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Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffes von Polypeptidnatur mit unspezifischer Immunisierungswirkung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffes von Polypeptidnatur mit unspezifischer Immunitätswirkung.
Es wurde gefunden, dass ein derartiger Wirkstoff aus Extrakten tierischer Organe isoliert werden kann, welcher die Eigenschaft besitzt, eine unspezifische Immunität hervorzurufen und der im wesentlichen pyrogenfrei und nicht antigenisch ist, welcher z. B. mittels Injektion verabreicht werden kann und keine merkbare Gewebsreaktion zeigt.
Der Ausdruck unspezifische Immunität wird im üblichen Sinne verstanden und soll nicht nur sowohl Widerstandskraft gegen Bakterien- und Vireninfektion einschliessen, sondern auch Immunität gegen Beanspruchung, z. B. Kältebeanspruchung, traumatischen Schock, endotoxische Beanspruchung usw. Es wurde auch gefunden, dass der Wirkstoff antimitotischeEigenschaften gegenüber verschiedenen Zellen wie z. B. Hela und Changzellen besitzt.
In chemischer Hinsicht ist der Wirkstoff ein Polypeptid oder eine Mischung von Polypeptiden, wobei dieser Ausdruck im breiten Sinne verwendet wird, um Substanzen zu definieren, deren Basis auf Polypeptidbauart liegt, ohne Rücksicht darauf, ob andere Gruppen, wie Kohlehydrate, auch vorhanden sind. Bei der Hydrolyse ergibt es eine Anzahl von Aminosäuren und Substanzen, welche Saccharidreaktionen zeigen. Die nachweisbaren Aminosäuren sind Glutamin- und Asparaginsäure, Arginin, Lysin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, Isoleucin, Glycin, Phenylalanin, Histidin, Prolin, Tyrosin und Threoanin. Der Wirkstoff zeigt positive Biuretreaktion, eine positive Anthronreaktion, was die Anwesenheit von Hexosen anzeigt und eine positive Anzeige von Hexosaminen mittels einer modifizierten Elson-Morgan-Reaktion (L.
Svennerholm, Uppsala Lakare-forenings Forhandlungar, 61 [1956], 287 : Reagens p-Dimethylamino- - benzaldehyd in Acetylaceton).
Der Wirkstoff zeigt gewöhnlich saure Reaktion mit dem isoelektrischen Punkt im Bereich PH 4-5 ; die Aminosäuren Glutamin-und Asparaginsäure sind im Molekül in beträchtlicher Menge enthalten und wahrscheinlich die Ursache für diese Azidität. Neutral wirkende Polypeptide können ebenfalls vorhanden sein.
Das Molekulargewicht des wirksamen Faktors ist wenigstens 103, wobei Produkte bevorzugt werden, in denen im wesentlichen kein Material aus dem tierischen Organextrakt verblieben ist, dessen Molekulargewicht geringer als 8 000 ist ; in der Regel werden Produkte bevorzugt, die kein Material mit Molekulargewichten unter 104 enthalten.
Der Wirkstoff ist im wesentlichen frei von Phosphor, was die völlige Abwesenheit von Nukleinsäure-
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B. flüssigeslieh in Äther, Chloroform und Petroläther.
Der Wirkstoff ist wärmestabil bis zu wenigstens 1000C und widersteht dem Erhitzen in Wasser auf 1000C während einer halben Stunde. In Lösung in wässerigem Medium zeigt das Produkt eine grünliche Fluoreszenz, die je nach Verunreinigung von gelbgrün bis blaugrün variiert.
Wie oben angegeben, ist der Wirkstoff pyrogenfrei und zeitigt keine antigenische Wirkung. Bei der Injektion ruft es Immunität gegen Vacciniavirus (Kuhpockenvirus), E. coli und eine beträchtliche Anzahl anderer Bakterien und Viren hervor und ruft auch eine Wiederstandskraft gegen gewöhnliche Grippeviren hervor, z. B. indem man es direkt auf die Nasenschleimhaut sprüht.
Der erfindungsgemäss herzustellende Wirkstoff kann für die Verabreichung mit einem oder mehreren pharmazeutischen Exzipientien zusammengebracht werden. Die Art des Exzipiens oder der Exzipientien wird davon abhängen, welche Art von Zubereitung man herstellen möchte. Die Zubereitung kann bequem in Form von Dosierungseinheiten hergestellt werden, die vorteilhafterweise 5 - 20 mg des wirksamen Polypeptides enthalten. Die Zubereitungen können für parenterale Verabreichung hergestellt werden, in welchem Falle der Exzipient eine parenteral brauchbare Flüssigkeit wie steriles, pyrogenfreies Wasser ist, oder für orale Verabreichung, wo die Exzipientien Wasser einschliessen können, zusammen mit einem oder mehreren Geschmacksmittel, Schutzmittel, Dispergiermittel, Färbemittel, Süssungsmittel u. dgl.
Die Zubereitungen können auch in fester Form hergestellt werden, z. B. Tabletten, welche den wirksamen Faktor enthalten. Bei einer bevorzugten Herstellungsweise wird eine erhaltene Lösung lyophylisiert, wiedergelöst in sterilem pyrogenfreien Wasser und sterilisiert, indem man sie durch geeignete, gesinterte Glasfilter leitet.
Der wirksame Faktor kann auch für topische Verabreichung zubereitet werden, z. B. aus einer wässerigen Lösung als Spray, welche auch ein Schutzmittel, wie Äthanol oder Methyl- oder Äthyl-p-hydroxybenzoat enthält.
Die Spray-Lösung kann z. B. 0, 01 - 10 Gew. -0/0, vorzugsweise 0, 05 - 0, 50/0, an aktivem Material enthalten.
Das erfindungsgemäss herzustellende wirksame Polypeptidmaterial kann vorteilhaft aus wässerigen Extrakten tierischer Organe mittels Fraktionierungsmassnahmen hergestellt werden, wobei man sich vorteilhaft der Entdeckung bedient, dass es sich um hochmolekulares Material handelt.
Gemäss der Erfindung wird somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidmaterials geschaffen, das eine unspezifische Immunität hervorruft, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine wässerige Suspension oder ein wässeriger Extrakt von Säugetierorganen, insbesondere Leber, Nieren und Milz, oder Säugetierblut bzw.
-serum bis zur Koagulation, vorzugsweise auf etwa 1000C erhitzt wird, hierauf die abgetrennte wässerige Losung einer Molekularfraktionierung nach an sich bekannten Methoden, wie einer selektiven Adsorption, insbesondere an Asbest, und Eluierung oder einer Behandlung mit einem Molekularsiebmaterial, insbesondere mit einem mit Äthylenoxyd vernetzten Dextran unterworfen wird und dabei eine proteinfreie, wasserlösliche, im UV-Licht grünfluoreszierende, pyrogenfreie, antigenfreie Polypeptidfraktion mit einem Molekulargewicht von wenigstens 1000, vorzugsweise wenigstens 8000, gewonnen wird.
Der Wirkstoff nach der Erfindung kann aus tierischen Organen gewonnen werden, wovon bevorzugte Beispiele Leber, Niere, Milz und Blut sind.
Der wässerige Organextrakt, der beim vorliegenden Verfahren verwendet wird, kann z. B. bloss ein wässeriger Auszug aus dem Organ sein, z. B. frische Ochsenleber, jedoch ist es vorteilhaft, den Auszug einer weiteren Behandlung zu unterziehen u. zw. grundsätzlich, um unerwünschtes Protein zu entfernen.
Erhitzen des Extraktes ist besonders wünschenswert und z. B. im Falle von Leber wird diese zerkleinert und dann mit Wasser unter Rühren auf 1000C erhitzt, worauf die überstehende Lösung abgetrennt und konzentriert wird, um festes Material, welches den aktiven Faktor enthält, auszufällen. Die so erhaltene Paste kann gewünschtenfalls mit Alkohol extrahiert werden, worauf man das Lösungsmittel z. B. mittels Vakuumdestillation entfernt. Es ist auch möglich, unerwünschtes Material mit Hilfe von Alkohol auszufällen oder die wässerige Lösung mit Phenol zu extrahieren, wobei man das aktive Material durch Fällung, z. B. mittels Äther, rückgewinnt.
Wässerige Extrakte von andern festen Organen können in gleicher Weise hergestellt werden.
Im Falle von Blut kann dieses erhitzt werden, um vorhandenes Protein zu koagulieren, worauf man filtriert. Ein selektives Proteinfällungsmittel, z. B. Sulfosalizylsäure, kann zum Filtrat gefügt werden, um restliches Protein abzutrennen, worauf die Lösung wieder filtriert wird. Die erhaltene Flüssigkeit ist für die Verwendung beim vorliegenden Verfahren geeignet.
Es ist auch möglich, den Organextrakt einer weiteren Vorbehandlung zu unterziehen, indem man
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zur Entfernung eines vorhandenen unerwünschten niedrigmolekulargewichtigen Materials unter Erzielung eines brauchbaren Effektes Molekularsiebe verwendbar sein, die für Moleküle von beträchtlich geringerem Molgewicht, z. B. 103, undurchlässig sind. Jedoch zwecks Erlangung einer möglichst wirksamen Trennung soll das Molekularsiebmaterial vorzugsweise durchlässig sein für Moleküle vom Molgewicht etwa 8 000, während das aktive Material noch ausgeschlossen ist, wobei die vernetzten Dextrane, die oben genannt wurden, besonders wirksam sind.
Eine weitere brauchbare Fraktionierungsmethode nach der Erfindung ist darin gelegen, den wässerigen Extrakt mit einem Molekularsiebmaterial in Berührung zu bringen, welches für Moleküle mit einem Molgewicht grösser als 1000 undurchlässig ist, um diese Moleküle von Substanzen mit niedrigerem Molgewicht abzutrennen.
Vernetzte Dextrane und verwandte Molekularsiebmaterialien, welche ihre Wirkungsweise in kleinteiligerForm durch Absorption niedrigmolekulargewichtigen Materials in ihren Teilchen ausüben, werden vorzugsweise in Kolonnen angewendet, wobei man sich der Chromatographietechnik bedient. In derartigen Kolonnen verbleibt das aktive Polypeptid in der Flüssigkeit, die sich im Raum zwischen den Teilchen bewegt und rasch durch die Kolonne hindurchgeht. Die Kolonne kann mit Wasser gewaschen werden, um das aktive Polypeptid durchzuwaschen und obwohl das niedrigmolekulargewichtige Material bei dieser Methode langsam eluiert wird, kann das aktive Material gewöhnlich entfernt werden bevor das unerwünsche Material beginnt, die Kolonne zu verlassen.
Im allgemeinen kann das aktive Polypeptidmaterial mittels geeigneter biologischer Versuche an Fraktionen, die aus der Kolonne eluiert wurden, bestimmt werden ; die niedrigmolekulargewichtigen Verunreinigungen sind in der Regel mit braunen oder gelben Substanzen verbunden, deren Bewegung visuell verfolgt werden kann.
Die Molekularsiebfraktionierung gemäss der Erfindung kann bei niedriger Temperatur, z. B. +4 C, ausgeführt werden, damit Bakterienwuchs verhindert wird. Bei höheren Temperaturen ist es angebracht, eine antibakterielle Substanz wie Phenol, Kresol od. dgl. zuzusetzen.
Bei der Herstellung der vernetzten Dextran-Kolonne, wird das kleinteilige Material vorzugsweise ein oder mehrere Male mit wässerigem, z. B. 0,05 n Natriumchlorid gerührt und abschliessend mit Wasser zwecks Entfernung der Chloridionen gewaschen.
Der wässerige, organische Extrakt, der in die Kolonne eingebracht wird, enthält einen Elektrolyt, z. B. ein Neutralsalz wie Natriumchlorid ; weil das aktive Material häufig saurer Natur ist, kann der Elektrolyt auch ein Alkali sein, z. B. kaustische Soda. Die Konzentration des Elektrolyt kann von 0,05 n bis 0,5 n reichen, z. B. 0, 1 n NaCl oder 0,01 n Na OH. Der aktive Faktor kann auch mit Vorteil durch die vemetzte Dextran-Kolonne mit einer alkalischen Lösung an Stelle von Wasser gewaschen werden, wobei eine 0, 05 - 0, 5 n Lösung, z. B. 0, 1 n Lösung von kaustischer Soda besonders zufriedenstellend ist. Die erhaltene Lösung kann durch Behandlung mit einem Kationenaustauschharz in der Wasserstoffform, z. B.
Amberlite IR20 (hergestellt von Rohm & Haas ine. in Philadelphia, U. S. A.) neutralisiert werden.
Eine weiter vorteilhafte Fraktionierungsmethode ist die Fällung des gewünschten Polypeptidmaterials mit einem inerten Proteinfällmittel, das ist ein solches, welches Protein oder Polypeptidmaterialien nicht zerstört oder denaturiert, sondern bloss ihre Lösung fällt.
Das Proteinfällmittel kann als Festsubstanz zugefügt werden, wie eine wasserlösliche anorganische Substanz, z. B. ein Salz wie Ammonsulfat, Ammonchlorid u. dgl. oder Phorphorwolframsäure, oder es kann eine Flüssigkeit sein, z. B. eine konzentrierte Lösung von solchen Substanzen.
Das hochmolekulargewichtige Material, enthaltend das aktive Polypeptid, kann aus dem wässerigen Extrakt gefällt und getrennt werden z. B. durch Filtration, Zentrifugierung u. dgl. oder es kann veranlasst werden, sich in einer getrennten organischen Phase zu lösen. Die organische Phase kann eine mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit sein, oder vorzugsweise eine polare Flüssigkeit, die normalerweise mit Wasser nicht mischbar ist, aber eine getrennte Phase bildet, wenn die wässerige Phase grossen Mengen an gelöstem Material enthält, wie es der Fall ist, wo ein anorganisches Salzfällmittel verwendet wird. Solche polaren Losungsmittel haben eine grössere Löslichkeit für den Faktor als die nicht-polaren Lösungsmittel.
Ein bequemer Weg zur Ausführung des vorliegenden Verfahrens liegt darin, das Proteinfällmittel zu einer wässerigen Lösung zuzusetzen, die das aktive Polypeptid und ein wassermischbares Lösungsmittel enthält, wodurch zwei Phasen gebildet werden, wobei man die organische Phase abtrennt und das aktive Polypeptid daraus gewinnt.
In der Regel wird der PH des wässerigen Extraktes die Trennung beeinflussen und die Menge des verwendeten Fällmittels muss in Beziehung mit dem PH gebracht werden. Die Anwesenheit von andern ge-
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lösten Substanzen wie z. B. wassermischbare Flüssigkeiten wie Äthanol, Aceton u. dgl., beeinflussen ebenfalls die Konzentration des Fällmittels für die Erlangung optimaler Resultate.
Bei Verwendung von Ammonsulfat als Fällmittel ist in der Regel die optimale Konzentration zwischen 25 und 60% der Sättigung und der PH liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 8. Wo auch eine wassermischbare organische Flüssigkeit wie z. B. Alkohol verwendet wird, ist die Menge derselben bequemerweise zwischen 30 und 601o der wässerigen Phase, wobei die genauen Anteile an Ammonsulfat und wassermischbarer Flüssigkeit so gewählt werden, dass sich zwei Phasen bilden. Beispielsweise wird bei Verwendung von 46% Äthanol die Konzentration an Ammonsulfat 25 Gel.-% betragen.
Die Menge der zugesetzten organischen Flüssigkeit wird vorzugsweise so bemessen, dass sich in der getrennten Phase ein relativ kleines Volumen ergibt, so dass eine Konzentrierung des aktiven Polypeptidmaterials hervorgerufen wird. Es sei bemerkt, dass bei Zusatz von Äthanol gewöhnlich einiges unerwünschtes Material ausgefällt wird, dass verworfen wird, bevor man mit dem anorganischen Salz die Fraktionierung vornimmt.
Die erfindungsgemässe Fraktionierung wird vorzugsweise bei Raumtemperatur ausgeführt und die oben genannten bevorzugten Konzentrationen des Fällmittels sind nicht immer bei höheren Temperaturen anwendbar. Der aktive Faktor ist jedoch bis zu 900C stabil und höhere Temperaturen könnten angewendet werden, ohne dass eine Inaktivierung erfolgen würde.
Die Fraktionierung nach dieser Methode kann direkt am wässerigen tierischen Organextrakt oder an wässerigenLösungen angewendet werden, die aus andern Reinigungsmassnahmen stammen. Weiters können andere Reinigungsmassnahmen mit dem aus dem vorliegenden Verfahren stammenden Material ausgeführt werden und im allgemeinen kann die Fraktionierung in irgendeiner Stufe der Gesamtreinigung des aktiven Faktors ausgeführt werden.
Es wurde auch gefunden, dass das aktive Polypeptid in besonders vorteilhafter Weise weiter gereinigt werden kann, indem man es an schwach basischem Cellulose-Ionenaustauschmaterial adsorbiert und dann hievon eluiert, wobei man einen wässerigen Elektrolyt, z. B. eine neutrale oder saure oder schwach basische Lösung verwendet.
Diese Methode ist brauchbar zu verwenden in Kombination mit einer der oben beschriebenen erfindungsgemässen Massnahme entweder vor oder nach der Fraktionierung.
Das bei diesem Verfahren verwendete Cellulose-Ionenaustauschharz kann z. B. von jenen Arten sein,
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stehen aus chemischen modifizierter Cellulose, die schwach basische Gruppen wie Amino-, Dialkylamino-, Dialkylaminoalkyl-Gruppen u. dgl. enthält. Das Ionenaustauschmaterial "Ecteola" (hergestellt von A. B. Pharmacia in Uppsala, Schweden) ist besonders geeignet. Ecteola ist das Reaktionsprodukt von Epichlorhydrin, Triäthanolamin und Natriumcellulose. DEAE-Cellulose oder DEAE Sephadex kann ebenfalls verwendet werden.
Das Celluloseionenaustauschmaterial wird vorzugsweise in zerteilter Form in einer Kolonne verwendet und ist vorzugsweise auf ein PH zwischen 6 und 10, vorteilhaft erwa 6, 5 - 8, 5 gepuffert. Eine geeignete Pufferlösung ist eine 0,1 M Ammonbicarbonatlösung oder 0,005 M Natriumbicarbonat-Kohlen- dioxyd-Puffer bei PH 6,8. Der wässerige Organextrakt wird vorzugsweise auf etwa dasselbe PH vor der Einführung in die Kolonne gepuffert und es ist vorteilhaft, eine gepufferte Lösung zum Auswaschen unerwünschter Verunreinigungen zu verwenden. Der wässerige Organextrakt ist vorzugsweise verhältnismässig verdünnt und enthält vorteilhafterweise 1-2 Gew.-% trockene Feststoffe.
Nach dem Waschen kann das aktive Polypeptid aus der Kolonne mit schwach alkalischer Lösung eluiert werden. Verdünnte, wässerige Natrium-, Kalium- oder Ammonhydroxydlösung von z. B. 0, 05 bis 2 N Stärke ist als Eluiermittel geeignet oder auch eine relativ konzentrierte Lösung von Ammonbicarbonat, z. B. eine etwa molare Lösung, kann hiefür verwendet werden. Die Eluierung kann auch mit einer sauren Lösung, die vorzugsweise auch ein lösliches Salz enthält, ausgeführt werden, wobei eine Lösung von Essigsäure und Natriumacetat von normaler und N/5 Stärke zufriedenstellend ist. Vorzugsweise werden jedoch ein Phosphatpuffer bei etwa PH 7,5 oder ein Alkalimetallhalogenid verwendet, vorteilhaft mit erhöhten Konzentrationen.
Die im Eluat vorhandenen unerwünschten anorganischen Ionen können durch Behandlung mit Molekularsiebmaterialien, z. B. durch Dialyse oder durch in Berührungbringen mit Substanzen wie Sephadex G 50 (verkauft von A. B. Pharmacia of Uppsala, Schweden), das bereits oben genannt wurde, entfernt werden. Kationen können durch Behandlung mit einem vernetzten Kationenaustauschharz Amberlite IR120 entfernt werden.
Beispiel l : a) Herstellung von Leberpaste.
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8 kg frische Ochsenleber werden zerkleinert und 16 1 Wasser und 108 g Phenol (zur Verhinderung von bakterieller Verunreinigung) zugesetzt. Die Mischung wird 2 h gerührt, unter Rühren eine halbe Stunde auf 1000C erhitzt und dann bis zum nächsten Tagbei Raumtemperatur stehen gelassen. Sodann wurde sie auf 700C erhitzt und abfiltriert ; der Rückstand wurde mit Wasser, welches 0, 5% Phenol enthielt gewaschen. Das vereinigte Filtrat (17, 8 l) enthielt 2, 8 g Trockenfeststoff pro 100 ml. Die Lösung wurde im Vakuum bei 60 - 700C zu einer gelben Paste konzentriert, die 760 g wog und 65% Trockenfeststoff enthielt. Die Paste wurde zu 3, 41 75% igem Äthanol (v/v) gefügt und die Mischung 6 h bei Raumtemperatur gerührt.
Am nächsten Tag wurde der Niederschlag abfiltriert und mit 70% igem Äthanol (v/v) gewaschen. Das vereinigte Äthanol-Filtrat von 4,6 1 enthielt 266 g Trockenfeststoff. Es wurde bei 30-400C im Vakuum zu einer braunschwarzen Paste (375 g) konzentriert, welche 71% Trockenfeststoff enthielt. b) Adsorption an Asbest.
800 g Leberpaste wurden in 2, 8 1 frisch destilliertem Wasser, das 0, 3% Trikresol enthielt, gelöst.
Die Losung besass ein PH von 4, 9 und wurde zu 11, 2 g Asbestpulver zugesetzt. Die Mischung wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt und ohne Rühren weiter 24 h stehen gelassen. Der Asbest wurde mit Wasser gewaschen, das 0, 3% Trikresol enthielt. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten wurden in gleicher Weise mit weiteren 11, 2 g Asbest behandelt. DergewascheneAsbestwurdeimVakuumüber?0 getrocknet und wog 25, 2 g. Der Asbest wurde in einem einfachen Ansatz mit flüssigem 100% eigen Phenol bei 50 - 600C eluiert, zuerst mit 200 g dann mit 100 g und schliesslich mit 200 g. Die vereinigten Eluate wurden mit dem 5fachen ihres Gewichtes an Äther versetzt, der Niederschlag abfiltriert und mit Äther gewaschen.
Das braune Material war nicht vollständig in Wasser löslich, aber Zusatz von 0, 1 N NaOH auf PH 7,5 brachte das nicht gelöste Material in Lösung.
Der Asbest wurde zwecks Entfernung von Phenol mit Äther gewaschen und darauf mit 200 ml ein normaler wässeriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert, wobei ein Niederschlag auftrat. Das Überstehende wurde für die weitere Verarbeitung verwendet.
Sowohl die Phenoleluatfraktion und als auch die Ammoniak-Eluat-Fraktion wurden weiter an Sephadex G 50 Kolonnen (2, 8 mm Durchmesser x 32,5 cm Höhe) gereinigt und in beiden Fällen die hochmolekulare Fraktion gesammelt. Die beiden gereinigten Fraktionen (12 mg aus der Phenolfraktion und 18 mg aus der Ammoniakfraktion) waren weder pyrogen in Kaninchen noch antigenisch im Menschen,
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wässeriger Ammoniaklösung eluiert werden. Auch wurde gefunden, dass das biologisch wirksame Material mit 0, 1 n NaOH vom Asbest eluiert werden kann. Die aktiven Fraktionen zeigten in Wasser eine bläu- lich-grüne Fluoreszenz und gaben mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag.
Beispiel 2 : 0, 51 Menschenblut wurden 30min auf 1000C erhitzt und es wurden 500 ml einer
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3 gew.-% igen,filtrierte. 1, 84 g Asbest wurden zum Filtrat gefügt und 2 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der
Asbest wurde von der flüssigen Phase durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 90g Phenol (100%) bei 600C eluiert, worauf zum Phenol-Eluat 450 ml Äther gefügt wurden und man sodann den entstehenden Nieder- schlag abfiltrierte. Der erhaltene Feststoff wurde in Wasser wieder gelöst und der'PH mit wässeriger
Natronlauge auf 7 eingestellt. Die erhaltene Lösung besass ähnliche Eigenschaften wie jene des Produktes von Beispiel 1.
Beispiel 3 : a) Herstellung der Sephadex Kolonne.
Sephadex G 50 (A. B. Pharmacia, Uppsala) wurde in 0, 05 M NaCl suspendiert und die Mischung
30 min gerührt. Nach 10 - 15 min Absetzdauer, wurde das Überstehende mit den feineren Teilchen ab- dekantiert. Nach Ersatz des Überstehenden mit frischem 0, 05 M NaCl wurde der gesamte Prozess weitere viermal wiederholt. Das Sephadex wurde unter Rühren unter Schwerkraft in eine Kolonne (45 cm Durch- messer x 30 cm Höhe) gepackt. Die Kolonne wurde bei +40C mit frisch destilliertem Wasser gewaschen, bis sie keine Chlorionen mehr enthielt. b) Fraktionierung von hochmolekularer Fraktion aus wässeriger Leberzubereitung.
Ein Leberextrakt (aus 6 kg frischer Leber) wurde in üblicher Weise aus frischer Rindsleber mittels
Proteolyse mit Papain, Fällung des Proteolysates mit Alkohol, partielle Eindampfung des Filtrates und
Extraktion der konzentrierten Lösung mit wassergesättigtem Phenol, Verdünnung des Phenolextraktes mit Äther und Extraktion der Phenol-Äther-Mischung mit Wasser, hergestellt. Zu 600 ml dieses wässerigen
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Bariumacetat Ba (CH3 COO)-HO zugefügt und die Lösung über Nacht bei 0 C stehen gelassen. Die ge- ringe Menge des gebildeten Niederschlages wurde durch Zentrifugieren abgetrennt.
Zu der überstehenden
Flüssigkeit wurden 2,8 1 96% tiger Alkohol gefügt und der gebildete Niederschlag wurde am nächsten Tag von der Lösung abzentrifugiert, mit Alkohol und dann mit Äther gewaschen und schliesslich getrocknet.
Der Niederschlag wog 10,95 g.
Der Niederschlag wurde in 500 ml Wasser gelöst und die Lösung durch eine Kolonne tropfen gelassen, die 140 ml eines Säureionenaustauschharzes enthielt. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen bis die austropfende Lösung ein PH von 5,5 bis 6 zeigte und farblos war. Zu der Lösung wurde dann 2 n NaOH zur
Einstellung eines PH von 6,5 gefügt ; sie wurde im Vakuum konzentriert und schliesslich gefriergetrocknet.
Das Produkt wog im trockenen Zustand 2,9 g.
0, 5 g des Produktes (Äquivalent zu 1 kg frischer Leber) wurden in 50 ml Wasser gelöst. Zu der
Lösung, die ein PH von 6,6 besass, wurden 1, 5 g Kohle zugesetzt, die zuvor mit Wasser und dann mit
Alkohol gewaschen war. Nach neunzehnstündigem Stehen wurde die Kohle abfiltriert und mit Wasser ge- waschen, bis das Filtrat farblos war. Die gesammelten Filtrate wurden im Vakuum konzentriert, dann gefriergetrocknet und wogen dann 0,250 g.
10 g dieses gefriergetrockneten Material wurden in 40 ml Wasser gelöst und durch eine Kolonne ge- leitet, welche dann mit Wasser gewaschen wird. Das Leervolumen (70 ml) wurde verworfen und die folgenden 200 ml (schwach bräunliche Farbe), die das hochmolekulare Material enthielten, wurden ge- sammelt und im Vakuum im gefrorenen Zustand zur Trockene eingedampft. DieFraktion wog 150 mg.
Der grösste Teil des dunkelgefärbten Materials in der Leberzubereitung bewegte sich in der Kolonne sehr langsam nach abwärts und bestand daher aus niedermolekularem Material. In Wasser zeigte die aktive
Fraktion eine bläulich-grüne Fluoreszenz und ergab mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag. c) Antigenität
Die hochmolekulare Fraktion ergab keine antigenische Reaktion, wie die der Hauttest zeigt, wenn sie beim Menschen in einer Menge von 0, 1 mg injiziert wurde. d) Schutz gegen E. coli Infektion in Mäusen.
Die hochmolekulare aktive Fraktion zeigte eine Schutzwirkung, wie dies aus folgenden Zahlen er- sichtlich ist.
Bakterien-Aufnahme-Doses : 1,25 x 108 Organismen pro Maus. 0, 1 mg (gelöst in 0, 31obigem Tri- kresol-Wasser) der hochmolekularen Fraktion wurden pro Maus intramuskulär injiziert. Einer Gruppe von sechs Mäusen wurde die hochmolekulare Fraktion 3 h vor der Bakterienaufnahme verabreicht und einer andern Gruppe 6 h vor der Ausnahme. Sechs Mäuse erhielten nur die Bakterien und dienten zur Kontrolle.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgezeigt.
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<tb>
<tb>
Überlebende/Gesamtzahl <SEP> der <SEP> Mäuse
<tb> Kontrolle <SEP> 0/6
<tb> 3 <SEP> h <SEP> vor <SEP> der <SEP> Aufnahme <SEP> 3/6
<tb> 6 <SEP> h <SEP> vor <SEP> der <SEP> Aufnahme <SEP> 2/6
<tb>
Bei einem zweiten Versuch betrug die Aufnahmedosis pro Maus 3,5 X 108 Organismen. Die Dosis der intramuskulär injizierten hochmolekularen Fraktion betrug 0, 2 mg (gelöst in 0, 1 ml Salzlösung). Im übrigen wurde der Versuch wie oben ausgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
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<tb>
<tb>
Überlebende/Gesamtzahl <SEP> der <SEP> Mäuse
<tb> Kontrolle <SEP> 0/6
<tb> 3 <SEP> h <SEP> vor <SEP> der <SEP> Aufnahme <SEP> 4/6
<tb> 6 <SEP> h <SEP> vor <SEP> der <SEP> Aufnahme <SEP> 3/6
<tb>
e) Schutz gegen Vaccinia (Kuhpocken)-Virus.
Die hochmolekulare Fraktion schützt Hühnerembryos gegen Vaccinia-Infektion (bei einem Dosisgehalt von 2, 55 jug). Die hochmolekulare Fraktion in Lösung in Wasser wurde in dieChorioallantoin-Membran von 10bisllTagen alten Hühnerembryos eingeführt. 24h hernach wurde den Embryos der Vaccinia-Virus aufgegeben. Dann wurde die Embryos 5 Tage bebrütet. Die Resultate sind aus der folgenden Tabelle zu
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ersehen.
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<tb>
<tb>
Verdünnung <SEP> der <SEP> Hochmolekulare <SEP> Fraktion <SEP> Kontrolle
<tb> Vaccine <SEP> aufgenommen
<tb> 10-6 <SEP> Einige <SEP> getrennte <SEP> Kolonien <SEP> ; <SEP> zahlreiche <SEP> Kolonien <SEP> ; <SEP>
<tb> 5 <SEP> lebende <SEP> Embryos, <SEP> 1 <SEP> tot. <SEP> alle <SEP> Embryos <SEP> tot
<tb> 10-7 <SEP> Wenige <SEP> getrennte <SEP> Kolonein; <SEP> zahlreiche <SEP> Kolonien <SEP> ; <SEP>
<tb> 6 <SEP> lebende <SEP> Embryos. <SEP> 4 <SEP> tote <SEP> Embryos <SEP> und
<tb> 1 <SEP> lebendes.
<tb>
104 <SEP> Einige <SEP> wenige <SEP> Kolonien <SEP> ; <SEP> zahlreiche <SEP> bis <SEP> zu
<tb> 6 <SEP> lebende <SEP> Embryos. <SEP> einigen <SEP> Kolonien <SEP> ; <SEP>
<tb> 6 <SEP> Embryos <SEP> lebend.
<tb>
Beispiel 4 : 61 Ochsenblut wurden gerührt und zwecks Verhinderung der Koagulation mit 0,3% Trikresol versetzt und das Ganze auf 1000C während 1 h erhitzt, worauf man über Nacht bei Raumtemperatur stehen liess. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat (4 l) mit 25, 5 ml 20% figer Sulfosalizylsäure versetzt. Der entstehende Niederschlag wurde entfernt. Das Filtrat wurde konzentriert und der PH auf 8 eingestellt. Das Material wurde an Sephadex G 50 (4 cm x 32 cm) in 0,01 n-NaOH fraktioniert und die hochmolekulare Fraktion gesammelt. Überschüssiges NaOH wurde mit Amberlite IR 120 (H) zu PH 7, 0 entfernt und die resultierende Lösung gefriergetrocknet. Ausbeute 481 mg.
Beispiel 5 : Fraktionierung an Ecteola.
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(1,5 cm Durchmesser x 5 cm Höhe) geleitet, die zuvor mit 0,01 m NHHCO Puffer von PH 8,5 ins
Gleichgewicht gebracht worden war. Nicht-absorbiertes Material wurdemittels30 ml 0,01 m-NHHCO
Puffer bei PH 8, 5 ausgewaschen. Die Kolonne wurde dann mit m-NH HCO eluiert, wodurch man das biologisch aktive Material erhielt. Das aktive Material konnte aus einer solchen Kolonne auch mit NaOH oder wässerigem Ammoniak eluiert werden. Im Falle der Eluierung mit NaOH wurde das PH durch Zu- satz von HCl auf 7 gebracht. NaCl und NH4 HC03 konnte durch Behandlung mit Sephadex G 50 entfernt werden.
Beispiel 6 : Fraktionierung an Ecteola. a) Behandlung von Ecteola vor dem Gebrauch.
5 g Ecteola wurde bei Raumtemperatur während 2 - 3 h mit 100 ml n-NaOH stehen gelassen. Das Überstehende wurde abdekantiert und weitere 100 ml NaOH zugesetzt, wonach man die Mischung 1 h stehen liess. Das Material wurde in eine Kolonne (1, 5 cm x 7 cm) gegossen und NaOH mit Wasser ausge- waschen. Die Kolonne wurde dann mit einem 0, 005 M NaHCO3 -Co2 Puffer bei PH 6, 8 ins Gleichge- wicht gebracht. b) 25 mg der hochmolekularen Fraktion aus der Sephadex Kolonne, hergestellt gemäss Beispiel 3 aus einer gefällten Leber-Fraktion wurde in 10 ml 0, 005 M NaHCO-CO Puffer bei PH 6, 8 gelöst und durch die Kolonne geleitet. Die Kolonne wurde mit dem Puffer gewaschen. Die Kolonne wurde mit 2 m NH3 eluiert und darauf mit 0,5 n NaOH, welche die aktive Fraktion entfernte. Die Lösung wurde mit Amber- lite IR 120 (H) bis zu PH 6,0 behandelt.
Die Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 24 mg, wovon ein Teil aus Natriumbicarbonat bestand, das durch weitere Behandlung mit Sephadex entfernt werden konnte.
Beispiel 7 : Eine Kolonne (5 cm x 1 cm) mit Ecteola, hergestellt wie im Beispiel 6a, wurde ver- wendet. 12,5 mg Material (erhalten durch Behandlung von Leberpaste mit Asbest, Eluierung mit NaOH,
Neutralisation mit HC1 und Entfernung von NaCl an Sephadex) wurde in 10 ml 0,005 M NaHCOg"CO
Puffer bei PH 6,7 gelöst und durch die Kolonne geleitet. Die Kolonne wurde mit dem Puffer gewaschen und sodann mit 40 ml 0, 11 n NaOH eluiert. Dies ergab eine Fraktion, die eine gelbe Fluoreszenz zeigte.
NaOH wurde durch Zusatz von Amberlite IR 120 (H) bis PH 7 entfernt und die Lösung gefriergetrocknet.
Der trockene Feststoff wog 10 mg, wovon einiges aus NaHCOs bestand.
Beispiel 8 : Zu 50 1 gerührtem Ochsenblut wurden 150 ml Trikresol gefügt, worauf unter Rück- fluss 2 1/2 h auf 900C erhitzt wurde. 82 1 96% iger Alkohol wurden zur heissen Lösung gefügt und weiter während 1 h ohne Erhitzung gerührt. Die Mischung wurde dann über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen
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gelassen und dann filtriert, wobei man 80 1 Filtrat erhielt. Es wurden 43 1 Wasser zugesetzt und die Mischung durch Zusatz von piger Sulfosalizylsäure auf PH 1 gebracht. Der Niederschlag wurde verworfen und der PH des Filtrates durch Zusatz von roziger NaOH auf PH 8-8, 3 eingestellt. 0, 25 kg (NH4) 2 S04 pro Liter wurden zu der Lösung unter Rühren gefügt. Beim Stehen der Mischung trennte sie sich in zwei Schichten.
Die obere Schicht (alkoholische Phase) wurde entfernt und im Vakuum auf 5 l
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gestellt und die Lösung filtriert und im Vakuum auf 450 ml konzentriert.
Eine Sephadex G 50 Kolonne (9, 2 cm x 95 cm) wurde mit 0, 01 n NaOH ins Gleichgewicht gebracht und 250 ml des obigen Konzentrates, das mit 30%oiger NaOH auf PH 11 - 12 eingestellt war, wurden der
Kolonne aufgegeben. 0, 01 n NaOH wurde als Eluiermittel verwendet, 11 des Eluates (Leervolumen) wurde verworfen und die folgenden 1, 46 1 gesammelt. Diese Lösung enthielt das hochmolekualre Material und gab mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag. Die Lösung wurde durch Zusatz von Amberlite IR 120 H (Kationenaustauschharz in der Wasserstoff-Form) neutralisiert, das Harz durch Filtration entfernt und das
Filtrat gefriergetrocknet. Die Ausbeute variierte von 0, 05 bis 0, 1 g pro Liter Blut.
Bei s pie 1 9 : 20 kg zerkleinerte Ochsenleber wurden mit 50 1 Wasser unter Erhitzen auf 900C ge- rührt. Phenol wurde zu einer Endkonzentration von 0, 5% zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht stehen gelassen und das Filtrat im Vakuum auf 3 1 konzentriert, 5, 3 l 96'oiger Alkohol wurden zuge- setzt und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Filtrat wurde im Vakuum auf 2, 6 1 konzentriert, wobei zwecks Vermeidung von bakterieller Verunreinigung 8, 4 ml Trikresol zu- gesetzt wurden.
Zu 500 ml der Lösung wurden 750 ml einer gesättigten Lösung von (NH) SO zugesetzt und zur Ab- scheidung des Niederschlages bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wurde mit gesättigter (ni4)2 804 Lösung gewaschen und in Wasser durch Einstellung des PH auf 7, 0 mit NaOH gelöst. Die Lösung wurde dialysiert, wodurch gefärbtes Material entfernt wurde. Die dialysierte Lösung
Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 1, 53 g.
Biologische Aktivität Die in diesen Beispielen beschriebenen Produkte zeigten Aktivität gegen Vaccinia-Virus in Kaninchen- haut und inhibierten Mitose in Hela Zellen in Pucks Medium.
Beispiel 10 : Fraktionierung von Material an Sephadex G 50 in 0, 1 M NaCl.
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setzt. Das Filtrat wurde mit NaOH auf PH 7, 5 neutralisiert und einer Sephadex G 50 Kolonne (35 cm Höhe x 3, 5 cm Durchmesser) aufgegeben, die mit 0, 1 M NaCl enthaltend 0, 30/0 Trikresol ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Kolonne wurde mit letzterer Lösung eluiert. Die ersten 95 ml Eluate wurden verworfen. Die nächsten 130 ml, enthaltend das hochmolekulare Material, wurden gesammelt, dialysiert und gefriergetrocknet. Ausbeute 80 mg.
Beispiel 11: Eine Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE)-Kolonne (7cm Höhe x 2, 8 cm Durchmesser) wurde mit 0, 005 M Phosphatpuffer PH 7, 5 ins Gleichgewicht gebracht. 200 mg Material (aus Blut) wurden in 40 ml des Puffers gelöst und durch die Kolonne geleitet. Die Kolonne wurde darnach mit dem Puffer gewaschen. Die Kolonne wurde dann mit 0, 005 M Phosphatpuffer PH 7, 5 enthaltend
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phatpuffer enthaltend 0, 5 M NaCl eluiert. Die drei Fraktionen wurden dialysiert und gefriergetrocknet. Die erste Fraktion lieferte 22 mg, die zweite 55 mg und die dritte 55 mg. Alle Fraktionen zeigten biologische Aktivität.
Zur Verwendung als Nasen-Spray Lösung wird 1 g gefriergetrocknetes Material, hergestellt nach dem
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einer Mischung von Methyl- und Äthyl-p-hydroxybenzoat (Nipaester 82121), gelöst.
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