CH468191A

CH468191A - Verfahren zur Herstellung einer Polypeptidfraktion

Info

Publication number: CH468191A
Application number: CH1507862A
Authority: CH
Inventors: Jensen Laland Per; Moe Laland Soren Gustav; Dedichen Jens; Thorsdalen Nils
Original assignee: Nyegaard & Co As
Priority date: 1961-12-27
Filing date: 1962-12-22
Publication date: 1969-02-15
Also published as: NL287198A; ES283674A1; DE1492047A1; DK108588C; SE323766B; FR2836M

Description

Verfahren zur Herstellung einer Polypeptidfraktion
Versuche haben gezeigt, dass man aus tierischen Organen Extrakte isolieren kann, welche eine nichtspezifische Immunität induzieren und, da sie praktisch pyrogenfrei und nicht-antigenisch sind, z. B. injiziert werden können, ohne eine bemerkbare Gewebereaktion zu erzeugen. Die Bezeichnung nicht-spezifische Immunität wird hier in ihrem allgemein anerkannten Sinn verwendet und umfasst nicht nur die Widerstandsfähigkeit gegen bakterielle und virale Infektion, sondern auch die Immunität gegen äussere Beanspruchungen, wie Abkühlung, traumatische Schockwirkung, endotoxische Einwirkungen usw. Es wurde auch festgestellt, dass das Produkt antimitotische Wirkungen gegen verschiedenartige Zellen aufweist, z. B. Hela- und Chang-Zellen.

Chemisch ist das Produkt ein Polypeptid oder eine Mischung von Polypeptiden, welche Bezeichnung in weitem Sinne zu verstehen ist und sich auf Stoffe bezieht, die eine grundlegende Polypeptidstruktur besitzen, unabhängig davon, ob andere Gruppen, z. B.

Kohlenhydratreste, zugegen sind oder nicht. Seine Hydrolyse liefert eine Anzahl von Aminosäuren und Stoffe, welche eine Saccharidreaktion zeigen. Es konnten die Aminosäuren, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Arginin, Lysin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, Isoleucin, Glycin, Phenylalanin, Histidin, Prolin, Tyrosin und Threonin festgestellt werden. Das Produkt gibt eine positive Biuret-Reaktion, eine positive Anthron-Reaktion, welche die Anwesenheit von Hexosen anzeigt und eine positive Anzeige von Hexosaminen mittels einer modifizierten Elson-Morgan-Reaktion (siehe L. Svennerholm, Uppsala Lakare-forenings Forhandlungar, 61, 1956, S.

287). Als Reagent dient dabei p-Dimethylaminobenzaldehyd in Acetylaceton.

Das Produkt gibt normalerweise eine saure Reaktion mit einem isoelektrischen Punkt von pH etwa 4-5; die Aminosäure Glutaminsäure und Asparaginsäure sind im Molekül in beträchtlichen Mengen enthalten und bewirken wahrscheinlich diese Azidität. Das Produkt kann aber auch neutral wirkende Polypeptide enthalten.

Das Molekulargewicht des aktiven Faktors liegt über 1000 und besonders brauchbar ist dasjenige Produkt, das praktisch kein aus den tierischen Organen stammendes Material mit einem Molekulargewicht von weniger als 8000 enthält. Vorgezogen werden Produkte, die keinen Stoff von geringerem Molekulargewicht als 104 enthalten.

Das Produkt ist praktisch phosphorfrei, was die Abwesenheit von Nucleinsäuren anzeigt, und enthält 13-15 O/o Stickstoff. Es wird durch Phosphorwolframsäure gefällt, aber nicht durch Sulfosalicylsäure, ist löslich in Wasser, Säuren und Basen, z. B. in flüssigem Phenol, 1 0-0/oiger Natronlauge usw., löslich in 70 -oigem wässrigem äthanol, wenig löslich in 96-0/oigem Äthanol und unlöslich in Äther, Chloroform und Petrol äther.

Das Produkt ist mindestens bis 100 CC hitzebeständig und erträgt ein t/2-stündiges Erwärmen auf 100 CC in Wasser. In Lösung zeigt es eine grünliche Fluoreszenz, die je nach Reinheit zwischen gelbgrün und blaugrün varriiert.

Wie schon gesagt, ist das Produkt praktisch pyrogenfrei und zeigt praktisch keine antige Wirkung. Nach Injektion induziert es Immunität gegen Impfstoffviren, Eschenchia coli und eine beträchtliche Anzahl von anderen Bakterien und Viren und erzeugt auch Immunität gegen das Schnupfenvirus, z. B. durch direktes Aufsprühen auf die Nasenschleimhaut.

Das Produkt kann in üblicher Weise in pharmazeutische Zusammensetzungen eingearbeitet werden. Diese werden zweckmässig in Einheiten dosiert, die je etwa 5 bis 20 mg des Wirkstoffes enthalten. Es kann parenteral, oral, äusserlich, etc. verabreicht werden. Bei einer bevorzugten Form wird die Lösung des Wirkstoffes lyophilisiert, in sterilem pyrogenfreiem Wasser wiedergelöst und durch Sinterglasfilter sterilisiert.

Die Form für die topische Verwendung ist zweckmässig eine wässrige Lösung, die ein Konservierungsmittel, z. B. Äthonal oder p-Oxybenzoesäuremethyl- oder -äthylester enthält und versprüht werden kann. Eine solche Lösung enthält z. B. 0,01 bis 10 Gew.-O/o, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 Gew.O!o Wirkstoff.

Das Verfahren zur Herstellung einer solchen Poly peptidfraktion ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einer wässrigen Suspension oder einem wässrigen Extrakt von Säugetierorganen oder Säugetierblut durch Erhitzen bis zur Koagulation die Polypeptide von den mit ihnen chemisch verbundenen Proteinen freilegt und die vom Koagulat abgetrennte, die freigelegten Polypeptide enthaltende wässrige Lösung einer Molekularfraktionierung unterwirft. Dass es sich bei diesem Verfahren um die Spaltung von chemischen Bindungen zwischen Polypeptid und Proteinen handelt, lässt sich daran erkennen, dass weder frisches Blut noch die behandelten Extrakte eine antikininase Wirksamkeit zeigen, während nach der Hitzekoagulation die freigelegten wirksamen Polypeptide leicht isoliert werden können.

Man kann z. B. Extrakte aus Leber, Niere und/oder Milz verwenden.

Den wässrigen Extrakt kann man einfach durch Extrahieren mit Wasser, z. B. aus frischer Rindsleber, bereiten und aus dem Extrakt die Proteine durch Hitzekoagulation von den Polypeptiden trennen; man kann derart vorgehen, dass man z. B. im Falle von Leber diese fein zerhackt, in Wasser von 100 0C umrührt, die Flüssigkeit abtrennt und einengt, wobei sich ein den aktiven Faktor enthaltender fester Stoff ausscheidet.

Diese Paste kann mit Alkohol extrahiert und dieser, z. B. durch Abdestillieren unter vermindertem Druck, entfernt werden. Man kann auch unerwünschte Verunreinigungen mit Alkohol fällen oder auch die wässrige Lösung mit Phenol extrahieren und das aktive Material z. B. durch Fällen mit Äther zurückgewinnen.

Aus anderen Organen können in ähnlicher Weise Extrakte gewonnen werden.

Aus Blut kann man das darin enthaltene Protein durch Hitze koagulieren und von den gelösten Polypepti den abfiltrieren. Man kann dem Filtrat ein selektives Proteinfällungsmittel, z. B. Sulfosalicylsäure, zusetzen, wodurch das restliche Protein gefällt wird und abfiltnert werden kann.

Man kann die Lösung noch einer weiteren Behand lung unterwerfen, indem man das aktive Material bei pH
5 bis 10 mit einem wasserlöslichen Salz eines mehrwerti gen Metalls in Gegenwart eines wasserlöslichen Alkohols behandelt, wobei sich das aktive Material ausscheidet.

Man kann z. B. einen wässrigen Organextrakt nach der
Hitzekoagulation mit Calcium-, Barium- oder Bleiacetat, oder Zink- oder Magnesiumchlorid in Gegenwart von Äthanol versetzen, wodurch das aktive Polypeptid gefällt wird. Dann können die Metallione entfernt werden, z. B. indem man den Niederschlag abfiltriert oder abzentrifu giert, wieder in Wasser löst und durch einen sauren
Ionenaustauscher gehen lässt. Man kann auch die
Metallione in Form ihrer unlöslichen Salze entfernen, z. B. Barium als Bariumsulfat mit Schwefelsäure.

Nach einer Behandlung mit dem Salz des mehrwerti gen Metalls und Alkohol und Entfernung der Metallione kann man das aktive Polypeptid in einem basischen
Ionenaustauscherharz adsorbieren und von dort mit einer schwach basischen Flüssigkeit eluieren. Diese Behandiung kann man dEXtweder vor oder nach der erfindungsgemässen Fraktionierung durchführen.

Eine besonders brauchbare Art der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man den Extrakt mit einem Adsorbiermittel in Berührung bringt, welches die gewünschte Polypeptidfraktion absorbiert, und dann die Elution mit einer sauren oder basisschen Flüssigkeit oder einer konzentrierten wässrigen Lösung eines Electrolyten durchführt.

Für die Adsorption solcher hochmolekularer Materialien geeignete Stoffe sind bekannt. Es sind meistens anorganische Stoffe, z. B. komplexe Lilikate, wie Bentonit, Montmorillonit, Celit usw. Es wurde gefunden, dass Asbest ein besonders wirksames Adsorbiermittel ist. Das pH des Extrakts während der Adsorption ist vorzugsweise zwischen 4 und 7, zweckmässig 5-6. Die Adsorption kann bei Zimmertemperatur oder etwas höher oder tiefer durchgeführt werden.

Die Elution des aktiven Polypeptides kann mit einer basischen oder sauren Flüssigkeit oder mit einer konzentrierten Lösung eines Elektrolyten erfolgen. Die saure Flüssigkeit kann eine flüssige schwache Säure sein, z. B. flüssiges Phenol. Man kann auch eine wässrige Säure verwenden, vorzugsweise eine wässrige Lösung einer schwachen Säure, z. B. von Essigsäure oder Ameisensäure mit etwa pH 4. Als basische Flüssigkeit kann man eine wässrige Lauge, z. B. Natronlauge in einer Konzentration von 0,1n verwenden oder ln-Ammoniak.

Manchmal ist es vorteilhaft, das Adsorbat erst mit Phenol zu eluieren, dann das Phenol auszuwaschen und weiter mit wässrigem Alkali zu eluieren. Ist der Eluent wasserfrei, z. B. 100 0/oiges Phenol, wird der Asbest vor der Elution zweckmässig getrocknet, z. B. über P.2O. Als konzentrierte Elektrolytlösungen kommen vor allem Salzlösungen in Betracht, z. B. wässriges Kochsalz in Normalkonzentration.

Die Adsorption wird zweckmässig in relativ konzentrierter Lösung durchgeführt, z. B. 25 mg Feststoff/100 ml.

Da der erwünschte Wirkstoff ein hohes Molekulargewicht hat, im allgemeinen mindestens 8000, und infolgedessen nicht durch oder in Molekularsiebe dringen kann, welche für Moleküle dieser Grösse undurchdringlich sind, kann man die niedermolekularen Verunreinigungen vom aktiven Faktor mit Hilfe solcher Molekularsiebe abfraktionieren. Ein solches Molekularsieb ist z. B. ein mit Äthylenoxyd vernetztes Dextran, wie das Sephadex G50 (eingetr. Warenzeichen) der A.B. Pharmacia in Uppsala, Schweden. Dieses Produkt ist für Moleküle, deren Molekulargewicht grösser ist als 8000-10 000, undurchdringlich. Man kann z. B. eine wässrige Lösung des Ausgangsmaterials durch eine Säule aus einem solchen Dextran fliessen lassen oder durch eine Membrane solcher Struktur dialysieren, elektrodialysieren oder ultrafiltrieren.

Die Verwendung solcher Dextrane als Molekularsiebe ist beschrieben durch Per Flodin in Dextran gels and their applications in gel filtration , Uppsala 1962. Andere brauchbare Molekularsiebe umfassen vernetzte Galactomannanprodukte (Denel et al., Advances in Chemistry, Series 1954, 11, 51) und Copolymere aus Acrylamid und Methylen-bis-acrylamid (Canadian Journal of Chemistry, 1962, 40, 159).

Eine brauchbare Druchführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens besteht also darin, dass man das Ausgangsmaterial mit einem Molekularsieb in Berüh rung bringt, welches für Moleküle von einem kleineren Molekulargewicht als 1000 durchlässig ist.

Vernetzte Dextrane und ähnliche Molekularsiebe in
Teilchenform, welche Stoffe von niedrigem Molekulargewicht absorbieren, werden in der Chromatographie verwendet. In solchen Säulen bleibt das aktive Polypep -tid in der Flüssigkeit, die zwischen den Teilchen rasch über die Säule fliesst. Man kann die Säule mit Wasser nachwaschen, um das aktive Polypeptid daraus zu entfernen, und obwohl dabei auch etwas niedermolekulares Material langsam eluiert wird, kann man im allgemeinen das aktive Material entfernen, bevor die -unerwünschten Stoffe die Säule zu verlassen beginnen.

Meistens kann man das aktive Polypeptid mit Hilfe von entsprechenden biologischen Tests aus den die Säule verlassenden Fraktionen aussuchen; die niedermolekularen Verunreinigungen sind im allgemeinen von braunen oder gelben Stoffen begleitet, deren Bewegung man optisch verfolgen kann.

Die Fraktionierung mit einem Molekularsieb wird zweckmässig bei verhältnismässig niederer Temperatur, z. B. bei +4 0C, durchgeführt, um das Wachstum von Bakterien zu vermeiden. Bei höheren Temperaturen ist es vorteilhaft, ein Desinfektionsmittel zuzusetzen, z. B.

Phenol oder Kresol.

Für die Herstellung einer Säule aus vernetztem Dextran rührt man die Teilchen zweckmässig einige Male in eine verdünnte, z. B. 0,5 n, Kochsalzlösung und wäscht sie dann mit Wasser, um die Chlorionen zu entfernen.

Die das aktive Material enthaltende Flüssigkeit, welche auf die Säule gebracht wird, enthält zweckmässig einen Elektrolyten, z. B. ein neutrales Salz, wie Kochsalz
Da der aktive Stoff öfters einen sauren Charakter hat, kann der Elektrolyt auch basisch sein, z. B. Natronlauge. Die Konzentration des Elektrolyten in der Lösung ist zweckmässig 0,05 bis 0,5n, z. B. 0,in NaCl oder 0,0 in NaOH. Man kann den aktiven Faktor auch anstelle von Wasser mit einer 0,05-0,Sn-Lösung von Natronlauge durch die Säule waschen. Eine Lösung von 0,1n NaOH hat sich gut bewährt. Die erhaltene Lösung kann man durch Behandlung mit einem Kationenaustau scher neutralisieren, z. B. mit Amberlite IR 20 in der Wasserstoffform.

Eine andere vorteilhafte Ausführungsform des erz in dungsgemässen Verfahrens ist das Fällen des gewünschten Polypeptides mit Hilfe eines inerten Mittels, das
Proteine ausscheidet. Mit inert wird ein Mittel bezeich net, welches das Protein oder die Polypeptide weder zersetzt noch ab ändert, sondern in unveränderter Form aus ihrer Lösung ausscheidet.

Das proteinfällende Mittel kann in fester Form zugesetzt werden, z. B. ein wasserlöslicher anorganischer
Stoff, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder
Phosphorwolframsäure. Man kann auch eine konzen trierte Lösung eines solchen Stoffes verwenden.

Das die aktive Polypeptidfraktion enthaltende hoch molekulare Material kann man aus der wässrigen Lö sung ausfällen und z. B. durch Filtrieren oder Zentrifu gieren abtrennen oder in eine getrennte organische Phase überführen. Diese organische Phase kann eine in
Wasser unlösliche Flüssigkeit sein, es ist aber zweckmäs sig, eine polare Flüssigkeit zu verwenden, die im allge meinen wasserlöslich ist, aber eine von der wässrigen getrennte Phase bildet, wenn die wässrige Phase z. B. grosse Mengen des zum Fällen verwendeten anorgani schen Stoffes gelöst enthält. Solche polare Lösungsmittel lösen den aktiven Faktor besser als nichtpolare Flüssig keiten.

Bei einer zweckmässigen Ausführungsart gibt man das proteinfällende Mittel zu einer wässrigen Lösung des aktiven Polypeptides und eines in Wasser löslichen organischen Lösungsmittels. Dabei bilden sich zwei Phasen, von denen die organische abgetrennt und daraus das aktive Polypeptid gewonnen wird.

Im allgemeinen beeinflusst das pH der wässrigen Lösung die Trennung, und die Menge des Fällungsmittels muss dem pH angepasst werden. Auch die Gegenwart von anderen wasserlöslichen Stoffen, z. B. von Äthanol oder Aceton, beeinflusst die optimale Menge des Fällungsmittels.

Wenn man z. B. Ammoniumsulfat benutzt, liegt die optimale Menge zwischen 25 und 60 O/o der Sättigung und pH zwischen 5 bis 8. Wird eine organische, wasserlösliche Flüssigkeit, z. B. Äthanol, mitverwendet, ist deren Konzentration zweckmässig 30 bis 60 O/o der wässrigen Phase und man nimmt so viel Ammoniumsulfat und organische Flüssigkeit, dass sich zwei Phasen bilden. Wenn man z. B. 46 O/o äthanol zusetzt, kann die Konzentration an Ammoniumsulfat 25 Gew.O/o sein.

Die zugesetzte Menge an organischer Flüssigkeit wird vorzugsweise derart bemessen, dass die von dieser gebildete Phase ein geringes Volumen hat, so dass sie das aktive Polypeptid in hoher Konzentration enthält. Es sei bemerkt, dass Äthanol oft geringe Mengen von Verunreinigungen ausscheidet, die entfernt werden müssen, bevor man die Fraktionierung mit dem anorganischen Salz durchführt.

Diese Fraktionierung führt man zweckmässig bei Zimmertemperatur aus, und die oben angegebenen Konzentrationen gelten für diese Temperatur. Der aktive Faktor ist aber bis 90 "C stabil, so dass man bis zu die ser Temperatur arbeiten kann, ohne eine Desaktivierung zu befürchten.

Diese Fraktionierung kann unmittelbar bei einem wässrigen Organextrakt angewendet werden oder bei wässrigen Lösungen, die schon vorgereinigt sind. Das durch die Fraktionierung gewonnene Material kann weiter gereinigt werden und die Fraktionierung kann im allgemeinen in jedem Stadium der Reinigung stattfinden.

Das aktive Polypeptid kann besonders vorteilhaft durch Adsorption auf einem schwach basischen Ionenaustauscher aus Cellulose und darauffolgende Elution mit einem wässrigen Elektrolyten, z. B. einer neutralen, sauren oder schwach basischen Lösung, gereinigt werden. Diese Reinigung wird vorteilhaft in Kombination mit der erfindungsgemässen Fraktionierung, also vor oder nach derselben, durchgeführt, Hierzu kann man einen cellulosichen Ionenaustauscher verwenden, wie er von Peterson und Sobers, J.A.C.S. 78,751 (1956) beschrieben wird. Diese Austauscher enthalten durch schwach basische Gruppen modifizierte Cellulose. Solche Gruppen sind z. B. Amino-, Dialkylamino- und Dialkylaminoalkylgruppen. Besonders brauchbar ist das unter der Bezeichnung Ecteola erhältliche Produkt.

Dieses ist ein Reaktionsprodukt von Epichlorhydrin, Triäthanolamin und Natriumcellulose. Man kann auch DEAE-Cellulose oder DEAE Sephadex verwenden.

Den Ionenaustauscher verwendet man vorzugsweise in Teilchenform in einer Säule und puffert auf pH 6-10, zweckmässig auf 6,5-8,5. Eine brauchbare Pufferlösung ist eine 0, 1n-Ammoniumbicarbonatlösung oder eine 0,05n Natriumbicarbonatlösung, die CO2 enthält und auf pH 6,8 eingestellt ist. Das zu behandeln de Material wird zweckmässig auf die gleiche Acidität gepuffert, bevor man es auf die Säule bringt, und es ist vorteilhaft, eine gepufferte Lösung zum Auswaschen von Verunreinigungen zu verwenden. Das auf die Säule gebrachte Material ist zweckmässig verdünnt und enthält vorteilhaft 1 bis 2 Gew.O/o Trockensubstanz.

Nach dem Waschen kann man das aktive Polypeptid aus der Säule mit einer schwach alkalischen Lösung eluieren. Brauchbar sind z. B. wässrige Lösungen von Natronlauge, Kalilauge oder Ammoniak in einer Konzentration von 0,05-2n, oder Pottasche oder eine konzentrierte, etwa molare Lösung von Ammoniumbicarbonat. Man kann auch mit einer sauren Flüssigkeit eluieren, die zweckmässig noch ein Salz gelöst enthält.

Eine solche Lösung ist z. B. n-Essigsäure, enthaltend n/5 Natriumacetat. Am besten verwendet man einen Phosphatpuffer von etwa pH 7,5 oder ein Alkalihalogenid, z. B. NaCl, in steigender Konzentration.

Die im Eluat vorhandenen anorganischen Ione kann man mit Molekularsieben entfernen, z. B. durch Dialyse oder durch Kontakt mit einer Substanz, wie das schon obenerwähnte Sephadex G50. Katione kann man entfernen mit einem vernetzten Kationenaustauschharz Amberlite IR 120.

Beispiel 1 a) Herstellung von Leberpaste.

8 kg frische Ochsenleber werden fein zerhackt, 16 Liter Wasser und 108 g Phenol zugegeben, letzteres, um die bakterielle Verunreinigung zu vermeiden. Die Mischung wird 2 Stunden gerührt, 1/2 Stunde unter Rühren auf 100 0C erhitzt und bis zum nächsten Tag bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Sie wird dann auf 70 "C erhitzt und filtriert. Den Rückstand wäscht man mit Wasser, das 0,5 O/o Phenol enthält. Das vereinigte Filtrat (17,8 Liter) enthält 2,8 g trockenen Feststoff pro 100ml. Die Lösung wird dann im Vakuum bei o0-70 OC zu einer gelben Paste konzentriert, die 760 g wiegt und 65 o/o trockenen Feststoff enthält.

Diese Paste setzt man zu 3,4 Litern 75 /0igem Äthanol zu und rührt das Gemisch 6 Stunden bei Zimmertemperatur. Am nächsten Tag wird der Niederschlag abfiltriert und mit 70 0/oigem Äthanol gewaschen. Das vereinigte äthanolische Filtrat (4,6 Liter) enthält 266 g trockenen Feststoff.

Dieser wird im Vakuum bei 30 40 "C zu 375 g einer bräunlichschwarzen Paste konzentriert, die 71 O/o trockenen Feststoff enthält. b) Adsorption auf Asbest.

800 g Leberpaste werden in 2,8 Litern frisch destilliertem Wasser, das 0,3 Oio Trikresol enthält, gelöst. Die Lösung, die einen pH-Wert von 40,9 hat, wird zu 11,2 g Asbestpulver zugesetzt. Man rührt die Mischung 24 Stunden bei Zimmertemperatur und lässt sie weitere 24 Stunden ohne Rühren stehen. Der Asbest wird mit Wasser gewaschen, das 0,3 0/0 Trikresol enthält. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden in gleicher Weise mit weiteren 11,2 g Asbest behandelt. Der gewaschene Asbest wird im Vakuum über piOs getrocknet und wiegt 25,2 g. Der Asbest wird in einem einzigen Arbeitsgang mit flüssigem 1000/oigem Phenol bei 50-60 OC eluiert, zuerst mit 200 g, dann mit 100 g und schliesslich mit 200 g.

Die vereinigten Eluate werden zur fünffachen Menge ihres Gewichts von Äther zugefügt, der Niederschlag abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das braune Material ist in Wasser nicht vollständig löslich, aber die Zugabe von 0,ln NaOh auf pH 7,5 bringt das ungelöste Material ebenfalls in Lösung.

Der Asbest wird zwecks Entfernung des Phenols mit Äther gewaschen und darauf mit 200 ml nNH5 eluiert.

Das Eluat wird im Vakuum konzentriert, worauf ein Niederschlag anfällt. Die überstehende Flüssigkeit wird für weitere Arbeitsgänge verwendet.

Sowohl die Phenoleluatfraktion als auch die Ammoniakeluatfraktion werden in Sephadex G50-Säulen (2,8 cm Durchmesser, 32,5 cm Höhe) weiter gereinigt und die hochmolekulare Fraktion in jedem Fall gesammelt. Die beiden gereinigten Fraktionen (12 mg aus der Phenolfraktion und 18 mg aus der Ammoniakfraktion) sind weder pyrogen im Kaninchen noch antigen im Menschen, schützen Mäuse gegen E. coli-Infektion und Hühnerembryos gegen den Vaccinia-Virus.

Der biologisch wirksame Faktor wird so durch 100 zeigen Phenol und n-Ammoniak eluiert. Es wurde auch gefunden, dass er aus dem Asbest mit 0,ln NaOH eluiert wird. Die aktive Fraktionen entwickeln in Wasser eine bläulich-grüne Fluoreszenz und liefern mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag.

Beispiel 2
0,5 Liter menschliches Blut werden 30 Minuten auf 100 "C erhitzt und 500 ml einer 0,3 gew.0/oigen wässrigen Lösung von Trikresol zugegeben. Das Gemisch wird filtriert, darauf 20 ml einer 20 gew.0/oigen wässrigen Lösung von Sulfosalicylsäure zum Filtrat zugefügt und das Ganze nochmals filtriert. Darauf setzt man 1,84 g Asbest zum Filtrat zu und lässt 2 Tage bei Zimmertemperatur stehen. Der Asbest wird aus der flüssigen Phase durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 90 g100 O/o- igem Phenol bei 60 OC eluiert, 450 mol äther zu dem Phenoleluat zugesetzt und der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Der erhaltene Feststoff wird nochmals in Wasser gelöst und der pH-Wert mit wässrigem Atznatron auf 7 eingestellt.

Die erhaltene Lösung hat ähnliche Eigenschaften wie diejenige des Beispiels 1.

Beispiel 3 a) Herstellung der Sephadex-Säule.

Sephadex G 50 (A.B.Pharmacia, Uppsala) wird in 0,05 n Natriumchlorid suspendiert und die Mischung 30 Minuten gerührt. Nach 10-15 Minuten Absetzzeit wird die überstehende Flüssigkeit mit den feineren Partikeln abdekantiert. Nach dem Ersetzen der überstehenden Flüssigkeit durch frisches 0,05n-Natriumchlorid wird der ganze Prozess viermal wiederholt. Das Sephadex wird dann unter Rühren unter eigenem Gewicht in eine Kolonne gepackt, die einen Durchmesser von 45 cm und eine Höhe von 30 cm hat. Die Säule wird bei 4 "C mit frisch destilliertem Wasser gewaschen, bis sie frei von Cl-Ionen ist. b) Fraktionierung der hochmolekularen Fraktion aus dem wässrigen Leberpräparat.

Ein aus 6 kg frischer Leber hergestellter Extrakt wird in üblicher Weise aus frischer Rinderleber durch Proteolyse mit Papain, Niederschlagen des Proteolysats mit Alkohol, teilweise Verdampfung des Filtrats und Extraktion der konzentrierten Lösung mit Wasser gesättigtem Phenol, Verdünnen des Phenolextrakts mit Äther und Extraktion des Phenol-Äther-Gemisches mit Wasser gewonnen. Zu 600 ml dieses wässrigen Extrakts gibt man eine 5 0/obige Kaliumhydroxydlösung, um den pH Wert auf 8,2 zu bringen. Dann setzt man 7, 32 g Bariumacetat Ba (CH3CO2) o. H2O zu und lässt die Lösung über Nacht bei 0 "C stehen. Eine kleine Menge des gebildeten Niederschlags wird durch Zentrifugieren entfernt.

Zu der überstehenden Flüssigkeit gibt man 2,8 Liter 96 zeigen Alkohol und zentrifugiert den gebildeten Niederschlag am nächsten Tag aus der Lösung, wäscht ihn mit Alkohol und dann mit Äther, und trocknet ihn.

Der Niederschlag wiegt 10,95 g.

Den Niederschlag löst man in 500 ml Wasser und lässt dann die Lösung durch eine Säule tropfen, die
140 ml saures Ionenaustauschharz enthält. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, bis die durchtropfende Lösung einen pH-Wert von etwa 5,5-6 hat und farblos ist. Zu der Lösung gibt man dann 2 n NaOH, um den pH-Wert auf 6,5 zu bringen. Sie wird unter Vakuum konzentriert und schliesslich gefriergetrocknet. Das Produkt wiegt im trockenen Zustand 2,8 g.

0,5 g des Produkts (äquivalent 1 kg frischer Leber) werden in 50 ml Wasser gelöst. Zu der Lösung, die einen PH-Wert von 6,6 hat gibt man 1,5 g Kohle, die vorher mit Wasser und dann mit Alkohol gewaschen war. Nach 19stündigem Stehenlassen wird die Kohle aus der Lösung abfiltriert und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat farblos ist. Die gesammelten Filtrate werden unter Vakuum konzentriert und wiegen nach Gefriertrocknen 0,250 g.

10 g dieses gefriergetrockneten Stoffes werden in 40 ml Wasser gelöst und durch eine Säule geleitet, die danach mit Wasser gewaschen wird. 70 ml wertloser Stoff werden verworfen, die folgenden 200 ml, die eine leicht bräunliche Farbe haben und die das hochmolekulare Material enthalten, werden gesammelt und im Vakuum im gefrorenen Zustand zur Trocknen eingedampft. Die Fraktion wiegt 150 mg. Der grösste Teil des dunkelgefärbten Stoffes in dem Leberpräparat sinkt sehr langsam durch die Säule und hat daher ein niedriges Molekulargewicht. In Wasser entwickelt die wirksame Fraktion eine bläulich-grüne Fluoreszenz und liefert mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag.

Verdünnung erhaltene hochmol des Vaccins Fraktion c) Antigenität.

Die hochmolekulare wirksame Fraktion zeigt keine antigene Reaktion, wie durch einen Hauttest festgestellt wurde, wenn sie in Menschen in einer Dosis von 01 mg injiziert wird. d) Schutz gegen E.coli-Infektion in Mäusen.

Die hochmolekulare wirksame Fraktion liefert einen
Schutz, wie die nachfolgenden Zahlen zeigen.

Bakterielle Infektionsdosis: 1, 25 x 108 Organismen pro Maus. 0,1 mg, gelöst in 0,3 O/o igem Trikresolwasser, der hochmolekularen Fraktion werden intramuskulär in die Maus injiziert. Einer Gruppe von 6 Mäusen wird eine hochmolekulare Fraktion drei Stunden vor der bakteriellen Infektion und einer anderen Gruppe 6 Stunden vor der Infektion einverleibt. Ferner wurden 6 nur infizierte Mäuse als Vergleich verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten.

Überlebende/total Mäuse
Vergleich 0/6
3 Stunden vor der Infektion 3/6
6 Stunden vor der Infektion 2/6
Bei einem zweiten Versuch war die Infektionsdosis 3.5 x 108 Organismen pro Maus. Die Dosis der hochmolekularen, intramuskulär injizierten Fraktion war 0,2 mg. (gelöst in 0,1 ml Salzlösung). Sonst wurde der Versuch wie oben beschrieben ausgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: tJberlebende/total Mäuse
Vergleich 0/6
3 Stunden vor der Infektion 4/6
6 Stunden vor der Infektion 3/6 e) Schutz gegen den Vaccinia-Virus.

Die hochmolekulare Fraktion schützt Hühnerembryos in einer Dosis von 2,55ug gegen Vaccinia Infektion. Die in Wasser gelöste hochmolekulare Fraktion wird in die chorioallantone Membrane in 10-11 Tage alten Hühnerembryos eingeführt. Nach 24 Stunden werden die Embryos mit dem Vaccinia-Virus infiziert.

Die Embryos werden darauf 5 Tage bebrütet. Die Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich: are Vergleich 10-6 einige getrennte Kolonien zahlreiche Kolonien
5 lebend

Beispiel 5
Fraktionierung auf ECTEOLA.

Leberpase, die 0,4 g trockenem Feststoff entspricht, wird in 25 ml 0,01 n NH4HCO3 gelöst. Durch Zugabe von starkem Ammoniak wird der pH-Wert auf 8,5 eingestellt. Die Lösung leitet man durch eine Säule von ECTEOLA von 1,5 cm Durchmesser und 5 cm Höhe, die vorher mit 0,0 in NH4HCO3-Puffer auf pH 8,5 eingestellt wurde. Nichtabsorbierter Stoff wird mittels 30ml 0,01 n NHlHCO3 - Puffer bei pH 8,5 ausgewaschen. Die Säule wird dann mit n-NH4HCO3 eluiert, wodurch die biologische Wirksamkeit entwickelt wird. Die gleiche Wirksamkeit kann auch bei einer Säule mit NaOH oder wässrigem Ammoniak entwickelt werden.

Im Falle der NaOH-Eluierung wird der pH-Wert durch Zugabe von HC1 auf 7 gebracht. NaCi und NHaHCOs können durch Behandlung mit Sephadex G50 entfernt werden.

Beispiel 6
Fraktionierung auf ECTEOLA a) Behandlung des ECTEOLA vor Verwendung.

5 g ECTEOLA werden bei Zimmertemperatur 2-3 Stunden mit 100 ml n.NaOH stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert, weitere 100 ml Natriumhydroxyd zugegeben und die Mischung eine Stunde stehen gelassen. Darauf wird der Stoff in eine Säule von 1,5 cm x 7 cm gegossen und das Natriumhydroxyd mit Wasser ausgewaschen. Die Säule wird dann mit 0,005 n NaHCO3-CO-Puffer auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. b) 25 mg der hochmolekularen Fraktion aus der Sephadex-Säule, die gemäss Beispiel 3 aus einer nieder geschlagenen Leberfraktion hergestellt wurden, werden in 10 ml 0,005 n NaHCO3-CO2-Puffer vom pH 6,8 gelöst und durch die Säule geleitet. Letztere wird mit Puffer gewaschen, mit 2 n NH3 und darauf mit 0,5 n NaOH gewaschen, um die wirksame Fraktion zu entfernen.

Die Lösung wird dann mit Amberlite IR 120 (H) behandelt, bis ein pH-Wert von 6,0 erhalten wird. Man gefriertrocknet die Lösung und erhält 24 mg, wovon ein Teil Natriumbicarbonat ist, das durch weitere Behandlung mit Sephadex entfernt werden kann.

Beispiel 7
Es wird eine Kolonne von 5 cm x 1 cm von ECTEOLA, die wie in Beispiel 6a beschrieben hergestellt ist, verwendet. 12,5 mg Material, das durch Behandlung von Leberpaste mit Asbest, Eluierung mit NaOH, Neutralisation mit HC1 und Entfernen von NaC1 auf Sephadex erhalten wurde, werden in 10 ml 0,005 n NaHCO3-CO2-Puffer vom pH-Wert 6,7 gelöst und durch die Säule geleitet. Diese wird mit dem Puffer gewaschen und dann mit 40 ml 0,1 in NaOH erluiert. Man erhält eine Fraktion, die eine gelbe Fluoreszenz aufweist. NaOH wird durch Zugabe vom Amberlite IR 120 (H) entfernt, bis der pH-Wert 7,0 erreicht hat, und die Lösung dann gefriergetrocknet.

Der trockene Feststoff wiegt 10 mg, wovon ein Teil aHCO8 ist.

Beispiel 8
Zu 50 Litern gerührtem Ochsenblut werden 150 ml Trikresol zugesetzt und die Mischung 2 t/2 Stunden bei 90 C unter Rückfluss erhitzt. Dann werden 82 Liter 96 0/obiger Äthanol zu der heissen Lösung zugesetzt uncf eine Stunde ohne Erhitzen gerührt. Die Mischung wird über Nacht auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen, filtriert und liefert 80 Liter Filtrat. Daraufhin gibt man 43 Liter Wasser zu und zu der Mischung eine wässrige Lösung von 20 0/obiger Sulfosalicylsäure, bis ein pH-Wert von 1 erreicht ist. Der Niederschlag wird verworfen und der pH-Wert des Filtrats mit 300/obiger NaOH auf 8-8,3 eingestellt. 0,25 kg (NE42SOo pro Liter setzt man der Lösung unter Rühren zu.

Nach Stehen scheidet sich die Mischung in zwei Schichten. Die obere, alkoholische Schicht wird entfernt und im Vakuum auf 5 Liter konzentriert und dann über Nacht dialysiert. Durch Zugabe von NaOH wird ein pH-Wert von 7,5-8 eingestellt, die Lösung filtriert und im Vakuum auf 450 ml konzentriert.

Eine Säule von Sephadex G50 (9,2 cm Durchmesser x 95 cm Höhe) wird mit 0,01n NaOH ins Gleichgewicht gebracht, worauf man 250 ml des obigen Konzentrats, das mittels 300/obiger NaOH auf einen pH-Wert von 11-12 eingestellt wurde, in die Säule gibt. 0,0 in NaOH wird als Eluierungsmittel verwendet 1 Liter des Eluats (wertloser Teil) wird verworfen und die nachfolgenden 1,46 Liter gesammelt. Diese Lösung enthält das hochmolekulare Material und liefert mit Phosphorwolfram- säure einen Niederschlag. Die Lösung wird durch Zugabe vom Amberlite IR 120 H (Kationenaustauschharz in der Wasserstofform) neutralisiert, das Harz durch Filtrieren entfernt und das Filtrat gefriergetrocknet. Die Ausbeute schwankt zwischen 0,05 g und 0,1 g pro Liter Blut.

Beispiel 9
20 kg feinzerhacke Ochsenleber werden unter Rühren bei 90 "C mit 50 Litern Wasser erhitzt. Phenol wird bis zu einer Endkonzentration von 0,5 o/o zugesetzt, die Mischung über Nacht stehen gelassen und das Filtrat im Vakuum auf 3 Liter konzentriert. Darauf setzt man 5,3 Liter 96-0/oigen Äthanol zu und lässt das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen. Das Filtrat konzentriert man im Vakuum auf 2,6 Liter und setzt, um eine bakterielle Verunreinigung zu vermeiden, 8,4 ml Trikresol zu.

Zu 500 ml der Lösung werden 750 ml einer Lösung von gesättigtem (nu4) 2SO4 zugegeben und der Niederschlag sich bei Zimmertemperatur über Nacht absetzen gelassen. Den Niederschlag wäscht man mit gesättigtem (NH4) 2SO4 und löst ihn in Wasser durch Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 mit NaOH. Man dialysiert die Lösung, wodurch einiges farbiges Material entfernt wird. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet und liefert 1,53 g. Biologische Wirksamkeit.

Die in diesen Beispielen beschriebenen Produkte zeigen eine Wirksamkeit gegen Vaccinia-Viren in der Kaninchenhaut und verhindern Mitosis in HeLA Zellen in Pucks-Medium.

Beispiel 10
Fraktionierung des Materials auf Sephadex G50 in 0,1n NaCl.

Die Lösung enthält 0,3 /o Trikresol, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern.

0,22 g Material werden in 10 ml Wasser gelöst und 4 ml 20-0/oige Sulfosalicylsäure zugesetzt. Das Filtrat wird mit NaOH bis auf einen pH-Wert von 7,5neutralisiert, auf eine Sephadex G50-Säule (35 cm hoch und 3,5 cm Durchmesser) gegeben und mit 0,1n NaCl, das 0,3 o/O Trikresol enthält, ins Gleichgewicht gebracht. Die Säule eluiert man mit letzterer Lösung. Die ersten 95 ml Eluat werden verworfen. Die nächsten 130 ml, die das hochmolekulare Material enthalten, werden gesammelt, dialysiert und gefriergetrocknet. Ausbeute 80 mg.

Beispiel 11
Eine Diäthylaminoäthylcellulose(DEAE)-Säule von
7 cm Höhe und 2,8 cm Durchmesser wird mit 0,005 n
Phosphatpuffer pH 7,5 ins Gleichgewicht gebracht. Man löst 200 mg Material (aus Blut) in 40 ml Puffer und leitet alles durch die Säule. Letztere wird danach mit
Puffer gewaschen, mit 0,005 n Phosphatpuffer pH 7,5, der 0,08n NaCl enthält, mit 0,05n Phosphatpuffer enthaltend 0, in NaCI und mit O,ln Phosphatpuffer pH
7,5 enthaltend 0,5n NaCl eluiert. Die drei Fraktionen werden dialysiert und gefriergetrocknet. Die erste Frak tion liefert 22 mg, die zweite 55 mg und die dritte 55 mg.

Alle Fraktionen entwickeln eine biologische Wirksam keit.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung einer proteinfreien, was serlöslichen, im UV-Licht grün fluoreszierenden, pyro gen- und antigenfreien Polypeptidfraktion unspezifischer Immunisierungswirkung mit einem Molekulargewicht von wenigstens 1000, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer wässrigen Suspension oder einem wässrigen Extrakt von Säugetierorganen oder Säugetierblut durch Erhitzen bis zur Koagulation die P. q. ypetitde von den mit ihnen chemisch verbundenen r, ruteinen freilegt und die vom Koagulat abgetrennte, e freigelegten Polypeptide enthaltende wässrige Lösung einer Molekularfraktionie- rung untenvirft.

tNTERANSPRtYCHE 1 Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass man die Molekularfraktionierung durch Adsorption des aktiven Polypeptides und darauffolgende Eluierung mit einer sauren oder basischen Flüssigkeit oder einer Lösung mit hoher Elektrolytkonzentration bewerkstelligt.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass die wässrige Lösung vor der Molekular- fraktionierung zur Entfernung von weiteren unerwünsch ten Proteinen mittels Sulfosalizylsäure behandelt wird.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass die Fraktionierung durch Inberührung bringen der wässsrigen Lösung mit einem Molekularsieb, insbesondere einem mit Äthylenoxyd vernetzten Dex tran, ausgeführt wird, das undurchlässig für Moleküle mit einem Molekulargewischt grösser al 1000 ist, wobei diese Moleküle von Substanzen mit niedrigerem Moleku largewicht getrennt werden.

4. Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch ge kennzeichnet, dass das vernetzte Dextran vor der Frak tionierung mit einer wässrigen Lösung eines Alkalime tallsalzes behandelt wird und die Anionen des Salzes durch Waschen entfernt werden.

5. Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch ge kennzeichnet, dass die gewünschte Polyp eptidfraktion vom vernetzten Dextran mit einer alkalischen Lösung eluiert wird.

6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass die vom Koagulat befreite, wässrige Polypeptidlösung durch Proteinfällungsmittel z. B. Am monsulfat, Ammonchlorid oder Phosporwolframsäure, einer fraktionierten Fällung unterworfen wird.