DE3525363A1 - Verfahren zur herstellung von auf wedelolacton- und/oder desmethylwedelolacton standardisierten extrakten aus eclipta alba und verwendung der extrakte zur herstellung eines lebertherapeutikums - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten aus Eclipta alba, die standardisierte Mengen von Wedelolacton und/oder Desmethylwedelolacton enthalten.

Es ist bekannt, daß Eclipta alba und Wedelia calendulacea aus der Familie der Asteraceae Heilmittelwirkung haben, beispielsweise bei Gelbsucht. Flüssigextrakte von E. alba sind auch schon bei Lebertherapie geprüft worden und es wurde festgestellt, daß sie bei einer Tetrachlorkohlenstoff-induzierten Leberschädigung eine Heilwirkung aufweisen. Die Blätter von Eclipta alba wurden auch schon oral gegen Kopfschmerzen verwendet und die Wurzeln davon sollen eine purgative Wirkung haben und zeigen auch eine antiseptische Wirkung sowie antibiotische Aktivität gegen Staphylococcus aureus und Escherichia coli. Als Naturprodukte, die in Eclipta alba und Wedelia calendulacea vorkommen, sind Wedelolacton (I) und auch Desmethylwedelolacton (II) nachgewiesen worden, (II) bisher nur in E. alba.

Trocknet man die Blätter von E. alba an der Luft oder unter vermindertem Druck unterhalb 40°C, so kann man in dem Extrakt weder (I) noch (II) nachweisen. Dies beruht wahrscheinlich auf der leichten Oxidierbarkeit dieser Verbindung.

Obwohl die Heilwirkung von E. alba und W. calendulacea insbesondere gegen Gelbsucht bekannt ist, wurde festgestellt, daß daraus isoliertes Wedelolacton keine merkliche pharmakologische Aktivität aufweist und insbesondere auch nicht gegen Gelbsucht wirksam ist.

Als pflanzliches Lebertherapeutikum ist derzeit im wesentlichen Silymarin aus Silybum marianum bekannt. Es besteht ein Bedürfnis nach weiteren und möglichst noch wirksameren pflanzlichen Lebertherapeutika, die dem Patienten und dem Therapeuten ermöglichen, bei der Lebertherapie auf Arzneimittel auszuweichen, die nicht auf der Basis von Silymarin aufgebaut sind.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren aufzuzeigen, das es ermöglicht, Extrakte von Eclipta alba zu erhalten, die auf Wedelolacton und/oder Desmethylwedelolacton standardisiert sind. Verbunden mit dieser Aufgabe ist es, ein standardisiertes Lebertherapeutikum auf Basis von Extrakten von Eclipta alba zur Verfügung zu stellen.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß entgegen der bisherigen Annahme Wedelolacton und Desmethylwedelolacton auch in der getrockneten Droge nachweisbar sind und daß sie eine signifikante antihepatotoxische, leberprotektive und die Leberregeneration fördernde Wirkung zeigen.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zum Standardisieren von wedelolacton- und/oder desmethylwedelolactonhaltigen Extrakten aus Eclipta alba und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Stufen durchführt:
(a) Extrahieren der getrockneten, pulverisierten oberirdischen Bestandteile der Droge Eclipta alba mit Methanol und/oder Ethanol
(b) Digerieren des vom Lösungsmittel befreiten Alkoholextraktes mit Wasser bei einer Temperatur bis 80°C,
(c) Filtrieren des wäßrigen Extraktes,
(d) Ausschütteln des wäßrigen Extraktes mit einem in Wasser wenig oder unmischbaren inerten organischen Lösungsmittel,
(e) Durchführen einer qualitativen und quantitativen HPLC-Standardisierung der nach (a) bis (d) erhaltenen angereicherten Fraktion unter folgenden Bedingungen:

Verwendung einer mit Umkehrphase gefüllten Säule und säurehaltigen Acetonitril/Wasser-Gemischen oder Methanol/Wasser-Gemischen als Fließmittel, Anwendung der Methode des externen Standards zur quantitativen Bestimmung von Wedelolacton und/oder Desmethylwedelolacton über ihre Peakflächen.

Zunächst wird die getrocknete Droge, wie sie im Handel erhältlich ist, pulverisiert und gründlich mit Methanol und/oder Ethanol extrahiert. Diese Extraktion wird vorzugsweise in einem Soxhlet durchgeführt, wobei bei dieser Extraktion ca. 20% an Extraktionsprodukten gewonnen werden. Die Extraktionszeit beträgt zweckmäßigerweise 12 h bis 7 Tage. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck vom Extrakt abgezogen. Der vom Extraktionsmittel befreite Extrakt wird dann mit Wasser bei einer Temperatur, die 80°C nicht überschreitet, digeriert. Hierzu verwendet man zweckmäßig die 2- bis 20-fache, vorzugsweise 3- bis 5-fache Wassermenge, bezogen auf das Trockengewicht des Extraktes. Zweckmäßigerweise führt man das Digerieren auf einem Dampfbad durch.

Der so erhaltene wäßrige Extrakt wird dann filtriert, wobei Chlorophyll und weitere Ballaststoffe auf dem Filter verbleiben.

Zur Anreicherung von Wedelolacton und Desmethylwedelolacton wird anschließend die wäßrige Phase mit einem mit Wasser wenig oder nicht mischbaren inerten organischen Lösungsmittel, in dem Wedelolacton oder Desmethylwedelolacton besser löslich sind als in Wasser, z. B. mit Ethylacetat oder Ether ausgeschüttelt. Das Ausschütteln erfolgt mehrfach, wobei man im allgemeinen pro Ausschüttelungsgang die 0,2- bis 0,5-fache Menge des Lösungsmittels verwendet.

Aus der so erhaltenen Fraktion kann man Wedelolacton und Desmethylwedelolacton durch Säulenchromatographie an Kieselgel und präparative Dünnschichtchromatographie und/oder präparative HPLC isolieren. Erfindungsgemäß erfolgt aber die weitere Behandlung der Fraktion durch HPLC-Standardisierung. Hierzu wird eine mit Umkehrphase gefüllte Säule, zweckmäßigerweise z. B. eine Hibar® LiChrospher-Stahlsäule der Fa. Merck, Darmstadt, und ein säurehaltiges Acetonitril/Wasser- oder auch Methanol/Wasser-Gradientensystem als Fließmittel verwendet.

Die qualitative Standardisierung geschieht über den HPLC-"Fingerprint". Die quantitative Standardisierung erfolgt nach der Methode des externen Standards, d. h. mit Hilfe einer mit reinem Wedelolacton erstellten Eichgeraden, über die Messung der Peakflächen von Wedelolacton und/oder Desmethylwedelolacton mit HPLC-Chromatogramm. Durch die Peakfläche läßt sich mit Hilfe der Eichgeraden die Menge an Wedelolacton und/oder Desmethylwedelolacton bestimmen, die auf die eingesetzte Menge an angereicherter Fraktion umgerechnet wird. Auch die Methode des inneren Standards ist zur quantitativen Bestimmung geeignet.

Man erhält, bezogen auf das Trockengewicht der angereicherten Fraktion, ca. 15% Wedelolacton und ca. 1,5% Desmethylwedelolacton, also im Verhältnis von etwa 10 : 1.

Pharmakologische Untersuchungen:

Der standardisierte Extrakt aus Eclipta alba wurde in zwei Untersuchungsmodellen pharmakologisch auf Leberwirksamkeit getestet:

1) Hepatocytenmodell nach HIKINO (Kiso, Y., Tohkin, M., Hikino, H.: J. Nat. Prod. 46, 841-847 (1983) und Kiso, Y., Tohkin, M., Hikino, H.: Planta med. 49, 222-225 (1983)):

Dieses erste Modell nach HIKINO et al verwendet aus Rattenleber isolierte Leberzellen (Hepatocyten), die künstlich mit Tetrachlorkohlenstoff (CCl₄) und Galactosamin (GalN), zwei bekannten und gut untersuchten hepatotoxischen Stoffen, geschädigt werden. Die Leberschädigung äußert sich durch Austritt des Enzyms Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) durch die geschädigte Zellmembran in das umgebende Medium. Die Enzymaktivität des aus den Hepatocyten ausgetretenen Enzyms wird gemessen. Wenn eine dem Testsystem zugesetzte Verbindung in der Lage ist, die Hepatocyten vor der Einwirkung von CCl₄ oder GalN zu schützen, äußert sich das in einer Hemmung der Freisetzung von GPT aus den Zellen. Das Ergebnis des Tests wird ausgedrückt in Prozent, bezogen auf eine Kontrolle, bei der der GPT-Spiegel nach reiner Schädigung der Zellen mit beiden Agentien ohne Schutz gleich 100% gesetzt wird. Je kleiner also der Wert ist, desto stärker schützt die Verbindung die Hepatocyten vor Schäden durch CCl₄ und GalN, und die Verbindung kann als antihepatotoxisch und leberprotektiv angesehen werden.

In diesem Modell ergab sich für die standardisierte Fraktion aus Eclipta alba im CCl₄-Modell ein Wert von 13%, im GalN-Modell wurden ebenfalls 13% erhalten. Für die Reinstoffe Wedelolacton und Desmethylwedelolacton wurden folgendeWerte erhalten:
Wedelolacton: 0% (CCl₄) und 9% (GalN)
Desmethylwedelolacton: 6% (CCl₄) und 10% (GalN).
Ein Vergleich mit den entsprechenden Werten für Silybin (31% im CCl₄-Modell und 77% im GalN-Modell bei vergleichbarer Dosis) (Dissertation M. Fiebig, München 1983, Hikino, H., Kiso, Y., Wagner, H., Fiebig, M.: Planta med. 50, 248 (1984)) zeigt, daß der standardisierte Extrakt sowie die beiden Hauptverbindungen, die sich in ihrer Wirkung kaum unterscheiden, in diesem Testmodell deutlich stärkere Wirkungen als Silybin zeigen.

2) RNA-Synthese-Stimulierungsmodell nach SONNENBICHLER (Machicao, F., Sonnenbichler, J.: Hoppe- Seyler′s Z. Physiol. Chem. 358, 141-147 (1977)):

Im zweiten Testmodell nach SONNENBICHLER et al werden isolierte Zellkerne aus Rattenleber verwendet. Zugesetztes tritiummarkiertes Uridintriphosphat (³H-UTP) wird unter dem Einfluß der Polymerasen in die Ribonukleinsäure (RNA) der Zellkerne eingebaut. Die Einbaurate von ³H-UTP wird durch Messung der Radioaktivität 15 min nach Zusatz der Testsubstanzenzum Reaktionsgemisch bestimmt. Höhere Radioaktivität bei den Proben gegenüber den Kontrollen bedeutet eine Stimulierung der RNA-Synthese durch die Substanzen. RNA-Synthesestimulierung im Zellkern bedeutet Stimulierung der Proteinbiosynthese und gibt Aufschluß darüber, inwieweit zugesetzte Leberwirkstoffe in der Lage sind, die Regenerationsfähigkeitder Leber durch vermehrte Produktion von Proteinen zu steigern.

Die standardisierte Fraktion aus Eclipta alba ergab bei einer Dosis von 20 µg/ml 52% und bei 5 µg/ml 88,8% Steigerung der Radioaktivität gegen die Kontrollwerte, so daß die RNA-Synthese in Rattenleberzellkernensignifikant und stärker als bei Silybin stimuliert wurde.

Beispiel

Die Herstellung von einem auf Wedelolacton und Desmethylwedelolacton standardisierten Extrakt aus Eclipta alba geschieht beispielsweise auf die folgende Weise:

475 g getrocknete oberirdische Bestandteile von Eclipta alba (Lieferant der Droge: Humalaya Drug Company, Bombay, Indien) wurden in einem Haushaltsmixer grob pulverisiert. Das Drogenpulver wurde anschließend 6 Tage lang mit etwa 2 l Methanol in einer Soxhlet-Apparatur extrahiert. Vom so gewonnenen Methanolextrakt wurde das Methanol unter vermindertem Druck abgezogen. Es wurden 103 g trockener Extrakt gewonnen, entsprechend etwa 21% vom eingesetzten Drogenmaterial.Der Methanolextrakt wurde in 500 ml demineralisiertem Wasser aufgeschlämmt und 30 min lang auf einem Dampfbad digeriert, wobei die Temperatur der wäßrigen Suspension 80°C nicht überschritt. Die Suspension wurde dann filtriert. Nach dieser Behandlung war der Extrakt vollständig von Chlorophyll und anderen Ballaststoffen befreit. Die nach der Filtration erhaltene wäßrige Phase wurde 5 Mal erschöpfend mit je mindestens 200 ml Ethylacetat ausgeschüttelt. Die quantitative Erfassung von Wedelolacton und Desmethylwedelolacton in der Ethylacetat-Fraktion durch die Ausschüttelung wurde dünnschichtchromatographisch geprüft. Dazu wurden Kieselgel-Fertigplatten 60 F 254 der Fa. Merck und als Laufmitteldas System Toluol: Aceton:Ameisensäure im Verhältnis 11 : 6 : 1 verwendet. In diesem System beträgt der Rf-Wert von Wedelolacton 0,58, der von Desmethylwedelolacton 0,48. Nach der fünfmaligen Ausschüttelung der wäßrigen Phase mit Ethylacetat war in der wäßrigen Phase dünnschichtchromatographisch kein Wedelolacton oder Desmethylwedelolacton mehr nachzuweisen. Die Ethylacetat-Fraktion wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Es konnten 2,2 g trockene Ethylacetat-Fraktion, in der die beiden Stoffe angereichert sind, gewonnen werden, entsprechend etwa 2% eingesetzemMethanolextrakt.

Die Standardisierung dieser Fraktion erfolgt mit einem HPLC-System der Fa. Hewlett-Packard: HP 1090 Liquid Chromatographmit HP 1040A Photodiodenarray- Detektor und HP 85B Tischcomputer, HP 9121Diskettenlaufwerk und HP 7470A X-Y-Plotter sowie HP 3392A Integrator. Die Ethylacetat-Fraktion wurde über eine Hibar-LiChrospher^R-Stahlsäule (100 CH-18/2), gefüllt mit C18-Umkehrphase (Teilchengröße 5 µm) mit den Maßen 125 × 4 mm (innerer Durchmesser), chromatographiert.Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 351 nm. Der Fließmittel-Gradient reichte bei linearem Anstieg von 15% wäßrigem Acetonitril bis 40% wäßrigem Acetonitril unter Zusatz von 10 ml 0,1 n Phoshorsäure/l Fließmittel. Der Durchfluß war 1 ml/min. Dieses Fließmittel-Gradienten-System eignet sich zur qualitativen sowie zur quantitativen Standardisierung der Fraktion auf die Wirkstoffe Wedelolacton und Desmethylwedelolacton.

Zur qualitativen Analyse wurden 10 µl einer 0,1%igen Lösung der Ethylacetat-Fraktion in Methanol p. A. eingesetzt.

Das HPLC-Bild ("Fingerprint") ist durch zwei charakteristische Peaks gekennzeichnet. Desmethylwedelolacton hat eine Retentionszeit von 11 min, Wedelolacton von 17,5 min. Zur quantitativen Standardisierung wurde mit reinem Wedelolacton eine Eichgerade erstellt bzw. errechnet. Dabei wurde die eingesetzte Menge an Wedelolacton (1, 4, 7 und 10 µl einer Lösung von 1,00 mg Wedelolacton in 2,0 ml Methanol p. A., entsprechend 0,5, 2, 3, 5 und 5 µg Wedelolacton) in Beziehung gesetzt zur Peakfläche, die im HPLC-Chromatogramm elektronisch integriert wurde. Zur Standardisierung der Ethylacetat- Fraktion wurden 5 und 10µl einer Lösung von 5,00 mg Fraktion in 5,0 ml Methanol p. A. (entsprechend 5 und 10 µg Fraktion) für die HPLC eingesetzt. Die Peakflächen von Wedelolacton und Desmethylwedelolacton wurden durch elektronische Integration bestimmt, die der Fläche entsprechende Menge errechnet mit Hilfe der Eichgeraden und auf die eingesetzte Menge Fraktion umgerechnet. Die Ethylacetat-Fraktion wurde auf einen Gehalt von 15% Wedelolacton und 1,5% Desmethylwedelolacton standardisiert. In dieser Drogencharge wurde also ein Verhältnis von 10 : 1 erhalten.

Mit dem so standardisierten Extrakt wurden die pharmakologischen Versuche durchgeführt.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von auf Wedelolacton und/oder Desmethylwedelolacton standardisierten Extrakten aus Eclipta alba, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
(a) Extrahieren der getrockneten, pulverisierten oberirdirschen Bestandteile der Droge Eclipta alba mit Methanol und/oder Ethanol
(b) Digerieren des vom Lösungsmittel befreiten Alkoholextraktes mit Wasser bei einer Temperatur bis 80°C,
(c) Filtrieren des wäßrigen Extraktes,
(d) Ausschütteln des wäßrigen Extraktes mit einem in Wasser wenig oder unmischbaren inerten organischen Lösungsmittel,
(e) Durchführen einer qualitativen und quantitativen HPLC-Standardisierung der nach (a) bis (d) erhaltenen angereicherten Fraktion unter folgenden Bedingungen:
Verwendung einer mit Umkehrphase gefüllten Säule und säurehaltigen Acetonitril/Wasser-Gemischen oder Methanol/Wasser-Gemischen als Fließmittel, Anwendung der Methode des externen Standards zur quantitativen Bestimmung von Wedelolacton und/oder Desmethylwedelolacton über ihre Peakflächen.

2. Verwendung der gemäß Anspruch 1 standardisierten Extrakte zur Herstellung eines antihepatotoxischen und leberprotektiven Arzneimittels.