DE60212647T2

DE60212647T2 - Antimikrobielles mittel

Info

Publication number: DE60212647T2
Application number: DE2002612647
Authority: DE
Inventors: Ulf St. Peter Port ROTHMAN
Original assignee: SVENSKA MILJOEBOLAGET SVV AB; Svenska Miljobolaget SVV AB
Current assignee: SVENSKA MILJOEBOLAGET SVV AB; Svenska Miljobolaget SVV AB
Priority date: 2001-08-29
Filing date: 2002-08-28
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2022-08-29
Also published as: PT1420646E; ES2268069T3; BR0212260A; JP4938215B2; AU2002324408B2; SE0102864D0; CA2457488C; CY1105224T1; RU2004109154A; ATE330474T1; US20030124111A1; CN1561164A; RU2303357C2; EP1420646A1; CN100356853C; JP2005500393A; WO2003017769A1; US8080258B2; EP1420646B1; DE60212647D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Proteinbausteins, der aus pflanzlichem Chromatin isoliert wird. Genauer betrifft die Erfindung die nicht-therapeutische Verwendung eines Proteinbausteins, der aus pflanzlichem Chromatin nach Dissoziation desselben isoliert wird, als antimikrobieller Wirkstoff, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Proteinbausteins bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung mikrobieller Infektionen.
Die meisten eukaryotischen Organismen erzeugen eine große Vielzahl von Schutzmechanismen, die sich gegen Infektionsauslöser richten. Mehrere Mechanismen basieren auf den grundlegenden Unterschieden, die zwischen Mikroben und Zellen komplexer mehrzelliger Organismen in der Membranzusammensetzung und -ordnung bestehen, d.h. sie richten sich gegen die Außenmembranen empfindlicher Mikroben. Diese Membranen bestehen aus Lipiden mit negativ geladenen Kopfgruppen, die nach außen zeigen, und die Mikroben haben offenbar Schwierigkeiten damit, den Wirkungen entgegenzuwirken, indem sie ihre Membranzusammensetzung und -ordnung ändern. Daher sind die Substanzen, die für die antibiotische Wirkung verantwortlich sind, wahrscheinliche Kandidaten als Ersatz für Antibiotika.
Ein Beispiel sind die Phospolipidtransferproteine, die in der Lage sind, Phospholipid zwischen Membranen zu transferieren. Es wurde über antimikrobielle Phospolipidtransferproteine aus einer Reihe von Pflanzenarten, einschließlich Getreidearten, berichtet, und diese Proteine variieren in ihrer Wirksamkeit gegen verschiedene Pathogene. Beispielsweise wird in US 5,698,200 gezeigt, dass ein Pflanzenteil mittels eines wässrigen Extrakts aus gemälzten Getreidekörnern vor einem pathogenen Pflanzenbakterium geschützt werden kann.
Die am meisten untersuchte Klasse von schützenden Wirkstoffen sind jedoch die antimikrobiellen Peptide. Diese finden sich in allen Arten von Lebewesen, von Pflanzen und Insekten bis hin zu Tieren, einschließlich Weichtieren, Schalentieren, Amphibien, Vögeln, Fischen, Säugetieren und Menschen.
Diese Peptide interagieren direkt mit Bakterien und töten diese. Sie werden antimikrobiell genannt, da sie ungewöhnlich breite Wirksamkeitsspektra aufweisen, einschließlich der Fähigkeit, gramnegative und grampositive Bakterienpilze (einschließlich Hefe), Parasiten (einschließlich Planarien und Nematoden), Krebszellen und sogar Viren mit lipidhaltiger Membran („enveloped virus") wie HIV- und Herpes-Simplex-Viren zu töten oder zu neutralisieren. Im Allgemeinen liegen diese Wirkstoffe in der Länge in einem Bereich zwischen nur 12 Aminosäuren und Molekülen mit mehr als 70 Resten. Es wurden bisher mehr als 500 solcher Peptide entdeckt.
Die Art und Weise der antimikrobiellen Wirksamkeit der fast immer kationischen antimikrobiellen Peptide wurde bisher im Einzelnen bei solchen Peptiden wie Melittin, Magainin, Gramicidin, Cecropin und Defensinen untersucht. Die antimokrobiellen Moleküle schädigen auch im Allgemeinen die Membranen der Organismen, die sie angreifen. Es wurde festgestellt, dass die kationischen antimikrobiellen Peptide bakterizidale Wirkung sowohl in vitro als auch in vivo besitzen. Sie töten sehr schnell, wählen nicht ohne Weiteres resistente Mutanten aus, sind mit herkömmlichen Antibiotika, anderen Peptiden sowie Lysozymen synergetisch und sind in der Lage, in Tierversuchen Bakterien zu töten.
Dementsprechend werden nun antimikrobielle Peptide tierischen Ursprungs als neue antibiotische Arzneimittel entwickelt. Beispiele sind die synthetische Version des Magainin (Pexiganan) und das Analog eines Protegin, ein antimikrobielles Peptid, das ursprünglich aus Schweineneutrophilen isoliert wurde.
Natürliche Quellen haben sich jedoch als wirtschaftlich nicht profitabel für die Herstellung neuer, alternativer Antibiotika erwiesen. Die einzige Ausnahme bildet das antimikrobielle Peptid Nisin, das effizient in einem Strang von Lactococcus lactis mit hoher Resistenz gegen die Substanz hergestellt werden kann.
Es wurde auch bei einer wachsenden Zahl von größeren Proteinen oder Fragmenten davon eine antibakterielle Wirksamkeit festgestellt. Beispielsweise scheint ein murines Makrophagenprotein, Ubiquicidin, das gleiche zu sein wie das Ribosomenprotein S30. Auch sind zwei der antimikrobiellen Peptide im Magen des Ochsenfrosches (Rana catesheina) von dem N-Terminus von Pepsinogen abgeleitet. Ebenso wurde ein antimikrobielles Peptid, Buforin I genannt, aus Magengewebe einer asiatischen Kröte isoliert (BBRC 218:408, 1996) isoliert. Es wurde festgestellt, dass die Aminosäurensequenz des 39 Aminosäuren langen Peptids identisch mit 37 der 39 aminoterminalen Resten des Xenopus-Histons H2A ist.
Außerdem kann das gesamte Proteinmolekül ein antimikrobielles Potenzial aufweisen. Antimikrobielle Wirkung wurde in Säureextrakten der Leber, der Gedärme und des Magens atlantischer Lachse nachgewiesen (BBRC 284:549, 2001). Das entsprechende antimikrobielle Protein kann aus der Leber des Lachses durch Säureextraktion mit anschließender Ammoniumsulfat-Ausfällung, Massen-Gelchromatografie (Gelfiltrierung), Umkehrphasen-HPLC und Größenausschluss-HPLC isoliert werden. Es wurde festgestellt, dass das antimikrobielle Protein des Lachses (SAM-Protein) eine molekulare Masse von 27,7 kD aufweist, und es wurde als das Protein Histon H1 identifiziert. In WO 2001/10901 wird das Protein Histon H1 vom Säugetier aus bovinem Thymus in antimikrobiellen Zusammensetzungen zur Behandlung antimikrobieller Infektionen bei verschiedenen eukaryotischen Organismen verwendet. Somit scheinen Proteine mit anderen, gut erforschten Funktionen eine zweite Eigenschaft zu besitzen, indem sie antimikrobiell sind.
Jedoch sollte die Verwendung von bovinen Proteinen, insbesondere von Proteinen aus bivinem Thymus, vermieden werden, da ein solches Material mit schädlichen Viren, insbesondere Hepatitis-Viren, kontaminiert sein kann, oder mit anderen pathogenen Stoffen, beispielsweise Prionen. Bovines Material, ob kontaminiert oder nicht, muss extrem strengen Tests unterzogen werden, wenn es im Zusammenhang mit Menschen verwendet werden soll.
Außerdem bedingt die Isolierung neuer, alternativer Antibiotika das Sammeln bestimmter tierischer Organe oder Gewebe, gefolgt von komplexen Reinigungsvorgängen, um ein Produkt zu gewinnen, das im Zusammenhang mit Menschen oder Haustieren verwendet werden kann.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen neuen antimikrobiellen Wirkstoff bereitzustellen, mit dem die oben genannten Probleme beseitigt werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen antimikrobiellen Wirkstoff bereitzustellen, mit dem das Risiko vermieden wird, infektiöse Stoffe, die auf Mensch und/oder Tier pathogen wirken, weiterzugeben.
Wiederum eine weitere Aufgabe besteht darin, einen antimikrobiellen Wirkstoff bereitzustellen, der geschmacksneutral ist, wenn er im Zusammenhang mit Lebensmitteln verwendet wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen Wirkstoffs bereitzustellen, bei dem billige Ausgangsmaterialien verwendet werden.
Wiederum eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen Wirkstoffs in praktisch unbegrenztem Umfang bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen Wirkstoffs bereitzustellen, das keine Investitionen in Produktionsstätten für bakterielle Fermentierung erfordert.
Diese Aufgaben werden durch die Verwendung sowie das Verfahren gemäß der Erfindung wie beansprucht gelöst.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt, das auf einfache und rationelle Weise die Herstellung eines Proteinbausteins ermöglicht, der als antimikrobielles Produkt verwendet werden kann, beispielsweise als Arzneistoff, als Vollkonservierungsmittel während der Herstellung und des Transports, als Zusatzstoff in Functional Food und/oder als neutrazeutischer Zusatzstoff sowie als Tierfutterzusatz.
Ein Proteinbaustein kann erstaunlich einfach aus einem anfänglich inerten Ausgangsmaterial hergestellt werden, das pflanzliches Chromatin umfasst. In dem erfinderischen Verfahren wird DNA von basischem, nuklearem pflanzlichen Chromatin getrennt. Vorzugsweise wird das pflanzliche Chromatin aus Pflanzensamen gewonnen. Geeignete Pflanzensamen werden aus Hafer, Körner-Sorghum, Milo, Weizen, Gerste. Roggen, Mais, Reis, Raps, Soja, Hirse oder Buchweizen gewonnen. Es kann jedoch jedes Chromatin-haltige pflanzliche Material, wie etwa Seetang oder andere Meerespflanzen, zur Herstellung eines antimikrobiellen Proteinbausteins in großer Größenordnung verwendet werden.
Das pflanzliche Chromatin, das zur Isolierung des Proteinbausteins verwendet wird, sollte ein Heterochromatin sein (stilles Chromatin oder „Abfall"-DNA). Bei dem Heterochromatin handelt es sich um hypoacetyliertes (deacetyliertes) Chromatin, das wegen einer höheren elektropositiven Ladung eine kondensiertere Struktur als hyperacetyliertes Chromatin annimmt.
Außerdem hängt die Wahl des Chromatin-Ausgangsmaterials zur weiteren spezifischen Proteinextraktion auch vom Ort und von dem Differenzierungszustand des pflanzlichen Zellgewebes ab. Beispielsweise wird ein Gewebe, das aus kleinen Zellen besteht, eine höhere Zelldichte aufweisen und enthält daher wahrscheinlich mehr Nukleinsäuren und damit einhergehende antibakterielle Proteinbausteine als eine gleiche Menge von Gewebe, das aus größeren Zellen besteht.
Ebenso enthalten viele Pflanzen wegen des hohen Heterochromatingehalts sehr große Basalgenomgrößen, was durch die Möglichkeit einer Polyploidie weiter verstärkt wird. In diesem Zusammenhang wird auf die Menge an DNA pro Haploidzelle, gemessen in der Anzahl von Basenpaaren (der c-Wert), verwiesen. Die Variation im DNA-Gehalt eines Organismus spiegelt sich in seinem DNA-c-Wert oder der Basalgenomgröße wider. Der c-Wert ist als der Gehalt an DNA definiert, gemessen nach Gewicht oder Anzahl von Basenpaaren in einer einzigen Kopie der gesamten DNA-Sequenz, die sich in den Zellen eines Organismus befindet. Er ist die Menge nuklearer DNA in ihrem nicht replizierten Haploid oder gametischen Nukleus, unabhängig vom Ploidieniveau des Taxons. Somit ist der c-Wert in diploiden Arten gleich der Genomgröße, übersteigt jedoch in polyploiden Arten stets die Genomgröße.
Es wird auch bevorzugt, dass sich selbst erneuernde, undifferenzierte, pflanzliche Stammzellen verwendet werden. Diese finden sich in Meristemen, Bereichen, die neues Wachstum an den Spitzen der Triebe und Wurzeln schaffen. Somit sind die Wurzelspitzen eines Pflanzenkeimlings das überragende Ausgangsmaterial für die Chromatinextraktion und die nachfolgende Isolierung des Proteinbausteins gemäß der Erfindung. Solches Rohmaterial ist ohne Weiteres in unbegrenzten Mengen verfügbar, da es ein Abfallprodukt während der Herstellung von Brauereimalz und Weizenkeimöl ist.
Andere pflanzliche Rohmaterialien mit Zellen, die sich unter optimalen Wachstumsbedingungen mitotisch teilen, sind ebenfalls für die erfindungsgemäße Herstellung eines Proteinbausteins geeignet. Es können beliebige keimende Sprossen und Würzelchen oder Keime in der Keimphase verwendet werden. Vorzugsweise werden Samen von einer der vier Maisarten verwendet, die man keimen lässt.
Ein kostengünstiges Ausgangsmaterial, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist etwas, das Grünmalz genannt, wobei es sich um ein Ausgangsmaterial für die Bierherstellung handelt. Die Brauindustrie stellt Grünmalz aus Gerste her, die man nach der Befeuchtung sechs Tage lang keimen lässt (Mälzen). Dieses industriell hergestellte Grünmalz oder dessen Nebenprodukte (Würzelchen) können erfindungsgemäß für die Herstellung eines antimikrobiellen Proteinbausteins verwendet werden.
Dementsprechend sind die Würzelchen von diploidem Mais und diploider Gerste (DNA-c-Wert von 5.000 Mbp) sowie von Zwiebel (DNA-c-Wert von 18.000 Mbp) als Ausgangsmaterialien für die Extraktion geeignet. Vorzugsweise wird der antimikrobielle Proteinbaustein aus einer Chromatinquelle extrahiert, deren DNA-c-Wert über 3.000 Mbp liegt.
Es wird insbesondere bevorzugt, dass das Ausgangsmaterial des Reinigungsvorgangs pflanzliches Chromatin umfasst, das aus sich vermehrenden pflanzlichen Zellen in der S-Phase isoliert wird. Keimende Samen (Körner) mit ihren Würzelchen sowie junge Blätter enthalten somit eine große Anzahl von Zellen in der S-Phase.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Proteinbausteins mit antimikrobieller Wirkung umfasst das Verfahren folgende Schritte:
das Homogenisieren eines pflanzlichen Materials, um sein pflanzliches Chromatin freizulegen,
das Dissoziieren des pflanzlichen Chromatins mit einem Dissoziationsagens unter hydrophoben Bedingungen und
das Auftrennen des dissoziierten pflanzlichen Chromatins in einzelne Fraktionen, von denen eine den pflanzlichen Proteinbaustein umfasst, mittels eines Auftrennungsvorgangs mit hydrophober Interaktion.
Demzufolge wird das pflanzliche Material zuerst homogenisiert. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff Homogenisierung ein Aufbrechen der Zellwände des pflanzlichen Materials solcherart, dass das Chromatin der Pflanze freigelegt und ein Homogenat als Aufschlämmung gewonnen wird. Die Zellwände können durch ein beliebiges aus einer Reihe von Verfahren aufgebrochen werden, die dem Fachmann bekannt sind, insbesondere das Mischen mit hoher Scherung, Sonifizierung, mechanisches Aufbrechen, Explosion durch Druck usw. Die Zellwände werden mit Hilfe eines geeigneten Gerätes aufgebrochen, wodurch ein Homogenat erzielt wird.
Das pflanzliche Chromatin in dem Homogenat wird dann mittels eines Dissoziationsagens in einer wässrigen Lösung daraus unter hydrophoben Bedingungen dissoziiert. Solche Bedingungen sind jene, die hydrophobe Interaktionen begünstigen.
Geeignete Dissoziationsagenzien sind Harnstoff, Guanidinchlorid und ein Chloridsalz mit hoher ionischer Stärke.
Es ist von Vorteil, wenn die Homogenisierung des pflanzlichen Materials in dem Dissoziationsagens durchgeführt wird. Auf diese Weise wird der Reinigungsvorgang vereinfacht, und die Anzahl der Reinigungsschritte wird reduziert.
Der Reinigungsvorgang von Grünmalz beginnt mit der Homogenisierung des Malzes in einer nahezu gesättigten Salzlösung, die 4 M Natriumchlorid enthält. Die hohe ionische Stärke dissoziiert das Chromatin sowie Nukleosomen, wobei gleichzeitig eine gleichzeitige Zersetzung von Proteinmaterial durch Proteasen verhindert wird. Vorzugsweise wird die Homogenisierung in Gegenwart einer hydrophoben Matrix durchgeführt.
Das Homogenat kann dann auf einem Sieb oder Drahtnetz oder dergleichen gesiebt werden, um Zellrückstände oder andere Partikel aus dem pflanzlichen Chromatin zu entfernen, die an diesem zurückbleiben. Auf diese Weise wird eine klare Lösung erzielt, die eine anschließende Reinigung des dissoziierten pflanzlichen Chromatins erleichtert.
Das dissoziierte pflanzliche Chromatin wird dann in einzelne Fraktionen aufgetrennt, von denen eine den pflanzlichen Proteinbaustein mit antimikrobieller Wirkung umfasst. Die Auftrennung wird vorzugsweise mit Hilfe eines Auftrennungsvorgangs mit hydrophober Interaktion durchgeführt. Vorzugsweise ist der Auftrennungsvorgang mit hydrophober Interaktion hydrophobe Chromatographie.
Weitere Beispiele geeigneter Auftrennungsvorgänge sind die Trennung in Polymersystemen, wie etwa die Verteilungschromatographie, Gegenstromverteilung und die Gas-Aphron-Trennung. Die Auftrennung der dissoziierten Chromatinbausteine kann alternativ auf Säulen mit Metallchelatgelen oder immobilisiertem Heparin erfolgen.
Der funktionale Ligand der Matrix, die für die hydrophobe Interaktion und/oder den Auftrennungsvorgang verwendet wird, sollte eine Ether-, Isopropyl-, Butyl- oder Oktylgruppe sein. Eine Phenylgruppe sollte vermieden werden. Vorzugsweise ist der funktionale Ligand eine Butylgruppe an einer Agarosematrix, die zu 4 % vernetzt ist. Es wird eine Ligandendichte von 40–50 μmol/ml erreicht, was zu einer Bindungskapazität von 7 mg IgG pro ml führt.
Beispielsweise wird nach dem Sortieren des Homogenats aus Grünmalz als Aufschlämmung eine hydrophobe Matrix schubweise zur erzielten Lösung gegeben, wobei es sich bei der hydrophoben Matrix um ein Gel für die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) handeln, welches aktive Butylgruppen enthält. Geeignete Matrizen sind Novarose^® s-Butyl 1000/40 von Inovata AB, Bromma, Schweden, und Butyl Sepharose^® 4 von Amersham Pharmacia Biotech, Schweden. Die hydrophobe Matrix wird dann mit der Salzlösung mit hoher ionischer Stärke gewaschen, wobei DNA ausgewaschen wird.
Dann wird die Matrix in eine Säule gegossen und einer schrittweisen Gradientelution mit abnehmender ionischer Stärke des Natriumchlorids unterzogen. Bei einer Konzentration von 1 M NaCl wird ein eindeutiger antimikrobieller Proteinbaustein eluiert.
Der Proteinbaustein kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens weiter gereinigt werden, das zur Reinigung von Peptiden/Proteinen geeignet ist. Solche Verfahren umfassen das Zentrifugieren, die Ausfällung am isoelektrischen Punkt, Phasentrennungen, Ultrafiltrieren, Gelchromatographie (Größenausschlusschromatographie), Ionenaustauschchromatographie oder HPLC sowie eine Kombination solcher Verfahren. Vorzugsweise ist der anschließende Auftrennungsvorgang Gelchromatographie oder Ionenaustauschchromatographie.
Am meisten bevorzugt erfolgt ein vorbereitender Gelchromatographieschritt in einer Säule, die mit einem Gel gefüllt ist, welches eine Ausschlussgrenze von 100 kD aufweist. Die Säule wird mit destilliertem Wasser equilibriert, bevor sie mit der Fraktion von 1 M NaCl beladen wird, die antibiotische Wirkung zeigt. Die Säule wird dann mit destilliertem Wasser oder Ammoniumacetat eluiert. Auf diese Weise wird die Entsalzung und Reinigung gleichzeitig in ein- und demselben Schritt erreicht. Somit kann der Proteinbaustein ohne weitere Reinigungsschritte bis zur Trockenheit konzentriert werden, beispielsweise mittels Gefriertrocknung.
Es wurde eine Proteinfraktion mit einem apparenten Molekulargewicht zwischen 10 und 20 kD isoliert, die antimikrobielle Eigenschaften zeigte.
Der Fachmann wird verstehen, dass die Reinigung des Proteinbausteins durch viele andere Verfahren erreicht werden kann, die dem Fachmann bekannt sind und die alle für diese Erfindung in Betracht kommen.
Es kann auch ein Komplexbildner wie etwa Heparin, Alginsäure, Phytinsäure oder eine Vanadinverbindung als Dissoziationsagens verwendet werden, sofern er das pflanzliche Chromatin in seine einzelnen Bestandteile dissoziiert. Alginsäure wird besonders als Dissoziationsagens bevorzugt, da Alginatkomplexe mit dem antibiotisch wirksamen Proteinbaustein gebildet werden. Solche Komplexe können mit dem Ziel der Reinigung gebildet werden oder an sich zur langsamen Freisetzung der antimikrobiellen Wirkung daraus verwendet werden.
Vor der erfindungsgemäßen Auftrennung des dissoziierten pflanzlichen Chromatins in einzelne Fraktionen, beispielsweise mit Hilfe eines Auftrennungsvorgangs mit hydrophober Interaktion, konnte in dem Ausgangsmaterial des dissoziierten Chromatins keinerlei antimikrobielle Wirkung festgestellt werden. Werden die pflanzlichen Proteinbausteine erfindungsgemäß gereinigt, so wird automatisch das Heterochromatin verwendet. Somit wird die biologische Wirkung sukzessive durch die physische Auftrennung von Chromatinbausteinen gebildet. Theoretisch könnte der Auftrennungsvorgang zu einer veränderten Molekularstruktur der Bausteine führen.
Es ist allgemein anerkannt, dass antimikrobielle Peptide ihre Wirkung auf Prokaryoten durch positive Ladung entfalten. Es wird nicht erwartet, dass sich der sehr wahrscheinliche Wirkmechanismus des erfindungsgemäß gewonnenen Proteinbausteins von dem unterscheidet, was über andere kationische Peptide bekannt ist. Bekannte basische Peptide jedoch würden eine Wechselwirkung mit Zellmembranen ermöglichen, die jene von Reinigungsmitteln imitiert. Solch ein Wirkmechanismus des Proteinbausteins wird durch seine Wirksamkeit bestätigt, die sich gegen grampositive Bakterien sowie gegen gramnegative Bakterien richtet.
Erfindungsgemäß können mit anderen Reinigungsvorgängen nach der Elution aus der hydrophoben Matrix auch andere antimikrobiell wirkenden Proteinbausteine aus anderen pflanzlichen Materialien gewonnen werden. Dies beruht auf der Tatsache, dass Proteine aus verschiedenen biologischen Materialien verschiedene post-synthetische Modifizierungsmuster zeigen, die zelluläre Wirkungen des pflanzlichen Materials zeigen. So sollte ein Auftrennungsmuster von dem Grad beispielsweise der Acetylierung, der Phosphorylierung, der Methylierung, der Ubiquininierung, der Glycosylierung sowie der ADP-Ribosylierung eines erfindungsgemäß gewonnenen Proteinbausteins beeinflusst werden.
Dementsprechend kann der isolierte Proteinbaustein aus pflanzlichem Chromatin anschließend chemisch modifiziert werden. Solche Modifizierungen umfassen Änderungen im Molekulargewicht und/oder Acetylierungsgrad und würden zu Zubereitungsformen mit einer spezifischeren biologischen Wirkung führen.
Die antimikrobielle Wirkung des Proteinbausteins, der mit dem erfinderischen Verfahren gewonnen wurde, kann in einem standardisierten Bioscreen^®-Verfahren bestimmt werden, wobei Nisin als Kontrollsubstanz verwendet wird. Im Vergleich zu Nisin wurde mit dem Proteinbaustein eine Wirkung gewonnen, die 2–4 mg/ml entspricht, wobei die Wirkung tödlich ist. Ferner wurde gegen gramnegative Bakterien eine Wirkung erzielt, die mit Nisin fehlt.
Das einfache erfinderische Reinigungsverfahren ermöglicht die Herstellung eines antimikrobiellen Proteinbausteins in praktisch unbegrenztem Umfang. Der Ertrag des Vorgangs beträgt etwa 1 g aus 1 kg Rohmaterial (beispielsweise Würzelchen). Durch die Verwendung keimender Saaten mit maximaler Proteinsynthese kann der Ertrag maximiert werden, wie sich beispielsweise bei dem sechstägigen Mälzen zeigt. Werden sich vermehrende pflanzliche Zellen in der S-Phase verwendet, ist die natürliche Chromatin-Protein-Synthese maximal und kann bis zu 80 % des gesamten synthetisierten Proteins darstellen.
Der Proteinbaustein, der erfindungsgemäß als antimikrobieller Wirkstoff aus pflanzlichem Chromatin isoliert wurde, kann zusammen mit einem oder mehreren antimikrobiell synergetischen Stoffen intensiviert werden. Beispiele solcher antimikrobiell synergetischen Stoffe sind Lysozyme, Protamine, Chelatbildner, Kupferverbindungen oder Bakteriozine.
Der Proteinbaustein aus pflanzlichem Chromatin ist für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung mikrobischer Infektionen geeignet.
Der Proteinbaustein kann bei oralen Anwendungen zur Behandlung von Zahn- und Zahnfleischerkrankungen, bei topischen Anwendungen zur externen Verwendung wie etwa bei dermatologischen Erkrankungen, Haut- und Haarerkrankungen und oto-ophthalmischen Erkrankungen verwendet werden. Der Proteinbaustein aus pflanzlichem Chromatin kann auch in Körperhöhlen wie Mund, Rachen, Lungen, Vagina und Rektum sowie oral zur Behandlung gastrointestinaler Erkrankungen nach der Verdauung pathogener Mikroorganismen verwendet werden.
Soll der Proteinbaustein als antimikrobieller Wirkstoff verwendet werden, so kann er in gepufferten, wässrigen Medien formuliert werden, die eine Anzahl verschiedener Salze und Puffer enthalten. Vorzugsweise sind die Salze Alkalisalze oder Salze alkalischer Erdhalide, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Natriumsulfat. Es können verschiedene Puffer verwendet werden, wie etwa Citrat, Phosphat, HEPES, Tris oder dergleichen, sofern solche Puffer für ihren Zweck physiologisch unbedenklich sind.
Es können verschiedene Hilfsstoffe oder andere Zusatzstoffe verwendet werden, wenn der Proteinbaustein als gefriergetrocknetes Pulver zur nachfolgenden Verwendung in Lösungen formuliert ist. Die Hilfsstoffe können verschiedene Polyole, inerte Pulver oder andere Streckmittel umfassen.
Die erfinderische Verwendung kann auch eine Zusammensetzung umfassen, die den gereinigten Proteinbaustein in einer Menge, die für das Abtöten von Bakterien oder Pilzen wirksam ist, und einen geeigneten Träger enthält. Solche Zusammensetzungen können auf vielfältige Art zur Bekämpfung von Bakterien und Pilzen verwendet werden, beispielsweise in antimikrobiellen Formulierungen für Haushalt und Labor, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Träger verwendet werden.
Verschiedene Zusammensetzungen werden unterschiedliche Grade der Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Organismen aufweisen. Wirksame Mengen, die zum Töten schädlicher Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze und anderer gesundheitsschädlicher Stoffe verwendet werden sollen, können ohne Weiteres vom Fachmann bestimmt werden.
Der erfindungsgemäße Proteinbaustein kann auch mit anderen Proteinen kombiniert werden, um als Konservierungsmittel zum Schutz des Proteinbausteins gegen proteolytische Zersetzung zu wirken. Alternativ kann der erfinderische Proteinbaustein oder Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Formulierungen als Konservierungsmittel oder Desinfektionsmittel verwendet werden, wie etwa in Kontaktlinsenlösungen, Salben, Shampoos, Medikamenten, Lebensmitteln und dergleichen. Die Menge des Proteinbausteins kann je nach Beschaffenheit der anderen Bestandteile, des erforderlichen Grades des antimikrobiellen Schutzes und der beabsichtigten Verwendung der Zusammensetzung variieren.
Der Proteinbaustein kann beispielsweise zusammen mit einem geeigneten Träger in einer Zusammensetzung zum Desinfizieren und Kaltsterilisieren von Oberflächen und als Adjuvant in der Hochdruck-Pasteurisierung von Lebensmitteln sowie in einer Zusammensetzung als Wasserkonservierungsstoff, z.B. in der Fischzucht, verwendet werden. Der Proteinbaustein kann auch in einer Menge, die für das Abtöten von Bakterien wirksam ist, verwendet werden, wenn er in Verpackungsmaterialien enthalten ist, um von diesen langsam freigesetzt zu werden.
BEISPIELE
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der folgenden Beispiele weiter beschrieben und illustriert. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass diese Beispiele keinesfalls als Einschränkung der Erfindung ausgelegt werden sollten.
Beispiel 1. Antibakterieller Assay
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 300 μl Wachstumsmedium (Nährflüssigkeit + 1 % Glukose) mit seiner zweifachen Konzen tration gefüllt. Duplikatproben wurden den Endkonzentrationen der Proteinbausteine von 2, 0,5 bzw. 0,2 mg/ml Protein zugesetzt.
Es wurden zwei Testorganismen verwendet: Pseudomonas fluorescens (ein gramnegatives Bakterium) und Listeria innocua (ein grampositives Bakterium).
Die Über-Nacht-Kulturen der Bakterienstränge wurden in Peptonwasser verdünnt, und 50 μl jedes Strangs wurden den Vertiefungen mit einer Konzentration von 104 Zellen/ml zugegeben. Es wurden Referenzvertiefungen (positive Kontrollen) verwendet, die kein Testmaterial enthielten.
Die Platten wurden 72 Stunden lang bei 30 °C in einem Bioscreen^®-Analysegerät inkubiert, wobei das Bakterienwachstum alle 15 Minuten als erhöhte Absorptionsfähigkeit bei visuellem Licht registriert wurde.
Beispiel 2. Extraktion und Fraktionierung
Bei der Extraktion und Fraktionierung von pflanzlichen Proteinen und Polypeptiden erlauben die Unterschiede der pflanzlichen Gewebe in der Struktur, Physiologie und Biochemie oft nicht die Anwendung aktueller oder herkömmlicher tierischer Puffer und/oder Mazerationstechniken. Die komplexere makromolekulare Zusammensetzung und Interaktionen innerhalb pflanzlicher Gewebe (z.B. Phenol-, Kohlenhydrat- und Kohlenwasserstoff-Verbindungen) sowie die kompaktere Zellwand erfordern stringentere Mazerations- und Isolationsverfahren bei der Herstellung pflanzlicher Extrakte, um die Integrität der Polypeptide zu gewährleisten.
Gerstenblätter (1 kg Frischgewicht) wurden dem Extraktions- und Fraktionierungsvorgang nach Langenbuch u.a., Plant Molecular Biology 2. 207–220 (1980 unterzogen. Das Chromatin aus Gerstenzellkernen wurde mit 0,4 N Schwefelsäure mit einem typischen Ertrag von 10–20 mg gewonnen.
Es wurde die spezielle Subfraktionierungstechnik befolgt, die eine vorbereitende Isolierung von Proteinbausteinen in großem Umfang ermöglicht. Durch differenzielle Löslichkeit in Ethanol (80%ig) : HCl (0,25 N) wurde ein spezifischer Proteinbaustein (MW 17.300) gewonnen.
Die Proteinbausteine wurden auf antimikrobielle Wirkung gegen die standardmäßigen Stränge im Innenbereich Listeria und Pseudomonas getestet.
Mit der Fraktion, die sowohl in Ethanol als auch in Wasser löslich ist, wurde eine vollständige Unterbindung des Wachstums beider Organismen erzielt. Die Auswirkung der Konzentration ist abhängig, d.h. es muss ein bestimmter Schwellenwert erreicht werden (bei einer Verdünnung von 1:1 wird keine Wirkung erzielt.)
Die antimikrobielle Wirkung ist ausschließlich auf den spezifischen Proteinbaustein mit MW 17.300 beschränkt. Mit einem größeren Proteinbaustein wurde keine Wirkung erzielt.
Beispiel 3. Alternative Extraktion und Fraktionierung
Zwei Wochen alte Erbsen-, Weizen-, Roggen- und Baumwollkeimlinge wurden dem Subfraktionierungsvorgang nach Sidorova & Konarev Biokhimiia 46, 1298 (1981) unterzogen.
Es wurden ein spezifischer Proteinbaustein mit MW 17.300 sowie ein größerer Proteinbaustein gewonnen.
Die Proteinbausteine wurden auf antimikrobielle Wirkung getestet, und die Ergebnisse waren identisch mit denen in Beispiel 1.
Beispiel 4. Verbessertes Fraktionierungsverfahren
Grünmalz wurde von einer örtlichen Brauerei bezogen. Das Malz war in einem herkömmlichen Mälzverfahren 6 Tage lang gekeimt worden.
Das Grünmalz (100 g) wurde in 4 M NaCl suspendiert und in einem Braun -Mixer etwa 10 Minuten lang homogenisiert. Das Homogenat wurde durch ein 20-μm-Sieb gefiltert, und die so gewonnene Lösung wurde dann zu 20 g einer hydrophoben Matrix (Novarose^® S-Butyl 1000/40, Inovata AB, Schweden), die in 4 M NaCl equilibriert wurde, gegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang angeregt, und die Matrix wurde durch ein 40-μm-Sieb gefiltert.
Dann wurde die Matrix in eine Säule (25 × 50 mm) gefüllt und vor der Elution mit 4 M NaCl gewaschen. Bei dieser ionischen Stärke bindet die DNA nicht an die Matrix, wie durch die erhöhte Absorptionsfähigkeit des Eluats bei 254 nm festgestellt wurde, und wird somit während der Vorgänge des Befüllens und des Waschens der Säule eluiert.
Mit Hilfe von UV-Absorption wurden deutliche Proteinmaxima bei 276 nm nach der schrittweisen Elution mit 2 M NaCl, 1 M NaCl bzw. Wasser registriert. Dies entspricht einer Desorption von Nicht-Chromatin-Material bei 2 M NaCl.
Beispiel 5. Subfraktionierungsvorgang
Die Fraktion, die in Beispiel 4 bei 1 M NaCl desorbiert wurde, wurde mit vorbereitender Gel-Chromatographie in 0,1 M Ammoniumsulfat auf einer Säule (25 × 500 mm) aus Novarose^® SE-100/40 (Inovata AB, Schweden) weiter subfraktioniert.
Es wurden drei Proteinfraktionen gewonnen und gefriergetrocknet. Die mittlere Proteinfraktion wies ein Rückhaltevolumen auf, das einem Molekulargewicht zwischen 10 und 20 kD entspricht.
Demzufolge ist pflanzliches Chromatin eine günstige Quelle für die Isolierung von hypoacetylierten, hydrophoben basischen Proteinen mit einer hohen elektropositiven Ladung in diesem Bereich des Molekulargewichts.
Bei der analytischen Gel-Chromatographie in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, auf einer Säule (8 × 300 mm) aus Novarose^® SE-100/17 (Inovata AB, Schweden) wurde festgestellt, dass diese Fraktion einem mittleren Molekulargewicht von etwa 14 kD entspricht.
Beispiel 6. Alternativer Fraktionierungsvorgang
Ein vergleichender Versuch wurde mit denselben Bedingungen wie in Beispiel 4, aber mit Novarose^® S-Phenyl (Inovata AB, Schweden) als hydrophober Matrix durchgeführt. Es konnte keine Proteindesorption festgestellt werden, als die Säule mit 1 M NaCl eluiert wurde, und es wurde nur eine Fraktion nach der Elution mit Wasser gewonnen. Noch führt die Lösung von 22%igem Ethanol in Wasser zu einer Desorption von Proteinmaterial aus der hydrophoben Matrix, was anzeigt, dass die Bindung zwischen Matrix und Proteinmaterial extrem hydrophob ist.
Beispiel 7. Feststellung antimikrobieller Wirkung
Die mittlere Fraktion, die nach Beispiel 5 gewonnen wurde, wurde in Bezug auf ihre antimikrobielle Wirkung weiter untersucht. Es wurden Proben hergestellt, indem die gefriergetrocknete Fraktion in Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) auf eine Konzentration von 4 mg/ml gelöst wurde. Diese Lösungen wurden dann vier- bis zehnmal mit dem Phosphatpuffer verdünnt.
Die erzielten Ergebnisse sind nicht von denen trennbar, die in Beispiel 5 mit dem spezifischen Proteinbaustein mit MW 17.300 erzielt wurden, wenn er nach dem Protokoll der Beispiele 4 und 5 hergestellt wurde.
Es sollte angemerkt werden, dass keine weitere Fraktion aus dem Vorgang der Gelchromatographie irgendeine antimikrobielle Wirkung zeigte.
Beispiel 8. Auswirkung des c-Werts
Es wurden Proteinbausteine mit ähnlicher antimikrobieller Wirkung mittels des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 4 und 5 beschrieben aus Chromatinen sowohl von 72 Stunden alter Arabidopsis und Weizenkeimlingen isoliert. Die mittleren Erträge der mittleren Fraktionen mit 10–20 kD aus diesen Arten sind auffallend verschieden, wobei Weizen eine weitaus günstigere Extraktionsquelle ist. Verglichen mit Gerste liegt die gewünschte Fraktion in etwa der doppelten Menge vor.
Beispiel 9. Analytische Elektrophorese
Die analytische Elektrophorese nach einem standardisierten Protokoll (Panyim & Chalkley, Biochem. 8:3972, 1969) zeigt mehrere Varianten des Proteinbausteins mit MW 17.300 ohne die Gegenwart von höhermolekularen Subfraktionen von Proteinbaustein mit einem Molekulargewicht zwischen 28,000 und 25,000.
Diese Ergebnisse spiegeln auch den Unterschied in der Genomgröße zwischen Pflanzenarten wider. Arabidopsis weist ein kleines diploides Genome mit 200 MbP und demzufolge geringere Erträge als Weizen auf, der ein großes hexaploides Genom mit 17.000 Mbp besitzt.
Demzufolge hängt der Extraktionsertrag eng mit der Größe des Genoms, ausgedrückt als sein c-Wert, zusammen.
Vergleichsbeispiel 1. Vergleich mit tierischen Histonen
Da die analytische Chromatographie in gepufferten Auftrennungsmedien wie in Beispiel 5 zu einem Molekulargewicht von etwa 14 kD führte, was den Molekulargewichten der Kalbshistone H2A und H2B entspricht. wurde ein Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Proteinbaustein und tierischen Histonen durchgeführt.
Parallele Kontrollversuche mit handelsüblich beziehbaren Kalbshistonen H2A und H2B (Sigma, USA) und der in Beispiel 4 gewonnenen mittleren Fraktion mit einem Molekulargewicht zwischen 10 und 20 kD wurden mittels einer analytischen Gelchromatographie in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, auf einer Säule (8 × 300 mm) mit Novarose^® SE-100/17 (Inovata AB, Schweden) durchgeführt.
Alle gewonnenen Fraktionen wurden auf antibakterielle Wirkung getestet, wobei die positiven Ergebnisse für den Proteinbaustein, der aus dem pflanzlichen Chromatin isoliert wurde, wiederholt wurden.
Ein weiterer Vergleichsversuch ergab keine antimikrobielle Wirkung der ersten Fraktion nahe der Leerstelle, einer Position, die für das pflanzliche Histon H1 erwartet wurde. Ferner wird wiederum festgestellt, dass sich das Dissoziationsmuster der Nukleosome in einer Salzlösung zwischen Tieren und Pflanzen unterscheidet und dass ein Standardprotokoll, das für Tiere verwendet wird, nicht für Pflanzen verwendet werden kann.
Vergleichsbeispiel 2. Extraktion in wässriger Lösung
Es sind wenige Verfahren verfügbar, die die Extraktion von ganzen Polypeptiden aus pflanzlichem Gewebe erlauben. Die verwendeten Verfahren bevorzugen die Herstellung von Fraktionen aus verschiedenen Geweben, die mit subzellulären Bausteinen angereichert sind. Im Gegensatz dazu ist bisher eine Anzahl mehr oder weniger „universeller" Zubereitungstechniken für tierische Systeme beschrieben worden.
Solche Techniken wurden von Karen Barrett, US 5,698,200 untersucht, wobei mehrere einfache Extraktionen mit wässrigen Lösemitteln an gemälztem Getreidekorn untersucht wurden.
Dieselben nachgeordneten Verfahren wie in Beispiel 1 und 2 von US 5,698,200 wurden mit Gerstenblättern als Ausgangsmaterial verwendet (siehe Beispiel 2).
Es wurden lediglich Speicherproteine im Bereich von 10–20 kD identifiziert. Diese Proteine zeigen keinerlei antibakterielle Wirkung.
Daraus folgt, dass mit keinem der Verfahren, die in US 5,698,200 beschrieben sind, Chromatin freigesetzt werden kann, wenn das Ausgangsmaterial cytosolisches Material ist. Sehr wahrscheinlich werden Thionine gewonnen, bei denen es sich um gut bekannte pflanzliche Defensine handelt, die als cytotoxische Schwefelpolypeptide mit geringem Molekulargewicht, 2–3 kD, gekennzeichnet sind.

Claims

Nicht-therapeutische Verwendung eines Proteinbausteins, der aus pflanzlichem Chromatin nach Dissoziation desselben isoliert wird, als antimikrobieller Wirkstoff mit einem apparenten Molekulargewicht zwischen 10 und 20 kDa.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das pflanzliche Chromatin Heterochromatin ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das pflanzliche Chromatin einen DNA-c-Wert über 3.000 Mbp aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das pflanzliche Chromatin aus Pflanzensamen gewonnen wird.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Pflanzensamen aus Hafer, Weizen, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Raps, Soja. Hirse oder Buchweizen gewonnen werden.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei das pflanzliche Chromatin während der Keimung aus den Samen gewonnen wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei sich der antimikrobielle Wirkstoff gegen grampositive Bakterien sowie gegen gramnegative Bakterien richtet.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die grampositiven Bakterien Listeria innocus sind.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die gramnegativen Bakterien Pseudomonas fluorescens sind.
Verwendung eines Proteinbausteins nach einem der Ansprüche 1–9 zusammen mit mindestens einem synergetischen antimikrobiellen Wirkstoff.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der mindestens eine synergetische antimikrobielle Wirkstoff Lysozym, Protamin, ein Chelatbildner, eine Kupferverbindung oder ein Bakteriozin ist.
Verwendung eines Proteinbausteins nach einem der Ansprüche 1–11 im Komplex mit einem Komplexbildner, um langsam aus diesem freigesetzt zu werden.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Komplexbildner Alginsäure ist.
Verwendung eines Proteinbausteins nach einem der Ansprüche 1–13 in einer Menge, die für das Abtöten von Bakterien wirksam ist, und eines geeigneten Trägers in einer Zusammensetzung als Lebensmittelzusatz.
Verwendung eines Proteinbausteins nach einem der Ansprüche 1–13 und eines geeigneten Trägers in einer Zusammensetzung als wachstumsfördernder Tierfutterzusatz.
Verwendung eines Proteinbausteins nach einem der Ansprüche 1–13 in einer Menge, die für das Abtöten von Bakterien wirksam ist, und eines geeigneten Trägers in einer Zusammensetzung zum Desinfizieren und Kaltsterilisieren von Oberflächen und als Adjuvant in der Hochdruck-Pasteurisierung von Lebensmitteln.
Verwendung eines Proteinbausteins nach einem der Ansprüche 1–13 in einer Menge, die für das Abtöten von Bakterien wirksam ist, in Verpackungsmaterialien enthalten, um von ihnen langsam freigesetzt zu werden.
Verwendung eines Proteinbausteins nach einem der Ansprüche 1–13 in einer Menge, die für das Abtöten von Bakterien wirksam ist, und eines geeigneten Trägers in einer Zusammensetzung als Wasserkonservierungsstoff.
Verwendung nach Anspruch 18 in der Fischzucht.
Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Proteinbausteins mit mikrobieller Wirkung, das die folgenden Schritte umfasst: a. das Homogenisieren eines pflanzlichen Materials, um sein pflanzliches Chromatin freizulegen, b. das Dissoziieren des pflanzlichen Chromatins mit einem Dissoziationsagens unter hydrophobischen Bedingungen und c. das Auftrennen des dissoziierten pflanzlichen Chromatins in einzelne Fraktionen, von denen eine den pflanzlichen Proteinbaustein umfasst, mittels eines Auftrennungsvorgangs mit hydrophobischer Interaktion.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Homogenisieren in dem Dissoziationsagens durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Dissoziationsagens Harnstoff, Guanidinchlorid oder ein Chloridsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Chloridsalz Natriumchlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Dissoziationsagens ein Komplexbildner ist und ein Komplex mit dem Proteinbaustein gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Komplexbildner Heparin, Alginsäure, Phytinsäure oder eine Vanadinverbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Auftrennen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Auftrennungsvorgang mit hydrophobischer Interaktion hydrophobische Interaktions- und Größenausschluss-Chromatographie, Metallchelat-Chromatographie, Verteilungschromatographie, Gegenstromverteilung oder Gas-Aphron-Trennung ist.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei der funktionale Ligand in dem Auftrennungsvorgang mit hydrophobischer Interaktion eine Ether-, Isopropyl-, Butyl- oder Oktylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei dem Auftrennungsvorgang mit hydrophobischer Interaktion ein weiterer Auftrennungsvorgang folgt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der weitere Auftrennungsvorgang Gelchromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie ist.
Verwendung eines Proteinbausteins, der aus pflanzlichem Chromatin nach Dissoziation desselben isoliert wird, in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung mikrobieller Infektionen, wobei der Proteinbaustein ein apparentes Molekulargewicht zwischen 10 und 20 kDa aufweist.