DE2054492A1

DE2054492A1 - Antineoplastisches Mittel und Ver fahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2054492A1
Application number: DE19702054492
Authority: DE
Inventors: Der Anmelder Ist
Original assignee: Cobb geb Doll, Edith Margot, Har penden, Hertford (Großbritannien)
Priority date: 1969-11-08
Filing date: 1970-11-05
Publication date: 1971-05-13
Also published as: GB1335181A

Description

Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz mit einer antineoplastischen Aktivität und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit einer antineoplastischen Aktivität zur Verfügung gestellt, welches darin besteht, nach bekannten Methoden einen Saft und/oder einen Lösungsmittelextrakt einer Spezies der Compositae-Familie, in vorteilhafter Weise aus einem Carduus benedictus-Pflanzen-

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material, zu fraktionieren und/oder zu konzentrieren, wobei die Konzentrierung und/oder Fraktionierung in einer solchen Weise durchgeführt wird, daß eine Fraktion oder ein Konzentrat erhalten wird, das nachstehend noch näher definiert wird und eine antineoplastische Aktivität besitzt. Es ist darauf hinzuweisen, daß die "Substanz" aus einer Mischung aus chemisch verschiedenen Verbindungen bestehen kann.

Erfindungsgemäß wird dann einer Substanz eine antineoplastische Aktivität zugeschrieben, wenn sie bei der Durchführung des folgenden Tests positive Ergebnisse liefert:

Festes Sarcoma 180 Tumormaterial wird in 20 besonders gezüchtete Mäuse eingepflanzt. Das zu testende Material wird an 10 Test-Tiere s/c in täglichen Dosen von 0,2 ml (oder 0,4 ml, je nach der Verdünnung), während einer Zeitspanne von 7 Tage, beginnend am Tag nach der Einpflanzung, verabreicht. An dem Tag nach Verabreichung der letzten Dosis werden die Test- und Vergleichstiere getötet, worauf die festen Tumore herausgeschnitten und gewogen werden. Bedeutet T das Tumorgewicht der behandelten Tiere und C das Tumorgewicht der nicht-behandelten Vergleichstiere, dann zeigt ein Τ/C-Wert <0,54 ein positives Ergebnis an. Eine Unterschiedlichkeit in den Ergebnissen muß von Test zu Test W erwartet werden, da in Tiersystemen Veränderungen unvermeidbar sind. Andere Tumorsysteme oder KB (Eagle)-Zellkultüren können für die Aktivitätsprüfung verwendet werden, um Materialien auf ihre Aktivität zu untersuchen.

Carduus benedictus (dieser Begriff umfaßt auch den Samen Cardui benedicti), welcher auch als Cnicus benedictus bezeichnet wird, ist eine Spezies der botanischen Familie

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Compositae. Carduus benedictus ist in den Mittelmeerländern beheimatet. Die Pflanze wächst jedoch auch in gemäßigten Klimata, wie z.B. in England und Deutschland. Beispielsweise kann sie während der Sommermonate■in diesen Ländern in gewöhnlicher Gartenerde gezüchtet werden. Ferner ist ein Züchten unter Glas oder unter künstlichen Bedingungen möglich. Erfindungsgemäß kann das verwendete Pflanzenmaterial aus einem oder mehreren der folgenden Teile der Pflanzen erhalten werden: Blätter, Stengel, Blüten, Früchte, Samen oder Wurzeln.

Wird erfindungsgemäß der Saft des Pflanzenmaterials verwendet, dann kann man diesen Saft in der Weise erhalten, daß das Pflanzenmaterial zerkleinert und ausgepreßt wird (beispielsweise unter Verwendung einer üblichen hydraulischen Presse oder einer kontinuierlich arbeitenden Schneckenpresse) , worauf die festen Verunreinigungen von dem Saft entfernt werden. Der Saft kann denaturieren und gären, das letztere wahrscheinlich infolge einer mikroben Verunreinigung. Es ist daher vorteilhaft, den Saft auf einer Temperatur von gerade oberhalb 0⁰C bis 20⁰C und insbesondere von gerade oberhalb 0⁰C bis 12⁰C und in ganz bevorzugter Weise von gerade oberhalb 0⁰C bis 4/C während der Lagerung und Verarbeitung zu halten. Ferner müssen während der Lagerung und Verarbeitung von Saft oder Lösungsmittelextrakten ein Denaturieren und/oder mikrobe Verunreinigungen verhindert werden, und zwar entweder durch Zugabe von Konservierungsmitteln, oder, vorausgesetzt daß dadurch nicht das aktive Material beeinflußt wird, durch Konservieren der Extrakte durch ein Tiefgefrieren während der Lagerung.

Ein zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneter Lösungsmittelextrakt kann aus dem Pflanzenmaterial

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nach irgendeiner bekannten Methode erhalten werden. Lösungsmittel, die sich zur Extraktion des Wirkstoffs als geeignet erwiesen haben, sind diejenigen Lösungsmittel, wie sie ganz allgemein zur Extraktion von Pflanzen verwendet werden. Biologische Tests können als Leitlinien angewendet werden. Man kann die ganze frische Pflanze oder Teile davon mit dem Lösungsmittel behandeln. Wahlweise können die Pflanze oder ein Teil oder Teile davon getrocknet und pulverisiert werden, bevor die Lösungsmittelextraktion durchgeführt wird.

Soll ein Lösungsmittelextrakt aus einem vermahlenen Pflanzenmaterial erhalten werden, dann wird das Lösungsmittel in vorteilhafter Weise dem frisch grobvermahlenen oder getrockneten pulverisierten Material zugesetzt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 8 bis 10 Tagen bei ungefähr 12 bis 20⁰C, vorzugsweise unter häufigem Schütteln¹* zum Ausziehen stehengelassen wird. Die Flüssigkeit wird dann abdekantiert, worauf der zurückbleibende Rückstand ausgedrückt wird. Der erhaltene Saft wird dem Lösungsmittelextrakt zugesetzt. Eine Extraktion des ausgepreßten Rückstandes kann unter Verwendung von frischem Lösungsmittel wiederholt werden.

Ein Lösungsmittelextrakt kann auch durch Durchseien (Pef- * kollation) des Pflanzenmaterials mit dem Lösungsmittel bei erhöhten Temperaturen gewonnen werden, vorausgesetzt, daü der Wirkstoff durch diese Behandlung nichrtädbeeinflußt wird.

Der Saft und/oder der Lösungsmittelextrakt, aus welchem die festen Verunreinigungen entfernt worden sind, wird dann nach bekannten Methoden fraktioniert und/oder konzentriert, und zwar so lange, bis eine Fraktion oder ein Konzentrat

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oder eine Substanz mit einer antineoplastischen Aktivität erhalten worden ist. Werden sowohl eine Fraktionierung als auch eine Konzentration durchgeführt, dann kann die letztere vor oder nach der Fraktionierung erfolgen. Die Konzentrierung kann beispielsweise durch Destillation unter niedrigem Druck und/oder durch Dialyse durchgeführt werden, während die Fraktionierung nach einer oder mehreren der folgenden Methoden ausgeführt werden kann:

a) Extraktion unter Verwendung von organischen oder anorganischen Lösungsmitteln;

b) Ausfällung mit Säuren, Basen, Salzen und/oder organischen Lösungsmitteln;

c) Kieselerde-, Papier-, Dünnschicht- und GasChromatographie;

d) Chromatographie mit anschließender Elektrophorese;

e) Stärke- oder Papier-Electrophorese;

f) Zentrifugieren;

g) Fraktionierung unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen; h) UV-Spektrophotometrie;

i) Polarographie;

j) Kolorimetrie;

k) Fluorometrie;

1) Massenspektrophotometrie.

Neben den genannten Methoden kommen alle weiteren physikali-

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sehen oder chemischen Methoden in Frage, bei deren Anwendung Mischungen in verschiedene Bestandteile zerlegt werden können.

Für eine Durchführung in größerem (technischen Maßstabe) bieten sich vor allem die Methoden a), b), d), f) und g) an.

Die erhaltenen verschiedenen Konzentrate und/oder Fraktionen werden so lange getestet, bis eine aktive Fraktion oder ein aktives Konzentrat oder ein aktiver Bestandteil gefunden worden ist.

Die Substanz, welche bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugt wird, besitzt eine antineoplastische Aktivität. Der Wirkstoff dieser Substanz wurde als "Kardollin" bezeichnet» wobei die chemische Zusammensetzung und die Formel bis jetzt noch nicht bekannt sind. Die antineoplastische Aktivität der Substanz wurde beispielsweise unter Verwendung von Tumoren, wie beispielsweise Sarcoma 180, die in Mäuse eingepflanzt worden sind, demonstriert. Es wurde ferner gefunden, daß die Substanz eine antibiotische (antibakterielle und antivirale) Aktivität besitzt. Dies konnte beispielsweise durch in vitro-Tests unter Verwendung Von Pseüdoinonas aeruginosa, Staph. aureus, E. Cöli und Proteus gezeigt werden.

Die nach dem erfitiduiigsgealäßeh Verfahren erzeugte Substanz kann zur Behandlung von Tumoren und anderen Neoplasia benutzt werdän, fcotiei ferner eine Bekämpfung von Infektionen möglich ist, die durch bestimmte pathogene Mikroorgäüisiiieh erzeugt werden. In den ftahmen der ilrfindung fällt daher auch die Schafftiiig littör ßHiriMzedtiäciien Zubereitung, welcHe die Substanz Öifer deh tirfcöiöff lh Mischung öder in Vörbin-

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dung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger enthält. Die pharmazeutische Zubereitung liegt in vorteilhafter Weise in Form einer Injektionslösung oder -suspension vor, sie kann jedoch auch in einer anderen geeigneten Form für eine orale oder parenterale Verabreichung hergestellt werden, beispielsweise in Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, Cachets, Körnern oder Pulfern, Die pharmazeutischen Zubereitungen werden vorzugsweise in Einheitsdosierungsformen hergestellt. Eine Zubereitung kann sterilisiert werden und/oder Hilfsstoffe enthalten, beispielsweise Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Benetzungsmittel oder Emulgierungsmittel, Salze zur Regulierung des osmotisehen Drucks oder Pufferungsmittel.

In den Rahmen der Erfindung fällt ferner ein Tierarzneimittel, das vorzugsweise in Form einer Injektionslösung oder -suspension vorliegt. Dieses Arzneimittel enthält eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Substanz in Mischung oder In Verbindung mit einem für veterinärische Zwecke geeigneten Träger. Mit diesem Tierarzneimittel können insbesondere Haustiere behandelt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Blätter, Stengel, Blumen, Früchte, Samen und Wurzeln der Carduus benedictus-Pflanze werden gründlich kalt gewaschen. Nach dem Abtrocknen des überschüssigen Wassers bei Zimmertemperatur wird das Pflanzenmaterial grob vermählen. Ein Druck auf das Material liefert nach der Filtration eine kolloidale tiefgrüne Lösung. Beim Stehenlassen trennt sich der Saft in Fraktionen oder Schichten mit verschiedener Dichte, und zwar in folgende Schichten:

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a) eine obere Schicht, die klar und praktisch farblos ist,

b) eine gelbe klare Schicht,

c) eine goldbraune klare Schicht,

d) eine goldbraune leicht kolloidale Schicht,

e) eine grüne kolloidale Schicht,

f) eine grünlich-braune kolloidale Schicht, und

g) eine grünlich-braune Suspension.

Die Fraktionen a) bis e) mit einem pH von ungefähr 6,8 werden zur Durchführung von biologischen Tests verwendet. Diese Fraktionen werden von den Fraktionen f) und g) unter Verwendung einer Pipette abgetrennt.

Die Fraktionen a) bis e) werden in vitro auf ihre antibakterielle Aktivität gegenüber E. coli, Staph aureus, Proteus und Pseudomonas aeruginosa getestet. Die Werte in der Tabelle stellen den Durchmesser der Wachstumshemmung bei der Durchführung von Plattentests dar.

E.coli Staph. aureus Proteus Pseudomonas

————— —-—-——_———.—. ——. aeruginosa

20 mm 24 mm 21 mm 42 mm

fc Die Fraktionen a) bis e) werden zur Durchführung von antineoplastischen Tests ungefähr 3 Wochen nach ihrer Herstellung verwendet. Die vereinigten Fraktionen a) bis e) werden auf das Zweifache ihres Volumens unter Verwendung von destilliertem Wasser verdünnt. Beginnend mit dem Tag nach der Einpflanzung von festem Sarcoma 160 in 20 Mäuse werden 0,4 ml-Dosen während einer Zeitspanne von 7 Tagen s/c an 10 Mäuse verabreicht. Die Mäuse werden an dem Tag, welcher sich an

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den Tag anschließt, an welchem die letzte Dosis verabreicht worden ist, getötet, worauf die Tumore der behandelten und nicht behandelten Tiere herausgeschnitten und gewogen werden. Dabei werden folgende Ergebnisse festgestellt:

Körpergewichts-Änderung (g) mittleres Tumor- überlebende Test / Vergleich |%^icht _±n _% ^Tiere

+1,4 / +0,4 422/1173 38 % 10 / 10

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Claims

Patentansprüche

1. Substanz mit einer antineoplastischen Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem Saft und/oder aus dem Lösungsmittelextrakt einer Spezies der Compositae-Familie durch Fraktionieren und/oder Konzentrieren nach üblichen Methoden erzeugt worden ist.

2. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß P es aus einer Substanz gemäß Anspruch 1 in Mischung oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger besteht.

3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

es in Form einer Injektionslösung oder -suspension vorliegt.

4. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form von Tabletten, Kapseln, Pillen, Cachets, Granulaten oder Pulvern vorliegt.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gefe kennzeichnet, daß es in einer Dosierungseinheitsform vorliegt.

6. Tierpräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Substanz gemäß Anspruch 1 in Mischung oder in Verbindung mit einem für veterinärische Zwecke geeigneten Träger besteht.

7. Präparat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß

es in Form einer Injektionslösung oder -suspension vorliegt.

8. Präparat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es

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in Form von Tabletten, Kapseln, Pillen, Cachets, Granulaten oder Pulvern vorliegt.

9. Präparat nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Dosierungseinheitsform vorliegt.

10. Verfahren zur Herstellung einer Substanz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach üblichen Methoden ein Saft und/oder ein Lösungsmittelextrakt von einer Spezies der Compositae-Familie fraktioniert und/oder konzentriert wird, wobei die Fraktionierung und/oder Konzentrierung in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß man zu einer Fraktion oder zu einem Konzentrat gelangt, das eine antineoplastische Aktivität besitzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Spezies der Compositae-Familie aus Carduus benedictus besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Pflanzenmaterial aus Blättern, Stengeln, Blüten, Früchten, Samen oder Wurzeln besteht.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Saft durch Zerkleinern und Zerquetschen des Pflanzenmaterials sowie durch Entfernung der festen Verunreinigungen gewonnen wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Saft auf einer Temperatur von gerade oberhalb 0⁰C bis 20⁰C während der Lagerung und Verarbeitung gehalten wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur gerade oberhalb 0⁰C bis 4°C gehalten wird.

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16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15,dadurch gekennzeichnet, daß Konservierungssubstanzen dem Saft zugesetzt werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösungsmittelextrakt in der Weise erhalten wird, daß ein frisches oder getrocknetes Pflanzenmaterial vermählen wird, worauf das vermahlene Material ait einem oder mehreren organischen oder anorganischen Lösungsmitteln behandelt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß das vermahlene Material in Kontakt mit dem oder den Lösungs-

* mitteln während einer Zeitspanne von 8 bis 10 Tagen bei einer Temperatur von ungefähr 12 bis 20°C stehen gelassen wird, worauf der Lösungsmittelextrakt abdekantiert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Abdekantieren des Lösungsmittelextrakts der Rückstand ausgepreßt wird, worauf der erhaltene Saft dem Lösungsmittelextrakt zugesetzt wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein Lösungsmittelextrakt durch Durchseien (Perkollation) des frischen oder getrockneten Pflanzenmaterials mit einem Lösungsmittel bei erhöhter Temperatur erzeugt wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Saft und/oder der Lösungsmittelextrakt durch eine Destillation unter vermindertem ¹WdC und/oder durch eine Dialyse und/oder durch eine ändert bekannte Methode konzentriert wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch

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gekennzeichnet, daß der Saft und/oder der Lösungsmittelextrakt nach einer der bekannten physikalischen oder chemischen Methoden zur Trennung von Mischungen in einzelne Bestandteile fraktioniert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionierung durch eine Extraktion mit organischen oder anorganischen Lösungsmitteln, durch eine Ausfällung mit Säuren, Basen, Salzen und/oder organischen Lösungsmitteln, durch eine Kieselerde-, Papier-, Dünnschichtoder Gaschromatographie, durch eine Chromatographie und anschließende Elektrophorese, durch eine Stärke- oder Papierelektrophorese, durch eine Zentrifugierung, durch eine Behandlung unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, durch eine UV-Spektrophotometrie, durch eine Polarographie, durch eine Kolorimetrie, durch eine Fluorometrie oder durch eine Massenspektrophotometrie durchgeführt wird.

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