号２に記載の２１９アミノ酸残基
からなるタンパクをコードしている。この配列番号２の
アミノ酸配列をニワトリ由来のＨ１ヒストン（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６２巻、９６５６頁−９６６３
頁、１９８７年）のアミノ酸配列と比較すると、特有の
配列部分（配列番号２においてアミノ酸番号１〜８９、
９１〜１８４、１８６〜２０３、２０５〜２１９）での
共通性（全アミノ酸配列における相同性９８．６％）が
認められた。

【００３９】（４）バキュロウイルスを用いた昆虫培養
細胞によるＨ１ヒストンの生産 （ａ）Ｈ１ヒストン遺伝子導入用組換えベクターの作製 上記（３）に記載したウズラＨ１ヒストンＤＮＡ断片が
プラスミドベクターｐＣＲ２．１に連結された４．９ｋ
ｂのプラスミド（以下、「ｐＱＨ１」という）のＤＮＡ
（６０μｇ）を、Ｈバッファー（宝酒造（株）製）３０
μｌ中で制限酵素ＥｃｏＲＩを１０ユニット用いて、３
７℃で１時間消化したのち、さらに、制限酵素ＢｓａＩ
を１０ユニット用いて、５０℃で１時間消化した。この
消化溶液の半量を１．２％アガロースゲル電気泳動によ
り分画し、ＤＮＡ断片として約８００ｂｐのバンドをゲ
ルから切り出した。このゲル断片にＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍ

【００４０】Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ８）を等量加え、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ II ｋｉｔ（フ
ナコシ社製）により分離して、約８００ｂｐのＤＮＡ断
片の精製品を得て、さらに８μｌの水に溶解した。この
水溶液を、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造
（株）製）で処理して、ＤＮＡ断片の平滑末端化反応を
行い、減圧下で乾燥させて、両端が平滑化されたウズラ
Ｈ１ヒストン遺伝子（約８００ｂｐ）ＤＮＡ断片−Ａを
得た。

【００４１】次に、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎ
ｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）プラスミドベクターのＤＮＡ
（２μｇ）を、Ｈバッファー（宝酒造（株）製）２０μ
ｌ中で制限酵素ＢａｍＨＩを１０ユニット用いて、３７
℃で１時間消化し、この消化反応液からＤＮＡを沈殿さ
せた後、減圧下で乾燥させ、８μｌの水に溶解した。得
られた水溶液をＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝
酒造（株）製）で処理して、ＤＮＡ断片の平滑末端化反
応を行い、再び減圧下で乾燥させ、約４．９ｋｂのサイ
ズのベクター断片を得た。

【００４２】上記で得たＤＮＡ断片−Ａと上記で得たベ
クター断片を、それぞれ５μｌと５０μｌの水に溶解し
た。その溶液の５μｌずつを混合した後、ＤＮＡ Ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）で処理して、
それら２種のＤＮＡ連結反応を行った後、沈殿させ、さ
らに減圧してＤＮＡを乾燥させた。こうして、ｐＢｌｕ
ｅＢａｃＨｉｓ２Ｂの切断ベクター断片に対し、ｐＱＨ
１の切断ベクター断片を連結してなる環状の組換えベク
ターｐＢｌｕｅＢａｃＱＨ１（約５．７ｋｂ）を作製し
た。

【００４３】（ｂ）Ｈ１ヒストン遺伝子を保持した組換
えバキュロウイルスの調製 Ｈ１ヒストン遺伝子を保持した組換えバキュロウイルス
の調製は、市販のＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ Ｔｒａｓｆｅ
ｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を
用いて、キット添付のプロトコールに準じて行った。ま
ず、ヨトウガ由来のＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅ
ｎ社製）を、市販のＳｆ−９００ II ＳＦＭ培地（ＧＩ
ＢＣＯＢＲＬ社製）を用い、スピナーフラスコ中で２７
℃において３日間培養した（細胞密度２．５×１０⁶個
／ｍｌ）。この細胞培養液を直径６０ｍｍのプラスティ
ックシャーレに１ｍｌ加えた後、１５分間室温に放置
し、シャーレ底面にＳｆ９細胞を付着させた。シャーレ
から培地を除去した後、このシャーレにＢａｃ−Ｎ−Ｂ
ｌｕｅＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）０．５μｇ、
上記（iii）のプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＱＨ１ ４
μｇ、及びＩｎｓｅｃｔｉｎＰｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｏｒ
ｏｇｅｎ社製）リポソーム２０μｌを含むＳｆ−９００
II ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）１ｍｌを加
え、４時間室温に放置した。これに、ＴＮＭ−ＦＨ培地
（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）１ｍｌを加え、２７℃
で１５日間培養を行い、細胞溶解させ、Ｈ１ヒストン遺
伝子を保持した組換えバキュロウイルスを含む培養液２
ｍｌ（力価１×１０⁶ｐｆｕ／ｍｌ）を得た。さらに、
この培養液２ｍｌを、Ｓｆ−９００ II ＳＦＭ培地（Ｇ
ＩＢＣＯＢＲＬ社製）５００ｍｌに加えたのち、Ｓｆ９
細胞（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を２．５×１０⁸
個加え、組織培養用フラスコ中で２７℃で１０日間培養
を行い、Ｈ１ヒストン遺伝子を保持する組換えベクター
ｐＢｌｕｅＢａｃＱＨ１が導入されたバキュロウイルス
の培養液（力価１×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ）を得た。

【００４４】（ｃ）Ｈ１ヒストンの生産および精製 上記組換えバキュロウイルスの培養液（力価１×１０⁸
ｐｆｕ／ｍｌ）４００ｍｌを、Ｓｆ−９００ II ＳＦＭ
培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）３６００ｍｌに加えたの
ち、ヨトウガ由来のＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅ
ｎ社製）を２．４×１０⁹個加え、組織培養用フラスコ
において２７℃で３日間培養し、組換えバキュロウイル
スのＳｆ９細胞への感染を行った。この細胞培養液を３
０００ｒｐｍ（８００×ｇ）で１０分間遠心分離を行
い、感染細胞の沈殿を得た。この沈殿に、氷冷した２５
０ｍｌの磨砕緩衝液ｐＨ７．４（１０ｍＭＮａ₂ＨＰ
Ｏ₄、１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、５００ｍＭＮａＣｌ、１
０ｍＭイミダゾール、１００μｇ／ｍｌフェニルメチル
スルフォニルフルオリド、０．５μｇ／ｍｌロイペプチ
ン、０．５μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌペプ
スタチンＡ）を加えて、０℃で５分間、昆虫細胞が完全
に破壊されるまで、超音波破砕処理を行った後、この破
砕液を２５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、
上清を得た。

【００４５】上記のようにして得た上清２５ｍｌを、あ
らかじめ１００ｍＭ硫酸ニッケル５００μｌおよび１０
ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．４（１０
ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄）１０ｍｌで
平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム
（容量１ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテク社
製）に導通させた後、カラムを、１０ｍＭイミダゾール
を含むリン酸緩衝液ｐＨ７．４（１０ｍＭＮａ₂ＨＰ
Ｏ₄、１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄）１０ｍｌで洗浄した。こ
のカラムに、１００ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝
液ｐＨ７．４（１０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭＮａＨ
₂ＰＯ₄）５ｍｌを導通し、溶出液を回収した。得られた
溶出液をＳｅｐ−ＰａｋＣ１８カラム（容量０．３４ｍ
ｌ、ウォーターズ社製）に導通させ、０．０５％トリフ
ルオロ酢酸液５ｍｌで洗浄した。このカラムに０．０５
％トリフルオロ酢酸／５０％アセトニトリル液１．５ｍ
ｌを導通し、溶出液を回収後、乾燥させ、乾燥物６５０
μｇを得た。この乾燥物を、公知のトリシンＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により分析し、また、抗
Ｈ１ヒストンモノクローナル抗体（レインコテクノロジ
ー社製）を１次抗体として、公知のウエスタンブロッテ
ィング法により分析した結果、上記で得られた乾燥物が
単一なタンパク質で、組換えＨ１ヒストンであることが
判った。

【００４６】（ｄ）組換えＨ１ヒストンの抗菌活性の測
定 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０
９）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴ
ＣＣ６５３８Ｐ）を検定菌として、上記の組換えＨ１ヒ
ストンの抗菌活性を調査した。調査方法は、各検定菌１
×１０⁵個を、０．０３％のトリプティックソイブロス
（ディフコラボラトリー社製）を含む８ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ７．４（８ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、８ｍＭＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄）５０μｌ中で、３７℃において２時間、１〜５０
μｇ／ｍｌの組換えＨ１ヒストンと接触させた後、６％
のトリプティックソイブロス（ディフコラボラトリー社
製）を等量加え、３７℃において１５時間培養を行い、
５５０ｎｍにおける菌懸濁液の吸光度を測定し、検定菌
の増殖率を算出した。その結果は表１に示される。検定
菌の増殖率は、組換えＨ１ヒストンを加えない場合の検
定菌の増殖率を１００％とした。この表１から、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）お
よび黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ６５
３８Ｐ）の増殖が、組換えＨ１ヒストンにより、抑制さ
れることが判る。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【発明の効果】本発明により提供される、ウズラのＨ１
ヒストンをコードする遺伝子を利用して、ヒストンタン
パクを生産することができる。また、本遺伝子を用いて
生産されたヒストンタンパクは飼料における抗菌性飼料
添加物などの抗菌性物質として利用することができる。

【００４９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 社団法人 農林水産技術情報協会 <120> ウズラのＨ１ヒストン及びその遺伝子 <130> P-6365 <141> 1999-03-25 <150> JP 10-113963 <151> 1998-04-23 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００５０】 <210> 1 <211> 820 <212> DNA <213> Coturnix coturnix <220> <221> CDS <222> (97)..(753) <400> 1 cgcaccaatc accgcgcggc tccgctctat aaatacgagc atctgacccg cgccagccca 60 attgtgttcg cctgctccgg agaggactcc gctgcg atg tcc gag acc gct ccc 114 Met Ser Glu Thr Ala Pro 1 5 gcc gca gcc ccc gat gcg ccc gcg ccc ggc gct aag gcc gcc gcc aag 162 Ala Ala Ala Pro Asp Ala Pro Ala Pro Gly Ala Lys Ala Ala Ala Lys 10 15 20 aag ccg aag aag gcg gcg ggc ggc gcc aaa gcc cgc aag ccc gcg ggc 210 Lys Pro Lys Lys Ala Ala Gly Gly Ala Lys Ala Arg Lys Pro Ala Gly 25 30 35 ccc agc gtc acc gag ctg atc acc aag gcc gtg tcc gcc tcc aag gag 258 Pro Ser Val Thr Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val Ser Ala Ser Lys Glu 40 45 50 cgc aag ggg ctc tcc ctc gcc gcg ctc aag aag gcg ctg gcc gcc ggc 306 Arg Lys Gly Leu Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys Ala Leu Ala Ala Gly 55 60 65 70 ggc tac gat gtg gag aag aac aac agc cgc atc aag ctg gga ctc aag 354 Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile Lys Leu Gly Leu Lys 75 80 85 agc ctg gtc aac aag ggc act ctg gtg cag acc aag ggc acc ggc gcc 402 Ser Leu Val Asn Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr Lys Gly Thr Gly Ala 90 95 100 tcg ggc tct ttt cgg ctc aac aag aag ccg ggt gag gtg aag gag aag 450 Ser Gly Ser Phe Arg Leu Asn Lys Lys Pro Gly Glu Val Lys Glu Lys 105 110 115 gct ccc agg aag cga gca act gca gcc aag ccc aag aag ccg gcg gcc 498 Ala Pro Arg Lys Arg Ala Thr Ala Ala Lys Pro Lys Lys Pro Ala Ala 120 125 130 aag aag cct gcg gct gct gcc aag aag ccc aag aag gca gcg gca gtg 546 Lys Lys Pro Ala Ala Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Ala Ala Val 135 140 145 150 aag aag agc ccc aag aaa gcc aag aag ccg gcg gct gct gcc acc aag 594 Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro Ala Ala Ala Ala Thr Lys 155 160 165 aaa gca gcg aag agc cct aag aag gcc gct aag gct ggc cgc ccc aag 642 Lys Ala Ala Lys Ser Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ala Gly Arg Pro Lys 170 175 180 aag gcc acc aag agc ccg gcc aag gcg aag gca gtg aag ccc aaa gct 690 Lys Ala Thr Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys Ala Val Lys Pro Lys Ala 185 190 195 gcc aag ccc aag gca gcc aaa ccc aag gcg gcc aag gca aag aag acg 738 Ala Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala Ala Lys Ala Lys Lys Thr 200 205 210 gca gcc aag aag aag taagttatcc cagcagagtc ctgctctacc tattttgata 793 Ala Ala Lys Lys Lys 215 cccaacggct cttttcagag ccacccc 820

【００５１】 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Coturnix coturnix <400> 2 Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Ala Pro Asp Ala Pro Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Lys Ala Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Ala Gly Gly Ala Lys 20 25 30 Ala Arg Lys Pro Ala Gly Pro Ser Val Thr Glu Leu Ile Thr Lys Ala 35 40 45 Val Ser Ala Ser Lys Glu Arg Lys Gly Leu Ser Leu Ala Ala Leu Lys 50 55 60 Lys Ala Leu Ala Ala Gly Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg 65 70 75 80 Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Asn Lys Gly Thr Leu Val Gln 85 90 95 Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Arg Leu Asn Lys Lys Pro 100 105 110 Gly Glu Val Lys Glu Lys Ala Pro Arg Lys Arg Ala Thr Ala Ala Lys 115 120 125 Pro Lys Lys Pro Ala Ala Lys Lys Pro Ala Ala Ala Ala Lys Lys Pro 130 135 140 Lys Lys Ala Ala Ala Val Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Thr Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Lys Lys Ala Ala 165 170 175 Lys Ala Gly Arg Pro Lys Lys Ala Thr Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys 180 185 190 Ala Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala 195 200 205 Ala Lys Ala Lys Lys Thr Ala Ala Lys Lys Lys 210 215

【００５２】 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 cgcaccaatc accgcgcggc tccgctctat 30

【００５３】 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 ggggtggctc tgaaaagagc cgttgggt 28

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を
   コードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するウ
   ズラのＨ１ヒストン。 （Ｂ）配列表配列番号２において、１若しくは２個のア
   ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつ、Ｈ１ヒストンの機能を有するタン
   パク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡで
   ある請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基番号９７〜７５
   ３からなる塩基配列を有するＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基番号９７〜７５
   ３からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな
   条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈ１ヒストンの機能
   を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。 （Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するウ
   ズラのＨ１ヒストン。 （Ｂ）配列表配列番号２において、１若しくは２個のア
   ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつ、Ｈ１ヒストンの機能を有するタン
   パク質。
4. 【請求項４】 請求項３記載のタンパク質を含む抗菌
   剤。