DE2947646A1

DE2947646A1 - Substanz mit interferon induzierender aktivitaet sowie verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2947646A1
Application number: DE19792947646
Authority: DE
Inventors: Takashi Hashimoto; Yasuhiko Kojima; Seishi Konno; Yoshimoto Sano; Sadao Tamamura
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1978-11-28
Filing date: 1979-11-27
Publication date: 1980-05-29
Also published as: US4419349A; GB2036751A; FR2442633A1; GB2036751B; FR2442633B1; DE2947646C2

Description

2*4764*- Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch Patentanwälte

Diplom-Physiker

Dr. Waltor Andrejewtkl

Diplom-lngantajr Dr.-lng. Manfred Honk· Diplom-lngentoiii

Ham Dieter Getthuysen

Diplom-Physiker

Dr. KaH Gerhard Match

AitwtiltMkto t 43 Bse#ft If iVNMtfMplBts #r FmH* 799

54 529/R+th 23. November 1979

Patentanmeldung KITASATO KENKYUSHO (The Kltasato Institute) 9-1 , Shirokane 5-ohome, Minato-ku, Tokyo-tOj Japan

Substanz mit Interferon Induzierender Aktivität sowie Verfahren zu Ihrer Herstellung.

Bei Interferon, welohes nachstehend auoh als IP oder ale virushemmender Faktor bezeichnet wird, handelt es sieh um eine Substanz, welche auf tierlsohe Zellen einwirken kann, um das Wachstum eines Virus zu hemmen, wobei es sich um eine von der Zelle entsprechend der VirusInfektlon freigegebene Proteinart handelt. Die virozide Aktivität von IP ist in Bezug auf eine Tierspezies spezifisch, Jedooh unspezifisoh in Bezug auf eine Viruespezies und kann unter für ihre Induzierung unterschiedlichen Bedingungen

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Andrejewslci, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen

schwanken. Es ist auch bekannt, daß das Wachstum bestimmter tierischer tumorartiger Viren durch IF unter bestimmten Bedingungen stark gehemmt werden kann.

Eine Substanz, welche zur Induzierung von IF auf tierische Zellen einwirken Kann, wird als Interferon induzierende Substanz bezeichnet. Eine derartige Substanz ist daher von Interesse für Vorbeugungsmaßnahmen und die Behandlung verschiedener menschlicher und tierischer Erkrankungen durch Virusinfektion. Allerdings wurden in der Praxis bisher verschiedene bekannte derartige Substanzen niemals für einen derartigen Zweck verwendet, da gewisse schwerwiegende Schäden auftraten. So ist beispielsweise in der US-Patentschrift 3 5^3 Ö93 (1971) eine doppelsträngige Ribonucleinsäure als Interferon induzierende Substanz offenbart, welche unter Verwendung eines Mikroorganismus hergestellt wird, daß viele Substanzen wie Bakterien, Viren, Polysaccharide, mitogene Wirkstoffe, Indotoxine und dgl. die Interferonbildung stimulieren, daß jedoch keine für den Routinegebrauch von Interesse ist, und zwar unter anderem wegen der Giftigkeit, der Antigenwirkung und wegen der Infektiösität. V/eitere bekannte Interferon induzierende Substanzen sind beispielsweise in den US-Patentschriften 3 773 924 und 3 884 845 sowie der japanischen Offenlegungsschrift Kokai Koho 121919/78 beschrieben. Diese Interferon induzierenden Substanzen sind jedoch nicht aus Pflanzen isoliert und man weiß auch, daß aus Mikroorganismen isolierte Interferon induzierende Substanzen im allgemeinen wegen ihrer hohen Giftigkeit für therapeutische Zwecke unvorteilhaft sind.

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Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen

Beispiele bekannter mitogener Mittel sind Phytohemaglutinin (Wheelock, Science, 149Q1O (I965), pokeweed Mitogen (Friedman et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 12^:901 (I967) und Concanavalin A (Willen et al. Cell. Immunol., 6:110 (1973)* welche jeweils aus Geweben zweier in Amerika als "kidney bean" und als "horse bean" bekannter Bohnenarten und aus einer unter den Namen Pokeweed bekannten Pflanze isoliert wurden. Infolge ihrer extrem niedrigen Aktivität, Interferon zu induzieren, wurde jedoch kein erfolgreicher Versuch gemacht, diese mitogenen Mittel zu Präventivzwecken und zum Heilen verschiedener menschlicher und tierischer Krankheiten infolge Virusinfektionen zu verwenden.

Man kennt auch andere Interferon induzierende Substanzen, welche aus Geweben höherer Pflanzen isoliert werden. So gibt beispielsweise Kumazawa, Kojima et al (japanische Offenlegungssohrift Kokai Koho 32107/78) an, daß eine Interferon induzierende Substanz, von welcher angenommen wird, daß es sich um eine Art von hydropolymerem Saccharid handelt, welche als Hauptbestandteile Hexose (48#), Protein (5#) und Uronsäure (40#) enthält und ein Molekulargewicht von mehr als 10 000 besitzt, aus der Wurzel von Angellica acutiloba Kitagawa (in Japan bekannt als Toki) durch durch Extraktion mit heißem Wasser isoliert wird, sodaß eine extrahierte Lösung entsteht, welche der Dialyse unterworfen wird. Dem entstandenen Rückstand wird Azeton zugesetzt, um ein Präzipitat zu erhalten, welches dann gefriergetrocknet wird. In diesem Fall kann, falls gewünscht, die extrahierte Lösung durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer Diaflo-Membrane und anschließende Dialyse auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden. Als Nächstes beschreiben Kojima und Tamamura (japanische Offenlegungssohrift Kokai Koho 99313/78)

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Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen

eine Interferon induzierende Substanz mit einem Molekulargewicht von mehr als 20 000 (in der Hauptsache mehr als 100 000), welche als Hauptbestandteil eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose: mehr als 9056) enthält. Diese Interferon induzierende Substanz wird dadurch hergestellt, daß die Wurzelrinde eines Maulbeerbaumes wie beispielsweise Morus alba Linne (in Japan als Maguwa bekannt) oder Morus bombycis Koizdumi (in Japan bekannt als Yamaguwa) mit heißem Wasser extrahiert wird, der extrahierten Lösung ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, um ein Präzipitat zu erhalten, und diesem Präzipitat eine geringe Wassermenge zugesetzt wird, die Lösung der Dialyse zur Herstellung eines Rückstandes unterworfen wird und dieser Rückstand dann gefriergetroCKnet wird. In diesem Fall kann die Lösung nach der Extraktion und/oder vor der Dialyse erforderlichenfalls durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer Diaflo-Membrane auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden.

Diese beiden Interferon induzierenden Substanzen haben eine geringe Giftigkeit und können leicht hergestellt werden. Der billige und reichlich vorhandene Vorrat der Pflanzengewebe, aus denen die Interferon induzierende Substanz erhalten wird, kann jedoch infolge der fortgesetzten Verwendung dieser Pflanzengewebe über viele Jahre hinweg als Quelle der traditionellen Sino-japanlschen Droge zu Ende gehen.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine Interferon induzierende Substanz mit ausgezeichneten Eigenschaften zu schaffen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu verwirklichen.

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Die Erfindung basiert auf der Peststellung, daß eine Substanz, welche aus'dem Gewebe verschiedener Pflanzen isoliert wurde, welche zum Genus Perilla der Familie Labiatae (in Japan bekannt als Genus Shiso der Familie Shiso) und ihren Varianten gehören, bei geringer Giftigkeit ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität zeigt. Außerdem kann die aktive Substanz aus Pflanzengewebe leicht und preiswert isoliert werden.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung ist eine Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, welche in der Form von amorphem weißlichem Pulver stabil ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie in praktisch reiner Form nachstehende physikalisch-chemische Merkmale aufweist:

1) Elementaranalyse:

H: 8,5-8,7Si, C: 48.8-49$, N: 6,>6,5#, P: 1,0-1,1Ji

2) Molekulargewicht:

Ca. 100 000 bis ca. J> 000 000 (hauptsächlich ca. 500 000 bis ca. 1 000 000)

bestimmt durch Ultrazentrifugieren mit einer Spinoo Model E Analytical Ultrazentrifuge (Handelsprodukt der Beokraan Instrument Inc., U.S.A.), Ultrafiltrieren mit einem Amioon Ultrafilter (Handelsprodukt der Amioon Corp., U.SiA.) mit Amicon XM 50,- XM lOOA- und XM 300-Membranen (HändeIsprodukt der Amicon Corp., U.S.A.) und UK 50- und UK 100-Membranen (Handelsprodukt der Toyo Roshi K.K., Tokyo) und Oel-flltrieren mit Sephadex G-200 (Handelsprodukt der Pharmaoia Fine Chemioal AB, Schweden).

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3) Schmelz- oder Zersetzungspunkt:
Schmelzpunkt unbestimmt. Verkohlt bei etwa 220 C.

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Siehe in Fig.l (bestimmt in 0,1N NaOH-Lösung), welches unverändert ist, wenn in Wasser oder IN NaOH-Lösung bestimmt.

5) Infrarot-Absorptionsspektrum:
Siehe in Fig.2 (durch KBr-Methode).

6) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

Löslich in Wasser, leicht löslich in wässrigen Lösungen von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid, im wesentlichen unlöslich in Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Azeton, Chloroform und Diäthyläther.

7) Farbreaktion:

Positiv in Ninhydrinreaktion, Phenol/Schwefelsäure-Reaktion und Dittmer-Reaktion. Negativ in Folin's Reagens und Elson-Morgan-Reaktion.

8) Natur:
Sauer.

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Andrejewslei, Honke & Partner, Patentanwälte in EsserT " * ' * *

9) Chemische Hauptbestandteile: a) Aminosäuren:

Hydroxyprolin (3,2+0,3$) Threonin (6,1+0,3$) Glutaminsäure (7,6+0,3$) Glycin (10,0+0,3$) Valin (6,6+0,3$) Leuzin (8,6+0,3$) Lysiti (3,9±0,3$)

Asparaginsäure (9,3+0,3$) Serin (4,3+0,3$) Prolin (4,0+0,3Ji) Alanin (10,3+0,3$) Isoleuzin (5*4+0,3$) Phenylalanin (2,0+0,3$) Arginin (3,4+0,3$)

Tyrosin (Spuren) Histidin (1,3+0,3$) Ammoniak (13,4+0,3$)

b) Zucker:

Arabinose (47,09+0,3$) Glukose (20,62+0,3$) Xylose (l,99±0,3$).

Galaktose (25,66+0,3$) Mannose (4,64+0,3$)

Die vorhandenen Aminosäuren wurden durch Hydrolyse mit 6N HCl bei 110⁰C in einer Zeitspanne von 48 h in vacuo und durch nachfolgende Analyse mit Technicon Amino Acid Autoanalyzer Type NC-I (Handels- ■ produkt der Technicon Corporation, U.S.A.) bestimmt. Die vor- j handenen Zucker wurden durch Hydrolyse mit O,1N Schwefelsäure bei 8o°C während einer Zeitspanne von 20 min bezw. mit IN Schwefelsäure bei 100⁰C in einer Zeitspanne von 2h und anschließende Analyse mit Technicon Sugar Autoanalyzer Type N-I (Handelsprodukt der Technicon Corporation, U.S.A.) bestimmt.

10) Optisches Drehvermögen:

⁵⁼ "⁷⁵° ^bis "⁸²° (~⁷⁹° ^im Durchschnitt) (c=0,47$ in O,1N NaOH).

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Biologische Merkmale:

1. Interferon induzierende Aktivität:

Proben der Interferon induzierenden Substanz der Erfindung wurden verwendet, um Interferon in den Zellen und dem Serum von Testtieren zu induzieren. Die Aktivität des entstandenen Interferon wurde durch die im Versuch 1_ beschriebene Methode bestimmt. Die Resultate dieser Bestimmung gibt Tabelle 1 wieder, welche zeigt, daß die Interferon induzierende Aktivität positiv ist.*

	Tabelle 1	1,0	0,1	0,01
Konzentration der Probe (/Ug/ml)	10	>100	94	<Ί0
Aktivität (in vitro)	> 100
	Tabelle 2

Aktivität Blutentnahme in (h) nach Verabreichung

(in vivo)

C) 1 2 4 6

Kaninchen 1 /10 90 240 JO 13 Kaninchen 2 «10 25 64 14 10

Tabelle 2 zeigt die nach der Methode, welche nachstehend im Versuch 1 beschrieben werden soll, bei zwei Kaninchen erhaltenen Resultate, aus denen sich ergibt, daß die Aktivität ihren Maximalwert zwei Stunden nach Verabreichung erreicht. Durch die im

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Andreiewild, Honke & Partner, Patentanwalt· in EneK '

Versuch 1 beschriebene Methode wurde auch bestätigt, daß Interferon im Körper des Testtieres durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz induziert wurde.

2. Stabilität der Interferon induzierenden Aktivität:

Proben von jeweils 1 mg der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz wurden in Wasser (jeweils 1 ml) gelöst und bei 10O⁰C für eine gegebene Zeitspanne oder bei einer gegebenen Temperatur für 1 h erhitzt. Jede Probe wurde dann in gleicher Weise wie im Versuch 1 beschrieben (in vitro-Methode) behandelt und man erzielt die in den Tabellen 3 und 4 wiedergegebenen Resultate, welche zeigen, daß die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz gegenüber Hitzeeinwirkung sehr stabil ist.

Tabelle 3

Heiztemperatur (⁰C)

Aktivität bei einer
Konzentration der Probe (/Ug/ml) von

10

1,0

0,1

Unbehandelt

37

80

100

	100	IP-Aktivität	88
>	100	>100	88
>	100	> 100	80
>	100	>100	88
>	100	>100	85
>	>100

<Ί0

< 10

Erwärmungszeit: 1 h.

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Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen

ήζ-

	Tabelle 4	1,0	0,1	von
Erwärmungszeit (h)		> 100	96	0,01
		' 100	92	<10
Unbehandelt	Aktivität bei einer Konzentration der Probe (/Ug/ml)	' 100	98	< 10
1	10	> 100	95	ClO
4	> 100 :	► 100	70	< ίο
8	> loo ;		< 10
24	> 100 >
> 100 >
> 100 >

Heiztemperatur: 100 C.

3· Akute Giftigkeit:

Männliche und weibliche Mäuse (ddy-Stamm; 5 Wochen alt; Gewicht 20+1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. Eine physiologische Lösung von Natriumchlorid, welche die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz enthielt, wurde den Mäusen verabreicht (ip. oder oral), um die LD,-₀-Werte von 560 mg/kg (ip.) und über 5 g/kg (oral) zu ermitteln. Es ergab sich kein bemerkenswerter Unterschied zwischen den männlichen und weiblichen Mäusen.

4. Anti-Tumor Aktivität:

Mäuse (ddy-Stamm; 5 Wochen alt; Gewicht 20+1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. In der Achselhöhle eines jeden Testtieres wurde eine Probe von S-I80

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Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen '°40

Sarcoma solid Tumor (2 χ 2 χ 2 mm) oder Ehrlich ascites tumor (2,5 χ 10 Zellen) geimpft. Nach 24 Stunden wurde die Interferon induzierende Substanz der Erfindung (0,2 mg) in Wasser gelöst jeder Maus verabreicht. Die Verabreichung erfolgte einmal täglich und wurde 14 Tage lang durchgeführt. Ein bemerkenswerter AntiTumor-Effekt wurde beobachtet.

Aus den vorgenannten Merkmalen wurde festgestellt, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz um eine Substanz handelt, welche als Hauptbestandteile Aminosäuren, Zucker und Phosphorsäure enthält und ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa 3 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt, wobei angenommen wird, daß es sich um einen Komplex aus Protein und Zucker handelt, welcher Phosphorsäure enthält. Diese Substanz entspricht auch der weitgehend anerkannten Definition irgendeiner Interferon induzierenden Substanz, da sie Interferon in tierischen Zellen oder Serum in vivo oder in vitro induziert, welche mit 0,08# Trypsin bei 37⁰C für 2 h inaktiviert wird, wobei außerdem die Aktivität der induzierten Substanz in Bezug auf tierische Spezies spezifisch ist, jedoch in Bezug auf Virus-Spezies unspezifisch ist. Daraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Substanz nicht nur eine neuartige Interferon induzierende Substanz ist, sondern daß es sioh auch um eine neue Substanz an sich handelt, da keine Substanz mit den gleichen physikalisch-chemischen und biologischen Merkmalen wie die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz bisher in der einschlägigen Literatur beschrieben wurde.

Bei den in der einschlägigen Literatur beschriebenen mitogenen Mitteln mit Interferon induzierender Aktivität (z.B. Phytohäma-

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Andrejewski, Honice & Partner, Patentanwälte in Essen

glutinin, Pokeweed-mitogen und Concanavalin A)handelt es sich beispielsweise um Proteintypen mit Molekulargewichten von über 100 000, welche eine sehr schwache Interferon induzierende Aktivität besitzen, welche bei Erwärmung auf 56⁰C für 5 h inaktiviert wird. Demgegenüber besitzt die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz andersartige chemische Bestandteile, eine hohe Wärmestabilität selbst bei 100°C für mehrere Stunden und ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität. Die aus der Tokiwurzel (Angellica acutiloba Kitagawa) isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz hat auch ein hohes Molekulargewicht (mehr als 100 000) und ihre Interferon induzierende Aktivität wird nicht inaktiviert, wenn sie auf 10O⁰C für 1 h erhitzt wird. Ihre chemischen Bestandteile (Hexose:4ö#, Uronsäure:40#, Protein: 5#) und das Infrarot-Absorptionsspektrum unterscheiden sich jedoch von den entsprechenden Werten der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz. Die aus der Maulbeerbaum-Wurzelrinde isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz enthält als Hauptbestandteile eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose:96#) und hat ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 (hauptsächlich mehr als 60 000). Außerdem findet sich die mitogene Aktivität, welche in den bekannten Interferon induzierenden Substanzen gefunden wird, welche von bakteriellem Endotoxin und höheren Pflanzen einschließlich der Toki-Pflanze und Maulbeerbäumen herstammt, nicht in der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz.

Verschiedene Pflanzen, welche zum Genus Perilla gehören und als Ausgangsstoff für das Produkt der Erfindung verwendet werden können, enthalten beispielsweise Perillaaldehyd, ef -Pinen, 1-Limonen, Perillaketon, Naginataketon, Shisonin, p-Kumarsäureester,

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Andnjewiki, Honke * Partner, Patentanwälte in EmR

Dihydroperillaalkohol, 1-Menthol und dgl., wobei es sich in der Gesamtheit um niedermolekulare Substanzen mit andersartigen physikalisch-chemischen Merkmalen und ohne Interferon induzierende Aktivität handelt.

Die physikalisch-chemischen Merkmale der bekannten Interferon induzierenden Substanzen, welche nicht aus Pflanzen isoliert werden (offenbart in den US-Patentschriften J 773 924 und 3 884645 sowie der japanischen Offenlegungsschrift Kokai Koho I21919/78), entsprechen nicht den Merkmalen der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz.

Die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz ist von potentiellem Interesse als Medikament zur Verhinderung und zur Behandlung verschiedener Krankheiten, welche durch Viren verursacht werden, wie beispielsweise tierische tumorartige Viren, da ihre Interferon induzierende Aktivität im Vergleich mit bekannten, aus Pflanzen isolierten Interferon induzierenden Substanzen ausgezeichnet ist und da sie gegen tierische Tumor-Viren aktiv ist. Außerdem ist ihre Giftigkeit sehr gering, wenn sie oral an Menschen und Tiere verabreicht wird.

In verfahrensmäßiger Hinsicht schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit Interferon induzierender Aktivität vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß diese aktive Substanz aus einer Pflanze des Genus Perilla der Familie Labiatae (in Japan bekannt als Genus Shiso der Familie Shiso) oder einer Variante derselben, welche diese aktive Substanz enthält, extrahiert wird und die aktive Substanz aus dem dadurch erhaltenen Extrakt gewonnen wird.

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Als Pflanzen für die Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz eignen sich Einjahrespflanze^ welche in verschiedenen Ländern der Welt unabhängig und im Überfluß wachsen und welche verschiedene Varianten wie Mutanten und Hybriden auf natürliche oder künstliche V/eise bilden können. Es wurde festgestellt, daß viele Pflanzen, welche zum Genus Perilla der Familie Labiatae gehören und in zahlreichen Ländern wachsen, sowie deren Varianten vorzugsweise für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können. Die zum Genus Perilla gehörenden nachstehend angegebenen Pflanzen sind lediglich als Beispiele anzusehen, wobei die mit einem χ versehenen Bezeichnungen der japanischen Nomenklatur entstammen:

Shisox (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. purpurea Makino); Aojisox (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridis Makino); Katamen-jisox (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. discolor Makino); Chrimen-jisox (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. crispa Makino); Chrimen-aojisox (P. frutescens Brit. var. crispa Dec. f. viridiscrispa Makino); Toranoojisox (P. frutescens Brit. var. hirtella Makino et Nemoto);Egomax (P. frutescens Britton); Lemon-egomax (P. citrodora Nakai und deren Varianten.

Die vorgenannten botanischen Namen sind folgenden druokschriftlichen Veröffentlicheungen entommen: "Genshoku Shokubutsu Dai Zukan", Vol. I, von Murakoshi und Makino, veröffentlicht von Hokuryukan, Tokyo (1955), "Yakuyo Shokubutsu Dai Jiten", herausgegeben von Kariyone und Kimura, veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (1974) sowie "Saishin Wakan Yakuyo Shokubutsu", von Kariyone und Kimura, veräffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (1978).

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Bekanntlich besitzen die vorstehend genannten Pflanzen im allgemeinen eine geringe Giftigkeit, und beispielsweise Shiso, Aojiso, Chirimen-jiso, Lemon-egoma und dgl. werden in Japan, China und anderen Ländern gezogen, da ihre Blätter und Samen lange Jahre hindurch beispielsweise als Nahrungsmittel, Sinojapanische traditionelle Droge und als Rohstoff für die Herstellung von Parfüm und dgl. verwendet wurden. Außerdem können alle Gewebe der zum Genus Perilla und ihren Varianten gehörenden Pflanzen, welche die aktive Substanz der Erfindung enthalten, als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Infolgedessen steht ohne besondere Schwierigkeiten eine große Menge an Ausgangsmaterial zur Verfügung.

Vorzugsweise werden als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren die Blätter und Stengel der Pflanzen verwendet, da die Saat die Substanz mit geringerer Aktivität enthält und außerdem zusätzliche Behandlungsvorgänge erforderlich sein können, um von der Pflanzenwurzel Erde oder dgl. zu entfernen. Die Blätter enthalten im wesentlichen die gleiche Menge an aktiver Substanz wie die Stengel, und die Mengen an aktiven Fraktionen, welche in verschiedenen Pflanzengeweben enthalten sind, sind im wesentlichen vor und nach der Blütezeit unverändert. Zwecks besserer Konservierung und Extrahierung wird vorzugsweise getrocknetes Material verwendet, wenn es auch möglich ist, frisches Material zu verwenden. Zum Trocknen kann Jedes gewünschte Verfahren wie beispielsweise Naturtrocknung, Trocknung mit Heißluft usw. angewendet werden. Erforderlichenfalls kann das Material vor der Verwendung mit Wasser gewtethen werden.

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Die Extraktion kann bei irgendeiner passenden Temperatur, beispielsweise zwischen Raumtemperatur bis zum Siedepunkt der Extraktionsmischung, mit Wasser erfolgen. Da die aktive Substanz der Erfindung besonders in Wasser unter alkalischen Bedingungen (z.B. pH 7-10) löslich ist, wird vorzugsweise der pH-Wert des Wassers vor der Verwendung beispielsweise mit einer geeigneten Pufferlösung wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Extraktion kann während einer beliebigen Zeitspanne, gewöhnlich 1-5 Tage bei Raumtemperatur, erfolgen, wobei diese Zeitspanne abgekürzt werden kann, wenn die Temperatur der Extraktion erhöht wird. So kann beispielsweise die Extraktion während einer Zeitspanne von 30 min bis 6 h bei 45-8o°C unter Umrühren erfolgen. Erfindungsgemäß kann man den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanz extrahieren (in einigen Fällen mehr als 9Q%). Allerdings sollte die Anwendung von übermäßig hohen Temperaturen vermieden werden, da hierdurch die Menge an unerwünschten Verunreinigungen wie Pigmenten, niedermolekularen Substanzen usw., die im Extrakt auftreten, erhöht werden kann. Man kann erforderlichenfalls dem extrahierenden Wasser auch einen geeigneten antiseptischen Wirkstoff zusetzen. Die Extraktion kann kontinuierlich oder intermittierend erfolgen, und es kann jedes zweckmäßig erscheinende Verhältnis zwischen dem extrahierenden Wasser und dem Rohmaterial angewendet werden.

Alternativ ist es auch möglich, die erfindungsgemäße aktive Substanz aus dem Pflanzengewebe mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Azeton und dgl. in irgendeiner zweckmäßigen Menge beispielsweise von 20 bis 8o# zu extrahieren. In diesem Fall kann

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die ExtraktIonszeit und die Temperatur beispielsweise 4 h bis 2 Tage bei 40 bis 8o°C betragen. Vorzugsweise erfolgt jedoch die Extraktion mit Wasser, da dies einfacher, sicherer und preiswerter durchgeführt werden kann.

Die Extraktion kann, falls gewünscht, durch Verwendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels trotz der Unlöslichkeit des reinen Produktes der Erfindung in derartigen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Die Extraktion unter Verwendung hydrophiler organischer Lösungsmittel kann beispielsweise dann durchgeführt werden, wenn die extrahierte Lösung eine Mischung oder einen Komplex von Substanzen wie beispielsweise Fettsäuren, Steroiden, Proteinen, Mono- oder Polysacchariden und dgl. enthält. Wenn auoh nicht beabsichtigt ist, sich auf theoretische Betrachtungen festzulegen, so darf doch angenommen werden, daß die Extraktion mit derartigen organischen Lösungsmitteln durch die Pufferwirkung ermöglicht wird.

Aus der extrahierten Lösung wird in üblicher Weise der Pflanzenrest entfernt, beispielsweise durch Filterung, Pressen, Zentrifugieren und dgl. Anschließend werden unerwünschte Verunreinigungen wie Pigment und niedermolekular-gewichtige Substanzen von der entstehenden überstehenden Flüssigkeit (supernatant) entfernt, um die Gewinnung der aktiven Fraktion zu ermöglichen. Für diesen Zweck geeignete bevorzugte Verfahren werden nachstehend angegeben.

A) Die überstehende Flüssigkeit wird durch Ultrafilterung fraktioniert, beispielsweise mittels einer geeigneten Membrane, um Substanzen zurückzuhalten, welche ein Molekulargewicht von mehr ■

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als 100 000 besitzen, da die erfindungsgemäße aktive Substanz, welche in den Fraktionen vorhanden ist, ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa 3 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt. Die Ultrafilterung kann unter geeignetem Druck von beispielsweise 0,1 bis 5 kg/cm mittels einer Membrane durchgeführt werden, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 oder 200 000 zurückhalten kann. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen und zusammengefaßt und dann gefriergetrocknet, wobei man braune Pulver enthält.

B) Die überstehende Flüssigkeit wird konzentriert, wenn gewünscht unter vermindertem Druck, und wird mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, n-butanol, Azeton und dgl. bei einer zweckmäßig erscheinenden Konzentration von beispielsweise ^0-70 w/v % behandelt, wobei Präzipitate entstehen, welche die aktive Substanz enthalten. Diese Präzipitate werden dann gefriergetrocknet und man erhält ein braunes Pulver.

C) Anstelle des organischen Lösungsmittels kann man der Überstehenden Flüssigkeit auch ein Ammoniumsalz wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Cetylmethylammoniumbromid und dgl. oder ein anorganisches Metallsalz wie beispielsweise Zinkchlorid, Kupferchlorid und dgl. bei einer zweckmäßigen Konzentration von beispielsweise 20 bis 50 w/v % zusetzen, wobei Präzipitate entstehen, welche dann entsalzt und gefriergetrocknet werden. Man erhält wiederum ein braunes Pulver.

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Es ist möglich, den Hauptteil der im Ausgangsmterial enthaltenen aktiven Substanz zu gewinnen, und zwar in einigen Fällen über 90$. Dabei ist die Menge an Verunreinigungen, welche im Rohpulver enthalten sind, bei Durchführung der Methode (A) am geringsten, welche auch einfach durchgeführt werden kann. Außerdem hat sich bestätigt, daß jegliche bemerkenswerte Nebenwirkung vermieden werden kann, selbst wenn eine große Menge des nach der Methode (A) erhaltenen Rohpulvers oral an Menschen und Tiere verabreicht wird, sodaß dieses Rohpulver für orale Verabreichung ohne weitere Reinigung verwendet werden kann. Es ist darauf hinzuweisen, daß, wenn bestimmte Pflanzen des Genus Perilla als Sino-japanische traditionelle Droge verwendet werden, die Pflanze gewöhnlich in siedendem Wasser extrahiert wird und die extrahierte Lösung direkt als solche an Menschen oral verabreicht wird.

Falls gewünscht, kann das auf diese Weise erhaltene Rohpulver noach weiter gereinigt werden, und zwar beispielsweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines geeigneten Wirkstoffes für die Gel-Filterung oder eines Ionentauschers. Im erstegenannten Fall kann die Elution mit Wasser durchgeführt werden, wenn es auch möglich ist, eine geeignete Pufferlösung zu verwenden. Im letztgenannten Fall kann die Elution mit einer geeigneten Pufferlösung durchgeführt werden. Bevorzugte Wirkstoffe für die Gel-Filterung sind beispielsweise Sephadex G-50 bis G-200, Sepahrose 2B bis 6b, Sephacryl S-200 oder S-300 (Handelsprodukte der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden), Bio-Gel P-^O bis P-300, Bio-Gel A (Handelsprodukte der Bio-Rad Laboratories Ltd., U.S.A.), Sagavac (HändeIsprodukt der Seravac Laboratories Ltd., U.K.) und dgl. . Bevorzugte Wirkstoffe für die Ionentausoher-Behandlung sind beispielsweise QAE-Sephadex A-25 und A-50

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(Cl~-Form), CM-Sephadex C-25 und C-50 (Na⁺-Form), SP-Sephadex C-25 und C-50 (Na⁺-Form), DEAE-Sephacel (Cl^-Form), DEAE-Sepharose C1-6B (Cl^--FOm-I)₁ CM-Sepharose CL-6B (Na⁺-Form) (Handelsprodukte der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und dgl.. Für die Reinigung kann man auch eine geeignete Anionen- oder Kationenaustauschzellulose verwenden. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann bestimmte Verunreinigungen enthalten, obwohl seine Interferon induzierende Aktivität für praktische ZwecKe ausreicht. Falls gewünscht, lassen sich die Mengen an Verunreinigungen durch Kombination der vorgenannten Behandlungen weiter herabsetzen.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Komposition ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Substanz der vorbeschriebenen Art zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten enthält. Die Zusammensetzung oder Mischung kann in geeigneter Form für orale, rektale oder parenterale Verabreichung dargeboten werden. So kann beispielsweise die Zusammensetzung oder Mischung für orale Verabreichung fest oder flüssig sein und die Form von Körnern, Tabletten, überzogenen Tabletten, Kapseln, Syrup, Emulsionen, Suspensionen oder Tropfen haben und Träger oder Exzipienten aufweisen, wie sie allgemein in der pharmazeutischen Technik verwendet werden. So können beispielsweise geeignete Tablettier-Exzipienten aus Laktose, Kartoffel- und löslichen Stärken und Magnesiumstearat bestehen.

Für die parenterale Verabreichung kann der Träger aus einer sterilen parenteral verträglichen Flüssigkeit wie beispielsweise

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sterilem Wasser oder einem parenteral verträglichen öl wie beispielsweise Arachis-Öl in Ampullen bestehen. Für die Rektal-Verabreichung eignen sich Zäpfchen, wobei der Träger aus einem dafür geeigneten Grundstoff besteht.

Zweckmäßigerweise wird die Zusammensetzung oder Mischung in Einsatzmengen formuliert, von denen jede eine feststehende Dosis des aktiven Bestandteils liefern kann. Tabletten, beschichtete Tabletten, Kapseln, Suppositorlen und Ampullen sind Beispiele geeigneter Formen von Einsatzmengen.

Schließlich sohafft die Erfindung noch eine Interferon induzierende Substanz der vorstehend beschriebenen Art in ihrer Verwendung als Medikament.

Die beiliegenden Figuren 1 und 2 zeigen das Ultraviolett-Absorptionsspektrum bezw. das Infrarot-Absorptionsspektrum der aktiven Substanz der Erfindung.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Ausführungsbeispiele des weiteren beschrieben, wobei diese Beispiele keinerlei Einschränkung der Erfindung bedeuten.

Beispiel 1

Zunächst wurden getrocknete Blätter von Perllla frutescens Britton var. crispa Dec. f. purpurea Makino (in Japan bekannt als Shiso) in einer Menge von 1 kg mit Wasser gewaschen und in 20 1 Wasser bei Raumtemperatur J5 Tage lang stehengelassen, um die Extraktion

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durchzuführen. Anschließend wurde das Ganze mit 6000 U/rain 20 min lang zentrifugiert, um den Rückstand zu entfernen, welcher zweimal mit Wasser gewaschen wurde, wobei jeweils 5 1 Wasser verwendet wurden.

Die Waschflüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit zusammengeschüttet. Der gesamte Feststoffgehalt der kombinierten Lösung betrug 92,892 g (Trockenbasis). Die kombinierte Lösung wurde durch Ultrafilterung mittels eines Ultrafilters (Model UD-6, Handelsprodukt der Bio Engineering K.K., Tokyo) mit einer UK 200-Membrane (Handelsprodukt derToyoroshi,Tokio,Japan) fraktioniert, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 200 000 bei

einem Druck von 3 kg/cm festzuhalten, wobei sich ein Rückstand ergab, welcher dann nach Gefriertrocknung ein braunes Pulver, und zwar 8,813 g, ergab. Zu Vergleichszwecken wurde die gleiche Behandlung mit einer Membrane durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 zurückzuhalten, wobei sich 9*210 g an braunem Pulver ergaben. In der zweiten Stufe, der Reinigung, wurden 1,5 g des ersten Rohpulvers in 5 ml Wasser gelöst und in eine Säule (4,5 χ 70 cm) übergeleitet, welche mit Sephadex G-200 (einem Wirkstoff für die Gel-Filterung) angefüllt war. Die Elution wurde mit 600 ml Wasser durchgeführt und die ausfließende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 27-50 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei ein weißliches Pulver (117 mg) entstand. In der dritten Stufe (weitere Reinigung) wurde dieses Pulver (100 mg) in einer 0,1M tris-HCT-Pufferlösung (5 ml; pH 7,0; 1=0,01) gelöst und in eine Säule (2,5 x 70 cm) gefüllt, welche mit DEAE-Sephadex A-50 (Ionentauscher) angefüllt war. Eine 0,1M tris-HCl-Pufferlösung (300 ml;

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pH 9,0;, welche 0,5M NaCl enthielt) wurde für die Elution verwendet und die ausfließende Flüssigkeit in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 15 bis 25 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei man ein weißliches amorphes Pulver (58,9 mg) erhielt, welches geringere Mengen an Verunreinigungen enthielt und im wesentlichen die gleiche Interferon induzierende Aktivität besaß wie das zuerst erhaltene weißliche Pulver. Das Endprodukt hatte die vorbeschriebenen physikalisch-chemischen Merkmale und sein hoher Reinheitsgrad wurde durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese bestätigt.

Zu Vergleichszwecken wurden die Interferon induzierenden Aktivitäten der in den einzelnen Stufen dieses Beispiels erhaltenen Substanz in gleicher Weise bestimmt, wie im nachstehend erläuterten Versuch 1 (in vitro-Methode), wobei sich nachstehende Resultate ergaben.

Tabelle 5

Stufe	Probe (nach)	Aktivität bei einer Konzen tration der Probe von (yug/ml)	1,0	0,1
		10	25	10
1	Extraktion	90	85	10
1	Ultrafilterung (Rohpulver)	100	100	Sh
2	Gel-Filterung (1. weißl. Pulver)	100	100	100
	Ionentauscher-Behandlung (Endprodukt)	100

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Andreiewsld, Honice & Partner, Patentanwälte in Essen Beispiel 2

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 vorgegangen, wobei jedoch Perilla frutescens Britton (In Japan bekannt als Egoma) dadurch extrahiert wurde, daß man die Blätter bei Raumtemperatur 2 h lang in Wasser stehen ließ, dem Wasser IN Natriumhydroxid zusetzte, um den pH-Wert auf 8,5 einzustellen, und dann bei 65°C weitere 2 h lang nochmals extrahierte. Die physikalisch-chemischen Merkmale des Endproduktes (5^*5 mg) waren im wesentlichen die gleichen wie bei dem Endprodukt, welches im Beispiel 1 erhalten wurde.

Beispiele 3 - b

Die Blätter, Stengel und Saatkörner getrockneter Perilla frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridis Makino, P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. discolor Makino, P. frutescens Britton var. crospa Dec. f. crispa Makino, P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridis-crispa Makino, P. frutescens Britton var. hirtella Makino und Nemoto und P. citriodora Nakai wurden unabhängig voneinander wie im Beispiel 1 behandelt. Die in der zweiten Stufe der Beispiele 1-8 erhaltenen ProduKte wurden unabhängig voneinander in gleicher Weise wie nachstehend im Versuch 1 (in vitro-Methode) behandelt, um ihre Interferon induzierenden Aktivitäten zu bestimmen. Die Resultate zeigt nachstehende Tabelle 6. Die physikalisch-chemischen Merkmale der Endprodukte der Beispiele 3 - Ö waren im wesentlichen die gleichen wie die des Endproduktes aus dem Beispiel 1.

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» * » ι.I.j tin ,,I.. ·. ITl.. 1.1». If 111« llll I Uli infill« M* ΓΐΙΙΙΙ

AIlCH¹HfHWSIQf ΠΟηΚβ m ViMtUWT, I UIVIIIUI IWrUli· HI DHn Tabelle 6

Pflanze

Gewebe Aktivität bei einer Konzentration der Probe von (/Ug/ml)

1,0 10

Shisox (Perilla frutescens A 70 Britton var. crispa Dec. f. B ^100 purpurea Makino) C

>100
>100

90 92

2. Egomax (P. frutescens Brit.) A 40

B >100 C >1OO >100
MOO

Aojisox(P. frutescens Brit. A 6o var. crispa Dec.f.viridis B >1OO Makino C MOO

>1OO
>100

95 90

4. Katarnen-jiso*(P.frutescens A 65 Brit. var. crispa Dec. f. B >100 discolor Makino) C »100

>100

0 4

5· Chirimen-Jlsox(P.frutescens A 50 Brit.var.crispa Dec. f. B >100 c - spa Makino C MOO

MOO
>100

0 O

6. Chirimen-aojisofp.frutescensA 70 Brit.var.orispa Dec. f. B MOO viridis-crispa Makino) C >100 >1OO

00 00 H-OUiO

7. Toranoo-jiso (P.frutescens A 50 Brit.var.hirtella Makino B >100 et Nemoto) C MOO

^100
MOO

70 70

8. Lemon-egoma*(P.citriodora
Nagai)

A
B
C

50

>100 MOO >100
^100

70 65

Legende: Nr. = Beispiel,

A - Saat,

B = Stengel,

C = Blätter,

χ = Japanische Nomenklatur

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Versuch 1

Bestimmung der IF-Induktion mit IF-induzierter Substanz und IF-Bestimmung: (Bezugsquelle: Y. Kojima's Bericht in Kitasato Arch. Med., 43:35 (1970)).

a) IF-Induktion (in vitro):

Ein Kaninchen (Gewicht etwa 1 kg; Neu Seeland Weiß; SPF) wurde durch Herzpunktur getötet und Milz, Knochenmark und Lymphknotenzellen entnommen und zu einer Zellsuspension kombiniert, welche die vermischten Zellen (10' Zellen) enthielt. Die Masse wurde dann in Proben von jeweils 1 ml aufgeteilt. Vier Proben wurden unabhängig voneinander mit 10, 1,0, 0,1 und 0,01 yug/ml eines Produktes versetzt, welches in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war. Die Proben wurden dann 24 h lang bei 25°C gezüchtet und anschließend zentrifugiert. Die entstehenden überstehenden Flüssigkeiten wurden jeweils als Probe verwendet, um die induzierte Interferon-Aktivität zu bestimmen.

b) IF-Induktion (in vivo):

Eine wässerige Lösung (2 ml) eines in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschriebenen Produktes (500 mg/ml) wurde in die Ohrvene eines Kaninchens (Gewicht etwa 1 kg; Neu Seeland Weiß; SPF) injiziert. 1, 2, 4 und 6 h nach der Injektion wurde eine Blutprobe von jeweils 2 ml dem Testtier entnommen und das Serum einer jeden Probe wurde vom Blut isoliert und als Probe zur Bestimmung der Aktivität des induzierten Interferon verwendet.

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c) Bestimmung der IF-Aktivität:

In beiden Methoden (a) und (b) wurde Vesicular-stomatitis-Virus als bedrohlicher Virus eingesetzt, um die Aktivität des induzierten Interferon auf nachstehende Weise zu bestimmen. Eine Είπε chi cht -KuI tür der belegten Zellen (linde cells) RK-I j5 von Kaninchen wurde in eine Flachschale gefüllt und derselben eine vorgegebene Menge der Probe der durch die vorgenannten Methoden (a) oder (b) erhaltenen Lösung zugesetzt. Die Kultur wurde bei 37°C über Nacht unter Zusatz von Vesicular stomatitis Viren als Krankheitsviren bebrütet. Die Interferon-Aktivität wurde aufgrund des Reduktionsverhältnisses von Platten (plaques) bestimmt. Die Einheit der Interferon-Aktivität wird durch eine reziproke Zahl der höchsten Verdünnung der Probe ausgedrückt, welche zur Reduzierung der Zahl von Platten auf 50$ erforderlich ist.

Versuch 2; Definition von Interferon:

Die Antivirus-Faktoren (a) und (b) lieferten die im allgemeinen dem Interferon zugeschriebenen Eigenschaften wie Sensibilität auf Inaktivierung durch 0,08# Trypsin (nach 2-stündiger Reaktion bei 37°C), Hemmung von Vesicular stomatitis- und Vaccinia Viren in RK-I3 Kaninchen-Zellkulturen und Fehlen von Antivirus-Aktivität in L-Zellen gegenüber Vesicular stomatitis-Viren.

Versuch 3;

Im Beispiel 1 wurde die Elektrophorese bei 4°C in herkömmlicher Weise durchgeführt, wobei eine im Handel erhältliche Einrichtung

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(Model AE-2, Handelsprodukt der Toyo Kagaku Sangyo K.K., Tokyo) eine Polyaorylaniid-Gel-Platte (Dicke 3 mm) und ein 0,3M Borsäure-Puffer (pH 8,4) verwendet wurden. Das entstehende Einzelband zeigte, daß die Testprobe einen hohen Reinheitsgrad hatte.

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Claims

Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen Patentansprüche:

1. Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, welche als amorphes weißliches Pulver stabil ist, dadurch gekennzeichnet, daI3 sie nachstehende physikalischchemischen Merkmale aufweist:

1) Elementaranalyse:

H: 8,5-8,7$, C: 48,8-49$, N: 6,3-6,5?°, P: 1,0-1,IJi

2) Molekulargewicht:

Ca. 100 000 bis ca. 300 000 (hauptsächlich ca. 500 000 bis ca. 1 000 000)

bestimmt durch Ultrazentrifugieren mit einer Spinco Model E Analytical Ultrazentrifuge (Handelsprodukt der Beckman Instrument Inc., U.U.A.), Ultrafiltrieren mit einem Amicon Ultrafilter (Handelsprodukt der Amicon Corp., U.S.A.) mit Amicon XM 50,- XM lOOA- und XM 300 Membranen (Handelsprodukt der Amicon Corp., U.S.A.) und UK 50- und UK 100-Membraneη (Handelsprodukt der Toyo Roshi K.K., Tokyo) und Gel-filtrieren mit Sephadex G-200 (Handelsprodukt der Pharmacia Fine Chemical AB, Schweden).

3) Schmelz- oder Zersetzungspunkt:

Schmelzpunkt unbestimmt. Verkohlt bei etwa 220⁰C.

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

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ORIGINAL INSPECTED

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X-

5) Infrarot-Absorptionsspektrum:
Siehe in Fig.2 (durch KBr-Methode).

6) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

7) Farbreaktion:

8) Natur: Sauer.

9) Chemische Hauptbestandteile: a) Aminosäuren:

Hydroxyprolin (3,2+0,3$) Threonin (6,l+0,3#) Glutaminsäure (7,6+0, Glycin (10,0+0,35*) Valin (6,6+O,3#) Leuzin (8,6+0,3Ji) Lysin (3,9±0,3#)

Asparaginsäure (9,3+0,3Ji) Serin (4,3+0,35*) Prolin (4,0+0, Alanin (10,3+0, Isoleuzin (5,4+0,35*) Phenylalanin (2,0+0,3#) Arginin (3,4+0,3*)

Tyrosin (Spuren) Histidin (l,3+0,3#) Ammoniak (13,4+0,3Ji)

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J-X-

b) Zuciver:

Arabinose (47,09+0, Glukose (20,62+0, Xylose

Galaktose (25,66+0, Mannose (4,64+0,3$)

(1,99+0,3*)

10) Optisches Drehvermögen:

W Jp = -75° bis -82° (-79° in, Durchschnitt) (c = 0,47$ in O,1N NaOH).

2. Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in im wesentlichen reiner Form die Merkmale gemäß Anspruch 1 aufweist.

3· Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß diese aktive Substanz aus einer Pflanze des Genus Perilla und deren diese aktive Substanz enthaltenden Varianten extrahiert wird und aus dem erhaltenen Extrakt die Substanz gewonnen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze ausgewählt wird aus Perilla frutescens Britton var. crispa Dec. F. purpurea Makino; P. frutescens Brit. var. crispa Dec. f. viridis Makino; P. frutescens Brit. var. crispa var. crispa Makino; P. frutescens Brit. var. crispa Dec. f. viridiscrispa Makino; P. frutescens Brit. var. hirtella Makino et Nemoto; P. frutescens Britton; P. citriodora Nakai und deren Varianten.

(1300??/OBU

29Α76ΑΘ

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5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit Wasser durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei einem pH-Wert von 7-10 durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit einem hydrophilen Lösungsmittel durchgeführt wird, welches im wesentlichen unfähig ist, die aktive Substanz zu lösen.

6. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung eine überstehende Flüssigkeit (supernatant) gebildet wird und diese durch Ultrafilterung in Fraktionen fraktioniert wird, welche die aktive Substanz enthalten.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafilterung mittels eines Ultrafilters durchgeführt wird, durch welchen Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 abfilterbar sind.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung eine überstehende Flüssigkeit (supernatant) gebildet wird und dieser ein hydrophiles organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, welches unfähig ist, die aktive Substanz zu lösen, wodurch Fraktionen erzielbar sind, welche die aktive Substanz enthalten.

11. Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3-10 hergestellt ist.

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29A76A8

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12. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine Interferon induzierende Substanz gemäß einem der Ansprüche 1 - 11 in Verbindung mit einem Träger oder Exzipienten enthält.

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