DE2552630C2

DE2552630C2 -

Info

Publication number: DE2552630C2
Application number: DE2552630A
Authority: DE
Inventors: Junichi Sapporo Jp Nakamura
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-11-24
Filing date: 1975-11-24
Publication date: 1987-08-27
Also published as: DE2552630A1

Description

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Erst vor kurzem sind wirksame und genaue Methoden für die Therapie von Pilzerkrankungen, die durch pathogene Fungi, wie Blastomyces, Candida, Cryptococcus, Coccidiodes, Epidermophyton, Histoplasma, Microsporum und Trichophyton, hervorgerufen werden, gefunden worden. Derzeit werden für die Therapie dieser Erkrankungen Antibiotika vom Polyen-Typ, wie Amphotericin B, Trichomycin und Nystatin oder Clotrimazol verabreicht; diese Stoffe zeigen jedoch unzureichende antimykotische Aktivität. Sie weisen daher keine wirkungsvollen und gezielten therapeutische Effekte auf.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Substanzgemischen mit antimykotischer Wirksamkeit bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 gelöst.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein antimykotisches Mittel, enthaltend eines der nach den Ansprüchen 1 bis 7 hergestellten Substanzgemische.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Pflanzen enthalten in ihren Geweben Alkaloide vom Berberin-Typ, wie Berberin, Palmatin, Coptesin, Worenin, in Form des Hydroxids.

Als Ausgangsmaterialien können z. B. die Rinde, von der die Korkschichten entfernt worden sind, von Philodendron amurense Ruprecht, die Blätter, Stengel und Wurzeln von Berberis Thunbergii, der Stengel von Costinum fenestratum verwendet werden.

Die Ausgangsmaterialien werden vor ihrem Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Lösungsmittel behandelt, um die darin enthaltenden fettartigen, harzartigen oder teerartigen Substanzen zu entfernen. Hierzu wird mit einem nichtpolaren Lösungsmittel, wie Ether, Petrolether, Waschbenzin, Benzol, Toluol oder Xylol, behandelt.

Nach dem Trocknen ergibt der bei der Extraktion mit dem nichtpolaren Lösungsmittel erhaltene Rückstand die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Pflanzengewebe. Diese werden mit einer geeigneten Menge, beispielsweise dem 2- bis 3fachen ihres Volumens, eines polaren Lösungsmittels, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Acetonalkohol, extrahiert. Die Extraktion wird mehrere Male bei 35 bis 75°C so lange durchgeführt, bis die letzte Extraktlösung praktisch farblos ist. Die Extraktlösung wird filtriert und mit etwa 1/8 bis 1/12 Volumenteilen einer 0,5- bis 1,5molaren wäßrigen alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung versetzt. Die Mischung wird auf 35 bis 75°C erhitzt und das polare Lösungsmittel wird bei dieser Temperatur unter vermindertem Druck abgedampft, wobei eine an dem Extrakt gesättigte Lösung erhalten wird.

Die erfindungsgemäße Extraktion kann auch unter Verwendung einer Mischung aus dem polaren Lösungsmittel und der wäßrigen alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 25 : 1 durchgeführt werden. In diesem Falle kann aus der erhaltenen Extraktlösung dann ohne eine weitere Behandlung mit der wäßrigen alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung sofort das polare Lösungsmittel abgedampft werden, wobei man die an dem Extrakt gesättigte Lösung erhält.

Der pH-Wert der an dem Extrakt gesättigten Lösung wird durch Zusatz einer wäßrigen alkalischen Lösung von Dialkalihydrogenphosphat, wie Dikalium- oder Dinatriumhydrogenphosphat, auf 6,8 bis 7,2 gebracht. Die Farbe der Mischung wird dabei blaßgelb-braun. Sie wird gemäß den Ansprüchen weiterbehandelt.

Mit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Philodendron amurense Rupr. var. jap. (Maxim) Ohwi gemäß Beispiel 1 erhaltenen Substanz NT-72 ist es möglich, mit Erfolg das Wachstum von verschiedenen medizinischen Pilzen, wie Genera Aspergillus, Candida, Trichophyton, zu inhibieren. Durch Einverleibung eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 kann die antimykotische Aktivität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Substanz NT-72 noch weiter verbessert werden, und sie kann in einem extrem stabilen Zustand gelagert werden. Die Substanz NT-72 ist in jeder beliebigen Menge sowohl mit hydrophilen als auch mit oleophilen Salbengrundlagemitteln mischbar, und sie zeigt eine hervorragende Wirkung bei der Therapie der Dermatophytose bei Mensch oder Tier, wenn sie in einer Menge von 0,2 bis 0,5 g auf die Haut des unter dieser Erkrankung leidenden Patienten aufgebracht wird.

Sie kann einem Patienten, der an innerer Mykose leidet, auf oralem Wege in einer Dosis von etwa 0,01 bis etwa 0,05 g/kg/Tag verabreicht werden oder sie kann in einer Dosis von etwa 0,001 bis etwa 0,005 g/kg/Tag injiziert werden.

Obgleich bisher noch nicht geklärt werden konnte, welcher Komponente des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Substanzgemisches die antimykotische Aktivität von NT-72 zuzuschreiben ist, wird angenommen, daß es sich hierbei um eine Substanz handelt, in der einige der Alkaloide vom Berberin-Typ in einer bestimmten Form mit Phosphorsäure verbunden sind.

Die Substanz NT-72 schmilzt zwischen 63 und 116°C und stellt eine Kombination von verschiedenen Komponenten dar. Wenn sie einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen wird, treten in dem Chromatogramm mehrere Maxima auf. Die antimykotische Wirksamkeit ist jedoch in zwei Maxima-Anteilen zu sehen.

Die Komponenten der Substanz NT-72 werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.

Die Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm, das bei Durchführung einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bei einem Druck von 30 kg/cm², bei Umgebungstemperatur, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,6 ml/Minute, einer Diagrammaufzeichnungsgeschwindigkeit von 0,5 cm/Minute mittels der Säule Jaskopack SD-C₂-500 und des Detektors UV-254 Uvidec-1,2-FP-4, RI, erhalten wurde.

Die Fig. 1 zeigt 7 Maxima. Das Maximum 1 geht auf die restlichen Lösungsmittel zurück, bei denen es sich um Wasser und Alkohol handelt. Die Maxima 2 bis 7 entsprechen den Komponenten von NT-72. Jede der Komponenten wird abgetrennt und nach der Scheibchenmethode in bezug auf ihre Wachstumsinhibierungsaktivität auf Aspergillus fumigatus, Candida albicans bzw. Trichophyton mentagrophytes getestet.

Tabelle I

Es wird angenommen, daß NT-72 ein anorganisches Salz eines Alkaloids vom Berberin-Typ als aktiven Bestandteil enthält. Wenn NT-72 durch Reduzieren mit Natriumborhydrid von dieser anorganischen Säure befreit wird und die dabei erhaltenen Substanzen mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert werden, wird die aktivste Komponente mit Butanol extrahiert. Wenn nun Berberinhydrochlorid, wie vorstehend angegeben, behandelt wird, weist der erhaltene Butanolextrakt nicht die gewünschte Aktivität auf. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

In der Fig. 2 sind die Infrarotabsorptionsspektren der Butanol- Extrakte dargestellt, wobei daraus hervorgeht, daß die beiden Substanzen voneinander verschieden sind.

Die Fig. 3 und 4 zeigen jeweils NMR-Spektren der Butanolextrakte von reduziertem NT-72 bzw. reduziertem Berberinhydrochlorid, gelöst in schwerem Wasser. Die gemeinsamen Absorptionen sind durch das Signal X angegeben und die bei Berberin fehlenden Absorptionen sind durch das Signal ↓ angegeben.

Die Fig. 5 zeigt die Gaschromatogramme der Butanolextrakte von NT-72 und Berberinhydrochlorid. Daraus ist zu ersehen, daß die Maxima A, B, C und D voneinander verschieden sind und daß die Maxima 1, 2, 3, 4, 5 und 6 gemeinsam sind. Die angewendeten gaschromatografischen Bedingungen waren folgende:

Säule:Gas Chrom P
Silicon GUM SE-30 0,75%
2,25 m Programmierung:40°C bis 240°C Geschwindigkeit:4°C/Minute Diagrammaufzeichnungs-
geschwindigkeit:5 mm/Minute

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

200 g eines Pulvers der von den Korkschichten befreiten Rinde von Philodendron amurense Rupr. var. japonicum (Maxim) Ohwi wurden mehrere Male mit jeweils 500 ml Äther extrahiert, um die darin enthaltenen Fett- oder Harzmaterialien zu entfernen. Zu dem Rückstand wurden 2000 ml Äthanol und 25 ml einer wäßrigen 1M Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄)-Lösung zugegeben, und die dabei erhaltene Mischung wurde 2 bis 3 Stunden lang bei etwa 60°C behandelt, abgekühlt und dann filtriert. Der Rückstand wurde 3mal dem gleichen Extraktionsvorgang wie oben unterworfen. Danach wurden die Filtrate miteinander vereinigt, und das Äthanol wurde durch Destillation unter vermindertem Druck bei unterhalb 60°C aus dem vereinigten Filtrat entfernt, wobei man eine mit dem Extrakt gesättigte Lösung erhielt. Durch Zugabe einer wäßrigen 1M Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄)-Lösung wurde die Lösung schwach alkalisch gemacht (pH 7,2), filtriert und der verbleibende Alkohol wurde durch Vakuumdestillation bei 60°C entfernt. Die erhaltene, wäßrige Lösung wurde dann gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wurde der Rückstand in 100 ml Äthanol aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck bei unterhalb 60°C zur Trockne eingedampft, wobei man 20 g eines gelbbraunen, kristallinen Pulvers erhielt.

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei diesmal jedoch das Äthanol jeweils durch die polaren Lösungsmittel Methanol und Acetonalkohol ersetzt wurde, wobei das gleiche Ergebnis wie oben erhalten wurde.

Beispiel 2

200 g eines Coptis-Pulvers aus Coptis Japonica Makino wurden dreimal mit jeweils 500 ml Äther extrahiert, um die darin enthaltenden Fett- oder Harzmaterialien zu entfernen. Der feste Rückstand wurde getrocknet und mit 2000 ml Äthanol versetzt und die dabei erhaltene Mischung wurde 2 Stunden lang bei etwa 60°C stehengelassen. Zu der Mischung wurden dann 40 ml einer wäßrigen 1M Kaliumdihydrogenphosphat(KH₂PO₄)- Lösung zugegeben, und die Mischung wurde auf etwa 60°C erhitzt, abgekühlt und dann filtriert. Der Rückstand wurde 3mal der gleichen Arbeitsweise wie vorstehend unterworfen. Danach wurden die Filtrate miteinander vereinigt und bis zur Sättigung konzentriert, indem sie einer Destillation unter vermindertem Druck bei unterhalb 60°C unterworfen wurden. Die erhaltene, gesättigte Lösung wurde durch Zugabe einer wäßrigen 1M Dinatrium hydrogenphosphat-(Na₂HPO₄)-Lösung schwach alkalisch gemacht (pH 7,2), durch Destillation unter vermindertem Druck bei 70°C von Äthanol vollständig befreit und dann gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wurde der Rückstand in 100 ml Äthanol aufgelöst, und die dabei erhaltene Lösung wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck bei unterhalb 60°C zur Trockne eingedampft, wobei man 20 g eines gelbbraunen kristallinen Pulvers erhielt.

Beispiele 3 bis 8

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei diesmal jedoch anstelle der Rinde von Philodendron jeweils die in der folgenden Tabelle VI angegebenen Ausgangsmaterialien verwendet wurden. Die Ausbeuten, die antimykotischen Aktivitäten und die akuten Toxizitäten der Produkte sind in der folgenden Tabelle VI angegeben.

Die antimykotische Aktivität wurde wie folgt bestimmt: 0,8 g Substanz wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Unter Verwendung von 0,01 ml der dabei erhaltenen Lösung wurde die Wachstumshemmwirkung nach der Scheibchenmethode getestet.

Die akute Toxizität wurde wie folgt bestimmt: Die in den Beispielen erhaltenen Produkte wurden jeweils in wäßrige Lösungen überführt, die dann mit Wasser verdünnt wurden mit Mengen von 65 bis 70 mg/ml, 70 bis 75 mg/ml, 75 bis 80 mg/ml und 80 bis 85 mg/ml. Die dabei erhaltenen Verdünnungen wurden dem akuten Toxizitätstest unterworfen. Der Test wurde in der Weise durchgeführt, daß jede Testlösung in die Schwänze von 20 Mäusen (männlich und weiblich) pro Gruppe (intravenös) injiziert wurde, die ein Körpergewicht von 21 bis 24 g und ein durchschnittliches Körpergewicht von 22,6 g hatten, und es wurde die Anzahl der überlebenden Mäuse festgestellt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI angegeben. Die Zahlen in der Tabelle VI stellen die Überlebensraten der Mäuse dar; so zeigt beispielsweise der Wert 10/10, daß 10 von 10 Mäusen überlebten, während der Wert 8,2/10 angibt, daß 8,2 von 10 Mäusen überlebten.

Beispiele 9 und 10

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei diesmal anstelle der Rinde von Philodendron jeweils die in der folgenden Tabelle VII angegebenen Ausgangsmaterialien und anstelle von Äther Petroläther zum Entfetten und Entharzen verwendet wurde. Die Ausbeute, die antimykotische Aktivität und die akute Toxizität der Produkte, die wie in den obigen Beispielen ermittelt wurden, sind in der folgenden Tabelle VII angegeben.

In dem Versuch wurden folgende Mikroorganismenstämme verwendet:

1) IFO-4057 Aspergillus fumigatus
2) IFO-0600 Candida albicans
3) IFO-5809 Trichophyton mentagrophytes
4) IFO-0608 Cryptococcus neoformans

In dem Versuch wurden folgende Nährmedien verwendet:

1) Sabouraud's 4% Glucose Agar, vom Erfinder hergestellt
2) Sabouraud's 2% Glucose Agar, vom Erfinder hergestellt
3) Brain Heart Infusion Agar, vom Erfinder hergestellt

Reife, conidien-bildende Kolonien von Aspergillus fumigatus (nachstehend mit A. fumiga abgekürzt) und von Trichophyton mentagrophytes (nachstehend als T. menta abgekürzt) wurden zerrieben und in sterilisierter, Tween-80-enthaltender physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.

Reife Kolonien von Candida albicans (nachstehend als C. albi. abgekürzt) und Cryptococcus neoformans (nachstehend als Cr. neoform. abgekürzt) wurden abgeschabt und getrennt mit sterilisierter, Tween-80-enthaltender physiologischer Kochsalzlösung vermischt. Die vorstehend beschriebenen Lösungen bilden die mykotischen Testlösungen.

Jedes der vorgenannten Nährmedien wurde sterilisiert und bei 54 bis 55°C gehalten. Jedes der Nährmedien wurde mit einer der vorgenannten mykotischen Lösungen versetzt. Die so erhaltene Mischung wurde auf dasselbe Nährmedium gegossen, das zuvor in eine Schale gegossen worden war und sich zu einer dünnen Schicht verfestigt hatte. Die so hergestellten Medien wurden für den antimykotischen Test verwendet.

Die zu prüfende antimykotischwirksamen Substanzen unterschieden sich hinsichtlich der Art des besten Lösungsmittels, von dem ihre Diffusion und Absorption abhängt. Unter den Testbedingungen wurde neutrales Wasser als bestes Lösungsmittel angesehen. Jedes der Testsubstanzen wurde daher in sterilisiertem, destilliertem Wasser gelöst, wobei Lösungen mit Gehalten von 0,001 mg/ml hergestellt wurden.

Für jede Substanz wurde ein handelsübliches Absorptionsscheibchen mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Dicke von 1 mm verwendet.

Durch Abwiegen wurde festgestellt, daß die Absorption der Substanzlösungen auf dem Scheibchen durchschnittlich etwa 0,0016 g betrug, wobei das Scheibchen selbst 0,003 g wog.

Die vorgenannten Medien, die jeweils getrennt jeden mykotischen Stamm enthielten, wurden zur Entfernung des auf ihrer Oberfläche befindlichen Wassers abgestrichen und dann etwa 30 Minuten bei 10°C stehengelassen. Anschließend wurden die mit den zu prüfenden Substanzen getränkten Scheibchen in gleichen Abständen willkürlich auf die Medien gelegt. Die Inkubation wurde bei 37°C während einer für das Wachstum jedes Stammes notwendigen Zeit durchgeführt, mit der Ausnahme, daß T. menta bei 30°C inkubiert wurde.

Die Ergebnisse wurden ausgewertet, nachdem jeder Stamm genügend gewachsen war. Im einzelnen wurden die Messungen der Hemmhöfe wie folgt durchgeführt:

Bei A. fumiga.:nachdem die ganze Fläche gefärbt und fast vollständig mit Conidien bedeckt war; Bei C. albi.:nachdem ein signifikanter Auswuchs am Abbruch jedes Hemmhofs beobachtet wurde; Bei T. menta.:nachdem Mycel-"Dorne" am Abbruch jedes Hemmhofs und kleine Auswüchste in der Peripherie beobachtet wurden; Bei Cr. neoform.:nachdem der Umfang jedes Hemmhofs eine glatte, kreisförmige Zone zeigte und kleine Auswüchse gebildet waren.

Zur Messung der Hemmwerte wurde der Durchmesser des durchsichtigen Teils der Hemmzone mit einem an den Boden der Schale angelegten Lineal gemessen; anschließend wurde das Scheibchen und die beiden durchsichtigen Teile gemessen. Wenn die Messung des Durchmessers mit der Summe der zuletztgenannten Messungen übereinstimmte, wurde der Wert als Hemmwert der betreffenden Substanz gegen den jeweiligen Stamm angesehen; dieser Wert wurde in mm angegeben.

In der nachstehenden Tabelle sind die Hemmwerte der antimykotischen Substanzen zusammengestellt. In der Tabelle bedeutet der Begriff "Spurring" die geringe Bildung eines Hemmhofs und der Begriff "Spur" die Bildung eines durchlässigen Teils (unvollständiger Hemmhof oder doppelter Hemmhof) zusätzlich zum durchsichtigen Hemmhof. Diese Tendenz wurde häufig bei Hefen beobachtet. Sie trat insbesondere bei wasserunlöslichen Substanzen auf, da der Test in einem wäßrigen Medium durchgeführt wurde. Clotrimazol ergab von Versuch zu Versuch verschiedene Ergebnisse wegen seiner Hydrolysierbarkeit.

Vergleich zwischen NT-72 (nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten) und anderen antimykotisch wirksamen Substanzen des Standes der Technik (Absorption auf dem Scheibchen: 0,001 g; Angaben in mm).

Akute orale Toxizität

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Substanz NT-72 und das aus dem Stand der Technik als Antimykotikum bekannte Clotrimazol wurden unter identischen Bedingungen untersucht wurden. Im einzelnen wurde je eine Gruppe von 10 DD-Mäusen mit einem Körpergewicht von 20 g ± 2 g, die jeweils aus 5 männlichen und 5 weiblichen Tieren bestand, untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß der LD₅₀ für die erfindungsgemäße Substanz NT-72 7200 mg/kg beträgt, während der entsprechende Wert für das bekannte Clotrimazol 865 mg/kg beträgt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Substanzgemisches mit antimykotischer Wirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkaloid vom Berberin-Typ mit der Grundstruktur enthaltende Pflanzengewebe, die von Fett- und Harzmaterialien befreit wurden, von Philodendron amurense Rupr. Var. japonicum (Maxim.) Ohwi, Philodendron amurense Rupr., aus Coptis japonica Makino hergestelltes Coptis-Pulver, Costinum fenestratum, Berberis Thunbergii, Berberis Sieboldi und/oder Columbo Radix mit einem polaren Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt während oder nach der Extraktion bei einer Temperatur von 35 bis 75°C mit einer wäßrigen alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung in Kontakt bringt, die Extraktlösung nach dem Inkontaktbringen mit der wäßrigen alkalischen Alkalidihydrogenphosphatlösung einengt unter Bildung einer an dem Extrakt gesättigten Lösung, die dabei erhaltene gesättigte Lösung mit einer wäßrigen alkalischen Dialkalihydrogenphosphatlösung mischt, um den pH-Wert der Mischung auf 6,8 bis 7,2 zu bringen, das polare Lösungsmittel bei einer Temperatur von 35 bis 75°C verdampft, den dabei erhaltenen Rückstand unter vermindertem Druck oder durch Gefriertrocknen trocknet, das getrocknete Material mit einem polaren Lösungsmittel extrahiert und das polare Lösungsmittel zur Trockne eindampft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares Lösungsmittel zum Extrahieren des ein Alkaloid vom Berberin-Typ enthaltenden Pflanzengewebes, das frei von Fett- oder Harzmaterialien ist, Methylalkohol, Ethylalkohol, Aceton oder Acetonalkohol verwendet.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 0,5- bis 1,5molare wäßrige alkalische Alkalidihydrogenphosphatlösung verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Einengen der Extraktlösung durch Eindampfen des polaren Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 35 bis 75°C durchführt.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als alkalisches Alkalidihydrogenphosphat Kaliumdihydrogenphosphat oder Natriumdihydrogenphosphat verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als alkalisches Dialkalihydrogenphosphat Dikaliumhydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat verwendet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares Lösungsmittel, mit dem der erhaltene Rückstand extrahiert wird, Ethylalkohol verwendet.

8. Antimykotisches Mittel, enthaltend eines der nach den Ansprüchen 1 bis 7 hergestellten Substanzgemische.