NO146818B - Fremgangsmaate for aa danne kanaler med hoey fluidumledningsevne i en formasjon rundt et borehull - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid-materiale med ikke-spesifikk immunitetsvirkning.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av et nytt produkt til anvendelse i medisinen for å fremkalle ikke-spisfikk immunitet. •Det er funnet at et produkt kan iso-leres fra ekstrakter av dyreorganer som er i besittelse av den egenskap at de kan fremkalle ikke-spesifikk immunitet, og da de er i alt vesentlig pyrogenfrie og ikke-antigene, kan de administreres f. eks. ved injisering uten merkbar vevreaksjon. Ut-trykket ikke- spesifikk immunitet er anvendt i sin generelt antatte betydning, for å omfatte ikke bare motstandsevne mot både bakterie- og virusinfeksjon, men og-så immunitet mot sjokk, f. eks. kuldesjokk, traumatisk sjokk, endotoksisk sjokk osv. Det er også funnet at produktet er i besittelse av antimitotiske egenskaper mot visse celler, f. eks. Hela- og Chang-celler.

Kjemisk er produktet et polypeptid eller blanding av polypeptider, dette uttrykk anvendes i sin omfattende betydning for å definere stoffer som har basisk polypep-tidstruktur uansett om det også er til stede andre grupper som f. eks. carbohydrater. Ved hydrolyse gir det en rekke aminosyrer og stoffer som gir sakaridreaksjoner. De aminosyrer som kan påvises er glutaminsyre og asparginsyre, arginin, lysin, alanin, serin, valin, leucin, iso-leucin, glycin, fe-nylalanin, histidin, prolin, tyrosin og thre-onin. Produktet gir en positiv biuretreak-sjon, en positiv anthronreaksjon, noe som tyder på at det er til stede hexoser, og en positiv indikasjon på hexosaminer ved en modifisert Elson-Morgan-reaksjon (L. Svennerholm, Uppsala Låkare-fbrenings Forhandlingar, 61, (1956), 287: reagent p-dimethylamino-benzaldehyde in acetyl acetone).

Produktet gir vanligvis en sur reaksjon, med isoelektrisk punkt i området pH 4—5; aminosyrene glutaminsyre og asparginsyre er til stede i molekylet i betrakte-lige mengder og er sannsynligvis årsaken til denne surhet. Nøytrale, aktive polypeptider kan også være til stede.

Molekylvekten av den aktive faktor er minst 1000, og det foretrekkes produkter i hvilke det i alt vesentlig ikke er noe materiale igjen fra dyreorgan-ekstraktet, som har en molekylvekt på mindre enn 8000; generelt inneholder de foretrukne produkter ikke materiale med molekylvekt mindre enn 10 000.

Produktet er i alt vesentlig uten inn-hold av fosfor, noe som tyder på at det nesten ikke er til stede nucleinsyrefor-urensninger, og inneholder 13—15 pst. ni-trogen. Det utfelles ved hjelp av fosforwolframsyre, men ikke ved hjelp av sulfosalicylsyre, og er oppløselig i vann, syrer og baser, f. eks. flytende fenol, 10 pst. natriumhydroxyd osv. oppløselig i 70 pst. vandig ethanol, svakt oppløselig i 96 pst. ethanol og uoppløselig i ether, kloroform og petrolether.

Produktet er varmestabilt opp til minst 100° C, og det er kjent at det har mot-stått oppvarmning ved 100° C i vann i y2 time. I oppløsning i vandige medier oppviser produktet en grønnaktig fluorescens som varierer fra gul-grønn til blå-grønn alt etter renheten.

Som angitt ovenfor er produktet i alt vesentlig ikke-pyrogent og oppviser i alt vesentlig ingen antigen aktivitet. Ved injisering frembringer det immunitet mot koppevirus, E. coli og betraktelig antall andre bakterier og viruser, og er også effektivt til å frembringe motstandsevne mot vanlig forkjølelsesvirus, f. eks. ved at det sprøytes direkte inn i neseslimhinnen.

Det nye produkt fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan administreres i for-bindelse med ett eller flere farmasøytiske bæremidler. Arten av det bæremiddel eller de bæremidler som anvendes, vil være av-hengig av den type preparat man ønsker. Preparatene kan hensiktmessig være i form av doseenheter som hver fordelaktig inneholder 5 til 20 mg av det aktive polypetid. Generelt kan preparatet fremstilles for parenteral administrering, i hvilket tilfelle bæremidlet må være en parenteral akseptabel væske, så som sterilt, pyrogen-fritt vann, eller for oraladministrering, hvor ibæremidlene kan omfatte vann, sam-men med ett eller flere smaksstoffer, pre-serveringsmidler, dispergeringsmidler, far-gemidler, søtstoffer og lignende. Preparatene kan også være i form av faste prepa-rater, f. eks. tabletter som inneholder den aktive faktor. Ved en foretrukken fremgangsmåte lyofiliseres den oppløsning man får til slutt, oppløses på nytt i sterilt, pyro-genfritt vann, og steriliseres ved hjelp av gjennomføring gjennom egnede, sintrede glassfiltre.

Den aktive faktor kan også fremstilles for topisk administrering, f. eks. fra vandig oppløsning som en dusj (spray), som også kan inneholde et preserveringsmiddel så som ethanol eller methyl- eller ethyl-p-hydroxybenzoat.

Dusj oppløsningen kan f. eks. inneholde 0,01 til 10 vektprosent, fortrinnsvis 0,05 til 0,5 vektprosent av det aktive materiale.

Det aktive polypeptid-materiale kan fremstilles i henhold til oppfinnelsen fra vandige ekstrakter av dyreorganer ved fraksjoneringsprosesser, idet man benytter seg av foreliggende oppdagelse at materialet er av høy molekylvekt.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en fremgangsmåte til fremstilling av polypeptid-materiale som har en ikke-spesifikk immunitetsvirkning, bestående i at et vandig dyreorganekstrakt utsettes for fraksjonering for å atskille materiale med høy molekylvekt fra materiale med lav molekylvekt, og derved utvinnes en polypetid-fraksjon som har en molekylvekt på minst 1000.

Det aktive produkte i henhold til oppfinnelsen kan utvinnes fra blod eller for-skjellige dyreorganer, foretrukne eksempler omfatter lever, nyre og milt.

Det vandige organekstrakt som anvendes for foreliggende oppfinnelse, kan f. eks. bare være et vandig ekstrakt av dette or-gan, f. eks. frisk okselever, men det er hensiktsmessig å utsette ekstraktet for ytterligere behandling, hovedsakelig for å fjerne uønsket protein. Oppvarmning av ekstraktet til 90—100° C må foretas, og således f. eks. når det gjelder lever, kan leve-ren finhakkes, og deretter oppvarmes med vann under omrøring ved 100° C og væsken kan atskilles og konsentreres for å få utfelt fast materiale som inneholder den aktive faktor. Den således erholdte pasta kan også eventuelt ekstraheres med alkohol og oppløsningsmidlet kan fjernes, f.

eks. ved destillasjon i vakuum. Det er også

mulig å utfelle uønsket materiale med alkohol, eller å ekstrahere den vandige opp-løsning med fenol, fulgt av utvinning av det aktive materiale f. eks. ved ether-ut-felning.

Vandige ekstrakter av andre faste or-ganer kan fremstilles på lignende måte.

Når det gjelder blod, kan dette oppvarmes for å koagulere det tilstedeværen-de protein, og filtreres. Et selektivt protein-fellemiddel, f. eks. sulfosalicylsyre, kan tilsettes til filtratet for å fjerne gjenvær-ende protein, og blandingen filtreres på nytt. Den resulterende væske er egnet til anvendelse ved foreliggende fremgangsmåte.

Det er også mulig å utsette organ-ekstraktet for ytterligere for-behandling ved å utfelle det aktive materiale ved pH 5 til 10 med et vannoppløselig, flerverdig metallsalt i nærvær av en alkohol som er blandbar med vann. Det vandige organekstrakt, eventuelt etter de ovenfor an-gitte rensningstrinn, kan således behandles med calcium-, barium- eller blyacetat, sink- eller magnesiumklorid osv. i nærvær av ethanol for å utfelle det aktive polypeptid, og metallionene kan deretter fjernes, f. eks. ved å utskille bunnfallet så som ved filtrering, sentrifugering osv., gjen-oppløse dette i vann og føre oppløsningen c gjennom en sur ionebytter-harpiks. Alter- i nativt kan et uoppløselig salt av metallet

utfelles, f. eks. barium kan utfelles som t bariumsulfat med svovelsyre. r

Etter fjerning av metallionene kan be- r handlingen med det flerverdige metallsalt k og alkohol hensiktmessig etterfølges av be- 1 handling med en basisk ionebytter-harpiks for å adsorbere det aktive polypeptid. Ut- p trekning kan utføres med svakt alkaliske r oppløsninger. Denne fremgangsmåte kan p også eventuelt utføres før eller etter frak- r sjonering i henhold til oppfinnelsen. r

En særlig hensiktsmessig fremgangs- f måte til fraksjonering i henhold til opp- c' finnelsen er å bringe ekstraktet i kontakt p med et adsorbsjonsmiddel som tjener til å I adsorbere høymolekylvekt-materiale for å t adsorbere det aktive polypeptid-materialet, c fulgt av uttrekning med en væske utvalgt r fra gruppen bestående av basiske og sure r væsker og oppløsning med høy elektrolyt- t konsentrasjon.

Adsorbsjonsmidler som har en tendens r til fortrinnsvis å adsorbere høymolekyl- r vekt-materialer, er velkjent. Slike stoffer t er vanligvis uorganiske stoffer så som s komplekssilikater som f. eks. bentonit, t montmorrilonit, celit osv. Det er imidlertid funnet at asbest er et særlig effektivt ad- a sorbsjonsmiddel, og foretrekkes av denne grunn. pH-verdien for ekstraktet under ad- s sorberingen er fortrinnsvis mellom 4 og 7, ( hensiktsmessig ca. 5—6. Adsorbsjonen kan r finne sted ved romtemperatur eller ved a høyere eller ved lavere temperaturer. Det a aktive polypeptid synes å være stabilt opp

til minst 100° C. t

Uttrekning av det aktive polypeptid c kan utføres med en basisk eller sur væske i eller en oppløsning med høy elektrolyt- e konsentrasjon. Hvis det anvendes en sur t væske, kan denne være en flytende, svak d syre, f. eks. flytende fenol. Vandige syrer fc kan også anvendes, fortrinnsvis vandige f oppløsninger av svake syrer så som eddik- r. syre eller maursyre som har en pH på min- L dre enn 4. Basiske væsker som er egnet for o uttrekning, omfatter vandig alkali så som r vandig kaustisk soda med f. eks. 0,1 nor- g mal styrke og vandig ammoniakk av 1- n normal styrke. Det er ofte hensiktsmessig e å vaske adsorbatet med fenol, og deretter, s etter utvasking av fenolen, å utføre ut- r trekningen med den vandige alkali. Når r uttrekningsvæsken skal være vannfri, f. h eks. 100 pst. fenol, tørkes asbesten for- f trinnsvis før uttrekning, f. eks. over P20,. e Oppløsninger med høy elektrolytkonsen-trasjon som kan anvendes for uttrekning, g

imfatter vandige saltoppløsninger, så som

-molar vandig NaCl.

Det vandige organpreparat er for-rinnsvis i en forholdsvis konsentrert form lår det 'bringes i kontakt med adsorbsj ons-nidlet i henhold til oppfinnelsen, f. eks. en Lonsentrasjon på ca. 25 gram tørrstoff/ 00 ml.

Det er også funnet at da det ønskede lolypetid har høy molekylvekt, øyensynlig ninst 8000, og således ikke i stand til å lassere igjennom eller inn i molekylsikt-naterialer som er ugjennomtrengelige for nolekyler av denne størrelse eller større,

. eks. et fornettet dextranderivat så som lextran fornettet med ethylenoxyd (f. eks. iroduktet Sephadex G50, solgt av A. B. 'harmacia i Uppsala), som er ugjennom-rengelig for molekyler med molekylvekt iver 8000 til 10 000, er det mulig å fraksjo-iere lavmolekylvekt-forurensninger fra nateriale som inneholder den aktive fak-or ved hjelp av molekylsikt-teknikk, f. eks. red å føre en vandig oppløsning av mate-ialet gjennom en fornettet dextrankolon-ie eller ved dialyse, elektrodialyse eller ul-raf iltrering gj ennom membraner med egnet truktur. Anvendelsen av dextranproduk-er eller molekylsikt-materialer er beskre-ret av Per Flodin i «Dextran gels and their ipplication in gel filtration» Uppsala 1962. ^.ndre molekylsikt-materialer omfatter vis-e fornettede galacto-mannan-produkter Deuel et al — Advances in Chémistry Se-les 1954, 11, 51) og kopolymerer av acryl-imid og methylen-bis-acrylamid (Canadi-m Journal of Chémistry 1962, 40, 159). Det skal legges merke til at med ut-rykket høymolekylvekt-materiale slik som Lette er anvendt her, menes materiale som iar en molekylvekt av størrelsesorden 8000 iller mer, f. eks. ikke under 10 000. Med ut-rykket lavmolekylvekt-materiale slik som let er anvendt her, menes materiale som iar en molekylvekt lavere enn ca. 8000, . eks. under 5000. Selvsagt vil det være lensiktsmessig å fjerne alt det uønskede avmolekylvekt-materialet som er til stede, ig det oppnåes en gunstig virkning selv ned molekylsikter som er ugjennomtren-;elige for molekyler med betraktelig lavere nolekylvekt, f. eks. 1000. For å oppnå så ffektiv atskillelse som mulig, bør molekyl-ikt-materialet imidlertid fortrinnsvis væ-e gjennomtrengelig for molekyler med nolekylvekt på ca. 8000 mens det samtidig tolder tilbake det aktive materialet, og ornettede dextraner som omtalt ovenfor, r særlig effektive.

En ytterligere hensiktsmessig frem-angsmåte til fraksjonering i henhold til oppfinnelsen er således å bringe det vandige ekstrakt i kontakt med et molekylsikt-materiale som er ugjennomtrengelig for molekyler med molekylvekt over 1000, for å atskille molekyler fra stoffer med lavere molekylvekt.

Fornettede dextraner og beslektede molekylsikt-materialer som anvendes i partikkelform ved adsorpsjon av lavmolekylvekt-materiale i deres partikler, anvendes fortrinnsvis i kolonner under anvendelse av kromatografiteknikk. I slike kolonner forblir det aktive polypeptid i væsken som beveger seg nedover i rommet mellom par-tiklene, og som passerer raskt gjennom kolonnen. Kolonnen kan vaskes med vann for å vaske det aktive polypeptid gjennom, og selv om lavmolekylvekt-materialet vil uttrekkes langsomt ved denne prosess, kan det aktive materialet vanligvis fjernes før det uønskede materialet begynner å forlate kolonnen. Generelt kan det aktive polypeptid-materialet påvises ved hjelp av egnede biologiske prøver av fraksjoner uttrukket fra kolonnen,, idet lavmolekylvekt-forurensninger vanligvis er forbundet med brune eller gule stoffer, og bevegelsen av disse stoffer kan følges med øynene.

Molekylsikt-fraksjoneringen i henhold til oppfinnelsen kan utføres ved lav tem-peratur, f. eks. -f- 4° C, for å unngå bak-terievekst. Ved høyere temperaturer er det tilrådelig å inkludere et antibakterielt stoff så som fenol, cresol osv.

Ved fremstilling av den fornettede dextrankolonne, røres det partikkelforme-de materialet fortrinnsvis én eller flere ganger med vandig natriumklorid, f. eks. 0,05N, og vaskes til slutt med vann for å fjerne kloridionene.

Det vandige, organiske ekstrakt som tilføres kolonnen, inneholder fortrinnsvis en elektrolyt, f. eks. et nøytralt salt så som natriumklorid; da det aktive materialet ofte er av sur karakter, kan elektrolyten også være et alkali f. eks. kaustisk soda. Konsenerasjonen av elektrolyten kan vari-ere fra 0,05N til 0,5N, f. eks. 0,1N NaCl eller 0,01N NaOH. Den aktive faktor kan og-så med fordel vaskes gjennom den fornettede dextrankolonne med en alkalisk opp-løsning istedenfor vann, og en 0,05—0,5N-oppløsning, f. eks. en 0,lN-oppløsning av kaustisk soda, er meget tilfredsstillende. Den resulterende oppløsning kan nøytra-liseres ved behandling med en kationebyt-ter-harpiks i hydrogenform f. eks. Amberlite IR20.

En ytterligere hensiktsmessig fremgangsmåte til fraksjonering er utfelling av det ønskede polypeptid-materialet med et inert proteinfellemiddel, d.v.s. et som ikke ødelegger eller skader protein- eller poly-peptidmaterialer, men (bare utfeller disse fra oppløsning.

Proteinfellemidlet kan tilsettes som et fast stoff, så som en vannoppløselig, uorganisk substans, f. eks. et salt så som ammoniumsulfat, ammoniumklorid osv., eller fosforwolframsyre, eller det kan være en væske, f. eks. en konsentrert oppløsning av slike substanser.

Det høymolekylvekt-materialet som inneholder det aktive polypeptid, kan utfelles fra det vandige ekstrakt og atskilles, f. eks. ved filtrering, sentrifugering osv., eller det kan bringes til oppløsning i en separat organisk fase. Den organiske fase kan være en ikke-vannblandbar væske eller, fortrinnsvis, en polar væske som vanligvis er blandbar med vann, men som dan-ner en separat fase når den vandige fase inneholder store mengder oppløst materiale, slik som tilfelle er når det anvendes et uorganisk salt som fellemiddel. Slike polare oppløsningsmidler har en høyere opp-løselighet for faktoren enn ikke-polare oppløsningsmidler.

Ved en hensiktmessig utførelsesform for den foreliggende oppfinnelse, tilsettes fellemidlet til en vandig oppløsning som inneholder det aktive polypeptid og et vannblandbart oppløsningsmiddel, hvorved det dannes to faser, og den organiske fase atskilles og det aktive polypeptid utvinnes fra denne fase.

Generelt vil pH-verdien for det vandige ekstrakt påvirke atskillelsen, og mengden av fellemiddel som anvendes, må av-passes etter pH-verdien. Tilstedeværelsen av andre oppløste stoffer, f. eks. vann-blandbare organiske væsker så som ethanol, aceton osv., påvirker også den konsentrasjon av fellemidlet som gir de optimale resultater.

Når ammoniumsulfat anvendes som fellemiddel, er den optimale konsentrasjon av saltet vanligvis mellom 25 og 60 pst. av den mettede oppløsning, og pH-verdien er fortrinnsvis mellom 5 og 8. Når de anvendes en organisk, vannblandbar væske, så som ethanol, er mengden av denne hensiktsmessig mellom 30 og 60 pst. av den vandige fase, og de nøyaktige mengdefor-hold av ammoniumsulfat og vannblandbar væske velges slik at man får 2 faser. Hvis det f. eks. anvendes en konsentrasjon på 46 pst. ethanol, kan konsentrasjonen av ammoniumsulfat være 25 vektprosent.

Mengden av den organiske væske som tilsettes, er beregnet slik at man får et forholdsvis lite volum i den separate fase, slik at man får en høyere konsentrasjon av det aktive polypeptid. Det skal bemerkes at når ethanol tilsettes, utfelles vanligvis noe uønsket materiale som kan fjernes før fraksjonering med et uorganisk salt.

Denne fraksjonering i henhold til oppfinnelsen utføres fortrinnsvis ved romtemperatur og de foretrukne konsentrasjoner av fellemidlet som angitt ovenfor, kan ikke alltid anvendes ved høyere temperaturer. Den aktive faktor er imidlertid stabil opp til 90° C, og høyere temperaturer kan anvendes uten at det finner sted noen in-aktivering.

Fraksjoneringen i henhold til foreliggende fremgangsmåte kan utføres direkte på det vandige dyreorganekstrakt eller på vandige oppløsninger som er resultatet av andre rensningsprosesser. Videre kan andre rensningsmetoder anvendes på materialet som er resultatet av foreliggende fremgangsmåte, og generelt kan fraksjoneringen utføres på ethvert trinn i den totale rensning av den aktive faktor.

Det er også funnet at aktivt polypeptid kan renses ytterligere på en særlig hensiktmessig måte ved adsorpsjon på et svakt basisk cellulose-ionebyttermateriale, fulgt av uttrekning fra dette med en vandig elektrolyt f. eks. nøytral eller sur eller svak alkalisk oppløsning.

Foreliggende fremgangsmåte er hensiktsmessig å anvende i kombinasjon med én av de ovenfor beskrevne fremgangsmå-ter i henhold til oppfinnelsen, enten før eller etter fraksjonering.

Cellulose-ionebytterharpiksen som anvendes ved den foreliggende fremgangsmåte, kan f. eks. være av den type som er beskrevet av Peterson og Sobers J.A.C.S. 78, 751 (1956); slike materialer omfatter cellulose som er kjemisk modifisert slik at de inneholder svakt basiske grupper så som aminogrupper, dialkylaminogrupper, di-alkylaminoalkylgrupper osv. Ionebyttermaterialet Ecteola er særlig egnet. Ecteola er reaksjonsproduktet av epiklorhydrin, trie-thanolamin og natriumcellulose. Deae-cellulose eller Deae Sephadex kan også anvendes.

Cellulose-ionebyttermaterialet anvendes fortrinnsvis i partikkelform i en kolonne, og puffres fortrinnsvis til en pH mellom 6 og 10, hensiktsmessig ca. 6,5—8,5. En velegnet pufferoppløsning er en 0,1 M am-moniumbicarbonatoppløsning eller 0,005 M natriumbicarbonat-carbondioxyd-puffer med en pH-verdi på 6,8. Det vandige organekstrakt puffres også fortrinnsvis til omtrentlig den samme pH-verdi før det inn-føres i kolonnen, og det er hensiktsmessig

å anvende en puffret oppløsning for å vaske ut de uønskede forurensninger. Det vandige organekstrakt er fortrinnsvis forholdsvis fortynnet, og inneholder hensiktsmessig 1 til 2 vektprosent tørrstoff.

Etter vasking kan det aktive polypeptid uttrekkes fra kolonnen med den svakt alkaliske oppløsning. Fortynnet, vandig natrium-, kalium- eller ammoniumhyd-roxydoppløsning f. eks. med en styrke på 0,05—2N, eller kaliumcarbonat er egnet som uttrekningsmiddel eller en forholdsvis konsentrert oppløsning av ammoniumbicar-bonat f. eks. en omtrentlig 1-molaroppløs-ning. Uttrekning kan også utføres med en sur oppløsning som fortrinnsvis også inneholder et oppløselig salt, en oppløsning av eddiksyre og natriumacetat av henholds-vis IN og 0,2N styrke er tilfredsstillende. Fortrinnsvis anvendes imidlertid en fosfatpuffer ved en pH-verdi på ca. 7,5, eller et alkalimetallhalogenid så som natriumklorid, hensiktsmessig i økende konsentrasjoner.

De uønskede uorganiske ioner som er til stede i uttrekningsmidlet, kan fjernes ved behandling med molekylsiktmaterialer f. eks. ved dialyse eller ved at uttrekningsmidlet bringes i kontakt med slike stoffer som Sephadex G50 (solgt av A.B. Pharmacia i Uppsala) omtalt ovenfor. Kationer kan også fjernes ved behandling med en fornettet kationebytterharpiks Amberlite IR120.

De følgende eksempler skal tjene til å klargjøre oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1.

(a) Fremstilling av leverpasta.

8 kg fersk okselever ble finhakket, tilsatt 16 1 vann og 108 g fenol (for å hindre bakterieforurensning). Blandingen ble om-rørt i 2 timer, oppvarmet under omrøring til 100° Ci en y2 time og stod til neste dag ved romtemperatur. Den ble deretter oppvarmet til 70° C og filtrert, residuet ble vasket med vann inneholdende 0,5 pst. fenol. Det kombinerte filtrat (17,8 1) inneholdt 2,8 g tørrstoff pr. 100 ml. Oppløsnin-gen ble konsentrert ved 60—70° Ci vakuum til en gul pasta som veide 760 g og inneholdt 65 pst. tørrstoff. Pastaen ble tilsatt til 3,4 1 75 volumprosent ethanol og blandingen ble omrørt i 6 timer ved romtemperatur. Neste dag ble bunnfallet filtrert av, og vasket med 70 volumprosent ethanol. Det kombinerte ethanolfiltrat på 4,6 1 inneholdt 266 g tørrstoff. Det ble konsentrert ved 30—40° C i vakuum til en brunaktig, sort pasta som veide 375 g og inneholdt 71 pst. tørrstoff.

(b) Adsorpsjon på asbest.

800 g leverpasta ble oppløst i 2,8 1 nydestillert vann inneholdende 0,3 pst. tricresol. Oppløsningen hade en pH-verdi på 4,9, og ble tilsatt til 11,2 g asbestpulver. Blandingen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur og stod uten omrøring i ytterligere 24 timer. Asbesten ble vasket med vann inneholdende 0,3 pst. tricresol. De kombinerte væsker (supernatants) ble foe^ handlet på samme måte med ytterligere 11,2 g asbest. Den vaskede asbest ble tørket i vakuum over P2Or> og veide 25,2 g. Asbesten ble utvasket under ett med flytende 100 pst. fenol ved 50—60° C, første gang med 200 g, annen gang med 100 g og tredje gang med 200 g. De kombinerte vaskevæs-ker ble tilsatt til fem ganger sin vekt ether, bunnfallet ble filtrert av og vasket med ether. Det brune materialet var ikke full-stendig oppløselig i vann, men tilsetning av 0,1 N-NaOH slik at man fikk en pH-verdi på 7,5, brakte det uoppløste materialet i oppløsning.

Asbesten ble vasket med ether for å fjerne fenol og deretter utvasket med 200 ml lN-NHg. Vaskevæsken ble konsentrert i vakuum og flet fremkom et bunnfall. Væsken ble anvendt videre.

Både f enol-vaskevæske-f raksj onen og ammoniakk-vaskevæske-f raksj onen ble renset ytterligere på Sephadex G50-kolonner (2,8 cm diameter x 32,5 cm høyde) og den høymolekylære fraksjon ble oppsamlet i hvert tilfelle. De to rensede fraksjoner (12 mg fra f enolf raksj onen og 18 mg fra ammoniakkf raksj onen) var hverken pyro-gene i kaniner eller antigene i mennesker, beskyttet mus mot E.coli-infeksjon og kyl-lingfoster mot koppevirus.

Biologisk aktivitet vaskes således ut både med 100 pst. fenol og lN-ammoniakk. Det er også funnet at biologisk aktivitet ut-vaskes fra asbesten med 0,1 N-NaOH. I vann oppviste de aktive fraksjoner en blå-grønn fluorescense og gav et bunnfall med f osf orwolf ramsyr e.

Eksempel 2.

0,5 liter menneskeblod ble oppvarmet i 30 minutter ved 100° C, og 500 ml av en 0,3 vektprosent vandig oppløsning av tricresol ble tilsatt. Blandingen ble filtrert, 20 ml av en 20 vektprosent vandig oppløsning av sulfosalicylsyre ble tilsatt til filtratet, og det hele ble filtrert igjen. 1,84 g asbest ble tilsatt filtratet og man lot det hele stå ved romtemperatur i 2 dager. Asbesten ble atskilt fra væskefasen ved sentrifugering og utvasket med 90 g (100 pst.) ved 60° C,

450 ml ether ble tilsatt til fenol-vaskevæsken, og det resulterende bunnfall ble filtrert fra. Det erholdte faste stoff ble løst opp på nytt i vann og pH-verdien ble regulert til 7 ved hjelp av vandig kaustisk soda. Den resulterende oppløsning hadde tilsvarende egenskaper til dem man fikk for produktet i eksempel 1.

Eksempel 3.

(a) Fremstilling av Sephadexkolonnen.

Sephadex G50 (A.B. Pharmacia, Uppsala) ble suspendert i 0,05 M natriumklorid og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Etter 10—15 minutters klaringsperiode ble væsken med de finere partikler dekantert fra. Etter at denne væske var erstattet med en frisk oppløsning av 0,05 M natriumklorid, ble hele prosessen gjentatt ytterligere fire ganger. Sephadexen ble deretter sammenpakket ved omrøring under tyng-dekraftens innvirkning i en kolonne (45 cm diameter x 30 cm høyde). Kolonnen ble vasket ved + 4° C med nydestillert vann inntil alle Cl-ioner var utvasket. (b) Fraksjonering av høymolekylær fraksjon fra vandig leverpreparat.

En leverekstrakt (fra 6 kg fersk lever) ble fremstilt på vanlig måte av fersk stor-felever ved proteolyse med papain, utfelling av proteolysatet med alkohol, delvis inndampning av filtratet og ekstrahering av den konsentrerte oppløsning med vann-mettet fenol, fortynning av fenolekstrak-tet med ether og ekstrahering av fenol-etherblandingen med vann. Til 600 ml av dette vandige ekstrakt ble det tilsatt en 5 pst. kaliumhydroxydoppløsning slik at man fikk en pH på 8,2. 7,32 g bariumace-tat Ba (CH3C02)2.H20 ble tilsatt, og man lot oppløsningen stå natten over ved 0° C. Den lille mengde bunnfall som var dannet, ble fjernet ved sentrifugering. Til den væske som var igjen etter sentrifugering, ble det tilsatt 2,8 liter 96 pst. alkohol, og det dannede bunnfall ble neste dag sentrifug-ert fra oppløsningen, vasket med alkohol og deretter med ether, og tørket. Bunnfallet veide 10,95 g.

Bunnfallet ble oppløst i 500 ml vann og man lot oppløsningen dryppe gjennom en kolonne inneholdende 140 ml sur ionebyt-terharpiks. Kolonnen ble vasket med vann inntil oppløsningen som dryppet igjennom, hadde antatt en pH på 5,5—6 og var farge-løs. Til oppløsningen ble det deretter tilsatt 2N NaOH til pH 6,5; den ble konsentrert under vakuum og til slutt frysetørket. Produktet veide i tørr tilstand 2,9 g.

0,5 g av produktet (svarende til 1 kg fersk lever) ble oppløst i 50 ml vann. Til oppløsningen, som hadde en pH på 6,6 ble det tilsatt 1,5 g carbon, som på forhånd var vasket med vann og deretter med alkohol. Etter 19 timers henstand ble carbonet filtrert fra oppløsningen og vasket med vann inntil filtratet var fargeløst. De oppsam-lede filtrater ble konsentrert under vakuum og veiet, etter frysetørking, 0,250 g. 10 g av dette frysetørkede materiale ble oppløst i 40 ml vann og ført gjennom kolonnen, som deretter ble vasket med vann. Det første volum man fikk ut (70 ml) ble kassert, de følgende 200 ml (svakt brunfarget) som inneholdt høymolekylært materiale ble oppsamlet og inndampet i tørrhet i vakuum i frossen tilstand. Frak-sjonen veide 150 mg. Mesteparten av det mørkfargede materiale i leverpreparatet beveget seg meget langsomt nedover i kolonnen, og den hadde derfor lav molekylvekt. I vann oppviste den aktive fraksjon en blågrønn fluorescens og gav bunnfall med fosforwolframsyre.

(c) Antigenitet.

Den høymolekylære, aktive fraksjon oppviste ingen antigen reaksjon, som det fremgikk av hudprøven, når den ble admi-nistrert ved injisering i mennesker i doser på 0,1 mg. (d) Beskyttelse mot E. coliinfeksjon i mus.

Den høymolekylære, aktive fraksjon oppviste en beskyttende virkning som vist ved de følgende tall.

Bakterieinnpodningsdose: 1,25 x IO<8 >organismer pr. mus. 0,1 mg (oppløst i 0,3 pst. tricresolvann) høymolekylær fraksjon ble injisert intravenøst i hver mus. En gruppe på 6 mus ble gitt den høymoleky-lære fraksjon 3 timer før bakterieinnpod-ningen og en annen gruppe 6 timer før innpodningen. 6 mus som bare fikk innpodningen, tjente som kontroll. Resultatene er vist i den følgende tabell:

I et annet eksperiment var innpod-ningsdosen 3,5 x IO<8> organismer pr. mus. Den dose av høymolekylærf raksj onen som ble injisert intramuskulært, var 0,2 mg (oppløst i 0,1 ml saltvann). Ellers ble eks-perimentet utført som ovenfor. Resultatene er vist i den følgende tabell:

(e) Beskyttelse mot koppevirus.

Den høymolekylære fraksjon beskytter kyllingfosteret mot koppeinfeksjon (ved en dosemengde på 2,55 mikrogram). Den høy-molekylære fraksjon i oppløsning i vann ble innført i den choriollantoiske membran i 10—11 dager gamle kyllingfostere. 24 timer senere ble fostrene innpodet med koppevirus. Fostrene ble deretter inkubert i 5 dager. Resultatene fremgår av den følgen-de tabell:

Eksempel 4.

6 1 okseblod ble omrørt for å hindre koagulering, 0,3 pst. tricresol ble tilsatt, og det hele ble oppvarmet til 100° i en time og stod ved romtemperatur natten over. Blan-

dingen ble filtrert, og til filtratet (4 1) ble det tilsatt 25,5 ml 20 pst. sulfosalicylsyre.

Det resulterende bunnfall ble fjernet.

Filtratet ble konsentrert og pH-verdien ble regulert til 8. Materialet ble fraksjonert på Sephadex G50 (4 cm x 32 cm) i 0,01 N-NaOH og den høymolekylære fraksjon ble oppsamlet. Overskudd av NaOH ble fjernet med Amberlite IR 120 (H) til pH 7,0 og den resulterende oppløsning ble frysførket. Utbytte. 481 mg.

Eksempel 5.

Fraksjonering på ECTEOLA

Leverpasta svarende til 0,4 g tørrstoff ble oppløst i 25 ml 0,01 M NH4HCO.,. pH-verdien tole regulert til 8,5 ved tilsetning av sterk ammoniakk. Oppløsningen ble ført gjennom en kolonne av ECTEOLA (1,5 cm diameter x 5 cm høyde) som tidligere var ekvilibrert med 0,01 M NH4CH03 puffer pH 8,5. Uabsorbert materiale ble vasket ut ved hjelp av 30 ml 0.01 M NH4HC03 puffer ved pH 8,5. Kolonnen ble deretter uttrukket med IM NH4HCO:! som fikk ut den biologisk aktive substans, ben aktive substans kunne også uttrekkes fra en slik kolonne med NaOH eller vandig ammoniakk. For NaOH-uttrekningens vedkommende ble pH-verdien brakt til 7 ved hjelp av HC1. NaCl og NH4HC03 kunne fjernes ved behandling med Sephadex G50.

Eksempel 6.

Fraksjonering på ECTEOLA

(a) Behandling av ECTEOLA før bruk. 5 g ECTEOLA stod ved romtemperatur i 2—3 timer med 100 ml lN.NaOH. Væsken ble dekantert av, og ytterligere 100 ml natriumhydroxyd ble tilsatt og blandingen stod i en time. Materialet ble helt oppi en kolonne (1,5 x 7 cm) og natriumhydroxyd ble vasket ut med vann. Kolonnen ble deretter ekvilibrert med 0,005 M NaHCO.,-C02-puffer ved pH 6,8. (b) 25 mg høymolekylær fraksjon fra Sephadex-kolonnen fremstilt i henhold til eksempel 3 fra en utfelt leverf raksj on, ble oppløst i 10 ml 0,005 M NaHC03-C02pH 6,8-puffer, og ført gjennom kolonnen. Kolonnen ble vasket med puffer. Kolonnen ble uttrukket med 2 M NH3 og deretter med 0,5 N NaOH som fjernet den aktive fraksjon. Oppløsningen ble behandlet med Amberlite IR 120 (H) inntil man fikk pH på 6,0. Oppløsningen ble frysetørket og gav 24 mg utbytte, hvorav en del var natriumcar-bonat, som kunne fjernes ytterligere ved behandling med Sephadex.

Eksempel 7.

En kolonne (5 cm x 1 cm) av ECTEOLA fremstilt som i eksempel 6a, ble anvendt. 1,5 mg materiale (fremstilt ved behandling av leverpasta med asbest, uttrekning med NaOH, nøytralisering med HC1 og fjerning av NaCl på Sephadex) ble opp-løst i 10 ml 0,005 M NaHCO:i-C02-puffer, pH 6,7, og ført gjennom kolonnen. Kolonnen ble vasket med pufferen, deretter uttrukket med 40 ml 0,11 N-NaOH. Dette gav en fraksjon som oppviste gul fluorescense. NaOH ble fjernet ved tilsetning av Amberlite Ir 120 (H) inntil man nådde pH 7,0, og oppløsningen ble frysetørket. Det tørre, faste stoff veide 10 mg, hvorav noe var NaHC03.

Eksempel 8.

Til 50 1 omrørt okseblod ble tilsatt 150 ml tricresol, og det hele ble oppvarmet ved 90° C under tilbakeløpskjøling i 2y2 time.

82 1 96 pst. ethylalkohol ble tilsatt til den

varme oppløsning og omrørt i en time uten oppvarmning. Man lot deretter blandingen stå natten over for å avkjøles til romtemperatur, og den ble deretter filtrert slik at man fikk 80 1 filtrat. 43 1 vann ble tilsatt, og til blandingen ble det tilsatt en vandig oppløsning av 20 pst. sulfocalicylsyre til man fikk en pH på 1. Bunnfallet ble fjernet, og pH-verdien for filtratet ble regulert til 8—8,3 ved hjelp av 30 pst. NaOH. 0,25 kg (NH4)2S04 pr. 1 ble tilsatt til oppløsnin-gen under omrøring. Ved henstand atskilte blandingen seg i to lag. Det øvre lag (alko-holiske fase) ble fjernet og konsentrert i vakuum til 5 1 og deretter dialysert natten over. pH-verdien ble regulert til 7,5—8 ved tilsetning av NaOH, og oppløsningen ble filtrert og konsentrert i vakuum til 450 ml.

En kolonne av Sephadex G50 (9,2 x 95 cm, diameter x høyde) ble ekvilibrert med

0,01 N-NaOH og 250 ml av det ovenfor-nevnte konsentrat, regulert til pH 11—12 med 30 pst. NaOH, tilført kolonnen. 0,01 N-NaOH ble anvendt som uttrekningsmiddel. 1 liter av uttrekningsmidlet som først kom igjennom kolonnen, ble kassert, og deretter ble 1,46 1 oppsamlet. Denne opp-løsning inneholdt det høymolekylære materiale og gav et bunnfall med fosforwolframsyre. Oppløsningen ble nøytralisert ved tilsetning av Amberlite IR 120 H (kationebytterharpiks i hydrogenform), har-piksen ble fjernet ved filtrering og filtratet ble frysetørket. Utbyttet varierte fra 0,05 g

—0,1 g pr. 1 blod.

Eksempel 9.

20 kg finhakket okselever ble oppvarmet under omrøring ved 90° C med 50 1 vann. Fenol ble tilsatt til en sluttkonsen-trasjon på 0,5 pst. Blandingen stod natten over og filtratet ble konsentrert i vakuum til 3 1. 53,1 1 96 pst. ethylalkohol ble tilsatt, og blandingen stod natten over ved romtemperatur. Filtratet ble konsentrert i vakuum til 2,6 1, og for å hindre bakterieforurensning ble 8,4 ml tricresol tilsatt.

Til 50 ml av oppløsningen ble tilsatt 750 ml av en oppløsning av mettet (NH4)2S04, og man lot bunnfallet utskilles natten over ved romtemperatur. Bunnfallet ble vasket med mettet (NH4)2S04 og oppløst i vann ved å regulere pH-verdien til 7,0 med NaOH. Oppløsningen ble dialysert, og noe av det fargede materiale ble derved fjernet. Den dialyserte oppløsning ble frysetørket og man fikk et utbytte på 1,53 g.

Biologisk aktivitet.

Produktene beskrevet i disse eksempler oppviser aktivitet mot koppevirus i ka-ninhud og hindrer mitose i HeLa-celler i Pucks medium.

Eksempel 10.

Fraksjonering av materiale på Sephadex G50 i 0, 1 M NaCl.

Oppløsningen inneholdt 0,3 pst. tricresol for å hindre vekst.

0,22 g materiale ble oppløst i 10 ml vann, og 4 ml 20 pst. sulfosalicylsyre ble tilsatt. Filtratet ble nøytralisert med NaOH til en pH-verdi på 7,5, tilført en Sephadex G50-kolonne (35 cm x 3,5 cm, høyde x diameter) og ekvilibrert med 0,1 M NaCl inneholdende 0,3 pst. tricresol. Kolonnen ble uttrukket med den sistnevnte oppløsning. De første 95 ml av uttrekningsmidlet som kom igjennom kolonnen ble kassert. De neste 130 ml som inneholdt det høymolekylære materialet, ble oppsamlet, dialysert og frysetørket. Utbytte 80 mg.

Eksempel 11.

En diethylaminoethyl-cellulose (DE-AE) kolonne (7 x 2,8, høyde x diameter) ble ekvilibrert med 0,005 M-fotfatpuffer, pH 7,5. 200 mg materiale (fra blod) ble opp-løst i 40 ml av pufferen og ført gjennom kolonnen. Kolonnen ble deretter vasket med puffer. Kolonnen ble så uttrukket med 0,005 M fosfatpuffer, pH 7,5, inneholdende 0,08 M NaCl, 0,05 m fosfatpuffer inneholdende 0,1 M NaCl og 0,1 M fosfatpuffer, pH 7,5, inneholdende 0,5 M NaCl. De tre fraksjoner ble dialysert og frysetørket. Den første fraksjon resulterte i et utbytte på 22 mg, den annen 55 mg og den tredje 55 mg. Alle fraksjoner oppviste biologisk aktivitet.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et polypeptidmateriale med ikke-spesifikk immunitetsvirkning, som skal tjene til å øke menneskers motstandsevne mot bakterie- og virusinfeksjon og sjokk, karakterisert ved at et vandig medium inneholdende blod eller et dyreorgan, såsom lever, nyre, milt eller et vannoppløselig materiale herav, utsettes for oppvarmning til 90—100° C, fast materiale fjernes, og det erholdte vandige medium utsettes for molekylær fraksjonering, f. eks. selektiv adsorpsjon og uttrekking, kontakt med mo-lekylsiktmateriale for å fjerne molekyler med lav molekylvekt og/eller fraksjonert utfelling med et proteinfellingsmiddel, og man utvelger de fraksjoner som inneholder et fluorescerende polypeptid med en molekylvekt på minst 1000, fortrinnsvis minst 8000.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at uønskede proteiner fjernes ved hjelp av sulfosalicylsyre.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at det som ad-sorberende materiale anvendes asbest, fra hvilket de adsorberte produkter uttrekkes ved hjelp av en sur eller basisk væske eller en oppløsning med høy elektrolyttkonsen-trasjon.

4. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at det som mole-kylsiktmateriale anvendes et med ethylenoxyd fornettet dextran, som før fraksjoneringen behandles med en vandig opp-løsning av et alkalimetallsalt, hvis anioner deretter fjernes ved vasking.

5. Fremgangsmåte ifølge påstand 4, karakterisert ved at oppløsningen av den ønskede polypeptidf raksj on utvas-kes fra det fornettede dextran ved hjelp av en alkalisk oppløsning. Anførte publikasjoner: Norsk patent nr. 56 894. C. A. 50 8035 e (1956). Alfred Burger: Medicinal Chémistry sec. ed. side 783.