ES2268069T3 - Agente antimicrobiano. - Google Patents

Abstract

Uso no terapéutico de un componente proteínico aislado de cromatina vegetal, después de disociación de la misma, como un agente antimicrobiano, teniendo dicho componente proteínico un peso molecular aparente entre 10 y 20 kD.

Description

Agente antimicrobiano.

La presente invención se refiere al uso de un componente proteínico aislado de cromatina vegetal. De forma más precisa, la invención se refiere al uso no terapéutico de un componente proteínico aislado de cromatina vegetal, después de la disociación de la misma, como un agente antimicrobiano, así como a un método para producir el mismo.

La invención se refiere además al uso del componente proteínico mencionado en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar infecciones microbianas.

La mayoría de los organismos eucariotas producen una amplia variedad de mecanismos protectores dirigidos a los agentes infecciosos. Varios mecanismos se basan en las diferencias fundamentales que existen en la composición de la membrana y la organización entre microbios y células de organismos multicelulares complejos, es decir, se dirigen a las membranas exteriores de microbios sensibles. Estas membranas están compuestas de lípidos que tienen grupos de cabeza con carga negativa mirando hacia fuera, y según parece para los microbios es difícil contrarrestar los efectos alterando la composición y organización de su membrana. Por lo tanto, las sustancias responsables de la acción antibiótica son candidatos probables como sustituyentes para los antibióticos.

Un ejemplo son las proteínas de transferencia de fosfolípidos, que pueden transferir fosfolípidos entre membranas. Las proteínas de transferencia de fosfolípidos antimicrobianas se han descrito en una amplia variedad de especies de plantas incluyendo los cereales, y estas proteínas tienen distinta actividad frente a diferentes patógenos. Por ejemplo, en el documento US 5.698.200 se muestra que una parte de una planta se puede proteger de una bacteria patógena de plantas mediante un extracto acuoso obtenido del grano de cereal malteado.

Sin embargo, la clase de agentes protectores más estudiada es la de péptidos antimicrobianos. Se encuentran en todas las especies vivientes que van desde plantas e insectos a animales, incluyendo moluscos, crustáceos, anfibios, aves, peces, mamíferos y seres humanos.

Estos péptidos interaccionan directamente con las bacterias y las matan. Se denominan antimicrobianos porque tienen un espectro de actividad excepcionalmente amplio que incluye la capacidad de matar o neutralizar bacterias Gram negativas y Gram positivas, hongos (incluyendo levaduras), parásitos (incluyendo planarias y nematodos), células de cáncer, e incluso virus con envuelta tales como el VIH y el virus herpes simplex. En general, estos agentes tienen una longitud en el intervalo de tan pocos como 12 aminoácidos a moléculas con más de 70 restos. Se han descubierto más de 500 de dichos péptidos.

Se ha estudiado con detalle la acción antimicrobiana de los péptidos antimicrobianos casi siempre catiónicos entre los péptidos tales como la melitina, magainina, gramicidina, cecropina y defensinas. En general las moléculas antimicrobianas también dañan las membranas de los organismos que atacan. Se ha encontrado que los péptidos antimicrobianos catiónicos tienen actividad bactericida in vitro así como in vivo. Matan muy rápido, no seleccionan fácilmente mutantes resistentes, son sinérgicos con antibióticos convencionales, otros péptidos así como lisozimas, y pueden matar bacterias en modelos animales.

Como consecuencia, ahora se han desarrollado péptidos antimicrobianos de origen animal como nuevo fármaco antibiótico. Son ejemplos la versión sintética de la magainina (pexiganan) y el análogo de la protegrina, un péptido antimicrobiano aislado inicialmente de neutrófilos de cerdo.

Sin embargo, las fuentes naturales no han demostrado ser económicamente provechosas para la producción de nuevos antibióticos alternativos. La única excepción es el péptido antimicrobiano nisina, que se puede producir eficazmente en una cepa de Lactococcus lactis con alta resistencia frente a la sustancia.

También se ha encontrado que un número creciente de proteínas más grandes o sus fragmentos presentan actividades antimicrobianas. Por ejemplo, una proteína de macrófago murino, la ubiquicidina, parece que es igual a la proteína ribosomal S30. Además, dos de los péptidos antimicrobianos en el estómago de la rana toro (Rana catesbeina) se obtienen del extremo N del pepsinógeno. De la misma forma se ha aislado un péptido antimicrobiano, denominado buforina I, del tejido del estómago de un sapo asiático (BBRC 218:408, 1996). Se ha encontrado que la secuencia de aminoácidos del péptido de 39 aminoácidos de longitud era idéntica a 37 de los 39 restos amino-terminal de la histona H2A de Xenopus.

Además, la molécula de proteína entera puede presentar potencial antimicrobiano. Se ha detectado actividad antimicrobiana en extractos ácidos del hígado, intestino y estómago de salmones atlánticos (BBRC 284:549, 2001). La correspondiente proteína antimicrobiana se puede aislar del hígado de salmón usando la extracción ácida seguida de precipitación con sulfato amónico, cromatografía en gel a gran escala (filtración en gel), HPLC de fase inversa, y HPLC por exclusión de tamaños. Se encontró que la proteína de salmón antimicrobiana (SAM) tenía una masa molecular de 27,7 kD y se identificó como la proteína histona H1. En el documento WO 200110901 la proteína histona H1 de mamífero de timo bovino se usa en composiciones antimicrobianas para tratar infecciones microbianas en diferentes organismos eucariotas. Por lo tanto, parece que proteínas que tienen otras funciones bien establecidas, presentan una segunda propiedad al ser antimicrobianas.

Sin embargo, se debe evitar el uso de proteínas bovinas, en especial proteínas de timo bovino, puesto que dicho material puede estar contaminado con virus perjudiciales, en especial el virus de la hepatitis, u otros agentes patógenos, por ejemplo priones. El material bovino, esté o no contaminado, se debe someter a ensayos muy estrictos cuando se pretende usar en relación con seres humanos.

Además, el aislamiento de nuevos antibióticos alternativos implica recoger órganos o tejido animal específicos, seguido de procedimientos de purificación complejos con el fin de obtener un producto que se pueda usar en relación con seres humanos o animales domésticos.

El propósito de la invención es proporcionar un nuevo agente antimicrobiano, de modo que se eliminen los problemas mencionados antes.

Otro propósito de la invención es proporcionar un agente antimicrobiano, mediante el cual se evite el riesgo de pasar agentes infecciosos patógenos al hombre y/o a los animales.

Todavía otro propósito es proporcionar un agente antimicrobiano que sea insípido cuando se usa en relación con alimentos.

Un propósito adicional de la invención es proporcionar un método para producir un agente antimicrobiano, en el que se usan materiales de partida baratos.

Todavía otro propósito adicional es proporcionar un método para producir un agente antimicrobiano en una escala prácticamente ilimitada.

Todavía un propósito adicional es proporcionar un método para producir un agente antimicrobiano, que no requiera inversiones en la fabricación en instalaciones para fermentación bacteriana.

Estos objetivos se logran usando también el método de acuerdo con la invención como se reivindica.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método que de una forma sencilla y racional permite producir un componente proteínico que se puede usar como producto antimicrobiano, por ejemplo como un fármaco, un agente conservante completo durante la fabricación y transporte, un alimento funcional y/o aditivo nutricéutico así como un aditivo para alimento animal.

Se puede preparar un componente proteínico con sorprendente facilidad a partir de un material de partida inicialmente inerte que comprende cromatina vegetal. En el método de la invención, se separa el ADN de la cromatina vegetal nuclear básica. Preferiblemente la cromatina vegetal se obtiene de semillas vegetales. Las semillas vegetales adecuadas se obtienen de avena, sorgo en grano, milo, trigo, cebada, centeno, maíz, arroz, colza, soja, mijo o alforfón. Sin embargo, se puede usar cualquier material vegetal que contenga cromatina, tal como algas y otras plantas marinas, para preparar un componente proteínico antimicrobiano a gran escala.

La cromatina vegetal usada para aislar el componente proteínico debe ser una heterocromatina (cromatina silenciosa o ADN "redundante"). La heterocromatina es cromatina hipoacetilada (desacetilada), que adopta una estructura más condensada que la cromatina hiperacetilada debido a una carga electropositiva mayor.

Además, la elección del material de partida de la cromatina para la posterior extracción de la proteína específica también depende del tejido celular de la planta y el estado de diferenciación. Por ejemplo, un tejido compuesto de células pequeñas tendrá una densidad celular mayor, y por lo tanto es probable que contenga más ácidos nucleicos y componente proteínico antibacteriano que lo acompaña que la misma cantidad de otro tejido que comprenda tamaños mayores de células.

De la misma forma, muchas plantas llevan tamaños de genoma base muy grandes debido al contenido alto de heterocromatina, potenciado además por una posibilidad de poliploide. A este respecto, se hace referencia a la cantidad de ADN por célula haploide medido en número de pares de bases (el valor c). La variación del contenido de ADN de un organismo se refleja en su valor c de ADN o tamaño del genoma base. El valor c se define como el contenido de ADN medido en peso o en número de pares de bases en una sola copia de la secuencia entera de ADN encontrada en las células de ese organismo. Es la cantidad de ADN nuclear en su núcleo gamético o haploide sin replicar, independientemente del nivel ploídico del taxón. Por lo tanto, el valor c es igual al tamaño del genoma en especies diploides, pero siempre es mayor que el tamaño del genoma en especies poliploides.

También se prefieren usar las células madre que se autorrenuevan no diferenciadas. Estas se encuentran en meristemas, regiones que proporcionan crecimiento nuevo en las puntas de los brotes y las raíces. Así, las puntas de las raíces de los plantones vegetales son el material de partida superior para la extracción de cromatina y posterior aislamiento corriente abajo del componente proteínico de acuerdo con la invención. Dicha materia prima se puede conseguir fácilmente en cantidades ilimitadas, ya que es un producto de desecho en la fabricación de cerveza y aceite de germen de trigo.

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Otras materias primas vegetales de células que se dividen por mitosis en condiciones de crecimiento óptimas también son adecuadas para preparar un componente proteínico de acuerdo con la invención. Se puede usar cualesquiera retoños que estén germinando y raicillas o gérmenes en fase de germinación. Preferiblemente, se usan semillas de una de las cuatro clases de maíz, que se dejan germinar.

Una materia prima barata para usar de acuerdo con la presente invención es lo que se llama la malta verde, que es el material de partida para la producción de cerveza. La industria cervecera produce malta verde a partir de cebada, que después de humedecer se deja germinar durante seis días (malteado). De acuerdo con la invención esta malta verde producida de forma industrial, o sus subproductos (salvado), se puede usar para producir un componente proteínico antimicrobiano.

Por consiguiente, el salvado del maíz y la cebada diploides (valor c del ADN 5.000 Mpb) así como de la cebolla (valor c del ADN 18.000 Mpb) son materiales de partida adecuados para la extracción. Preferiblemente, el componente proteínico antibacteriano se extrae de una fuente de cromatina cuyo valor c del ADN es mayor que 3.000 Mpb.

Se prefiere en especial que el material de partida del procedimiento de purificación comprenda cromatina vegetal aislada de células vegetales que proliferan en la fase S. Así pues, las semillas que germinan (granos) con su salvado así como hojas jóvenes contienen un número grande de células en la fase S.

En el método de la invención para producir un componente vegetal proteínico que tenga actividad antimicrobiana, el método comprende las etapas de:

homogeneizar un material vegetal con el fin de exponer su cromatina vegetal;

disociar la cromatina vegetal con un agente de disociación en condiciones hidrófobas; y

separar la cromatina vegetal disociada en fracciones individuales, una de las cuales comprende el componente vegetal proteínico, mediante un procedimiento de separación por interacción hidrófoba.

Por consiguiente, el material vegetal primero se homogeneiza. A este respecto, el término homogeneización significa una disrupción de las paredes celulares del material vegetal de forma que la cromatina de la planta se exponga y se obtenga un homogeneizado en forma de una suspensión. La disrupción de las paredes celulares se puede hacer por cualquiera de una serie de métodos que conocen los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitar, mezcla de alta cizalladura, sonicación, disrupción mecánica, explosión por presión, etc. La disrupción de las paredes celulares se hace mediante un dispositivo adecuado, mediante el cual se obtiene un homogeneizado.

Después, la cromatina vegetal en el homogeneizado se disocia mediante un agente de disociación en una disolución acuosa del mismo en condiciones hidrófobas. Dichas condiciones son las que promueven las interacciones hidrófobas.

Los agentes de disociación adecuados son la urea, cloruro de guanidinio, y una sal de cloruro. Preferiblemente, la sal de cloruro es el cloruro sódico con fuerza iónica alta.

Es una ventaja que la homogeneización del material vegetal se lleve a cabo en el agente de disociación. De esta forma el procedimiento de purificación se simplifica y se reduce el número de etapas de purificación.

El procedimiento de purificación de la malta verde se inicia mediante la homogeneización de la malta en una solución salina casi saturada que comprende cloruro sódico 4 M. La fuerza iónica alta disocia la cromatina así como los nucleosomas, evitándose al mismo tiempo una degradación simultánea del material proteínico por las proteasas. Preferiblemente, la homogeneización se lleva a cabo en presencia de una matriz hidrófoba.

Después, el homogeneizado se puede tamizar en un tamiz o en una red de hilo metálico o similar, con el fin de eliminar los residuos celulares u otras partículas de la cromatina vegetal, que son retenidos en la misma. De esta forma se obtiene una solución transparente que facilita una posterior purificación de la cromatina vegetal disociada.

La cromatina vegetal disociada después se separa en fracciones individuales, una de las cuales comprende el componente vegetal proteínico que tiene actividad antimicrobiana. La separación se realiza preferiblemente mediante un procedimiento de separación por interacción hidrófoba. Preferiblemente el procedimiento de separación por interacción hidrófoba es la cromatografía hidrófoba.

Otros ejemplos de procedimientos de separación adecuados son el reparto en sistemas polímeros, tales como cromatografía de reparto, distribución contracorriente, y reparto en fase gaseosa Aphron. Alternativamente, la separación de los componentes de cromatina disociada se puede llevar a cabo en columnas con geles de quelato metálico o heparina inmovilizada.

El ligando funcional de la matriz usada para la interacción hidrófoba y/o procedimiento de separación debe ser un éter, un grupo isopropilo, un butilo, o un octilo. Debe evitarse un grupo fenilo. Preferiblemente, el ligando funcional es un grupo butilo en una matriz de agarosa que está reticulado un 4%. Se logra una densidad de ligando de 40-50 \mumol/ml, que da como resultado una capacidad de unión de 7 mg de IgG por ml.

Por ejemplo, después de tamizar el homogeneizado de malta verde en forma de una suspensión, se añade una matriz hidrófoba de forma discontinua a la solución obtenida, siendo el material hidrófobo un gel de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) que contiene grupos butilo. Las matrices adecuadas son Novarose® S-Butyl 1000/40 de Inovata AB, Bromma, Suecia, y Butyl Sepharose® de Amersham Pharmacia Biotech, Suecia. Después la matriz hidrófoba se lava con la solución salina de fuerza iónica alta, extrayéndose el ADN.

Después la matriz se vierte en una columna y se somete a una elución con gradiente por pasos con fuerza iónica decreciente de cloruro sódico. Se eluye un componente proteínico antimicrobiano claro con una concentración de NaCl 1 M.

El componente proteínico se puede purificar más mediante un método convencional adecuado para la purificación de péptidos/proteínas. Dichos métodos incluyen centrifugación, precipitación en el punto isoeléctrico, separaciones de fase, ultrafiltración, cromatografía en gel (cromatografía por exclusión de tamaños), cromatografía de intercambio iónico, o HPLC, así como una combinación de dichos métodos. Preferiblemente, el procedimiento de separación posterior es la cromatografía en gel o cromatografía de intercambio iónico.

Más preferiblemente, se lleva a cabo una etapa de cromatografía en gel preparativa en una columna empaquetada con un gel que tiene un límite de exclusión de 100 kD. La columna se equilibra con agua destilada antes de cargarla con la fracción de NaCl 1 M que presenta actividad antibiótica. Después, la columna se eluye con agua destilada o acetato amónico. De esta forma se obtiene al mismo tiempo una desalación y purificación en una sola y la misma etapa. Así pues, el componente proteínico se puede concentrar a sequedad, por ejemplo mediante liofilización, sin etapas adicionales de purificación.

Se aisló una fracción de proteína que tenía un peso molecular aparente entre 10 y 20 kD, que presentaba propiedades antimicrobianas.

El experto en la técnica observará que la purificación del componente proteínico se puede llevar a cabo por muchos otros métodos conocidos por los expertos en la técnica, todos los cuales están contemplados en esta invención.

También se puede usar un agente complejante, tal como heparina, ácido algínico, ácido fítico, o un compuesto de vanadinio, como un agente de disociación, con la condición de que disocie la cromatina vegetal en sus componentes individuales. Se prefiere en especial el ácido algínico como agente de disociación, con el que se forman complejos de alginato con el componente proteínico activo como antibiótico. Dichos complejos se pueden usar con el objetivo de purificación o se pueden usar como tales para la liberación lenta de la actividad antimicrobia-
na.

Ante de la separación de la cromatina vegetal disociada en fracciones individuales de acuerdo con la invención, por ejemplo, mediante un procedimiento de separación por interacción hidrófoba, no se podía encontrar actividad antibacteriana en absoluto en el material de partida de la cromatina disociada. Cuando los componentes vegetales proteínicos se purifiquen de acuerdo con la invención, se usará automáticamente la heterocromatina. Por lo tanto, la actividad biológica se forma sucesivamente por la separación física de los componentes de cromatina. En teoría, el procedimiento de separación podría dar como resultado una estructura molecular alterada de los compo-
nentes.

En general se acepta que los péptidos antimicrobianos ejercen su acción en procariotas por la carga positiva. Se espera que el mecanismo de acción más probable del componente proteínico obtenido de acuerdo con la invención no difiera del conocido para otros polipéptidos catiónicos. Sin embargo, los péptidos básicos conocidos permitirían una interacción con las membranas celulares que mimetiza la de los detergentes. Dicho mecanismo de acción del componente proteínico se confirma por su actividad dirigida contra bacterias Gram positivas así como bacterias Gram negativas.

De acuerdo con la invención, se pueden obtener otros componentes proteínicos activos como antimicrobianos de otros materiales vegetales mediante otros procedimientos de purificación después de la elución de la matriz hidrófoba. Esto se debe al hecho de que las proteínas de diferentes materiales biológicos presentan diferentes patrones de modificación post-sintética que reflejan las actividades celulares del material vegetal. Por lo tanto, a un patrón de separación le puede influir, por ejemplo, el grado de acetilación, fosforilación, metilación, ubiquitinación, glicosilación, así como ADP-ribosilación de un componente proteínico obtenido de acuerdo con la invención.

En la misma medida, el componente proteínico aislado de la cromatina vegetal posteriormente se puede modificar químicamente. Dichas modificaciones incluyen cambios en el peso molecular y/o nivel de acetilación, y darían como resultado formas de preparación que tienen una actividad biológica más específica.

El efecto antimicrobiano del componente proteínico obtenido mediante el método de la invención se puede determinar en un método de Bioscreen® normalizado, usándose nisina como una sustancia patrón. Comparado con la nisina, se obtuvo un efecto con el componente proteínico correspondiente a 2-4 mg/ml, que era un efecto letal para organismos. Además se obtuvo un efecto contra bacterias Gram negativas, que no está presente con la nisi-
na.

El método de purificación sencillo de la invención permite producir un componente proteínico antibacteriano en una escala prácticamente ilimitada. El rendimiento del procedimiento es aproximadamente 1 g de proteína a partir de 1 kg de materia prima (por ejemplo salvado). Usando semillas que germinan con síntesis de proteínas máxima se puede maximizar el rendimiento, como se muestra, por ejemplo, mediante el malteado durante seis días. Cuando se usan células vegetales que proliferan en la fase S, la síntesis de la proteína de la cromatina natural es máxima y puede representar hasta 80% de la proteína total sintetizada.

El componente proteínico aislado de la cromatina vegetal de acuerdo con la invención como agente antimicrobiano se puede intensificar junto con uno o más agentes sinérgicos antimicrobianos. Los ejemplos de dichos agentes sinérgicos antimicrobianos son lisozimas, protaminas, agentes quelantes, compuestos cúpricos, y bacteriocinas.

El componente proteínico de la cromatina vegetal es adecuado en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar infecciones microbianas.

El componente proteínico se puede usar en aplicaciones orales para tratar trastornos dentales y de las encías, en aplicaciones tópicas para uso externo, tal como en trastornos dermatológicos, trastornos de la piel y el pelo, y trastornos oto-oftalmológicos. El componente proteínico de la cromatina vegetal también se puede usar en cavidades corporales, tales como la boca, garganta, pulmones, vagina y recto, así como por vía oral para el tratamiento de trastornos gastrointestinales después de la digestión de microorganismos patógenos.

Cuando el componente proteínico se va a usar como un agente antimicrobiano, se puede formular en medios acuosos tamponados que contienen una variedad de sales y tampones. Preferiblemente, las sales son haluros alcalinos y alcalinotérreos, p. ej., cloruro sódico, cloruro potásico, o sulfato sódico. Se pueden usar diferentes tampones tales como citrato, fosfato, HEPES, Tris o similares, en la medida que dichos tampones sean fisiológicamente aceptables para su propósito.

Se pueden usar diferentes excipientes u otros aditivos cuando el componente proteínico se formula en forma de un polvo liofilizado, para su uso posterior en solución. Los excipientes pueden incluir diferente polioles, polvos inertes u otras cargas.

El uso de la invención también incluye una composición que comprende el componente proteínico purificado en una cantidad eficaz para matar bacterias u hongos y un vehículo adecuado. Dichas composiciones se pueden usar de numerosas formas para combatir bacterias y hongos, por ejemplo en formulaciones antimicrobianas para el hogar o el laboratorio usando vehículos conocidos en la técnica.

Diferentes composiciones tendrán diferentes grados de actividad frente a los diferentes organismos. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las cantidades eficaces que hay que usar para matar microorganismos dañinos, tales como bacterias y hongos, y otros agentes nocivos.

El componente proteínico de acuerdo con la presente invención también se puede combinar con otras proteínas para actuar como conservante con el fin de proteger el componente proteínico frente a la degradación proteolítica. Alternativamente, el componente proteínico de la invención o las composiciones se pueden usar como conservantes o desinfectantes en una amplia variedad de formulaciones, tales como soluciones para lentes de contacto, pomadas, champús, medicamentos, alimentos y similares. La cantidad de componente proteínico puede variar dependiendo de la naturaleza de otros componentes, el grado de protección antimicrobiana necesaria y el uso pretendido de la composición.

El componente proteínico se puede usar, por ejemplo, junto con un vehículo adecuado en una composición para desinfectar y esterilizar en frío superficies y como adyuvante en la pasteurización a alta presión de alimentos, así como en una composición como un agente de conservación del agua, p. ej., en piscicultura. El componente proteínico también se puede usar en una cantidad eficaz para matar bacterias cuando está encerrado en materiales de empaquetamiento para ser liberado lentamente de estos.

Ejemplos

Ahora la invención se describirá con más detalle y se ilustrará haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, hay que indicar que estos ejemplos no deben considerarse limitantes de la invención de ninguna forma.

Ejemplo 1 Ensayo antibacteriano

Se llenaron los pocillos de una placa de microvaloración con 300 \mul de medio de crecimiento (caldo nutritivo + glucosa al 1%) al doble de su concentración. Se añadieron muestras por duplicado, con una concentración final del componente proteínico de 2, 0,5 y 0,2 mg/ml de proteína, respectivamente.

Se usaron dos organismos de ensayo: Pseudomonas fluorescens (una bacteria aeróbica Gram negativa) y Listeria innocua (una bacteria aeróbica Gram positiva).

Los cultivos de la noche de las cepas bacterianas se diluyeron con agua con peptona, y se añadieron 50 \mul de cada cepa a los pocillos con una concentración de 10^{4} células/ml. Se usaron pocillos de referencia (testigos positivos), que no contenían material de ensayo.

Las placas se incubaron a 30ºC durante 72 h en un aparato de análisis Bioscreen®, registrándose el crecimiento bacteriano como aumento de la absorbancia con luz visible cada 15 minutos.

Ejemplo 2 Extracción y fraccionamiento

Cuando se extraen y fraccionan las proteínas y polipéptidos vegetales las diferencias en la estructura, fisiología y bioquímica de los tejidos vegetales a menudo no permiten aplicar los tampones y/o técnicas de maceración habituales o convencionales para animales. La composición macromolecular más compleja y las interacciones dentro de los tejidos vegetales (p. ej., compuestos fenólicos, carbohidratos y compuestos hidrocarbonados) así como las paredes celulares más compactas necesitan métodos de maceración y aislamiento más restrictivos en la preparación de extractos vegetales para asegurar la integridad de los polipéptidos.

Se sometieron hojas de cebada (1 kg, peso fresco) al procedimiento de extracción y fraccionamiento de Langenbuch et al., Plant Molecular Biology 2, 207-220 (1983). La cromatina de los núcleos de cebada se obtuvo con ácido sulfúrico 0,4 N con un rendimiento típico de 10-20 mg.

Se siguió la técnica de subfraccionamiento especial que permite el aislamiento preparativo a gran escala de los componentes proteínicos. Se obtuvo un componente proteínico específico (PM 17.300) por solubilidad diferencial en etanol (80%):HCl (0,25 N).

Se ensayó la actividad antimicrobiana de los componentes proteínicos contra las cepas Listeria y Pseudomonas habituales.

Se obtuvo una inhibición total del crecimiento de ambos organismos con la fracción soluble tanto en etanol como en agua. El efecto depende de la concentración, es decir, se debe alcanzar un valor umbral determinado (no se obtiene efecto con la dilución 1:1).

La actividad antimicrobiana está exclusivamente restringida al componente proteínico específico de PM 17.300. No se obtuvo actividad con un componente proteínico mayor.

Ejemplo 3 Extracción y fraccionamiento alternativos

Se sometieron plantones de guisante, trigo, centeno y algodón de 2 semanas de edad, al procedimiento de subfraccionamiento de acuerdo con Sidorova & Konarev, Biokhimiia, 46, 1298 (1981).

Se obtuvo un componente proteínico específico de PM 17.300 así como un componente proteínico más grande.

Se ensayó la actividad antibacteriana de los componentes proteínicos y los resultados fueron idénticos a los del Ejemplo 1.

Ejemplo 4 Procedimiento de fraccionamiento mejorado

Se obtuvo malta verde de una fábrica cervecera local. La malta se había germinado en un procedimiento de malteado convencional durante 6 días.

La malta verde (100 g) se suspendió en NaCl 4 M y se homogeneizó durante aproximadamente 10 minutos en un mezclador Braun. El homogeneizado se filtró a través de un tamiz de 20 \mum, y la solución obtenida se añadió a 20 g de matriz hidrófoba (Novarose® S-Butyl 1000/40 Inovata AB, Suecia) equilibrada con NaCl 4 M. La mezcla se agitó durante 10 minutos y la matriz se filtró a través de un tamiz de 40 \mum.

Después la matriz se empaquetó en una columna (25 x 50 mm) y se lavó con NaCl 4 M antes de la elución. Con esta fuerza iónica alta el ADN no se une a la matriz, como se determina por la mayor absorbancia del eluato a 254 nm, y por lo tanto se eluirá durante los procedimientos de empaquetamiento y lavado de la columna.

Se registraron distintos picos de proteínas mediante la absorción UV a 276 nm después de la elución por pasos con NaCl 2 M, NaCl 1 M y agua, respectivamente. Esto corresponde a una desorción con NaCl 2 M de material no cromatínico.

Ejemplo 5 Procedimiento de subfraccionamiento

La fracción desorbida con NaCl 1 M en el Ejemplo 4 se subfraccionó adicionalmente mediante cromatografía en gel preparativa en acetato amónico 0,1 M en una columna (25 x 500 mm) de Novarosa® SE-100/40 (Inovata AB, Suecia).

Se obtuvieron tres fracciones de proteína y se liofilizaron. La fracción media de proteína tenía un volumen de retención que correspondía a un peso molecular entre 10 y 20 kD.

Por consiguiente, la cromatina vegetal es una fuente conveniente para aislar en este intervalo de peso molecular proteínas básicas hidrófobas hipoacetiladas que tienen carga electropositiva alta.

Tras la cromatografía en gel analítica en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,0, en una columna (8 x 300 mm) de Novarose® SE-100/17 (Inovata AB, Suecia), se encontró que esta fracción correspondía a un peso molecular medio de aproximadamente 14 kD.

Ejemplo 6 Procedimiento de fraccionamiento alternativo

Se llevó a cabo un experimento comparativo con las mismas condiciones que en el Ejemplo 4 pero con Novarose® S-Phenyl (Inovata AB, Suecia) como matriz hidrófoba. No se pudo detectar desorción de proteína cuando la columna se eluyó con NaCl 1 M, y sólo se obtuvo una fracción después de la elución con agua. Una solución de etanol al 22% en agua tampoco dio como resultado la desorción de material proteínico de la matriz hidrófoba, lo que indica que la unión entre la matriz y el material proteínico es extremadamente hidrófobo.

Ejemplo 7 Establecimiento de la actividad antimicrobiana

La fracción media obtenida de acuerdo con el Ejemplo 5 se examinó más respecto a su actividad antimicrobiana. Las muestras se prepararon disolviendo la fracción liofilizada en tampón de fosfato (pH 7,0) a una concentración de 4 mg/ml. Después estas soluciones se diluyeron de cuatro a diez veces con el tampón de fosfato.

Los resultados obtenidos no se pueden separar de los obtenidos en el Ejemplo 5 por el componente proteínico específico de PM 17.300, cuando se preparó de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 4 y 5.

Hay que indicar que ninguna otra fracción del procedimiento de cromatografía en gel presentaba ninguna actividad antimicrobiana en absoluto.

Ejemplo 8 Efecto del valor c

Se aislaron componentes proteínicos con actividad antimicrobiana similar por el mismo procedimiento descrito en los Ejemplos 4 y 5 tanto de cromatinas de arabidopsis de 72 h como de plantones de trigo. Los rendimientos medios de las fracciones medias de 10-20 kD de estas especies son extraordinariamente diferentes, siendo el trigo una fuente de extracción mucho más favorable. Comparado con la cebada, la fracción deseada está presente aproximadamente en doble cantidad.

Ejemplo 9 Electroforesis analítica

La electroforesis analítica siguiendo un protocolo patrón (Panyim & Chalkley, Biochem. 8:3972, 1969), presenta múltiples variantes del componente proteínico específico de PM 17.300 sin la presencia de ninguna subfracción de peso molecular mayor de componentes proteínicos de un peso molecular entre 28.000 y 35.000.

Estos resultados también reflejan la diferencia en el tamaño del genoma entre especies de plantas. La arabidopsis tiene un genoma diploide pequeño de 200 Mpb y de forma proporcional rendimientos menores que el trigo que tiene un genoma hexaploide grande de 17.000 Mpb.

Por consiguiente, el rendimiento de extracción está estrechamente relacionado con el tamaño del genoma expresado como su valor c.

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Ejemplo comparativo 1

Comparación con histonas animales

Puesto que la cromatografía analítica en medios de separación tamponados como en el Ejemplo 5 dio como resultado un peso molecular de aproximadamente 14 kD que corresponde a los pesos moleculares de las histonas de ternero H2A y H2B, se llevó a cabo una comparación entre los componentes proteínicos de acuerdo con la invención y las histonas animales.

Se llevaron a cabo experimentos de control en paralelo con las histonas de ternero H2A y H2B disponibles en el comercio (Sigma, EE.UU.) y la fracción media obtenida en el Ejemplo 4, que tiene un peso molecular entre 10 y 20 kD, mediante una cromatografía en gel analítica en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,0, en una columna (8 x 300 mm) de Novarose® SE-100/17 (Inovata AB, Suecia).

Se ensayó la actividad antibacteriana de todas las fracciones obtenidas, y se repitieron los resultados positivos para el componente proteínico aislado de la cromatina vegetal.

Otro experimento comparativo no demostró ninguna actividad antimicrobiana en la primera fracción cercana al volumen muerto, una posición esperada para la histona vegetal H1. Además, se estableció otra vez que el patrón de disociación de los nucleosomas en una solución salina de animales y plantas difiere, y un protocolo estándar usado para los animales no se puede usar para las plantas.

Ejemplo comparativo 2

Extracción en disolvente acuoso

Hay pocos métodos disponibles que permitan la extracción de todos los polipéptidos de los tejidos de las plantas. Los métodos usados favorecen la preparación de fracciones de diferentes tejidos, que están enriquecidas con componentes subcelulares. En contraste, se han descrito una serie de técnicas de preparación más o menos "universales" para sistemas animales.

Karen Barrett estudiaba dichas técnicas en el documento US 5.698.200, y se examinaron varias extracciones sencillas en disolvente acuoso de grano de cereal malteado.

Se usaron los mismos métodos corriente abajo que los descritos en el Ejemplo 1 y 2 del documento US 5.698.200 para hojas de cebada (véase el Ejemplo 2) como material de partida.

Sólo se identificaron proteínas de reserva en el intervalo de 10-20 kD. Estas proteínas no presentan actividad antibacteriana en absoluto.

Se concluye que no se puede liberar cromatina por ninguno de los métodos descritos en el documento US 5.698.200, en el que el material de partida es materia citosólica. Lo más probable es que se obtengan tioninas, que son defensinas vegetales conocidas caracterizadas como polipéptidos con azufre citotóxicos de peso molecular bajo, 2-3 kD.

Claims (31)

1. Uso no terapéutico de un componente proteínico aislado de cromatina vegetal, después de disociación de la misma, como un agente antimicrobiano, teniendo dicho componente proteínico un peso molecular aparente entre 10 y 20 kD.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha cromatina vegetal es heterocromatina.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha cromatina vegetal tiene un valor c del ADN mayor que 3.000 Mpb.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha cromatina vegetal se obtiene de semillas de plantas.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que dichas semillas de plantas se obtienen de avena, trigo, cebada, centeno, maíz, arroz, colza, soja, mijo o alforfón.

6. Uso según la reivindicación 4 ó 5, en el que dicha cromatina vegetal se obtiene de dichas semillas durante la germinación.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho agente antimicrobiano se dirige contra bacterias Gram positivas así como bacterias Gram negativas.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que dichas bacterias Gram positivas son Listeria innocua.

9. Uso según la reivindicación 7, en el que dichas bacterias Gram negativas son Pseudomonas fluorescens.

10. Uso de un componente proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, junto con al menos un agente sinérgico antimicrobiano.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicho al menos un agente sinérgico antimicrobiano es una lisozima, protamina, un agente quelante, un compuesto cúprico o bacteriocina.

12. Uso de un componente proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en un complejo con un agente complejante para ser liberado lentamente del mismo.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que dicho agente complejante es ácido algínico.

14. Uso de un componente proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en una cantidad eficaz para matar bacterias, y un vehículo adecuado, en una composición como aditivo alimentario.

15. Uso de un componente proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, y un vehículo adecuado, en una composición como un aditivo alimentario promotor del crecimiento para animales.

16. Uso de un componente proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en una cantidad suficiente para matar bacterias, y un vehículo adecuado, en una composición para desinfección y esterilización en frío de superficies, y como un adyuvante en la pasteurización de alimentos a alta presión.

17. Uso de un componente proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en una cantidad eficaz para matar bacterias encerradas en materiales de empaquetamiento para ser liberado lentamente de los mismos.

18. Uso de un componente proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en una cantidad eficaz para matar bacterias, y un vehículo adecuado, en una composición como un agente conservante del agua.

19. Uso según la reivindicación 18, en piscicultura.

20. Un método para producir un componente vegetal proteínico que tiene actividad antimicrobiana, que comprende las etapas de:

homogeneizar un material vegetal con el fin de exponer su cromatina vegetal;

disociar dicha cromatina vegetal con un agente de disociación en condiciones hidrófobas; y

separar dicha cromatina vegetal disociada en fracciones individuales, una de las cuales comprende dicho componente vegetal proteínico, mediante un procedimiento de separación por interacción hidrófoba.

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21. Método según la reivindicación 20, en el que dicha homogeneización se lleva a cabo en dicho agente de disociación.

22. Método según la reivindicación 20 ó 21, en el que dicho agente de disociación es urea, cloruro de guanidinio o una sal de cloruro.

23. Método según la reivindicación 22, en el que dicha sal de cloruro es cloruro sódico.

24. Método según la reivindicación 20 ó 21, en el que dicho agente de disociación es un agente complejante, y el complejo se forma con dicho componente proteínico.

25. Método según la reivindicación 24, en el que dicho agente complejante es heparina, ácido algínico, ácido fítico o un compuesto de vanadinio.

26. Método según la reivindicación 20, en el que se lleva a cabo dicha separación.

27. Método según la reivindicación 26, en el que dicho procedimiento de separación por interacción hidrófoba es la cromatografía hidrófoba, cromatografía con quelato metálico, cromatografía de reparto, distribución contracorriente, o reparto en fase gaseosa Aphron.

28. Método según la reivindicación 26 ó 27, en el que dicho ligando funcional en dicho procedimiento de separación por interacción hidrófoba es un éter, un grupo isopropilo, butilo u octilo.

29. Método según la reivindicación 26, en el que dicho a procedimiento de separación por interacción hidrófoba le sigue un procedimiento de separación adicional.

30. Método según la reivindicación 29, en el que dicho procedimiento de separación adicional es cromatografía en gel o cromatografía de intercambio iónico.

31. Uso de un componente proteínico aislado de cromatina vegetal, después de disociación de la misma, en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar infecciones microbianas, teniendo dicho componente proteínico un peso molecular aparente entre 10 y 20 kD.