JP2005500393A - 抗菌剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、見掛け分子量が１０から２０ｋＤの間の数値であることを特徴とする植物クロマチンから解離された後に植物クロマチンから単離されたタンパク質成分を抗菌剤として使用する方法に関連する。植物性タンパク質成分を製造する方法は、植物クロマチンを露呈させるために植物材料を均質化し、疎水の状況において植物クロマチンを解離剤を用いて解離させ、上記の解離された植物クロマチンを、疎水相互作用による分離法を用いて上記のタンパク質植物成分から成る個々の分留に分離するという工程から構成される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は植物クロマチンから単離されたタンパク成分の使用法に関する。更に本発明は上記成分が解離された後に植物クロマチンから単離されたタンパク成分の抗菌剤としての使用法及びその製造法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のほとんどが、感染因子に対して様々な防御機構を備え持っている。そのいくつかの機構は、微生物と複合多細胞生物の細胞との膜構成や組織の根本的な相違に基づいており、すなわち感応（感覚）微生物の外膜に向かって機構が備わっている。これらの膜は外側に向いたマイナスの電荷を帯びたヘッドグループを有する脂質から構成され、それらの膜構成や組織を変えてその影響を相殺することは微生物には明らかに困難であるようだ。よって、抗菌作用を有する物質は抗生物質の代用品の候補になりうると考えられる。
【０００３】
この１つの例は、リン脂質を膜の間を転移させることが可能なリン脂質転移タンパク質である。抗菌性リン脂質転移タンパク質は、穀物を含む様々な植物種子に存在することが報告されており、これらのタンパク質は異なる病原体に対するそれぞれの作用によって異なる。例えば、米国特許第５６９８２００号において、麦芽した穀物の粒子から得られた水性抽出物を用いると植物の一部を植物病原菌から保護できることが開示されている。
【０００４】
しかし、保護剤として最も研究がされている分類は抗菌性ペプチドである。この物質は,植物や昆虫から軟体動物、甲殻類、両生類、鳥類、魚類、哺乳類そして人類を含む動物に到るまで、全ての生命体において存在が確認されている。
【０００５】
これらのペプチドは細菌に直接作用し殺してしまう。これらの物質は、グラム陰性及びグラム陽性の菌類（イースト菌など）、寄生虫（プラナリアや線虫など）、癌細胞、そしてＨＩＶや単純ヘルペスウィルスなどの外膜（エンベロープ）ウィルスまでも殺すか、または中和する能力を含む稀に見る広範囲な活動をするため、抗菌薬と称されている。一般的に、これらの薬剤は少ないところでは１２個のアミノ酸から７０個もの残留物を有する分子まで広範囲に及ぶ。このようなペプチドは既に５００以上も発見されている。
【０００６】
メリチン、マゲイニン、グラミシジン、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）及びディフェンシンなどのペプチドのうちで、ほぼ全ての場合においてカチオン性の抗菌ペプチドにおける抗菌作用の状態が詳細に研究された。抗菌分子は、通常それらが攻撃する生物の膜を損傷する。カオチン性の抗菌ペプチドは、生体内だけでなく生体外においても殺菌作用を保持することが発見された。それらは対象物を迅速に殺し、容易には耐性変異体を選択せず、従来の抗菌薬やリゾチームを含むその他のペプチドとの相乗作用を持ち、動物モデルにおける細菌を殺すことが可能である。
【０００７】
結論として、動物由来の抗菌ペプチドは新たな抗生物質として発展を遂げていると言える。例としては、合成されたマンガン（ぺクシガナン（Ｐｅｘｉｇａｎａｎ））やプロテグリン（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）の類似体や元々豚の好中球から単離された抗菌ペプチドなどが挙げられる。
【０００８】
しかしながら、代用品となる新しい抗生物質を製造するにあたって、自然源では経済的に利益がでないことが判明した。その唯一の例外が、物質に対して高い耐性を持ち、ラクトコッカス・ラクティス株において効率的に生成されるニシン（ｎｉｓｉｎ）である。
【０００９】
多くのより大きなタンパク質やその一部が抗菌作用を有することが判明した。例えば、マウスマクロファージタンパク質、ユビキチダン（ｕｂｉｑｕｉｃｉｄａｎ）などはリボソームタンパク質Ｓ３０と同様のように考えられる。また、ウシガエル（ラナ・カテスベイナ（Ｒａｎａ・ｃａｔｅｓｂｅｉｎａ））の胃における抗菌ペプチドのうち２つは、ペプシノゲンのＮ―端末から得られる。同様に、ブフォリンI（ＢｕｆｏｒｉｎＩ）という名称の抗菌ペプチドは、アジアカエル（ＢＢＲＣ ２１８：４０８、１９９６）の胃の組織から単離される。アミノ酸３９個の長さのペプチドのアミノ酸配列は、ゼノパスヒストンＨ２Ａにおける３９個のアミノ末端残基のうち３７個と同じであることが判明した。
【００１０】
それに加え、全体としてのタンパク質分子は抗菌潜在能力を示すこともできる。大西洋サケ（ＢＢＲＣ ２８４：５４９、２００１）の肝臓、腸及び胃から採取された酸抽出物において、抗菌作用が検知された。対応する抗菌タンパク質は、酸抽出物を使用した後に、硫安塩析精製、大規模なゲルクロマトグラフィ（ゲルろ過）、逆相クロマトグラフィ及び粒径排除クロマトグラフィを行うことでサケの肝臓から単離させることができる。サケ抗菌（ＳＡＭ）タンパク質は、２７．７ｋＤの分子量を有することが判明し、これはヒストンＨ１タンパク質であると確認された。ＷＯ ２００１１０９０１において、ウシの胸腺から採取した哺乳類ヒストンＨ１タンパク質は、様々な真核生物における微生物感染を治療するための抗菌組成において用いられる。このように、その他の周知の機能を有するタンパク質は、抗菌性であることによって第２の性質を表すようである。
【００１１】
しかしながら、ウシのタンパク質、とりわけウシの胸腺のタンパク質は有害なウィルス、特に肝炎ウィルスや例えばプリオンなどのその他の病原体によって汚染されやすいので、この使用は避けなければいけない。ウシの試料は、汚染されていようがなかろうが、人間に関連して使用される場合には非常に厳重に検査が行われなければならない。
【００１２】
さらに、人間または家畜に関連して使用できる商品を採取するために代用品となる新たな抗生物質を単離するには、ある特定の動物の器官または組織を収集し、その後に複合純化作業を行なわなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的とするところは、上記の問題を解消する新しい抗菌剤を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、病原になりうる感染物質を人間及び／または動物に移すリスクが回避された抗菌剤を提供することである。
【００１５】
また、本発明のもう１つの目的は、食品に関連して使用される場合において味の無い抗菌剤を提供することである。
【００１６】
本発明のもう１つの目的は、製造に安価な出発原料が用いられる抗菌剤を製造する方法を提供することである。
【００１７】
また、本発明の更なる目的は、抗菌剤を実質的に無限の規模で製造する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の更なる目的は、細菌発酵のために植物における製造に投資を必要としない抗菌剤を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
これらの目的は、請求項に記載の本発明による使用法または手順をもって達成することができる。
【００２０】
本発明による方法によると、簡単で合理的に、例えば薬物などの抗菌物質、製造及び移動を行なう間に完全なる保存剤や機能的食品及び／または栄養補助食品の添加物だけでなく動物の飼料の添加物として使用できるタンパク質成分を製造することが可能である。
【００２１】
タンパク質成分は、植物クロマチンから成る元々は不活性な出発原料から驚くべき容易さで製造できる。発明の方法において、ＤＮＡは塩基性核植物クロマチンから分離される。植物クロマチンは、植物の種子から得られることが好ましい。適した植物の種子としては、オート麦、雑実用モロコシ、ミロ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、米、菜種、大豆、粟または蕎麦の実などが挙げられる。しかし、海草やその他の水中植物などの植物物質を含む全てのクロマチンは、抗菌性タンパク質成分の大規模な製造において用いることができる。
【００２２】
タンパク質成分を単離させるのに用いる植物クロマチンは、ヘテロクロマチン（サイレント・クロマチンまたはジャンクＤＮＡ）でなくてはならない。ヘテロクロマチンは、低アセチル化がなされた（アセチル基が取り除かれた）クロマチンで、これはより高い陽性物質電荷を有するため高アセチル化されたクロマチンより凝縮された構成を持つ。
【００２３】
それに加えて、さらなる特定のタンパク質抽出物のためのクロマチン出発原料の選択は、植物細胞組織の位置と分化状態による。例えば、小さな細胞から成る組織は細胞密度が高くなるので、大きな細胞から成る同量の組織より多くの核酸とそれに付随する抗菌性タンパク質成分を含むとされる。
【００２４】
よって、多くの植物は高いヘテロクロマチンを含有するため非常に大きな基底ゲノムを有し、さらに倍数性可能性によって増加される。これに関連して、塩基対の数値（Ｃ値）において測定された１倍体細胞に対するＤＮＡの量が参照とされる。生物のＤＮＡ含有量における変異は、そのＤＮＡのＣ値または基底ゲノムの大きさによって反映される。Ｃ値は、生物の細胞内に存在するＤＮＡの完全な配列の１つの複写に含まれる塩基対の重さ及び数によって測定されるＤＮＡの含有量として定義される。つまり、Ｃ値とは分類群の倍数性のレベルとは関係なく、再生されていない１倍体細胞または配偶子核におけるＤＮＡ核の量なのである。このように、Ｃ値は２倍体種におけるゲノムの大きさと同等であるが、一方で倍数性種におけるゲノムの大きさよりも常に大きい。
【００２５】
また、植物の自己再生型で未分化の幹細胞を用いることが好ましい。これは、新芽や根端において新たな成長を促す領域である分裂組織に存在する。従って、植物の発芽した根端は本発明によるクロマチンの採取やそれに続いて行なわれるタンパク質成分の単離を行なうにあたって優れた出発原料となる。このような原料は、醸造用麦芽や小麦の胚種油を製造する際に廃棄物とされるため、無限的な量をたやすく手に入れることができる。
【００２６】
成長する最適な状態にある分裂性細胞を有するその他の植物原料もまた、本発明によるタンパク質成分の単離を行なうのに適する。発芽段階にあるどのような発芽新芽や幼根や胚種でも使用することは可能である。好ましくは、上記で挙げた穀物４種の内の１つの種子を用いて、順次発芽させるとよい。
【００２７】
本発明において用いるのに安価な原料は、ビールの出発原料となるモルトと呼ばれる物である。醸造産業では、モルトは大麦を湿らせた後、６日間発芽させて製造される（麦芽製造）。この生産的に製造されたモルトや製造における副産物（ルートリングス（ｒｏｏｔｌｉｎｇｓ））は、本発明によると抗菌性タンパク質成分を製造するのに用いることができる。
【００２８】
従って、２倍体の穀物や（ＤＮＡＣ値５０００Ｍｂｐの）大麦や（ＤＮＡＣ値１８０００Ｍｂｐの）玉ねぎが適した採取の出発原料となる。好ましくは、抗菌性タンパク質成分は、ＤＮＡのＣ値が３０００Ｍｂｐを超えるクロマチン源から採取されるとよい。
【００２９】
純化作業における出発原料は、Ｓ段階において増殖する植物から単離された植物クロマチンから構成されることが特に好ましい。発芽した種子（粒子）やそれに伴うルートリングスや若葉は、このようなＳ段階の細胞を大量に含んでいる。
【００３０】
抗菌作用を有する植物性タンパク質成分を製造する発明的な方法において、その方法は下記の工程から構成される。
植物クロマチンを露呈させるために植物材料を均質化し、
疎水の状況において植物クロマチンを解離剤を用いて解離させ、
上記の解離された植物クロマチンを、疎水相互作用による分離法を用いて上記のタンパク質植物成分から成る個々の分留に分離する。
【００３１】
従って、まず植物材料は均質化される。これと関連した「均質化」という語句は、植物のクロマチンが露呈しホモジェネートが懸濁液として採取できるように、植物材料の細胞壁を破壊するという意味で用いられる。細胞壁は、これらの方法に限定する訳ではないが、高剪断、超音波処理、機械的破壊、圧力による爆発などを含む当業者には周知であるその他の技術を用いても破壊することができる。細胞壁はホモジェネートを採取でき得る適した装置を用いて破壊される。
【００３２】
ホモジェネートにおける植物クロマチンは、疎水の状態において水溶液の形態の解離剤によって解離される。上記のような状態とは、疎水作用を促進させる状態のことを指す。
【００３３】
適した解離剤としては、尿素、グラニジン、塩素及び塩化物が挙げられる。塩化物は、好ましくは高いイオン強度を有する塩化ナトリウムであるとよい。
【００３４】
植物材料の均質化が、解離剤において行なわれるとより有利となる。こうすることで、純化作業が単純化され、作業における工程が少なくて済む。
【００３５】
モルトの純化作業は、４Ｍの塩化ナトリウムから成るほとんど飽和状態の塩溶水においてモルトを均質化することから始まる。高いイオン強度はクロマチンだけでなくヌクレオソームを解離し、それと同時にプロテアーゼによるタンパク性物質の劣化を防ぐ役割も果たす。均質化は、疎水性マトリックスが存在する状況で行なわれることが好ましい。
【００３６】
ホモジェネートは、植物クロマチンの細胞残留物やその他の破片を取り除くためにこし器やワイヤー網などの類で濾される。こうすることにより、濁りのない溶液を得ることができ、これに続く解離されたクロマチンの純化を容易に行なうことができる。
【００３７】
そして解離された植物クロマチンは、抗菌作用を有する植物性タンパク質成分を含む個々の分留に分離される。上記の分離は、疎水相互作用による分離工程によって行なわれることが好ましい。上記の疎水相互作用による分離工程として、好ましくは疎水クロマトグラフィがよい。
【００３８】
その他の適した分離工程の例としては、分配クロマトグラフィ、逆電流クロマトグラフィ、ガスアフロン（ｇａｓ ａｐｈｒｏｎ）分配などの高分子システムによる分配がある。解離されたクロマチン成分の分離は、別の方法としては金属キレートゲルまたは非活性へパリンが施されたカラムにおいて行なわれてもよい。
【００３９】
疎水相互作用及び／または分離工程において用いるマトリックスの機能性リガンドは、エーテル、イソプロピル、ブチルまたはオクチル群であることとする。フェニル群の使用は避けなければならない。機能性リガンドは好ましくは、４％に架橋結合するアガロースマトリックスにおけるブチル群であるとよい。すると４０から５０μｍｏｌ／ｍｌのリガンド密度を得ることができ、結果として１ミリリットルにつき７ｍｇ ＩｇＧの結合密度が得られる。
【００４０】
例としては、懸濁液としてのモルトホモジェネートのスクリーニングを行なった後、活性ブチル群を含む疎水相互作用クロマトグラフィゲル（ＨＩＣ）である疎水性マトリックスのひとまとまりが、採取された溶液に加えられる。適したマトリックスは、スウェーデン国、ブロマ、イノバータＡＢ（ＩｎｏｖａｔａＡＢ、Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるノバローズ（Ｎｏｖａｒｏｓｅ（登録商標））Ｓ−ブチル １０００／４０及びスウェーデン国、アメルシャム ファーマシア バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によるブチルセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））４である。そして疎水性マトリックスは高いイオン強度の塩溶液で洗われ、ＤＮＡが洗い落とされる。
【００４１】
そしてマトリックスはカラムに流し入れられ、塩化ナトリウムが有する低下したイオン強度と共に次の工程である勾配溶離の対象とされる。ある特定の抗菌性タンパク質成分は、１Ｍ ＮａＣｌの濃度で溶離される。
【００４２】
タンパク質成分は、ペプチドやタンパク質の純化に適した周知の方法によって更に純化されてもよい。上記の方法としては、遠心分離法、等電値での沈殿法、相分離法、除外濾過法、ゲルクロマトグラフィ（粒径排除クロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィまたはＨＰＣＬなどがあり、また上記の方法を組み合わせてももちろんよい。分離工程として好ましくは、ゲルクロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィがよい。
【００４３】
分離のためのゲルクロマトグラフィ工程は、１００ｋＤの除外限度を有するゲルが詰められたカラム内で行なわれることがとりわけ好ましい。カラムは、抗生作用を持つ１Ｍ ＮａＣｌの分留が補充される前に蒸留水で均衡される。そして、カラムは蒸留水またはアンモニウム酢酸塩によって溶離される。こうすることによって、１つの同じ工程において塩分除去と純化を一度に行なうことができる。このようにタンパク質成分は、更なる純化工程を行なうことなく、例えば凍結乾燥などによって乾燥で濃縮されることも可能である。
【００４４】
そして、抗菌的な性質を持ち、１０から２０ｋＤの見掛け分子量を有するタンパク質分留は単離される。
【００４５】
本発明におけるタンパク質成分の純化は、本発明で全て企図されている当業者には周知のその他たくさんの方法によっても達成できることは、当業者には理解してもらえるだろう。
【００４６】
植物クロマチンを個々の成分に解離することができるならば、へパリン、アルギン酸、フィチン酸またはバナジウム化合物などの錯化剤を解離剤として用いることも可能である。抗生的に活性したタンパク質成分はアルギン複合体と共に形成されるため、解離剤としてはアルギン酸が特に好ましい。上記の複合体は、純化の目的で用いるほかにも、そこから抗菌作用をゆっくり放出させるためにも用いられる。
【００４７】
本発明の解離した植物クロマチンを、例えば疎水相互作用による分離作業によって個々の分留に分離する前は、解離された植物クロマチンの出発原料には抗菌作用は全く見られなかった。本発明による方法で植物のタンパク質成分が純化されると、ヘテロクロマチンが自動的に使用される。このように、クロマチン成分の物理的分離によって生物学的作用が引き続いて生じる。理論上では、この分離工程は成分の分子構造に結果として変化を生じさせる。
【００４８】
抗菌性ペプチドは、陽性電荷によって原核生物にその作用を及ぼすことは一般的に周知となっている。それと非常に似た、本発明によって得られるタンパク質成分の作用機序は、他のカチオンポリペプチドについて知られている事と異なるものではない。しかし、周知の塩基性ペプチドは、洗浄剤の作用を擬態し、細胞膜と相互作用を行なう効果を持つ。タンパク質成分のこのような作用機序は、グラム陽性の細菌だけでなくグラム陰性の細菌に対して及ぼすその作用によって確認されている。
【００４９】
本発明によると、抗菌的に活性したタンパク質成分は、疎水性マトリックスから溶離された後その他の純化工程を用いて、その他の植物材料から得ることもできる。これは、異なる生物材料から得られるタンパク質は植物材料の細胞の活性を反映して、異なる合成後の変異形態を示すためである。このように分離形態は、本発明によって得られたタンパク質成分の例えばアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、グリコシル化及びＡＤＦ−リボシル化の程度によって影響されるのである。
【００５０】
これに対応して、植物クロマチンから単離されたタンパク質成分は順じて化学的に変化する。このような変化は、分子量における変化及び／またはアセチル化レベルにおける変化を含み、結果としてより特定された生物的活性を有する分離的形態となる。
【００５１】
本発明による方法で得られたタンパク質成分の抗菌効果は、制御物質としてニシン（ｎｉｓｉｎ）が用いられる標準化されたバイオスクリーン法（Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標） ｍｅｔｈｏｄ）において確認することができる。ニシン（ｎｉｓｉｎ）と比較して、２から４ｍｇ／ｍｌに相応するタンパク質成分が結果として採取でき、殺菌効果が見られた。さらに、グラム陰性の細菌に対する効果は、ニシンの欠如として現れた。
【００５２】
本発明による簡単な純化法によって、抗菌性タンパク質成分の製造を実質的に無限の規模で行なうことが可能となる。工程における収穫は、１キロの原料（例えばルートリングス）から約１グラムのタンパク質が得られる。例えば６日間麦芽されたような、最大限のタンパク質合成体を有する発芽種子を用いると収穫は最大となる。Ｓ段階において増殖された植物細胞を用いると、自然クロマチンタンパク質合成物は最大となり、合成されたタンパク質の合計の最高で８０％を表す。
【００５３】
本発明によって得られた、抗菌剤としての植物クロマチンから単離されたタンパク質成分は、１つまたは複数の相乗効果を有する抗菌剤と共に用いることでその働きを強化することが可能である。上記の相乗効果を有する抗菌剤の例としては、リゾチーム、プロタミン、キレート剤、第２銅化合物及びバクテリオシンなどがある。
【００５４】
植物クロマチンのタンパク質成分は、微生物感染を治療するための薬理的組成を製造する際に適する。また、本発明は治療に効果的な量のタンパク質成分が投与されることによって、人間を含む哺乳類における微生物感染を治療する方法も企図している。
【００５５】
このタンパク質成分は、歯及び歯茎の疾患を治療するための口内使用、例えば皮膚病的疾患、皮膚及び髪の疾患、耳及び眼科疾患などの外部的な治療のための局所使用として用いることができる。この植物クロマチンタンパク質成分は、口、喉、肺、膣及び直腸、それに病原菌となる微生物の消化に伴う胃腸疾患の治療のために口部などの体の穴部に使用することもできる。
【００５６】
タンパク質成分は抗菌剤として用いられる際、様々な塩や緩衝液を含んだ緩衝された水性媒体において形成されてもよい。塩は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはは硫酸ナトリウムなどのアルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物であることが好ましい。緩衝液としては様々な物が使用でき、例えばクエン酸塩、リン酸、ＨＥＰＥＳ、トリス、またはその類の物質で、生理学的にそれぞれの用途に使用できる範囲内であればよい。
【００５７】
タンパク質成分が乾燥粉として形成される場合、溶液において続いて使用されるために、様々な結合剤またはその他の添加剤が用いられることもある。上記の結合剤は、様々なポリオール、不活性粉末またはその他の増量剤などを含む。本発明による使用法には、細菌または菌類を殺すために効果的な量の純化されたタンパク質成分と適したキャリアーから構成される組成も包括される。このような組成は細菌や菌類を退治するための様々な方法に用いることができ、例えば家庭内または実験室における周知のキャリアーを用いた抗菌製剤に用いられる。
【００５８】
異なる組成は、異なる生物に対して異なる程度の作用を有する。細菌や菌類などの有害な微生物を殺すために効果的な量やその他の有害な溶剤は、当業者にはたやすく特定することができるであろう。
【００５９】
また本発明によるタンパク質成分は、タンパク質加水分解変質に対してタンパク質成分を保護するための予防剤として作用するため、その他のタンパク質と組み合わせられてもよい。別の案としては、本発明によるタンパク質成分または組成は保存剤または殺菌剤として、例えばコンタクトレンズの溶液、軟膏、シャンプー、薬剤、食品やその類のものなど、多種多様な処方で用いることができる。用いるタンパク質成分の量は、その他の成分の性質、必要とされる抗菌保護の程度及び組成の意図とする用途によって変わる。
【００６０】
タンパク質成分は、例えば適したキャリアーと共に除菌や表面の照射殺菌のための組成として、食品の高圧低温殺菌の補助として、そして例えば養魚における水の防腐剤として使用されることも可能である。またタンパク質成分は、包装材に包まれた際にもそこからゆっくりと放出するように、細菌を殺すために効果的な量で使用される。
【００６１】
例
これより本発明は、以下に記載の例を参照にしてさらなる説明及び明示を行なう。しかし、これらの例は本発明の範囲を限定するためのものでは決してないことを留意されたい。
【００６２】
例１．抗菌性の実験
マイクロタイタ―プレートのくぼみには、その２倍の濃度の３００μｌの成長媒体（ブイヨン＋１％のブドウ糖）が充たされた。複製された試料は、２、０．５及び０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を有するタンパク質成分の最終的な濃縮物のそれぞれに加えられた。
【００６３】
シュードモナス・フローレセンス（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（グラム陰性の好気性細菌）とリステリア・イノキュア（Ｉｎｎｏｃｕａ）（グラム陽性の好気性細菌）の２つの実験生物が用いられた。
【００６４】
一晩おいた細菌株の培養菌はペプトン水に溶解され、それぞれ株は５０μｌづつ、１ｍｌにつき１０⁴細胞の濃度でくぼみに加えられた。実験材料が加えられていない、参考となるくぼみ（実薬対照）が用いられた。
【００６５】
プレートは３０℃で７２時間、バイオスクリーン分析装置において培養され、細菌の成長は可視光における吸収度の増加として毎１５分置きに記録された。
【００６６】
例２．採取及び分留
植物タンパク質またはポリペプチドを採取及び分留する場合、植物の組織の構造、体質及び生化学が異なるため、電流または従来の動物緩衝液及び／または浸清の技術を用いることが不可能な場合が多い。細胞組織において高分子組成及び相互作用が複雑であればある程（例としてフェノール、炭水化物及び炭化水素の化合物など）、細胞壁はより緻密になり、本来のポリペプチドを確保するために植物採取物における浸清及び単離法を厳重に行なう。
【００６７】
大麦の葉（生葉の重量で１キロ）を使用して、ランゲンバック及びその他（Ｌａｎｇｅｎｂｕｃｈ ｅｔ ａｌ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２、２０７−２２０（１９８３））による採取及び分留を行なった。大麦核クロマチンは、０．４Ｎの硫酸を用いて１０から２０ｍｇという標準的な収穫が得られた。
【００６８】
次いで、タンパク質成分の大規模な分離的な単離を行なうための、特別な再分留（サブフラクショネーション（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ））技術が行なわれた。分化溶解性によって、ある特定のタンパク質成分（ＭＷ１７，３００）がエタノール（８０％）：ＨＣｌ（０．２５Ｎ）において得られた。
【００６９】
屋内のリステリア及びシュードモナス株の標準に対する抗菌作用を調べるためにタンパク質成分には実験が行なわれた。
【００７０】
双方の生物の増加に対する合計的な抑制は、エタノールと水の両方において溶解する分留を用いて見られた。効果は濃度依存性で、つまり所定のしきい値に達しなければならない（溶液１：１では効果は見られない）。
【００７１】
抗菌作用は、ＭＷ１７，３００の特定のタンパク質成分だけに限定される。これ以上のタンパク質成分では、作用は見られない。
【００７２】
例３．別案としての採取及び分留
発芽後２週間の豆、小麦、ライ麦及び綿の発芽に、シドロヴァとコナレヴ（Ｓｉｄｏｒｏｖａ ＆ Ｋｏｎａｒｅｖ、Ｂｉｏｋｈｉｍｉｉａ ４６、１２９８（１９８１））による再分留工程を行なった。
【００７３】
ＭＷ１７，３００のある特定のタンパク質成分だけでなく、それより大きなタンパク質成分が得られた。
【００７４】
タンパク質成分はその抗菌作用を見るために検査され、その結果は例１で得られたものと同じであった。
【００７５】
例４．改良された分留工程
モルトは地元の醸造所から入手した。そのモルトは、従来の麦芽製造法で６日間発芽されたものだった。
【００７６】
モルト（１００グラム）は４Ｍ ＮａＣｌにおいて懸濁され、ブラウンミキサー（Ｂｒａｕｎ ｍｉｘｅｒ）で約１０分間均質化された。均質化物は２０μｍのこし器を通して濾過され、そこで得られた溶液は２０グラムの疎水性マトリックス（Ｎｏｖａｒｏｓｅ（登録商標） Ｓ−Ｂｕｔｙｌ １０００／４０ Ｉｎｏｖａｔａ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）に加えられ、４Ｍ ＮａＣｌにおいて均衡された。この混合物は１０分間攪拌され、マトリックスは４０μｍのこし器を通して濾過された。
【００７７】
そしてマトリックスはカラム（２５×５０ｍｍ）に詰められ、溶離される前に４Ｍ ＮａＣｌで洗われる。２５４ｎｍでの溶離液の上昇した吸収度から特定できるように、この高いイオン強度ではＤＮＡはマトリックスと結合せず、カラムを詰めて洗う工程の際に溶離された。
【００７８】
２Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ及び水と順次それぞれと溶離された後、特定のタンパク質の最高値は２７６ｎｍで紫外線吸収率によって記録された。これは非クロマチン材料の２Ｍ ＮａＣｌでの脱着に相当する。
【００７９】
例５．再分留（サブフラクショネーション）作業
例４で１Ｍ ＮａＣｌにおいて脱着した分留は、ノヴァローズ（Ｎｏｖａｒｏｓｅ）ＳＥ−１００／４０（Ｉｎｏｖａｔａ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）のカラム（２５×５００ｍｍ）で、０．１Ｍアンモニウムアセテートにおける分離ゲルクロマトグラフィによって更に分留された。
【００８０】
３つのタンパク質分留が得られ、凍結乾燥される。中間のタンパク質分留は、１０から２０ｋＤの分子量に相当する保有量を有していた。
【００８１】
従って植物クロマチンは、高い陽性電荷を有し、このような分子量範囲を持つ高アセチル化された疎水性塩基タンパク質における単離に都合の良い材料であるといえる。
【００８２】
ノヴァローズ１００／１７（Ｉｎｏｖａｔａ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）のカラム（８×３００ｍｍ）の０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐｈ７．０において分析的ゲルクロマトグラフィを行なった結果、この分留は約１４ｋＤの分子量に相当することが分かった。
【００８３】
例６．別案としての分留工程
例４と同様の状況だが、疎水性マトリックスとしてノヴァローズＳ―フェニル（Ｉｎｏｖａｔａ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた、比較的な実験が行なわれた。カラムが１Ｍ ＮａＣｌと溶離した際にタンパク質の脱着は検知されず、水と溶離した際には分留は１つしか得られなかった。水に２２％のエタノールが含まれた溶液を用いても、疎水性マトリックスからタンパク質物質の脱着は見られず、これはマトリックスとタンパク質物質との結合はきわめて疎水的であることを示している。
【００８４】
例７．抗菌作用の確立
例５において得られた中間の分留は、その抗菌作用に関連して更に調べられた。凍結乾燥された分留をリン酸緩衝液（ｐｈ７．０）において４ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して、試料が準備された。そして、これらの溶液はリン酸緩衝液によって４倍から１０倍に薄められた。
【００８５】
得られた結果は、例４及び５におけるプロトコルに応じて製造されると、ＭＷ１７，３００の特定のタンパク質成分によって例５で得られた結果と切り離せない。
【００８６】
留意すべきは、ゲルクロマトグラフィ工程によって得られた分留のどれにおいても抗菌作用は見られなかったということである。
【００８７】
例８．Ｃ値の効果
同様の抗菌作用を持つタンパク質成分は、例４及び５で説明した工程を用いて、７２時間置かれたのシロイヌナズナ及び小麦発芽のクロマチンから単離された。これらの種類の１０から２０ｋＤを有する中間の分留の平均収穫は驚くほど異なり、最も好適な採取源は小麦であった。大麦と比べると、所望の分留は約２倍の量に含まれていた。
【００８８】
例９．分析的電気泳動
標準のプロトコルに次いで行なわれる分析的電気泳動（Ｐａｎｙｉｍ ＆ Ｃｈａｌｋｌｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８：３９７２、１９６９）は、２８，０００と３５，０００の間の分子量を有するタンパク質成分よりも高い分子量の再分留（サブフラクション）を存在させることなく、ＭＷ１７，３００を有するある特定のタンパク質成分の変異体を多数表す。
【００８９】
これらの結果は、植物類におけるゲノムの大きさの相違を反映している。シロイヌナズナは小さな２００Ｍｂｐの２倍体ゲノムを有し、これに対応して１７，０００Ｍｂｐの６倍体ゲノムを有する小麦よりも収穫は低くなるのだ。
【００９０】
従って、採取物の収穫はＣ値として表されるゲノムの多きさに密接に関連していると言える。
【００９１】
比較例１． 動物のヒストンとの比較
例５のような緩衝された分離媒体における分析的クロマトグラフィの結果が、ウシのヒストンＨ２Ａ及びＨ２Ｂの分子量に相当する１４ｋＤの分子量を表したので、本発明によるタンパク質成分と動物ヒストンとを比較実験が行なわれた。
【００９２】
商用的に手に入れることが可能なウシのヒストンＨ２Ａ及びＨ２Ｂ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と、例４において得られた１０から２０ｋＤの分子量を有する中間の分留とにおける並列制御（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）実験が、ノヴァローズＳＥ−１００／１７（Ｉｎｏｖａｔａ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）のカラム（８×３００ｍｍ）において０．１Ｍのｐｈ７．０のリン酸緩衝液分析的ゲルクロマトグラフィを用いて行なわれた。
【００９３】
得られた全ての分留は抗菌作用を調べるために検査され、植物クロマチンから単離されたタンパク質成分において肯定的な結果が繰り返し得られた。
【００９４】
もう１つの比較実験においては、第１の分留によって抗菌作用はほとんど見られず、これは植物ヒストンＨ１に予期されていた結果であった。さらに、塩溶水におけるヌクレオソームの解離形態は動物と植物とで異なり、動物に用いられる標準プロトコルは植物では使用できないことが分かった。
【００９５】
比較例２． 水溶液の採取
完全なる植物組織ポリペプチドを採取するためには、いくつかの方法がある。用いられる方法は、細胞成分で濃縮された様々な組織の分留の分離に有利に働く。それとは対称に、動物のシステムには多少一般的な分離技術が多数紹介されている。
【００９６】
上記のような技術はカレン・バレット（Ｋａｒｅｎ Ｂａｒｒｅｔｔ）によって米国特許第５６９８２００号において研究されており、麦芽した雑穀粒子においていくつかの単純な水溶液が調べられた。
【００９７】
大麦の葉（参照：例２）を出発原料として、米国特許第５６９８２００号における例１及び２と同様のこれに続いて行なわれる方法が用いられた。
【００９８】
すると１０から２０ｋＤの範囲の貯蔵タンパク質のみが確認された。このタンパク質は、抗菌作用を全く示さない。
【００９９】
結論的には、米国特許第５６９８２００で説明されているどの方法を用いても、出発原料が細胞質物であるためクロマチンは放出されないことが分かった。多くの場合、２から３ｋＤという低い分子量を有する細胞復害性硫黄ポリペプチドとして特徴付けられる周知の植物ディフェンシンであるテオニンが得られた。

Claims (32)

1. 見掛け分子量が１０から２０ｋＤの間の数値であることを特徴とする植物クロマチンから解離された後に植物クロマチンから単離されたタンパク質成分を抗菌剤として使用する方法。
2. 上記の植物クロマチンはヘテロクロマチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 上記の植物クロマチンは３０００Ｍｂｐを超えるＤＮＡのＣ値を有することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 上記の植物クロマチンは植物の種子から採取されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 上記の植物の種子はオート麦、小麦、大麦、ライ麦、とうもろこし、米、菜種、大豆、粟、または蕎麦の実から採取されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 上記の植物クロマチンは発芽した状態の上記の種子から採取されることを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
7. 上記の抗菌剤はグラム陽性の細菌だけでなくグラム陰性の細菌に対しても作用することを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 上記のグラム陽性の細菌はリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 上記のグラム陰性細菌はシュードモナス・フローレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. 少なくとも１つの抗菌的な相乗作用を有する薬剤と共に使用されることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載のタンパク質成分の使用法。
11. 上記の少なくとも１つの抗菌的な相乗作用を有する薬剤はリゾチーム、プロタミン、キレート剤、第２銅化合物、またはバクテリオシンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 錯化剤と複合し、それがタンパク質成分からゆっくりと放出されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載のタンパク質成分の使用法。
13. 上記の錯化剤はアルギン酸であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 食品添加物としての組成において、適切なキャリアー及び細菌を殺すために効果的な量の請求項１から１３のいずれか１項に記載のタンパク質成分の使用法。
15. 成長を促進する家畜飼料添加物としての組成において、適切なキャリアー及び請求項１から１３のいずれか１項に記載のタンパク質成分の使用法。
16. 表面の消毒及び照射殺菌を行なうための、食品の高圧低温殺菌の補助としての組成において、適切なキャリアー及び細菌を殺すために効果的な量の請求項１から１３のいずれか１項に記載のタンパク質成分の使用法。
17. 包装材料に包装され、そこからゆっくりと放出されることを特徴とする細菌を殺すために効果的な量の請求項１から１３のいずれか１項に記載のタンパク質成分の使用法。
18. 水質保全剤としての組成において、適切なキャリアー及び細菌を殺すために効果的な量の請求項１から１３のいずれか１項に記載のタンパク質成分の使用法。
19. 養魚における請求項１８に記載の使用法。
20. 植物クロマチンを露呈するために植物材料を均質化し、
    疎水の状況において上記の植物クロマチンを解離剤によって解離し、
    上記の解離された植物クロマチンを、疎水相互作用による分離法を用いて上記のタンパク質植物成分から成る個々の分留に分離する、という上記の手順から構成される抗菌作用を有するタンパク質植物成分を製造する方法。
21. 上記の均質化は上記の解離剤において行われることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. 上記の解離剤は、尿素、グアニジン、塩素、または塩化物であることを特徴とする請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
23. 上記の塩化物は、塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
24. 上記の解離剤は、上記のタンパク質成分から形成された複合物である錯化剤であることを特徴とする請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
25. 上記の錯化剤はヘパリン、アルギン酸、フィチン酸またはバナジウム化合物であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 上記の分離が行われることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
27. 上記の疎水相互作用による分離法は、疎水クロマトグラフィ、金属キレートクロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ、逆電流クロマトグラフィまたはガスアフロン（ｇａｓ ａｐｈｒｏｎ）分配であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. 上記の疎水相互作用による分離法における機能性リガンドはエーテル、イソプロピル、ブチルまたはオクチル群であることを特徴とする請求項２６または２７のいずれかに記載の方法。
29. 上記の疎水相互作用による分離法の後に更なる分離法が行われることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
30. 上記の更なる分離法はゲルクロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
31. 微生物感染を治療するための薬理的組成の製造において、上記のタンパク質成分は１０から２０ｋＤの間の数値の見掛け分子量を有する、植物クロマチンから分離された後に単離されたタンパク質成分の使用法。
32. 治療に効果的な量の植物クロマチンから解離された後に単離され、１０から２０ｋＤの間の数値の見掛け分子量を有するタンパク質成分が投与されることを特徴とする人間を含む哺乳類における微生物感染を治療するための方法。