DE2552630A1 - Gegen fungi wirksame substanz und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Gegen fungi wirksame substanz und verfahren zu ihrer herstellung

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Description

  • Gegen Fungi wirksame Substanz und Verfahren zu ihrer Herstellung
  • Die Erfindung betrifft eine Substanz zur Bekämpfung (Kontrolle) von echten Fungi sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung; sie betrifft insbesondere Mittel zur Bekämpfung (Kontrolle) von echten Fungi, die aus Alkaloide vom Berberin-Typ enthaltenden Pflanzen gewonnen werden, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
  • Unter Alkaloiden vom Berberin-Typ sind Berberin, Coptisin, Worenin, Palmatin und andere, welche die gemeinsame Grundstruktur haben, zu verstehen.
  • Erst vor kurzem sind wirksame und genaue Methoden für die Therapie von Pilzerkrankungen, die durch pathogene Fungi, wie Blastomyces, Candida, Cryptococcus, Coccidiodes, Epidermophyton, Histoplasma, Microsporum und Trichophyton,hervorgerufen werden, gefunden worden. Derzeit werden für die Tharapie dieser Erkrankungen Antibiotika vom Polyen-Typ, wie Amphotericin B, Trlchomycin und Nystatin, verabreicht; diese Antibiotika haben jedoch verschiedene Nachteile, z. B. den, daß sie toxisch sind und ihre Antifungi-Aktivität ungleichmäßig is-t, und sie weisen daher keine wirkungsvollen und gezielten therapeutischen Effekte auf.
  • Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Substanzen zur Bekämpfung (Kontrolle) von echten Pilzen (Fungi) anzugeben, die eine hohe Antifungi-Aktivität aufweisen. Ziel der Erfindung ist es ferner, ein Verfahren zur Herstellung solcher die echten Fungi bekämpfender (kontrollierender) Substanzen anzugeben.
  • Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer echte Fungi bekämpfenden (kontrollierenden) Substanz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltende, von Fett- oder Harzmaterialien freie Pflanzen gewebe mit einem polaren Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt während oder nach der Extraktion bei einer Temperatur von 35 bis 750C mit einer wässrigen, alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung in Kontakt bringt, die Extraktösung nach dem Inkontaktbringen mit der wässrigen alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung einengt unter Bildung einer an dem Extrakt gesättigten Lösung, die dabei erhaltene gesättigte Lösung mit einer wässrigen} alkalischen Dialkalihydrogenphosphatlösung mischt, um den pH-Wert der Mischung auf 6,8 bis 7,2 zu bringen, das polare Lösungsmittel bei einer Temperatur von 35 bis 75°C eindampft, den dabei erhaltenen Rückstand unter vermindertem Druck trocknet, das getrocknete Material mit einem polaren Löaingsmittel extrahiert und die Extraktlösung zur Trockne eindampft.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner das nach diesem Verfahren hergestellte Produkt.
  • Beispiele für Pflanzen, die Alkaloide vom Berberin-Typ enthalten, sind Philodendron amurense Ruprecht, P. amurense Rupr. var.
  • sachalinense, P amurense Rupr. var. japonicum (Maxim.) Ohwi und P. amurense Rupr. var. Levallei (Dode) Sprague,welche zur Familie der Rutaceae gehören; Coptis japonica Makino, Coptis japonica Makino var. dissecta Nakoi, Coptis trifolia sabsbuty, Exanphorrhiza und Xanphorrhiza simplicissima, die zur Familie der Ranunculsceae gehören; Berberis Thunberzii, Berberis sieboldí:, Berberis amurensis und Nandina domestica, die zur Familie der Berberidaceae gehören; sowie Costinum fenestratum und Columbo Radix, die zur Familie der Menispermaceae gehören.
  • Diese Pflanzen enthalten in ihren Geweben Alkaloide vom Berberin-Typ, wie z. B. Berberin, Palmatin, Coptesin, Worenin und dgl., in Form des Hydroxids.
  • Als Ausgangsmaterialien können die ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltenden Gewebe dieser Pflanzen verwendet werden, wie z. B. die Rinde von der die Korkschichten entfernt worden sind, von Philodendron amurense Ruprecht, zur Familie der Rutaceae gehörig, die unterirdischen Stengel von Xanphorrhiza, zur Familie der Ranunculsceae gehörig, die Blätter, Stengel und Wurzeln von Berberis Thunberzii, zur Familie der Berberidaceae gehörig, der Stengel von Costinum fenestratum, zur Familie der Menispermaceae gehörig und die Blätter und Stengel von Coptis Rhizoma. Außerdm sind trockenePulver von Gewebender oben genannten Pflanzen im Handel erhältlich, wie z. B. rohe Arzneimittel unter den Bezeichnungen Philodendron-Pulver, Coptis-Pulver und dgl., so daß die Verwendung dieser rohen Arzneimittel bevorzugt ist.
  • Der Gehalt der ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltenden Ausgangsmaterialien an harzartigen Substanzen ist vorzugsweise so gering wie möglich. Dementsprechend werden die Ausgangsmaterialien vorzugsweise vorher mit einem Lösu-ngsmittel behandelt, um die darin enthaltenden fettartigen, harzartigen oder teerartigen Substanzen zu entfernen. D. h., die Ausgangsmaterialien, d. h. die oben genannten Pflanzengewebe oder rohen Arzneimttel, werden mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, wie Äther, Petroläther, Waschbenzin, Benzol, Toluol oder Xylol, behandelt, um die in diesem Lösungsmittel löslichen Komponenten daraus zu entfernen.
  • Nach dem Trocknen wird der bei der Extraktion mit dem nichtpolaren Lösungsmittel erhaltene Rückstand mit einer geeigneten Menge, beispielsweise dem 2- bis 3-fachen seines Volumens, eines polaren Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol, Aceton, Acetonalkohol unddgl., weiter extrahiert. Die Extraktion wird mehrere Male, vorzugsweise bei einer Tempratur von 35 bis 75 C, so lange durchgeführt, bis die letzte Extraktlösung praktisch farblos ist. Die Extraktlösung wird filtriert und mit etwa 1/8 bis 1/12 Volumenteilen einer 0,5 bis 1,5 molaren wässrigen alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung versetzt.
  • Die Mischung wird auf 35 bis 75OC erhitzt und das polare Lösungsmittel wird bei dieser Temperatur unter vermindertem Druck abgedampft, wobei eine an dem Extrakt gesättigte Lösung erhalten wird.
  • Die Extraktion des getrockneten Rückstandes kann unter Venvendung einer Mischung aus dem polaren Lösungsmittel und der wässrigen alkalischen Alkalidihyr-ogenphosphatlösung in einem Mischuqpverhältnis von 5 bis 25:1 durchgeführt werden. In diesem Falle kann aus der erhaltenen Extraktlösung dann ohne eine weitere Behandlung mit der wässrigen alkalischen Alkalid hydrogenphosphatlösung sofort das polare Lösungsmittel abgedampft werden, wobei man die an dem Extrakt gesättigte Lösung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene Lösung kann nach der vollständigen Verdampfung des polaren Lösungsmittels unter sauren Bedingungen mit Äther extrahiert werden, um weitere Verunreinigungen daraus zu entfernen, die sich in dem Äther lösen.
  • Der pH-Wert der an dem Extrakt gesättigten Lösung wird durch Verwendung einer alkalischen Lösung von Dialkalihydrogenphosphat, wie Dikallum- oder Dinatriumhydrogenphosphat, oder von Phosphorsäure und Ätzalkall, auf 6,8 bis 7,2 gebracht. Die Farbe der Mischung wird dabei bla3gelb-braun.
  • Die Mischung, bei der es sich um eine klare Lösung handelt, wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 800 c oder weniger eingedampft, wobei man eine konzentrierte Lösung erhält, welche die gewünschten Substanzen enthält, die unter vermindertem Druck oder durch Gefriertrocknen getrocknet werden können.
  • Die die gewünschten Substanzen enthaltende konzentrierte Losung kann als Mittel zur Bekämpfung (Kontrolle) von echten Fungi verwendet und nach dem Verdünnen mit einer geeigneten Menge Wasser an Mensch oder Tier verabreicht werden. Sie kann aber auch durch wiederholtes Extrahieren des getrockneten Materials mit den polaren Lösungsmitteln und anschließendes Verdampfen des polaren Lösungsmittels weiter gereinigt werden, wobei man ein stärker gereinigte Produkt erhält. Dieses gereinigte Produkt, bei dem es sich um ein gelbbraunes kristallines Pulver handelt, wird nachfolgend als Substanz "NT-72" bezeichnet.
  • Mit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren arhältlichen Substanz NT-72 ist es möglich, mit Erfolg das Wachstum von verschiedenen medizinischen Fungi, wie z. B. solchen, die zu den-Genera Aspergillus, Candida, Trichophyton und dgl. gehören, zu inhibieren (zu hemmen). Durch EinverLeibung eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 kann die Antifungi-Aktivität der Substanz NT-72 noch weiter verbessert werden und sie kann in einem extrem stabilen Zustand gelagert werden. Die erfindungsgeinäße Substanz NT-72 ist in jeder beliebigen Menge sowohl mit hydrophilen als auch mit oleophilen Salbenunterlagemitteln mischbar und sie zeigt eine hervorragende Wirkung bei der Therapie der Dermatophytose bei Mensch oder Tier, wenn sie in einer Menge von 0,2 bis 0,5 g auf die Haut des unter dieser Erkrankung leidenden Patienten aufgebracht wird.
  • Sie kann einem Patienten, der an inneren Fungi-Erkrankungen leidet, auf oralem Wege in einer Dosis von etwa 0,01 bis etwa 0,05 g/kg/Tag verabreicht werden oder sie kann in einer Dosis von etwa 0,001 bis etwa 0,005 g/kg/Tag injiziert werden. Die akute Toxitität ist so gering, daß bei oraler Verabreichung an Mäuse die LDSo von NT-72 7 g/kg beträgt, d. h. die Toxitität ist weit geringer als diejenige von Berberinhydrochlorid,dessen LD5Q 60 bis 70 mg/kg beträgt.
  • Obgleich bisher noch nicht geklärt werden konnte, welcher Komponente der Berberin enthaltenden Pflanze die Antifungi-Aktivität von NT-72 zuzuschreiben ist, wird angenommen, daß es sich bei diesem Produkt um eine Substanz handelt, in der einige der Alkalolde vom Berberin-Typ in einer bestimmten Form mit Phosphorsäure verbunden sind.
  • Die aus Philodendron gewonnene Substanz NT-72 schmilzt zwischen und 116°C und stellt eine Kombination von verschiedenen Komponenten dar. Wenn sie einer Hochleistungs-Flüssighitschromatographie unterworfen wird, treten in dem Chromatogramm mehrere Maxima auf. Die aktive Wirksamkeit in bezug auf die Wachstumshemmung bei echten Fungi (Pilzen) ist jedoch in zwei Maxima-Anteilen zu sehen unter denen einer der aktivste ist.
  • Die Komponenten der Substanz NT-72 werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.
  • Die Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm, das bei Durchführung einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung der Vorrichtung FLC-350 der Firma Nihon Bunko Co. bei einem Druck von 30 kg/cm², bei Umgebungstemperatur, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,6 ml/Minute, einer Diagrammaufzeichnungsgeschwindigkeit von 0,5 cm/Minute mittels der Säule Jaskopack SD-C2 -500 und des Detektors UV-254 Uvidec-1,2-FP-4, RI, erhalten wurde.
  • Die Fig. 1 zeigt 7 Maxima. Das Maximum 1 geht auf die restlichen Lösungsmittel zurück, bei denen es sich um Wasser und Alkohol handelt. Die Maxima 2 bi-s 7 entsprechen den Komponenten von NT-72. Jede der Komponenten wird abgetrennt und nach der Scheibenmethode In bezug auf ihre Wachstumsinhibierungsaktivität auf Aspergillus fumigatus, Candida albicans bzw. Trichophyton mentagrophytes getestet.
  • Tabelle Durchmesser des Inhibierungskreises (mm) abgetrennte Komponente 1 2 3 4 5 6 7 Aspergillus fumigatus (-) 7,0-7,2 (-) (-) 16-17 Spur (-) Spur Candida albicans (-) 11,5-12,4(" ) 14-15 (-) (-) Trichophyton (-) 12,5-13,6 (-) (-) 28-29 Spur (-) mentagrophytes Unter der Voraussetzung, daß N-75 ein anorganisches Salz eines Alkaloids vom Berberin-Typ als aktiven Bestandteil enthält, wenn es durch Reduzieren mit Natriumborhydrid von dieser anorganischen Säure befreit wird und die dabei erhaltenen Substanzen mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert werden, wird die aktivste Komponente mit Butanol extrahiert.
  • Wenn nun Berberinhydrochlorid (Japanese Pharmacopeia Grade), wie oben angegeben behandelt wird, weist der erhaltene Butanolextrakt nicht die gewünschte Aktivität auf. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.
  • Tabelle II Durchmesser des Inhibierungskreises (mm) NT-72 Aspergillus fumigatus Candida albicans Methanollösung vollständig 10,0 unvollständig 23>0 23,0 wässrige Lösung 18,0 30,0 Berberinhydrochlorid Methanollösung sind (-) wässrige Lösung (-) (-) In der Fig. 2 sind die Infrarotabsorptionsspektren der Butanol-Extrakte dargestellt, wobei daraus hervorgeht, daß die beiden Substanzen voneinander verschieden sind.
  • Die Fig. 3 und 4 zeigen jeweils NMR-Spektren der Butanolextrakte von reduziertem NT-72 bzw. reduziertem Berberinhydrochlorid, gelöst in schwerem Wasser. Die cemeinsamen Absorptionen sind durch das Signal X angegeben und die bei Berberin fehlenden Absorptionen sind durch das Signal angegeben.
  • Die Fig. 5 zeigt die Gaschromatogramme der Butanolextrakte von NT-72 und Berberinhydrochlorid. Daraus ist zu ersehen, daß die Maxima A, B, C und D voneinander verschieden sind und daß die Maxima 1, 2, 3, 4, 5 und 6 gemeinsam sind. Die angewendeten gaschromatografischen Bedingungen waren folgende: Säule: Gas Chrom P Silicon GUM SE-30 0,75% 2,25 m Programmierung: 40°C bis 240°C.
  • Geschwindigkeit: 400/Minute Diagrammaufzeichnungsgeschwindigkeit: 5 mm/Minute Vorrichtung: Janagimoto GCG-550 FP Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, Versuchs-, Bezugs- und klinischen Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
  • Beispiel 1 befreiten Rinde 200 g eines Pulvers der von den Korkschichten/von Philodendron wurdenrnehrere Male mit jeweils 500 ml Äther extrahiert, um die darin enthaltenen Fett- oder Harzmaterialien zu entfernen. Zu dem Rückstand wurden 2000 ml Äthanol und 25 ml einer wässrigen 1M Kaliumdihydrogenphosphat (KH2P04)-Lösung zugegeben und die dabei erhaltene Mischung wurde 2 bis 3 Stunden lang bei etwa 600 C behandelt, abgekühlt und dann filtriert. Der Rückstand wurde 3 mal dem gleichen Extraktionsvorgang wie oben unterworfen.
  • Danach wurden die Filtrate miteinander vereinigt und das Äthanol wurde durch Destillation unter vermindertem Druck bei unterhalb 60 0C aus dem vereinigten Filtrat entfernt, wobei man eine mit dem Extrakt gesättigte Lösung erhielt. Durch Zugabe einer wässrigen lN Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HP04)-Lösung wurde die Lösung schwach alkalisch gemacht (pH 7,2) und dann gefiergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wurde der Rückstand in 100 ml Äthanol aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck bei unterhalb 600C zur Trockne eingedampSZ wobei man 20 g eines gelbbraunen kristallinen Pulvers enthielt.
  • Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei diesmal jedoch das Äthanol jeweils durch die polaren Lösungsmittel Äthanol und Acetonalkohol ersetzt wurde, wobei das gleiche Ergebnis wie oben erhalten wurde.
  • Beispiel 2 200 g eines feinen Pulvers der von den Korkschichten befreiten Rinde von Philodendron wurdenmehrere Male mit 500 ml Petroläther extrahiert, um das darin enthaltende Fett und den darin enthaltenen Teer zu entfernen. Zu dem Rückstand wurden 2000 ml Äthanol zugegeben und die dabei erhaltene Mischung wurde 2 bis 3 Stunden lang auf etwa 60°C erhitzt, gekühlt und dann filtriert.
  • Der Rückstand wurde 3 mal der gleichen Extraktion wie oben unterworfen. Danach wurden die Filtrate miteinander vereinigt und es wurden 25 ml einer wässrigen 1M Natriumdihydrogenphosphatlösung zugegeben. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck bei 60°C bis zur Trockne destilliert. Der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde 3 mal jeweils unter Verwendung von etwa 1/3 ihrer Menge an Äther geschüttelt. Die gebildete wässrige Schicht wurde abgetrennt, durch Zugabe einer wässrigen 1M Dinatriumhydrogenphosphat (Na2 HP04)-Lösung schwach alkalisch gemacht (pH 7,2) und dann gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wurde der Rückstand mit 100 ml Äthanol gelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck unterhalb 600C zur Trockne eingedampft und man erhielt 20 g des gleichen gelbbraunen kristallinen Pulvers wie in Beispiel 1.
  • Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei diesmal das Äthanol jeweils durch die polaren Lösungsmittel Methanol und Aceton ersetzt wurde, wobei man das gleiche Ergebnis wie oben erhielt.
  • Bezuvsbeispiel (1) Ein von Fett und Teer befreites Pulver, das auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 aus 200 g eines Philodendronpulvers hergestellt worden war, wurde zu 2000 ml einer 3% Chlorwasserstoffsäure enthaltenden Äthanollösung zugegeben. Die dabei erhaltene Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei unterhalb 40°C eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde 3 mal unter Verwendung von jeweils etwa 1/3 ihrer Menge an Äther geschüttelt.
  • Die dabei gebildete wässrige Schicht wurde abgezogen, durch Zugabe einer lOZOiaen wässrigen Ammoniaklösung schwach alkalisch gemacht (pH 7,2) und dann gefriergetrocknet. Nach dem G2lriertrocknen wurde der Rückstand in 100 m Äthanol gelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck bei unterhalb 600C zur Trockne eingedampft und man erhielt ein gelblich-braunes Pulver.
  • (2) Unter Verwendung von 2000 ml Äthanol, das 3 % Weinsäure enthielt, wurden 200 g eines von Fett und Teer befreiten Philodendronpulvers, das auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wie in dem obigen Abschnitt (1) angegeben behandelt, wobei ein gelblich-braunes Pulver erhalten wurde.
  • (3) Unter Verwendung von 2000 ml Äthanol, das 3 % Essigsäure enthielt, wurden 200 g eines vonTeer und Fett befreiten Philodendronpulvers, das auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, wie in dem obigen Abschnitt (1) angegeben behandelt, wobei ein gelblich-braunes Pulver erhalten wurde.
  • 0.02 g jedes der in den obigen Abschnitten (1) bis (3) erhaltenen gelblich-braunen Pulver und die in den Beispielen l.und 2 erhaltenen gelb braunen kristallinen Pulver wurden 2 mal am Tage 2 Wochen lang auf oralem Wege an männliche Mäuse mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 bis 22 g (Durchschnittsalter 1,5 Monate) verabreicht. In den Gruppen, denen die in denBeispielen 1 und 2 erhaltenen gelbbraunen kristallinen Pulver verabreicht worden waren,wurden keine toten Mäuse beobachtet (vgl. die folgende Tabelle III).
  • Tabelle III Extraktions- Anzahl der Mäuse Anzahl der lebenden Anzahl de-r verfahren pro Gruppe Mäuse nach 2 Wochen toten Nässe nach 2Wo chen Bezugsbeisp.(L) 10 2 8 (2) 10 7 3 (3) 10 6 4 Beispiel 1 10 10 0 Beispiel 2 10 10 0 Versuchsbeispiel 1 Antifungi-Aktivität: 0,8 g jedes der in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen gelbbraunen kristallinen Pulver wurden in 1 ml eines Phosphatpuffers bei pH 6,8 bzw. destilliertem Wasser gelöst.
  • Unter Verwendung von 0,01 ml der dabei erhaltenen Lösung wurde die Wachstumshemmwirkung jedes Pulvers auf Pilze (F (Fungi) nach der Scheibenmethode getestet. Dabei wurde eine Zunahme der Hemmwirkung In dem Falle, in dem der Phosphatpuffer verwendet wurde, beobachtet (vgl. die folgende Tabelle IV).
  • Tabelle IV Beispiel 1 Beispiel 2 Test-Fungi destilliertes pH 6,8 destiliertes pH 6,8 Wasser Wasser Trichophyton mentagrophytes 19 - 21 22-23 18 - 21 23-24 Candida albicans 19 - 21 23-24 18 - 20 22-24 Aspergillus fumigatus 19 - 21 23-24 19 - 21 23-24 [Die Zahlen geben die Durchmesser des Hemmkreises (mm) an] Versuchsbeispiel 2 Wässrige Lösungen von Nystatin, Ainphotericin B und Byb 5097 sowie eine Phosphatpufferlösung des in BeispIel 1 hergestellten gelbbraunen kristallinen Pulvers wurden jeweils auf eine Anti-Fungi-Testscheibe (Durchmesser 8 mm, Gewicht 0,03 g) aufgebracht, um darauf 0,005 g des aktiven Bestandteils jeder Lösung zu adsorbieren, und es wurde die Hemmwirkung gegenüber Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes und Cryptococcus neoformans beobachtet, wobei die in der folgenden Tabelle V angegebenen Ergebnisse erhalten wurden.
  • Tabelle V in Beispiel 1 Amphoteerhaltenes ricin B Nystatin Byb 5097 Pulver Aspergillus 18 - 12 12,5 fumigatus (kreisförmi- (Spur 18) ge Spur) Candida 25 11 21 17 albicans (Spur 14) (Spur 22) Trichophyton mentagro- 48,5 8,5 12,5 24 phytes Cryptococcus 11 - 11 neoformans (kreisförmi- (Spur 18) ge Spur) [Die Zahlen geben den Durchmesser der Hemmkreise (in mm) an] JedeFungi-TestElüssigkeit wurde mit einem 0,1 % Twen 80 enthaltenden Sabouraud-- Agar-Medlum gemischt unter Bildung eines mehrschichtigen Fungi-Agar-Films, der dann erstarren gelassen wurde. Außerdem waren Amphotericin B, Nystatin und Byb 5097 in der Phosphatfpufferlösung nicht genügend löslich, es wurde jedoch angenommen, daß sie in einer für die ausreichende Abso+ tion auf der 8 mm-Scheibe ausreichenden Menge eingearbeitet worden waren.
  • Beispiel 3 200 g eines Coptis-Pulvers wurden 3mal mit jeweils 500 ml Äther extrahiert, um die darin enthaltenden Fett- oder Harzmaterialien zu entfernen. Der feste Rückstand wurde getrocknet und mit 2000 ml Äthanol versetzt und die dabei erhaltene Mischung wurde 2 Stunden lang bei etwa 600C stehengelassen. Zu der Mischung wurden dann 40 ml einer wässrigen 1M Kaliumdihydrogenphosphat-(KH2P04 )-Lösung zugegebaiund die Mischung wurde auf etwa 600C erhitzt'abgekühlt und dann filtriert. Der Rückstand wurde 3 mal der gleichen Arbeitsweise wie oben unterworfen. Danach wurden die Filtrate miteinander vereinigt und dann bei unterhalb 60°C einer Destillation unter vermindertem Druck unterworfen. Der Rückstand wurde durch Zugabe einer wässrigen 1M Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HP04)-Lösung schwach alkalisch gemacht (pH 7,2).
  • durch D2stRation von Äthanol vollständig befreit und dann gefriergerocknet. Nach dem Gefriertrocknen wurde der Rückstand in 100 ml Äthanol aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck bei unterhalb 600C zur Trockne eingedampft, wobei man 20 g eines gelbbraunen kristallinen Pulvers erhielt.
  • Beispiel 4 200 g eines Coptis-Pulvers wurden unter Verwendung von jeweils 500 ml Äther extrahiert, um die darin enthaltenden Fett- oder Harzmaterialien zu entfernen. Zu dem Rückstand wurden 2000 ml Äthanol und 56 ml einer wässrigen 1M Dikaliumhydrogenphosphatlösung zugegeben und die dabei erhaltene Mischung wurde 2 Stunden lang bei etwa 600C digeriert, gekühlt und dann filtriert.
  • Der Rückstand wurde 3 mal der gleichen Extraktion wie oben unter worfen. Danach wurden die Filtrate miteinander vereinigt und das Äthanol wurde durch DesdEation unter vermindertem Druck bei unterhalb 600C aus dem kombinierten Filtrat entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde 3 mal unter Verwendung von etwa 1/3 ihrer Menge an Äther geschüttelt. Die gebildete wässrige Schicht wurde abgetrennt durch Zugabe einer wässrigen 1M Dinatriumhydrogenphosphat (Na2 HPO4)-Lösung schwach alkalisch gemacht (pH 7,2) und dann gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wurde der Rückstand in 100 ml Äthanol gelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck bei unterhalb 600C zur Trockne eingedampft und man erhielt 20 g des gleichen gelbbraunen kristallinen Pulvers wie in Beispiel 3.
  • Das auf diese Weise erhaltene Pulver wurde in 100 ml eines Phosphatpuffers (bestehend aus 40 ml M/15 KH2PO4 und 60 ml M/15 Na2HP04) gelöst unter Bildung einer stabilen Lösung mit einem pH-Wert von 7,0. Diese Lösung wurde 6 Monate lang bei 300C aufbewahrt, wobei jedoch keine Änderung in bezug auf die Antifungiaktivität beobachtet wurde.
  • Beispiele 5 bis 10 Das Beispiel 1 wurde wiederholtwobei diesmal jedoch anstelle der Rinde von Philodendron jeweils die in der folgenden Tabelle Vt angegebenen Ausgangsmaterialien verwendet wurden. Die Ausbeuten, die Antifungi-Aktivitäten und die akuten Toxititäten der Produkte sind in der folgenden Tabelle VI angegeben.
  • Die Antifungiaktivität wurde nach dem in dem Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die akute Toxitität wurde wie folgt bestimmt: die in den Beispielen erhaltenen Produkte wurden jeweils in wässrige Lösungen überführt, die dann mit Wasser verdünnt wurden mit Mengen von 65 bis 70 mg/ml, 70 bis 75 mg/ml, 75 bis 80 mg/ml und 80 bis 85 mg/mlXund die dabei erhaltenen Verdünnungen wurden dem aktuten Toxititätstest unterworfen. Der Test wurde in der Weise durchgeführt, daß jede Testlösung in die Schwänze von 20 Mäusen (männlich und weiblich) pro Gruppe (intravenös) injiziert wurde (85 Mäuse wurden reserviert), die ein Körpergewicht von 21 bis 24 g und ein durchschnittliches Körpergewicht von 22,6 g hatten, und es wurde die Anzahl der überlebenden Mäuse festgestellt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI angegeben.
  • Die Zahlen in der Tabelle VI stellen die Überlebensverhältnisse der mäuse dar; so zeigt beispielsweise der Wert 10/10, daß 10 von 10 Mäusen überlebten, während der Wert 8,2/10 angibt, daß 8,2 von 10 Mäusen überlebten.
  • Tabelle VI Bei- Ausgangsmate- Aus Antifungiaktivität akute Toxitität sp. rial (Teil) beute Aspergil- Canadida Trichophy- 65 - 70 70 - 75 75 - 80 80 - 85 85 - 90 lus fumi- albicans ton menta- mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml Nr. (g) gatus grophytes 5 Costinum fenestratum (Rinden) 18,1 20-23 18-20 26-27 8,6/10 8/10 7,6/10 6/10 5/10 6 Berberis Thunberzii (Blätter) 15,5 20-22 20-23 28-30 10/10 10/10 8,2/10 6,8/10 6/10 7 Barberis Thunberzii (Stengel) 20,2 23-24 21-23 28-32 10/10 8/10 7/10 6,2/10 6/10 8 Berberis Sieboldi (Stämme) 17,0 20-23 21-22 27-28 10/10 10/10 10/10 9/10 7/10 9 Philodendrom (Rinden) Barberis Thun- 17,5 18-19 18-19 24-25 9/10 7,6/10 6,4/10 5,2/10 5/10 berzii (Blätter) jeweils 100 10 Philodendron (Rinden) Col-umbo Radix 16,3 22-24 20-24 28-31 10/10 8/10 7,2/10 7/10 6/10 (Früchte) 50 : 150 Beispiele 11 und 12 Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei diesmal anstelle der Rinde von Philodendron jeweils die in der folgenden Tabelle ltII angegebenen Ausgangsmaterialien und anstelle von Äther Petroläther verwendet wurde. Die Ausbeute, die Antifungi-Aktivitäten und die akuten Toxizitäten der Produkte, die wie in den obigen Beispielen ermittelt wurden,sind in der folgenden Tabelle VII angegeben.
  • Bei- Ausgangsmate- Aus Antifungiaktivität akute Toxitität sp. rial (Teil) beute Aspergil- Canadida Trichophy- 65 - 70 70 - 75 75 - 80 80 - 85 85 - 90 lus fumi- albicans ton menta- mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml Nr. (g) gatus grophytes 11 Costinum fenestratum (Stengel, Wurzeln) 18,2 22-24 21-23 28-30 8,7/10 8/10 7/10 5,6/10 5/10 12 Coptis-Pulver 15,1 20-22 15-16 20-22 9/10 8,2/10 7710 5,6/10 5/10 Klinisches Beispiel Es wurde eine Lösung hergestellt, indem 0,4 g der in dem obigen Beispiel 1 erhaltenen gelbbraunen kristallinen pulverigen Substanz in 1 ml eines Phosphatpuffers gelöst wurden. Diese Lösung wurde als Ausgangsflüssigkeit (End-pH-Wert 7,2) verwendet.
  • Die Ausgangsflüssigkeit wurde auf das 50-fache verdünnt und 30 ml der Verdünnung (0,24 g der gelbbraunen pulverförmigen Substanz) wurden 3 mal am Tage 3. bis 3 Wochen lang auf oralem Wege den in der folgenden Tabelle VIII angegebenen Patienten verabreicht, die an einer Fungi-Pneumonie oder -Harnwegsinfektion litten, wobei die Zunahme oder Abnahme der Anzahl der Fungi und Bakterien im Sputum und Urin und die Schwankung der Alkal- oidkonzentration in dem Blut beobachtet wurden. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII angegeben.
  • Wie aus der Tabelle VIII hervorgeht, nahmen die Mengen der Fungi und Bakterien in dem Sputum und in dem Urin ab oder wurden zu o bei zunehmender Konzentration des erfindungsgernäßen Produktes in dem Blut und die erfindungsgemäße gelbbraune pulverförmige Substanz erwies sich als klinisch wirksam nicht nur gegenüber Fungi, sondern auch gegenüber bakteriellen Infektionserkrankungen, die durch Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Micrococcus pyogenes hervorgerufen wurden. Außerdem wurden die therapeutischen Effekte beobachtet, welche die Senkung des Fiebers und die Abnahme oder das Verschwinden der Brustschatten beim Röntgen begleiteten. Die Verabreichung dieses Arzneimittels führte zu keiner Beeinträchtigung der Funktionen der Leber und der Nieren und zu keinen sonstigen Nebenwirhungen.
  • Tabelle VIII
    Name der Anfangswert erste Woche zweite Woche dritte vierte
    Erkrankung Woche Woche
    Parkinson Bakterien- im Sputum (Anzahl der Zellen)
    (vollständige test Candida 7000 #80 #55 #3000
    Steifheit) im Urin
    #59 Jahre alt Escherichia 300 #400 #220 #(-)
    Konzentration (2 Std. nach der Verab-
    im Blut reichung) 0,12 (#/ml) 8 18 1,5
    Verabreich-
    ungsdauer # 14 Tage #
    Fungi-Men in- Bakterien- im Sputum
    gitis test Pseudomonas 2000
    (Asperigillus- Candida 800
    Infektion)
    im Urin
    #41 Jahre alt Candida 600 #40000 #500
    Escherichia 3000 #6000 #4500
    Konzentration (2 Stunden nach der Verab- 14
    im Blut reichung) 0,4 (#/ml)
    Verabreich-
    ungsdauer # 7 Tage #
    Fortsetzung der Tabelle VIII
    Name der Anfangswert erste zweite dritte vierte
    Erkrankung Woche Woche Woche Woche
    Rückgrad-Schaden Bakterien-Test im Sputum
    #27 Jahre als Pseudomonas 50000 #80000
    im Urin 140 #200 #400 #10
    Staphylococcus
    Konzentration (2 Std. nach der Verabrei
    im Blut chung) + (#/ml) 8,8 5
    Verabreich-
    ungsdauer # 7 Tage #
    Verrenkung Bakterien-Test im Sputum
    #39 Jahre alt Pseudomonas 140000 #140 #20 #(-)
    im Urin
    Pseudomonas 600 #600 #1000 #600
    Staphylococcus 600
    Escherichia 400
    Konzentration (2 Stunden nach der Verab-
    im Blut reichung) + (#/ml) 2,4 2,2 25
    Verabreich-
    ungsdauer # 21 Tage #
    Bruch des Cerebral- Bakterientest im Sputum
    Aneurysma Candida 160000 #4000 #8000 #7000 #30
    #67 Jahre alt im Urin
    Pseudomonas 60000 #5000 #1000 #60000 #7000
    Candida 200
    Fortsetzung der Tabelle VIII
    Name der Anfangswert erste zweite dritte vierte
    Erkrankung Woche Woche Woche Woche
    Konzentration (3 Std. nach der Verabrei-
    im Blut chung) 0,5 (#/ml) 2,2 18 0,8 40
    Verabreichungs-
    Dauer # 14 Tage # # 7 Tage #
    Cerebral- Bakterien-Test im Spectrum
    Thrombose Candida 40000 #40 #30000 #3000 #(-)
    #59 Jahre Escherichia 20000 350
    alt
    im Urin
    Escherichia 8000 #(-)
    Candida 460 #(-)
    Konzentration (3 Std. nach der Verabrei-
    im Blut chung) + (#/ml) 8 1,8 12 16
    Verabreich-
    ungsdauer # 28 Tage #
    Cerebral Backterien-Test im Sputum
    Thrombose Candida 100000 #20 #400 #200
    #59 Jahre Micrococcus 8000 #8000 #400
    alt im Urin
    Candida 400 #20 #(-) #(-)
    Staphylococcus 140 #(-) #(-)
    Konzentration (3 Std. nach der Verabrei-
    im Blut chung) + (#/ml) 24 16 16
    Verabrei-
    chungsdauer # 21 Tage #
    Fußnoten: (1.) Candida: Candida albicans Pseudomonas: Pseldomonas aeruginosa Escherichia: Escherichia coli Saphylococcus: Staphylococcus aureus (2.) Der Bakterientest wurde alle 7 Tage durchgeführt.
  • Die Messung der Konzentration im Blut wurde zum ersten Mal 2 bis 3 Stunden nach der Verabreichung des Arzneimittels und danach alle 7 Tage gleichzeitig mit dem Bakterientest durchgeführt.
  • (3.) Die Alkaloid-Konzentration im Blut wurde nach 2 Verfahren bestimmt: einem Verfahren unter Verwendung eines Wagner-Reagens und einem Verfahren zur Bestimmung des Antifungi-Wertes des Serums gegenüber Aspergillus fumigatus (100 O00/ml).
  • Die Erfindung wurde z-ar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Facnmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vie-lerlei Hinsicht abgeändert und modifiziert werden Ennen, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
  • Patentansprüche L e e r s e i t e

Claims (17)

  1. Patentansprüche tL? Verfahren zur Herstellung einer Substanz zur Bekämpfung (Kontrolle) von daten Fungi, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltende, von Fett- oder Harzmaterialien freie Pflanzengewebe mit einem polaren Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt während oder nach der Extraktion bei einer Temperatur von 35 bis 750 ß mit einer wässrigen alkalischen Alkalidihydro genphosphatlösung in Kontakt bringt, die Extraktlösung nach dem Inkontaktbringen mit der wässrigen alkalischen Alkalidihydrogenphospatlösung einengt unter Bildung einer an dem Extrakt gesättigten Lösung die dabei erhaltene gesättigte Lösung mit einer wässrigen alkalischen Dialkalihydrogenphosphatlösung mischt, um den pwWert der Mischung auf 6,8 bis 7,2 zu bringen, das polare Lösungsmittel bei einer Temperatur von 35 bis 75°C verdampft, den dabei erhaltenen Rückstand unter vermindertem Druck trocknet, das getrocknete Material mit einem polaren Lösungsmittel extrahiert und das polare Lösungsmittel zur Trockne eindampft.
  2. -2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mal als ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltendes Pflanzen gewebe ein solches von Philodendron, Coptis, Costinum, Co1umbo und Berberis verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mal als ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltendes Pflanzengewebe rohe Arzneimittel verwendet, die Philodendron-Pulver oder Coptis-Pulver enthalten oder daraus bestehen.
  4. 4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltende Pf lanzengewebe verwendet, aus denen die Fett-oder Harzmaterialien entfernt worden sind durch Extrahieren der Fett- oder Harz materialien aus den ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltenden Pflanzengeweben mittels eines nichtpolaren Lösungsmittels aus der Gruppe Äther, Petroläther, Waschbenzin, Benzol, Toluol und Xylol.
  5. 5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares Lösungsmittel zum Extrahieren des ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltenden Pflanzengewebes, das frei von Fett- oder Harzmaterialien ist> Methylalkohol, Äthylalkohol, Aceton oder Acetonalkohol verwendet.
  6. 6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion des ein Alkaloid vom Barberin-Typ enthaltenden Pflazengewebes bei einer Temperatur von 35 bis 75°C durchführt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mehrere Male wiederholt.
  8. 8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 0,5-bis 1,5-molare wässrige alkalische Alkalidihydrogenphosphatlösung verwendet.
  9. 9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die wässrige alkalische Alkalidihydrogenphosphatlösung, die mit dem Extrakt in Kontakt gebracht wird, in einer solchen enge verwendet, die etwa 1/8 bis 1/12 des Volumens des für die Extraktion des Gewebes verwendeten polaren Lösungsmittels entspricht.
  10. 10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Einengen der Extraktlösung durch Eidampfen des polaren Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 35 bis 75°C durchführt.
  11. 11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als alkalisches Alkalidihydrogenphosphat Kaliumdihydrogenphosphat oder Natriumdi-hydrogenphosphat verwendet.
  12. 12. Verfahren nach mindestens einern der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als alkalisches Dialkalihydrogenphosphat Dikaliumhydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat verwendet.
  13. 13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rückstand durch Gefriertrocknen trocknet.
  14. 14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares Lösungsmittel, mit dem der erhaltene Rückstand extrahiert wird, Äthylalkohol verwendet.
  15. 15. Substanz zur Bekämpfung (Kontrolle) von echten Fungi, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestellt worden ist.
  16. 16. Substanz nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält oder besteht aus einer Mischung von an Phosphorsaure gebundenen Alkaloiden vom Berberin-Typ, die nach der Durchführung einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie aus den den Maxima Nr. 2 bis 7 der Fig. 1 entsprechenden Y,(omponentender Substanz NT-72 besteht.
  17. 17. Mittel zur Bekämpfung (Kontrolle) von echten Fungi, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält oder besteht aus der Substanz nach Anspruch 15 und/oder 16 und Phosphaten, die eine Pufferlösung mit pH 6,8 bis 7,2 ergeben.
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