PT1420646E - Agente antimicrobiano - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "AGENTE ANTIMICROBIANO" A presente invenção relaciona-se com a utilização de um componente proteico isolado a partir da cromatina vegetal. Mais precisamente, a invenção relaciona-se com a utilização não terapêutica de um componente proteico isolado da cromatina vegetal, após dissociação da mesma, como um agente antimicrobiano, bem como com um método de produção do mesmo. A invenção relaciona-se ainda com a utilização do referido componente proteico no fabrico de uma formulação farmacêutica para o tratamento de infecções microbianas. A maior parte dos organismos eucariotas produzem uma grande variedade de mecanismos protectores orientados para agentes infecciosos. Vários mecanismos baseiam-se nas diferenças fundamentais que existem na composição e organização da membrana entre os microrganismos e as células de organismos multicelulares complexos, i.e. eles são orientados para as membranas externas de microrganismos sensíveis. Estas membranas são constituídas por lípidos com grupos cabeça carregados negativamente virados para fora e, aparentemente, os microrganismos têm dificuldade em anular os efeitos através da alteração da composição e organização da sua membrana. Deste modo, as substâncias responsáveis pela acção antibiótica são candidatos potenciais como substitutos de antibióticos. 2

Um exemplo é as proteínas de transferência de fosfolípidos, as quais são capazes de transferir fosfolípidos entre membranas. Foram descritas proteínas de transferência de fosfolípidos antimicrobianas numa gama de espécies vegetais, incluindo cereais, e estas proteínas variam na sua actividade contra patogéneos diferentes. Por exemplo, na US 5 698 200 é demonstrado que uma parte da planta pode ser protegida de uma bactéria patogénica para vegetais por meio de um extracto aquoso obtido a partir de grãos de cereais maltados.

No entanto, a classe mais estudada de agentes protectores é a dos péptidos antimicrobianos. Eles estão presentes em todas as espécies vivas, desde as plantas e insectos até aos animais, incluindo moluscos, crustáceos, anfíbios, pássaros, peixe, mamíferos e seres humanos.

Estes péptidos interagem directamente com as bactérias e matam-nas. Eles são designados por antimicrobianos porque eles têm um espectro invulgarmente largo de actividade incluindo a aptidão para matar ou neutralizar bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, fungos (incluindo leveduras), parasitas (incluindo planárias e nemátodas), células neoplásicas e até mesmo vírus com envelope como o HIV e o vírus do herpes simplex. Duma maneira geral, estes agentes têm um comprimento que varia desde tão pouco quanto 12 aminoácidos até moléculas com mais de 70 resíduos. Foram descobertos mais de 500 destes péptidos.

Foi estudado em pormenor o modo de acção antimicrobiana dos péptidos antimicrobianos, quase sempre catiónicos, entre péptidos tais como a melitina, magainina, 3 gramicidina, cecropina e defensinas. De um modo geral as moléculas antimicrobianas também deterioram as membranas dos organismos que elas atacam. Constatou-se que os péptidos antimicrobianos catiónicos possuem actividade bactericida In vitro e in vivo. Eles matam muito rapidamente, não seleccionam facilmente mutantes resistentes, são sinérgicos com os antibióticos convencionais, outros péptidos e lisozimas, e são capazes de matar bactérias em modelos animais.

Como consequência são actualmente desenvolvidos péptidos antimicrobianos de origem animal como novos fármacos antibióticos. Os exemplos são a versão sintética de magainina (pexiganano) e o análogo de uma protegrina, um péptido antimicrobiano inicialmente isolado de neutrófilos de porco.

No entanto, as fontes naturais não provaram serem economicamente vantajosas para a produção de novos antibióticos alternativos. A única excepção é o péptido antimicrobiano nisina, o qual pode ser eficazmente produzido numa estirpe de Lactococcus lactis com elevada resistência para a substância.

Descobriu-se também um número crescente de proteínas maiores ou de fragmentos destas que exibem actividades antimicrobianas. Por exemplo, uma proteína de macrófagos murinos, ubiquicidina, parece ser a mesma que a proteína ribossómica S30. De igual modo, dois dos péptidos antimicrobianos do estômago da rã (Rana catesbeina) são derivados da extremidade N do pepsinogéneo. De modo semelhante foi isolado um péptido antimicrobiano, chamado 4 buforina I, do tecido do estômago de um sapo asiático (BBRC 218:408, 1996). A sequência de aminoácidos do péptido de 39 aminoácidos de comprimento é idêntica a 37 dos 39 resíduos amino-terminais da histona H2A de Xenopus.

Além disso, a molécula de proteína integral pode apresentar um potencial antimicrobiano. Foi detectada actividade antimicrobiana em extractos ácidos de fígado, intestino e estômago de salmões do atlântico (BBRC 284:549, 2001). A proteína antimicrobiana correspondente pode ser isolada do fígado de salmão utilizando extracção ácida seguida de precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de gel em grande escala (filtração de gel), HPLC de fase inversa e HPLC de exclusão molecular. Descobriu-se que a proteína antimicrobiana do salmão (SAM) tem uma massa molecular de 27,7 kD e foi identificada como a proteína histona Hl. Na WO 200110901, utiliza-se a proteína mamífera histona Hl do timo de bovino em formulações antimicrobianas para tratar infecções microbianas em diferentes organismos eucariotas. Deste modo, proteínas com outras funções bem estabelecidas parecem apresentar uma segunda propriedade ao serem antimicrobianas.

No entanto, a utilização de proteínas de bovino, em especial de proteínas do timo de bovino, deveria ser evitada uma vez que este tipo de material pode estar contaminado com vírus prejudiciais, em especial vírus da hepatite, ou com outros agentes patogénicos, por exemplo priões. O material bovino - quer contaminado ou não - tem de ser submetido a testes extremamente rigorosos quando se destina a ser utilizado em seres humanos. 5

Além do mais, o isolamento de novos antibióticos alternativos envolve a recolha de órgãos ou tecidos específicos de animais, seguido de procedimentos complexos de purificação para se obter um produto que pode ser utilizado associado a seres humanos ou animais domésticos. 0 objectivo da invenção é proporcionar um novo agente antimicrobiano, por meio do qual sejam eliminados os problemas supramencionados.

Um outro objectivo invenção é proporcionar um agente antimicrobiano, por meio do qual seja evitado o risco de transmissão de agentes infecciosos patogénicos para o Homem e/ou outros animais.

Ainda um outro objectivo é proporcionar um agente antimicrobiano que não possua sabor quando utilizado associado a alimentos.

Um outro objectivo da invenção é proporcionar um método de produção de um agente antimicrobiano, no qual sejam utilizados materiais de partida baratos.

Ainda um outro objectivo é proporcionar um método de produção de um agente antimicrobiano numa escala não limitada em termos práticos.

Ainda um outro objectivo é proporcionar um método de produção de um agente antimicrobiano, que não necessite de investimentos em unidades de fermentação bacteriana. 6

Estes objectivos são conseguidos pela utilização bem como pelo método de acordo com a invenção conforme reivindicada.

De acordo com a invenção é proporcionado um método o qual, de um modo simples e racional, permite a produção de um componente proteico o qual pode ser utilizado como um produto antimicrobiano, por exemplo como um fármaco, um conservante total durante o fabrico e transporte, um alimento funcional e/ou aditivo nutracêutico e como um aditivo de alimentos compostos para animais.

Um componente proteico pode ser preparado com uma facilidade surpreendente a partir de um material de partida inicialmente inerte contendo cromatina vegetal. No método da invenção, o ADN é separado da cromatina vegetal nuclear básica. De um modo preferido, a cromatina vegetal é obtida de sementes de plantas. As sementes de plantas adequadas são obtidas a partir de aveias, sorgo granifero, sorgo, trigo, cevada, centeio, milho, arroz, colza, soja, milho painço ou trigo mourisco. No entanto pode utilizar-se qualquer material vegetal contendo cromatina, tal como xylaria e outras plantas marinhas, para a preparação de um componente proteico antimicrobiano em grande escala. A cromatina vegetal utilizada para o isolamento do componente proteico deveria ser uma heterocromatina (cromatina silenciosa ou ADN de "desperdícios". A heterocromatina é cromatina hipoacetilada (desacetilada), que assume uma estrutura mais condensada do que a cromatina hiperacetilada devido a uma carga electropositiva maior. 7

Além disso, a escolha do material de partida de cromatina para uma extracção mais especifica da proteína é também dependente da localização do tecido celular e do estado de diferenciação. Por exemplo, um tecido constituído por células pequenas terá uma densidade celular maior e, por conseguinte, conterá provavelmente mais ácidos nucleicos e componente proteico antibacteriano acompanhante do que uma mesma quantidade de tecido constituído por células de tamanho maior.

De modo semelhante, muitas plantas transportam tamanhos muito grandes de genoma basal devido a um teor elevado de heterocromatina, adicionalmente aumentado por uma possibilidade poliploidia. A este respeito faz-se referência à quantidade de ADN por célula haplóide como medida pelo número de pares de bases (o índice c) . A variação no teor de ADN de um organismo é reflectida pelo seu índice c de ADN ou pelo tamanho do genoma basal. 0 índice c é definido como o teor de ADN como medido em peso ou número de pares de bases numa única cópia da sequência total de ADN presente dentro das células desse organismo. É a quantidade de ADN nuclear no seu núcleo haplóide ou gamético não replicado, independentemente do nível de ploidia taxonómica. Assim, o índice c iguala o tamanho do genoma em espécies diplóides, mas excede sempre o tamanho do genoma em espécies poliplóides.

Prefere-se também que sejam utilizadas células estaminais não diferenciadas que se auto-renovem. Estas estão presentes em meristemas, regiões que originam novo crescimento nas extremidades dos rebentos e raízes. Deste modo, as extremidades das raízes das plântulas são o 8 material de partida de eleição para extracção da cromatina e isolamento subsequente do componente proteico de acordo com a invenção. Esta matéria-prima está prontamente disponível em quantidades ilimitadas, uma vez que é um desperdício do malte da cerveja e do óleo de gérmen de trigo. São também adequadas outras matérias-primas vegetais de células em divisão mitótica em condições óptimas de crescimento para a preparação de um componente proteico de acordo com a invenção. Pode utilizar-se quaisquer rebentos e radículas ou gérmenes em fase de germinação. De um modo preferido, utiliza-se sementes de um dos quatro tipos de milho, que se deixam germinar.

Uma matéria-prima favorável em termos de custos que pode ser utilizada de acordo com a presente invenção é o que se chama de malte verde, o qual é um material de partida para a produção de cerveja. A indústria cervejeira produz malte verde a partir de cevada, a qual depois de humidificada é deixada germinar durante seis dias (maltagem). Este malte verde produzido industrialmente, ou os seus produtos secundários (bagaços), podem ser utilizados de acordo com a invenção para a produção de um componente proteico antimicrobiano.

Em conformidade, as radículas de milho e cevada diplóide (índice c de ADN de 5.000 Mbp) assim como de cebola (índice c de ADN de 18.000 Mbp) são materiais de partida adequados para extracção. De um modo preferido, o componente proteico antibacteriano é extraído de uma fonte 9 de cromatina, com um índice c de ADN que ultrapassa os 3.000 Mbp. É especialmente preferido que o material de partida do procedimento de purificação inclua cromatina veqetal isolada de células veqetais em proliferação na fase S. As sementes (grãos) em germinação com as suas radículas e as folhas jovens contêm um grande número de células na fase S.

No método da invenção para produzir um componente vegetal proteico com actividade antimicrobiana, o método compreende os passos de homogeneizar um material vegetal para expor a sua cromatina vegetal; dissociar a cromatina vegetal com um agente de dissociação em condições hidrófobas; e separar a cromatina vegetal dissociada em fracções individuais, compreendendo uma delas o componente vegetal proteico, por meio de um procedimento de separação por interacção hidrófoba.

Consequentemente, o material vegetal é primeiramente homogeneizado. A este respeito, o termo homogeneização significa uma ruptura das paredes celulares do material vegetal de modo a expor a cromatina da planta e a obter um homogenato sob a forma de uma pasta. As paredes celulares podem ser destruídas por qualquer um de um conjunto de métodos conhecidos dos especialistas na técnica incluindo, mas não se limitando a mistura com esforço de corte elevado, ultra-sons, destruição mecânica, explosão por pressão etc. As paredes celulares são destruídas por meio 10 de um dispositivo adequado, pelo qual se obtém um homogenato. A cromatina vegetal no homogenato é depois dissociada por meio de um agente de dissociação numa solução aquosa daquela em condições hidrófobas. Estas condições são aquelas que promovem interacções hidrófobas.

Os agentes de dissociação adequados são a ureia, cloreto de guanidinio e um sal de cloreto. De um modo preferido, o sal de cloreto é cloreto de sódio de força iónica elevada. É uma vantagem se a homogeneização do material vegetal for realizada no agente de dissociação. Deste modo é simplificado o procedimento de purificação e reduzido o número de passos de purificação. 0 procedimento de purificação do malte verde é iniciado por uma homogeneização do malte numa solução salina quase saturada contendo cloreto de sódio 4 Μ. A força iónica elevada dissocia a cromatina bem como os nucleossomas, sendo ao mesmo tempo impedida uma degradação simultânea do material proteico pelas proteases. De um modo preferido, a homogeneização é realizada na presença de uma matriz hidrófoba. 0 homogenato pode ser depois peneirado num peneiro ou numa rede ou noutro tipo de dispositivo para eliminar desperdícios celulares ou outras partículas da cromatina vegetal, os quais ficam retidos. Deste modo é obtida uma 11 solução transparente que facilita uma purificação subsequente da cromatina vegetal dissociada. A cromatina vegetal dissociada é depois separada em fracções individuais, compreendendo uma delas o componente vegetal proteico possuindo actividade antimicrobiana. A separação é preferencialmente realizada por meio de um procedimento de separação por interacção hidrófoba. De um modo preferido, o procedimento de separação por interacção hidrófoba é a cromatografia hidrófoba.

Outros exemplos de procedimentos de separação adequados são a partição em sistemas poliméricos, tais como cromatografia de partição, distribuição em contracorrente e partição gasosa "Aphron". A separação dos componentes de cromatina dissociados pode ser alternativamente realizada em colunas com geles de quelatos metálicos ou heparina imobilizada. 0 ligando funcional da matriz utilizado para a interacção hidrófoba e/ou procedimento de separação deverá ser um grupo éter, um isopropilo, um butilo ou um octilo. 0 grupo fenilo deverá ser evitado. De um modo preferido, o ligando funcional é um grupo butilo numa matriz de agarose a qual está até 4% reticulada. É conseguida uma densidade de ligando de 40-50 μιηοΐ/ml, o que origina uma capacidade de ligação de 7 mg de IgG por ml.

Por exemplo, após crivagem do homogenato de malte verde sob a forma de pasta, adiciona-se uma matriz hidrófoba em lotes à solução obtida, sendo a matriz hidrófoba um gel para cromatografia de interacção hidrófoba 12 (HIC) contendo grupos butilo activos. As matrizes adequadas são Novarose® S-Butyl 1000/40 de Inovata AB, Bromma, Suécia, e Butyl Sepharose® 4 de Amersham Pharmacia Biotech, Suécia. A matriz hidrófoba é depois lavada com a solução salina de força iónica elevada, sendo o ADN eliminado por lavagem.

Verte-se em seguida a matriz numa coluna e submete-se a uma eluição gradiente em degrau com força iónica decrescente de cloreto de sódio. É eluido um componente proteico antimicrobiano distinto a uma concentração de NaCl de 1 M. 0 componente proteico pode ser ainda purificado por meio de um método convencional adequado para purificação de péptidos/proteinas. Estes métodos incluem centrifugação, precipitação no ponto isoeléctrico, separações de fase, ultrafiltração, cromatografia de gel (cromatografia de exclusão molecular), cromatografia de permuta iónica ou HPLC, assim como uma combinação destes métodos. De um modo preferido, o procedimento de separação subsequente é a cromatografia em gel ou a cromatografia de permuta iónica.

De um modo muito preferido é realizado um passo de cromatografia em gel preparativa numa coluna empacotada com um gel com um limite de exclusão de 100 kD. A coluna é equilibrada com água destilada antes de se carregar com a fracção de NaCl 1 M exibindo actividade antibiótica. Elui-se então a coluna com água destilada ou acetato de amónio. Deste modo obtém-se uma dessalinação e purificação ao mesmo tempo num único e mesmo passo. Deste modo, o componente proteico pode ser concentrado à secura, por exemplo por 13 meio de liofilização, sem quaisquer passos de purificação adicionais.

Isolou-se uma fracção proteica possuindo um peso molecular aparente entre 10 e 20 kD, que apresentou propriedades antimicrobianas. O especialista na técnica compreenderá que a purificação do componente proteico pode ser conseguida por muitos outros métodos conhecidos dos especialistas na matéria, os quais estão todos abrangidos pela presente invenção.

Também se pode utilizar um agente de complexação tal como heparina, ácido alginico, ácido fitico ou um composto de vanádio, como um agente de dissociação, desde que ele dissocie a cromatina vegetal nos seus componentes individuais. O ácido alginico é especialmente preferido como um agente de dissociação, formando-se complexos de alginato com o componente proteico antibioticamente activo. Estes complexos podem ser utilizados com o objectivo de purificação ou podem ser utilizados como tal para uma libertação lenta da actividade antimicrobiana daqueles.

Antes da separação da cromatina vegetal dissociada em fracções individuais de acordo com a invenção por meio, por exemplo, de um procedimento de separação por interacção hidrófoba, não pôde ser encontrada nenhuma actividade antimicrobiana no material de partida de cromatina dissociada. Quando os componentes vegetais proteicos são purificados de acordo com a invenção, a heterocromatina será automaticamente utilizada. Nestes termos, a actividade 14 biológica é obtida com sucesso pela separação física dos componentes da cromatina. Teoricamente, o procedimento de separação poderia originar uma estrutura molecular alterada dos componentes. É geralmente aceite que os péptidos antimicrobianos exercem a sua acção em procariotas por carga positiva. Não é esperado que os mecanismos de acção mais prováveis do componente proteico obtido de acordo com a invenção sejam diferentes do que é conhecido em relação a outros polipéptidos catiónicos. No entanto, os péptidos básicos conhecidos permitiram uma interacção com as membranas celulares semelhante à dos detergentes. Um tal mecanismo de acção do componente proteico é confirmado pela sua actividade contra bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas.

De acordo com a invenção podem ser obtidos outros componentes proteicos antimicrobianamente activos a partir de outros materiais vegetais através de outros procedimentos de purificação após eluição da matriz hidrófoba. Isto deve-se ao facto das proteínas de diferentes materiais biológicos exibirem diferentes padrões de modificação pós-sintética os quais reflectem as actividades celulares do material vegetal. Deste modo, um padrão de separação será influenciado pelo grau, por exemplo, de acetilação, fosforilação, metilação, ubiquitinação, glicosilação e ADP-ribosilação de um componente proteico obtido de acordo com a invenção.

Em conformidade, o componente proteico isolado da cromatina vegetal pode ser depois quimicamente modificado. 15

Tais modificações incluem alterações no peso molecular e/ou nivel de acetilação e resultariam em formas de preparação possuindo uma actividade biológica mais especifica. 0 efeito antimicrobiano do componente proteico obtido por meio do método da invenção pode ser determinado através de um método Bioscreen® corrente, em que se utiliza nisina como substância de controlo. Em comparação com a nisina obteve-se um efeito com o componente proteico correspondente a 2-4 mg/ml, efeito esse que é microbicida. Além disso, obteve-se um efeito contra bactérias Gram-negativas, o qual não ocorre com a nisina. 0 método de purificação simples da invenção permite produzir um componente proteico antimicrobiano numa escala praticamente ilimitada. 0 rendimento do processo é de cerca de 1 g de proteina a partir de 1 kg de matéria-prima (por exemplo radiculas). Utilizando sementes germinadas com uma sintese proteica máxima pode maximizar-se o rendimento, como se demonstra, por exemplo, para a maltagem durante seis dias. Quando se utilizam células vegetais em proliferação na fase S, a sintese da proteina natural cromatina é máxima e pode representar até 80% da proteina total sintetizada. O componente proteico isolado da cromatina vegetal de acordo com a invenção como um agente antimicrobiano pode ser intensificado em conjunto com um ou mais agentes sinérgicos antimicrobianos. Os exemplos de tais agentes sinérgicos antimicrobianos são a lisozima, protamina, agentes quelantes, compostos cúpricos e bacteriocinas. 16 0 componente proteico da cromatina vegetal é adequado para o fabrico de uma formulação farmacêutica para tratar infecções microbianas. 0 componente proteico pode ser utilizado em aplicações orais para tratar distúrbios dos dentes e gengivas, aplicações tópicas para utilização externa, tais como distúrbios dermatológicos, distúrbios da pele e cabelo, e distúrbios oto-oftalmológicos. 0 componente proteico da cromatina vegetal também pode ser utilizado nas cavidades do organismo, tais como boca, garganta, pulmões, vagina e recto, bem como por via oral para o tratamento de distúrbios gastrointestinais após digestão de microrganismos patogénicos.

Quando o componente proteico é para ser utilizado como um agente antimicrobiano, ele pode ser formulado em meios aquosos tamponados contendo uma diversidade de sais e tampões. De um modo preferido, os sais são halogenetos de metais alcalinos e alcalino-terrosos, por exemplo cloreto de sódio, cloreto de potássio ou sulfato de sódio. Pode utilizar-se vários tampões, tais como citrato, fosfato, HEPES, Tris ou semelhantes até ao teor em que esses tampões sejam fisiologicamente aceitáveis para o seu fim.

Pode utilizar-se vários excipientes ou outros aditivos, quando o componente proteico é formulado como um pó liofilizado, para utilização subsequente em solução. Os excipientes podem incluir vários polióis, pós inertes ou outros diluentes. 17 A utilização da invenção também inclui uma formulação a qual compreende o componente proteico purificado numa quantidade eficaz para matar bactérias ou fungos e um veiculo adequado. Estas composições podem ser utilizadas de várias formas para combater bactérias e fungos, por exemplo, em formulações antimicrobianas domésticas ou laboratoriais utilizando veiculos bem conhecidos na técnica.

Formulações diferentes terão graus de actividade diferentes para organismos diferentes. As quantidades eficazes a serem utilizadas para matar microrganismos nocivos, tais como bactérias e fungos, e outros agentes perniciosos podem ser facilmente determinadas pelos especialistas na técnica. 0 componente proteico de acordo com a presente invenção também pode ser combinado com outras proteínas para actuarem como conservantes para proteger o componente proteico contra degradação proteolítica. Alternativamente, o componente proteico ou formulações da invenção podem ser utilizados como conservantes ou desinfectantes numa grande variedade de formulações, tais como soluções para lentes de contacto, pomadas, champôs, medicamentos, alimentos e semelhantes. A quantidade de componente proteico pode variar em função da natureza de outros componentes, do grau de protecção antimicrobiana necessário e da utilização pretendida para a formulação. 0 componente proteico pode, por exemplo, ser utilizado em conjunto com um veículo adequado numa formulação para desinfecção e esterilização a frio de superfícies e como um 18 adjuvante na pasteurização a alta pressão de alimentos, assim como numa formulação como um agente conservante de água, por exemplo em piscicultura. 0 componente proteico também pode ser utilizado numa quantidade eficaz para matar bactérias guando fechado em materiais de embalagem para serem libertados lentamente a partir dos mesmos.

EXEMPLOS A invenção será agora ainda descrita e ilustrada relativamente aos exemplos que se seguem. Assinale-se, contudo, que estes exemplos não deverão ser interpretados como restringindo a invenção seja de que forma for.

Exemplo 1._Ensaio Antibacteriano.

Encheu-se os poços de uma placa microtitulo com 300 μΐ de meio de crescimento (Caldo Nutriente + 1% de glucose) ao dobro da sua concentração. Adicionou-se amostras duplicadas às concentrações finais dos componentes proteicos de 2, 0,5 e 0,2 mg/ml de proteína, respectivamente.

Utilizou-se dois organismos de ensaio: Pseudomonas fluorescens (uma bactéria aeróbica Gram-negativa) e Listeria innocua (uma bactéria aeróbica Gram-positiva).

Diluiu-se culturas nocturnas das estirpes bacterianas em água de peptona, e adicionou-se 50 μΐ de cada estirpe aos poços a uma concentração de 104 células/ml. Utilizou-se poços de referência (controlos positivos), os quais não continham nenhum material de ensaio. 19

Incubou-se as placas a 30 °C durante 72 h num dispositivo de análise Bioscreen®, sendo o crescimento bacteriano registado como um aumento da absorvância na gama de radiação visivel a cada 15 minutos.

Exemplo 2._Extracção e Fraccionamento.

Quando se extrai e fracciona as proteínas e polipéptidos vegetais, as diferenças na estrutura, fisiologia e bioguímica dos tecidos vegetais não permitem frequentemente a utilização de tampões para animais e/ou técnicas de maceração correntes ou convencionais. Uma composição macromolecular e interacções nos tecidos vegetais mais complexos (por exemplo, compostos fenólicos, hidratos de carbono e hidrocarbonetos) assim como uma parede celular mais compacta necessitam de métodos de maceração e isolamento mais rigorosos na preparação do extracto vegetal para garantir a integridade dos polipéptidos.

Submeteu-se folhas de cevada (1 kg, peso em fresco) ao procedimento de extracção e fraccionamento de Langenbuch et al., Plant Molecular Biology 2, 207-220 (1983). A cromatina de núcleos de cevada foi obtida com ácido sulfúrico 0,4 N com um rendimento típico de 10-20 mg.

Seguiu-se a técnica especial de subfraccionamento, a qual permite o isolamento em grande escala de componentes proteicos. Obteve-se um componente proteico específico (PM 17.300) por solubilidade diferencial em etanol (80%):HC1 (0,25 N). 20

Analisou-se os componentes proteicos para a presença de actividade antimicrobiana contra as estirpes correntes existentes no nosso laboratório de Listeria e Pseudomonas.

Obteve-se uma inibição total do crescimento de ambos os organismos com a fracção solúvel no etanol e na água. O efeito é dependente da concentração, isto é, tem de ser atingido um determinado valor limiar (não se obtém qualquer efeito à diluição de 1:1). A actividade antimicrobiana limita-se exclusivamente ao componente proteico especifico de PM 17.300. Não se obteve qualquer actividade com um componente proteico maior.

Exemplo 3._Extracção_e_Fraccionamento

Alternativos.

Submeteu-se plântulas com duas semanas de ervilha, trigo, centeio e algodão ao procedimento de subfraccionamento de acordo com Sidorova & Konarev, Biokhimiia 46, 1298 (1981).

Obteve-se um componente proteico especifico de PM 17.300 bem como um componente proteico maior.

Analisou-se os componentes proteicos para a actividade antimicrobiana e os resultados foram idênticos aos do Exemplo 1. 21

Exemplο 4 ._Procedimento_de_Fraccionamento

Melhorado.

Obteve-se malte verde de uma indústria cervejeira local. 0 malte foi germinado num processo de maltagem convencional durante 6 dias.

Suspendeu-se o malte verde (100 g) em NaCl 4 M e homogeneizou-se durante cerca de 10 minutos num misturador Braun. Filtrou-se o homogenato através de um peneiro de 20 μπι e adicionou-se então a solução obtida a 20 g de uma matriz hidrófoba (Novarose® S-Butyl 1000/40 Inovata AB, Suécia) equilibrada em NaCl 4 M. Agitou-se a mistura durante 10 minutos e filtrou-se a matriz através de um peneiro de 40 μιη.

Empacotou-se em seguida a matriz numa coluna (25 x 50 mm) e lavou-se com NaCl 4 M antes da eluição. A esta força iónica elevada, o ADN não se liga à matriz, como se determinou pelo aumento na absorvância do eluato a 254 nm e será, deste modo, eluido durante os procedimentos de empacotamento e lavagem da coluna.

Registou-se os picos distintos das proteínas por meio de absorção no UV a 276 nm após eluição em degrau com NaCl 2 M, NaCl 1 M e água, respectivamente. Isto corresponde a uma dessorção a NaCl 2 M de material não cromatínico.

Exemplo 5._Procedimento de Subfraccionamento. A fracção dessorvida a NaCl 1 M no Exemplo 4 foi adicionalmente subfraccionada por meio de cromatografia em 22 gel preparativa em acetato de amónio 0,1 M numa coluna (25 x 500 mm) de Novarose® SE-100/40, (Inovata AB, Suécia).

Obteve-se três fracções de proteínas e liofilizou-se. A fracção central da proteína tinha um volume de retenção que corresponde a um peso molecular entre 10 e 20 kD.

Consequentemente, a cromatina vegetal é uma fonte conveniente para o isolamento, nesta gama de peso molecular, de proteínas básicas hidrófobas hipoacetiladas com uma carga electropositiva elevada.

Na cromatografia em gel analítica em tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,0, numa coluna (8 x 300 mm) de Novarose® SEI 0 0/17, (Inovata AB, Suécia), constatou-se que esta fracção corresponde a um peso molecular médio de cerca de 14 kD.

Exempl o 6._Procedimen t o_de_Fr a cci on amen t o

Alternativo.

Realizou-se uma experiência comparativa nas mesmas condições que o Exemplo 4 mas com Novarose® S-Phenyl (Inovata AB, Suécia) como matriz hidrófoba. Não se detectou nenhuma dessorção de proteína quando a coluna foi eluída com NaCl 1 M e obteve-se apenas uma fracção após eluição com água. Nem sequer uma solução de etanol a 22% em água originou a dessorção do material proteico da matriz hidrófoba, o que indica que a ligação entre a matriz e o material proteico é extremamente hidrófoba. 23

Exemplο 7._Estabelecimento_da_Actividade

Antimicrobiana. A fracção central obtida de acordo com Exemplo 5 foi ainda avaliada em relação à sua actividade antimicrobiana. As amostras foram preparadas dissolvendo a fracção liofilizada em tampão de fosfato (pH 7,0) a uma concentração de 4 mg/ml. Estas soluções foram depois diluidas quatro até dez vezes com o tampão de fosfato.

Os resultados obtidos são indistinguíveis dos obtidos no Exemplo 5 pelo componente proteico especifico de PM 17.300, quando preparado de acordo com o protocolo dos Exemplos 4 e 5.

Assinale-se que nenhuma outra fracção do procedimento de cromatografia em gel apresentou de todo qualquer actividade antimicrobiana.

Exempl o 8._Efeito do índice c.

Isolou-se componentes proteicos de actividade antimicrobiana semelhante pelo mesmo procedimento que o descrito nos Exemplos 4 e 5 a partir de cromatinas de plântulas de Arabidopsis e de trigo com 72 h. Os rendimentos médios das fracções centrais de 10-20 kD destas espécies são impressionantemente diferentes, sendo o trigo uma fonte de extracção extremamente mais favorável. Relativamente à cevada, a fracção desejada está presente em quantidades aproximadamente duplas. 24

Exemplο 9._Electroforese Analítica . A electroforese analítica seguindo um protocolo corrente (Panyim & Chalkley, Biochem. 8:3972, 1969), apresenta variantes múltiplas do componente proteico específico de PM 17.300 sem a presença de quaisquer subfracções de peso molecular mais elevado de componentes proteicos com um peso molecular entre 28.000 e 35.000.

Estes resultados também reflectem a diferença no tamanho do genoma entre espécies vegetais. A Arabidopsis tem um genoma diplóide pequeno com 200 Mbp e, em harmonia, rendimentos mais baixos do que o trigo o qual tem um genoma hexaplóide grande com 17.000 Mbp.

Consequentemente, o rendimento de extracção relaciona-se de perto com o tamanho do genoma exprimido como o seu índice c.

Exemplo Comparativo 1. Comparação_com_Histonas

Animais.

Uma vez que a cromatograf ia analítica em meios de separação tamponados como no Exemplo 5 originou um peso molecular de cerca de 14 kD o qual corresponde aos pesos moleculares das histonas de vitelo H2A e H2B, efectuou-se uma comparação entre o componente proteico de acordo com a invenção e as histonas animais.

Realizou-se experiências de controlo paralelas com histonas de vitelo H2A e H2B comercialmente acessíveis (Sigma, USA) e com a fracção central obtida no Exemplo 4, 25 possuindo um peso molecular entre 10 e 20 kD, por meio de cromatografia em gel analítica em tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,0, numa coluna (8 x 300 mm) de Novarose® SE-100/17, (Inovata AB, Suécia).

Todas as fracções obtidas foram analisadas para a presença de actividade antibacteriana, sendo os resultados positivos repetidos para o componente proteico isolado de cromatina vegetal.

Uma outra experiência comparativa não demonstrou qualquer actividade antimicrobiana para a primeira fracção próxima do volume morto, uma posição esperada para a histona Hl vegetal. Além disso, foi novamente estabelecido que o padrão de dissociação dos nucleossomas numa solução salina difere entre animais e vegetais, e um protocolo corrente utilizado para animais não pode ser utilizado para vegetais.

Exemplo Comparativo 2. Extracção_com_Solvente

Aquoso.

Estão disponíveis poucos métodos que permitam extrair os polipéptidos do tecido vegetal inteiro. Os métodos utilizados favorecem a preparação de fracções de vários tecidos, as quais estão enriquecidas em componentes subcelulares. Contrariamente foi descrito um conjunto de técnicas preparativas mais ou menos "universal" para os sistemas animais. 26

Estas técnicas foram estudadas por Karen Barrett, US 5 698 200, tendo sido examinadas várias extracções simples com solvente aquoso em grãos de cereal maltado.

Utilizou-se os mesmos métodos a jusante como descritos nos Exemplos 1 e 2 da US 5 698 200 com folhas de cevada (c.f. Exemplo 2) como material de partida.

Identificou-se apenas proteínas de armazenagem na gama de 10-20 kD. Estas proteínas não apresentaram de todo qualquer actividade antibacteriana.

Conclui-se que não pode ser libertada nenhuma cromatina pelos métodos descritos na US 5 698 200, em que o material de partida é matéria citosólica. Muito provavelmente foram obtidas tioninas, as quais são defensinas vegetais bem conhecidas caracterizadas como polipéptidos de enxofre citotóxicos de baixo peso molecular, 2-3 kD.

Lisboa, 18 de Setembro de 2006

Claims (31)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização não terapêutica de um componente proteico isolado de cromatina vegetal, após dissociação da mesma, como um agente antimicrobiano, em que o referido componente proteico tem um peso molecular aparente entre 10 e 20 kD.
2. 2. Utilização como na reivindicação 1, em que a referida cromatina vegetal é heterocromatina.
3. 3. Utilização como na reivindicação 1 ou 2, em que a referida cromatina vegetal tem um índice c de ADN que excede 3.000 Mbp.
4. 4. Utilização como em qualquer uma das reivindicações 1- 3, em que a referida cromatina vegetal é obtida a partir de sementes de plantas.
5. 5. Utilização como na reivindicação 4, em que as referidas sementes de plantas são obtidas de aveia, trigo, cevada, centeio, milho, arroz, colza, soja, milho de painço ou trigo mourisco.
6. 6. Utilização como na reivindicação 4 ou 5, em que a referida cromatina vegetal é obtida a partir das referidas sementes durante a germinação.
7. 7. Utilização como na reivindicação 6, em que o referido agente antimicrobiano é dirigido contra bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas. 2
8. 8. Utilização como na reivindicação 7, em que as referidas bactérias Gram-positivas são Listeria innocua.
9. 9. Utilização como na reivindicação 7, em que as referidas bactérias Gram-negativas são a Pseudomonas fluorescens.
10. 10. Utilização de um componente proteico como em qualquer uma das reivindicações 1-9 em conjunto com pelo menos um agente antimicrobianamente sinérgico.
11. 11. Utilização como na reivindicação 10, em que o referido pelo menos um agente antimicrobianamente sinérgico é uma lisozima, protamina, um agente quelante, um composto cúprico ou uma bacteriocina.
12. 12. Utilização de um componente proteico como em qualquer uma das reivindicações 1-11 complexado com um agente de complexação para ser libertado lentamente a partir deste.
13. 13. Utilização como na reivindicação 12, em que o referido agente de complexação é o ácido alginico.
14. 14. Utilização de um componente proteico como em qualquer uma das reivindicações 1-13 numa quantidade eficaz para matar bactérias, e um veiculo adequado, numa formulação como um aditivo alimentar.
15. 15. Utilização de um componente proteico como em qualquer uma das reivindicações 1-13, e um veiculo adequado, 2 3 numa formulação como um aditivo de promoção do crescimento para alimentos compostos para animais.
16. 16. Utilização de um componente proteico como em qualquer uma das reivindicações 1-13 numa quantidade eficaz para matar bactérias, e um veiculo adequado, numa formulação para desinfecção e esterilização a frio de superfícies e como um adjuvante na pasteurização a alta pressão de alimentos.
17. 17. Utilização de um componente proteico como em qualquer uma das reivindicações 1-13 numa quantidade eficaz para matar bactérias empacotado em materiais de embalaqem para ser libertado lentamente a partir da mesma.
18. 18. Utilização de um componente proteico como em qualquer uma das reivindicações 1-13 numa quantidade eficaz para matar bactérias, e um veículo adequado, numa formulação como um conservante de água.
19. 19. Utilização como na reivindicação 18 em piscicultura.
20. 20. Método para produzir um componente vegetal proteico possuindo actividade antimicrobiana, o qual compreende os passos de: homogeneizar um material vegetal para expor a sua cromatina vegetal; dissociar a referida cromatina vegetal com um agente de dissociação em condições hidrófobas; e separar a referida cromatina vegetal dissociada em fracções individuais, uma das quais contém o 3 4 referido componente vegetal proteico, por meio de um procedimento de separação por interacção hidrófoba.
21. 21. Método como na reivindicação 20, em que a referida homogeneização é realizada no referido agente de dissociação.
22. 22 . Método como na reivindicação 20 ou 21, em que o referido agente de dissociação é ureia, cloreto de guanidinio ou um sal de cloreto.
23. 23 . Método como na reivindicação 22, em que o referido sal de cloreto é cloreto de sódio.
24. 24 . Método como na reivindicação 20 ou 21, em que o referido agente de dissociação é um agente de complexação, formando-se um complexo com o referido componente proteico.
25. 25. Método como na reivindicação 24, em que o referido agente de complexaçao é heparina, ácido alginico, ácido fitico ou um composto de vanádio.
26. 26. Método como na reivindicação 20, em que é realizada a referida preparação.
27. 27. Método como na reivindicação 26, em que o referido procedimento de separação por interacção hidrófoba é a cromatografia hidrófoba, cromatografia de quelato metálico, cromatografia de partição, distribuição em contracorrente ou partição gasosa "Aphron". 4 5
28. 28. Método como na reivindicação 26 ou 27, em que o ligando funcional no referido procedimento de separação por interacção hidrófoba é um grupo éter, isopropilo, butilo ou octilo.
29. 29. Método como na reivindicação 26, em que o referido procedimento de separação por interacção hidrófoba é seguido de outro procedimento de separação.
30. 30. Método como na reivindicação 29, em que o referido outro procedimento de separação é cromatografia em gel ou cromatografia de permuta iónica.
31. 31. Utilização de um componente proteico isolado de cromatina vegetal, após dissociação da mesma, no fabrico de uma formulação farmacêutica para tratar infecções microbianas, em que o referido componente proteico tem um peso molecular aparente entre 10 e 20 kD. Lisboa, 18 de Setembro de 2006 5