JPH02124899A - 新規な蛋白質とその製造法及びこれを有効成分とする免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、免疫抑制能を有するマンネンタケ属（Ｇａｎ
ｏｄｅｒｍａ）菌糸体由来の新規な蛋白質、その製造方
法及びこれを有効成分として含有する免疫抑制剤に関す
る。

［従来の技術］ マンネンタケはヒダナシタケ目サルノコシカケ科（Ｐａ
ｌ　　ｏｒａｌｅｓ）に属する担子菌で、霊芝ともいわ
れ、古くから生薬として珍重されており、現在でも漢方
薬成分の一つとして又健康食品として広く利用されてい
る。これら用途の殆どが子実体を利用したものであるが
、その薬効は多岐にわたる（文献：漢方医学Ｖｏ１．ｌ
Ｏ，Ｎｏ、６．２１１ｉ−３２（１９８Ｇ）、化学と生
物Ｖｏ１．２３．　Ｎｏ、１２．７９７（１９８５））
と言われている。しかしその薬効に関して、殆どその基
礎的な研究が欠如しており、確認されていないのが現状
である。しかし近年徐々にではあるが、マンネンタケ中
の成分の同定やその薬理作用の研究も報告されてきては
いる。免疫活性、抗腫瘍活性を示す多糖類（第３５回日
本癌学会総会記事、１２９（１９７Ｂ）、Ｈ，Ｉｔｏ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｍｉｅ　Ｍｅｄ、　Ｊ、、　２８．１４
７（１９７７）、水野卓　他、日本農芸化学会誌、５８
．８７１（１９８４））や血圧降下（特願昭５３−４５
５５８、特願昭５６−５７８０ｆ）血糖降下（特願昭Ｇ
Ｏ−１８１０２６）　、抗脂血症の改善（有地滋　他、
基礎と臨床、１３．４２４５（１９７９））等を示す多
糖類が代表的な例である。この他の薬効では、抗アレル
ギー効果が子実体の熱水抽出エキスに有ると言う報告（
野上真理　他、日本薬学会第１０４年会講演要旨集、１
２Ｇ（１９８４））もあるが、これもその抽出方法から
みると多糖の一つと考えられる。このようにマンネンタ
ケの成分の同定拳確認は徐々におこなわれてきているが
、これらは子実体よりの報告であり、菌糸体よりの報告
はみられない。又、子実体、菌糸体を含めてもいまだか
って免疫抑制能をもつ蛋白質の報告はない。

一方アレルギーとは、過剰な免疫応答をおこす疾病を総
称し、その発現機序、産生ずる免疫グロプリンの種類、
症状の違いによって１〜Ｖ型に分類されている（山村雄
−・岸本忠三編、■講座、免疫科学１「免疫学入門ｊ　
ｐ、１８９〜）。例えばアナフィラキシ−反応で代表さ
れるＩｇＨの過剰抗体現象であるＩ型アレルギー　自己
免疫疾患で代表される自己組織に対するＩｇＧ及びＩｇ
Ｍの異常抗体産生現象である■型アレルギー　膠原病等
で代表される免疫複合体による■型アレルギー　臓器移
植時の拒絶反応に代表される細胞性免疫による■型アレ
ルギー及びバセドウ病に代表される■型アレルギーの様
にいずれも本来抑制されるべき免疫活性が抑制されない
為に生じるものである。

アレルギーの治療薬には、Ｉ型アレルギーに汎用されて
いるアレルギー反応最終課程で生成する化学物質により
惹起される化学反応を抑制する対症療法剤（例えば抗ヒ
スタミン剤）と免疫抑制剤がある。しかし対症療法では
、根本的な治療は難しく効果も少ない。

従って重篤なアレルギーには、専らアルキル化剤である
サイクロフォスフアミド、プリン拮抗剤であるアザチオ
プリン、葉酸拮抗剤であるメトトレキセレート、抗生物
質であるサイクロスポリンＡＮ　　Ｈ’ｌ　Ｔｉ　皮質
ホルモン（コルチゾン様物質）（Ｓａｌａｍａｎ　Ｊｒ
、、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｓｕｐｐｒｅｓｌｖｅＡｇｅｎｔｓ、　ｐ、３．　Ｌｉ
ｐｐｉｎｃｏｔｔ（１９８１））の様な免疫抑制剤が利
用されている。

しかしこうした免疫抑制剤も作用の特異性に乏しく広範
で重篤な副作用（例えば免疫不能状態）を生じる等の問
題点を残している。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って免疫抑制能をもつ物質の検索は、アレルギーにお
ける重要な研究課題であり、新しい免疫抑制物質の提示
が望まれている。

本発明者らは、マンネンタケの菌糸体について生理活性
の研究の過程で菌糸体粉砕水性溶媒抽出液が微弱ながら
リンパ球の幼若化反応（マイトジェン活性）を示すこと
を見い出した。そして更にその有効成分の特定、薬理効
果を中心に研究を重ねたところ、マンネンタケ菌糸体内
で産生された蛋白質がリンパ球の幼若化反応を示すこと
が明らかになった。そこで本発明者らは、上記発明を端
緒としてこの新規な蛋白質の効果と免疫抑制剤としての
可能性とを明らかにし、更には経済的な生産方法を確立
するという課題を設定するに至った。

更にこの新規な蛋白質を発現するＤＮＡをクローニング
し、そのＤＮＡ配列を明らかにする課題を設定した。

［問題を解決するための手段］ 本発明者は上記検討課題に関して研究を重ねた結果、本
物質が免疫抑制能を有していることを見い出すと共に、
大量生産に有効な培養方法及び分離精製方法を確立し、
更に本発明の新規な蛋白質が医薬品として有効な免疫抑
制作用を有しており、アレルギー治療に有効であること
を見い出し本発明を完成した。

従って本発明の目的は、免疫抑制能を有している新規な
蛋白質を提供することにある。また本発明の他の目的は
、当該蛋白質を製造するための方法を提供することにあ
る。更に本発明の他の目的は、当該蛋白質を有効成分と
して含有する免疫抑制剤を提供することにある。

更に本発明の他の目的はこの新規な蛋白質を発現するＤ
ＮＡ配列を明らかにすることにある。

本発明による新規な蛋白質（以下本物質又は精製した本
物質という）は以下に示す性質を有する。

■　分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で１７゜５０
０付近の分子量で、　トリシンＳＯＳアクリルアミドゲ
ル電気泳動で１２，８００〜１４，４００の分子量を示
す。

すなわち、精製した本物質を　１５％アクリルアミドを
含むＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分
離し、分子量を測定すると、第１図（２）に示す通り　
１７．５００付近にバンドを示す。

還元した本物質を同様にＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけると　１７，１００付近にバンドを示す
（第１図（３））。

又、還元した本物質を最近開発されたトリシン（Ｔｒｌ
ｃｌｎ　；　Ｎ−ｔｒｌｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ
ｌ）ｍｅｔｈｙｌ−ｇｌｃｉｎｅ）−ＳＯＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（Ｈ。

ＳｃｈＡｇｇｅｒ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｊａｇｏｗ、　　Ａ
ｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、υ」。

３１３８−３７９（１９８７））にかけると　１２．８
００−１４，４００付近にバンドを示す（第２図）。

■　等電点 精製した本物質を等電点電気泳動にかけると本物質の等
電点は第３図に示す通りｐＨ４，４の付近にバンドを示
す。

■　物質の形状 凍結乾燥品は白色である。

■　溶解性 水に可溶でエタノールに不溶。

■　蛋白質の一次構造のアミノ酸配列 本物質の蛋白質の一次構造の全アミノ酸配列を分析した
結果を以下に示す。

Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　Ｌｅｕ　　［ｌｅ
　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＡｌａＴｒｐ　Ａｓｐ　Ｖ
ａｔ　　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａ
ｓｐ　ＴｙｒＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ
　　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎｓｎ Ｐｈｅ ｌｉｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒ。

Ｌｙｓ Ｍａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　
ＡｌａＶａｔ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌ
ｙ　　ＡｒｇＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　　Ａｌ
ａ　　ＶａｌＳｅｒ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　
　Ａｓｎ　　ＰｈｅＳｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ｇ
ｌｙ　　ｌｉｅ　　Ａｌａｌｌｅ　　Ｇｉｎ　　Ｍａｌ
　　Ｐｈｅ　　Ｍａｌ　　ＶａｌＡｓｎ　　Ａｓｎ　　
Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　ｌｉｅ　　１ｌｅＴｙｒ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｔｙｒ Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　ＡＳＩ） Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ ■　作用 本物質は免疫抑制能を有す ■　赤血球凝集能の有無 本物質はヒト赤血球（Ａ１Ｂ１ を凝集しない。

る。

ＡＢ型） 上述の新規な蛋白質は、ヒダナシタケ目サルノコシカケ
科マンネンタケ属に属する担子菌の天然または人工培養
菌糸体を培養し、得られた菌糸体を水性溶媒で抽出し、
精製することにより製造される。

本発明に使用されるマンネンタケは、原色日本菌類図鑑
（保育社版）並びに伊藤誠也著日本菌類誌（養賢堂版）
に準じ同定された菌糸体であればいずれのものでもよい
が、菌株によって産生量にバラツキがあったり、又採取
した菌株の地域差が存在する可能性がある為、本物質を
効率的に得る為には、例えば微工研に寄託されている微
工研条寄第１８２６号（ＦＥＲＮ　ＢＰ−１８２Ｇ）の
使用が適当である。

本物質はマンネンタケ菌糸体内に産生される為、抽出原
料として菌糸体そのものが必要である。これらの菌糸体
は、上述したように天然又は人工培養によるいずれでも
使用できるが、産業上の有用性から判断すると人工培養
が適当である。人工培養は、静置培養、振盪培養又は浮
遊攪拌培養のいずれの方法を用いても良い。

本物質生産の為、マンネンタケ菌糸体は、まず斜面培養
を行い、次に適当な菌体量を接種し液体培養による前培
養を行う。増殖が定常期に達した時点で前培養終了とし
、プラスチ、ンクプレート等を用いた静置培養、フラス
コ等を用いた振盪培養若しくはジャーファメンター等を
用いた浮遊攪拌培養を行う。

これらの培養条件は、以下の通り規定することが出来る
。培地は、通常真菌類の培養に用いられる培地が使用で
きる。その中でポテト−デキストロース培地が適当で、
培地濃度は、２〜３％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。ポテト−
デキストロース培地は、市販のものでも又ポテト抽出液
にグルコース等の単糖を加えた自調整培地でも使用でき
る。培養温度は２５〜３０°Ｃ１溶存酸素量は酸素移動
係数（Ｋｄ）で０．３５〜０．４５　ｍＭ　Ｏ２／気圧
・分の範囲が適当である。

又培地のｐＨは、５．５〜５．８の間が良い。菌糸体の
接種量は、通常約５〜１０　ｍｇ乾燥菌体／１００−で
十分であり、培養期間は３〜２０日程度が好ましい。

上述の培養条件は、静置培養、振盪培養若しくは浮遊撹
拌培養において通常使用される条件である。

静置培養は、上述の培養条件で行えば特に問題なく培養
を行える。振盪培養の場合は、酸素移動係数が上述の範
囲になる様に振幅数を設定する必要がある。

浮遊攪拌培養では、上述の条件を使用する機器の物理的
制御方法に適合させることによって達成される。特に通
常攪拌速度は、培養器によって異なるが、例えば１４　
Ｒ容器ジャーファーメンタ−（ＮＢＳ社）の場合、ｔｏ
　１１の培地を入れ、２０Ｏｒ、ｐ。

ｍ９、通気量２〜３９空気／分程度が適当である。以上
の培養方法を用いることにより高収率で菌糸体を得るこ
とが出来る。

このようにして得た菌糸体からの本物質の抽出は、菌糸
体を集菌後、水性溶媒で抽出することにより行われる。

菌糸体からの抽出は、菌糸体を粉砕しなくても少量であ
れば抽出可能である。しかし収率面を考慮すると菌糸体
を粉砕した状態で抽出することが好ましい。これらの原
料は、凍結乾燥等の乾燥処理を行って保存しておいて適
宜用いても良い。

使用する抽出溶媒である水性溶媒としては、水、酸、塩
基等を少量含有する水溶液、若しくは緩衝液が適当であ
る。酸としては塩酸、硫酸、酢酸、塩基としてはアンモ
ニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カル
シウム等が使用できるが、通常は塩酸水溶液、塩酸緩衝
液を使用する。

溶媒のｐＨは、微酸性、中性、微塩基性溶液の６〜８が
好ましい。抽出時の抽出温度は、本発明の場合重要で８
０°Ｃを越えない温度で行うことが適切である。菌糸体
を１００℃の水性溶媒で抽出することも可能であるが、
抽出された本物質の変性等を生じ生理活性を減する為収
率面から見ると有効でない。

抽出液は、遠心分離、ゲル口過の後、イオン交換クロマ
トグラフィー　アフィニティークロマトグラフィー等を
単独で若しくはこれらを組み合わせることにより精製で
きる。

精製の手順の例を示せば次の通りである。まず抽出液を
遠心分離にかけて不溶物を除去した後、平衡化したセフ
ァデックスＧ−７５を用いたゲル口過による分画を行い
、活性画分を平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−２
５に吸着させ、これをゲル平衡化用緩衝液を含む０．１
Ｍ程度の塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８）にて溶出させる
。次いで活性画分を集め、透析し、透析後の溶液を凍結
乾燥し精製品とする。

この他に本物質のモノクローナル抗体を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーを利用することによっても高
収率で本物質を得ることができる。

以上の精製は、４〜ｌＯ°Ｃの低温で行うのが好ましい
。

上記の様にして得られた本発明の新規な蛋白質について
の分子量、免疫抑制効果、毒性並びに免疫抑制能のパラ
メーターとしてのリンパ球幼若化活性は以下の通りであ
る。

（Ａ）　　分子量及び純度検定 本物質をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ク
ーマシー染色し分子量を測定すると、第１図（２）に示
す通り　１７，５００付近を示す。そして還元した本物
質を同様にＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかける
と分子量は１７，１００付近を示す（第１図（３））。

又、　トリシン（Ｔｒｌｃｌｎｅ）　−５ＤＳによる１
６．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると、還
元した本物質の分子量は　１２，８００〜１４．４００
付近を示す（第２図）。

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、
クーフシ−染色後、ゲルの可視部吸収（ＧＧＯｎｍ）を
ゲルスキャナー（Ｂｅｃｋ−ｍａｎ、　ＤＶ−８５ＬＡ
Ｂ　ＧＥＬ　５ＣＡＮＮＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ）によっ
て検定を行うと本物質は１ピークである。この結果は、
第４図に示す。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の手法は、ラエ
ムリらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．　［ｆ８０８
（１９７０））に準じ、トリシン−５Ｏ５によるポリア
クリルアミドゲル電気泳動の手法はシャガーら（Ｓｃｈ
Ａ　ｇｇｅｒ　ｅｔａｔ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、　１１３［ｉ、　３６８（１９８７））の方法に
準じた。

（Ｂ）　　免疫抑制 本物質は、細胞性拒絶反応やマウスを用いた各種アレル
ギー疾患モデルに対して顕著な抑制作用を有する。

（Ｃ）　　リンパ球幼若化活性 本物質はリンパ球の幼弱化活性を持つ。

本物質がリンパ球の中のどの細胞画分に作用しているの
かを調べたところ、少なくとも本物質はマクロファージ
を介して、抗ＣＤ　８モノクロ一ナル抗体と反応するリ
ンパ球分画を顕著に活性化する作用を持つことが判明し
た。

この作用は、具体的には、次のインビトロ実験系によっ
て証明された。

まず、Ｔ細胞画分とＢ細胞及びマクロファージを含む両
分を次のようにして分画した。即ち、ヘパリンを加えた
３０　ｄのヒト末梢血液に同量のリン酸緩衝液を加え、
フィコールパック（Ｐｈａｒｍａｃｌａ社）に重層し遠
心分離（３５０Ｘ　ｇ、　　１５分）後、リンパ球層を
集めた。このリンパ球分画に約１５−のＲＰＭ１１８４
０を加えて遠心分離（４００Ｘ　ｇ、　　１５分）し、
ヘパリンを除去したものを末梢血リンパ球画分とし、こ
の画分を５％ＦＣ５／　ＲＰＭ　Ｉ　Ｉ　Ｇ　４０に加
え、ｌ×１０Ｔ個／ｆｆｌ１１に調整した。次いでノイ
ラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球（Ｉ　Ｘ　１０”個
／艷濃度の赤血球浮遊２＆　１　ｍｆｆに対してノイラ
ミニダーゼ５０ユニツトを加え、３７°Ｃで３０分反応
させた後、リン酸緩衝液で３回洗浄したもの）を２　Ｘ
　１０９個／ｄ　７Ｈ１度に調整し、同量の末梢血リン
パ球画分を加え、よく混和後、培養チューブにｌ＋ｎｌ
ｌづつ分注し、次いで遠心（２００Ｘ　ｇ１５分）した
後、水中に浸し２時間静置した。静置後、管底に沈んで
いる細胞を静かに再浮遊させ、これをフィコールパック
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いた遠心分＊　（４００
Ｘ　ｇ、　　３０分）により、ロゼツトを形成するＴ細
胞画分と、形成しないＢ細胞及びマクロファージを含む
両分とに分けた。

こうして得たＴ細胞画分から次のようにしてＣＤ４抗原
をもつリンパ球分画とＣＤ８抗原をもつリンパ球分画に
分けた。

Ｔ細胞分画に４−へモリシス緩衝液（０，１Ｇ　ＭＮＨ
ＪＣＲｌｏ、１７　Ｍ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＱ　）を加え、
２分間浮遊反応させ、Ｔ細胞に結合しているヒツジ赤血
球を溶血させた後、リン酸緩衝液で３回洗浄した。これ
を抗ＣＤ８モノクローナル抗体と抗ＣＤ　４モノクロ一
ナル抗体（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｌｃｋｌｎｓｏｎ
　＆　Ｃｏ１製の抗Ｌｅｕ３ａ抗体と抗Ｌｅｕ２ａ抗体
）を用いたウィソキとサトーのパンニング（ｐａｎｎｔ
ｎｇ）法（Ｗｙｓｏｃｋｉ、　Ｌ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖ
、　Ｌ、　５ａｔｏ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃ１、　ＵＳＡ、　７５．２８４４（１９７
８））に準じてＣＤ　４抗原をもつリンパ球画分（以下
Ｔ　ｈ／１画分と称す）、ＣＤ８抗原をもつリンパ球画
分（以下Ｔ　５　／。両分と称す）とした。つまりＴ細
胞画分を２群に分け、一方を抗ＣＤ　４モノクロ一ナル
抗体、残る一方を抗ＣＤ８モノクローナル抗体（それぞ
れ５μｇ／＋＋＋５１）で２５℃、２０分間インキュベ
ートし、１％ＦＣＳを含むリン酸緩衝液で３回洗浄した
。これらの細胞を抗マウスイムノグロブリン−ヤギ血清
でコートした直径Ｇ　ｃｍのプラスチックシャーレで４
°Ｃ１２時間インキユベートシ、非附着細胞を洗った後
、耐着細胞をラバーポリスマンで集めて各々をＴｈｚｔ
画分、Ｔ３−７゜両分とした。

尚、上述の耐着細胞画分は、リン酸緩衝液単独では３Ｈ
−チミジンの取り込みを起こさない。又これらの画分は
、抗体との結合物であるが、予備試験の結果、各リンパ
球画分がもつ３Ｈ−チミジンの取り込み量には、影響を
及ぼさないことが確認されている。

一方、Ｂ細胞画分（以下Ｂ画分と称す）とマクロファー
ジ（以下Ｍφと称す）画分とは、以下の通りにして分け
た。即ち、ロゼツト法によって分けられたＢ細胞及びＭ
φを含む両分をプラスチックデイツシュに入れ、３７°
Ｃ，３時間インキュベートすることにより、Ｍφをデイ
ツシュに附着させ、Ｂ画分を得た。附着したＭφはラバ
ーポリスマン等で静かに集め、Ｍφ画分とした。

以上により得られた４つの両分（Ｔｈ７＋画分、Ｔ１１
／Ｃ画分、Ｂ画分、Ｍφ）から、Ｔ　ｈｚ＋画分のみの
もの、ＴＳ７Ｃ画分のみのもの、Ｔ、７μ画分とＭφを
含むもの、ＴＳ／Ｃ画分とＭφを含むもの、Ｂ画分のみ
のもの、Ｂ画分とＭ６を含むもの及び、Ｍφだけのもの
、都合７サンプルを作成し、それぞれに本物質を添加し
、反応後の３Ｈ−チミジンの取り込み量を測定した。

測定条件と測定方法は以下の通りである。

実験には９６　ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）を用いた
。

各々の両分の細胞数は、Ｔｈ／１両分の細胞、ＴＳ／Ｃ
画分の細胞及びＢ画分の細胞が各々２．５　Ｘ　１０’
個／ウェル、Ｍφ画分の細胞が２．５　Ｘ　１０３個／
ウェルとした。本物質は最終濃度が２０μｇ／ｄとなる
ように添加した。又各サンプルに本物質の替わりにリン
酸緩衝液を加え、その際の３Ｈ−チミジンの取り込み量
をコントロールとした。

本物質溶液を加えてから７２時間、３７°Ｃ，５％ＣＯ
２，９５％空気の条件でインキュベートした。

反応終了後、３Ｈ−チミジン（ＮＥＷ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）をＲＰ旧１６４０で２５μ０
１／ｎｔＱに調整し、固液を０．５μＣＩ（２０μＱ）
／ウェルづつ加え、３７°Ｃ１５％ＣＯ２，９５％空気
の条件で１６時間インキュベートした。その後セルハー
ベスタ−（アベ科学）でグラスフィルター上に細胞を集
め、乾燥後、フィルターを切取って、オムニバイアル（
Ｗｈｅａｔｏｎ社、Ｎｏ　、２２５４０２）内に入れ、
２　ｍｌのトルエン系シンチレータ−（ＰＰＯ４，Ｏｇ
、　　ＤＭ−ＰＯＰＯＰ　０．１　ｇ／Ｑ　Ｔｏｌｕｅ
ｎｅ）を加え、液体シンチレーシ日ンカウンター（ＢＥ
ＴＡ　ｍａｔｌｃＩＩ　Ｋｏｎｔｒｏｎ社）で放射活性
の測定を行った。

結果を第５図に示すが、ＴＳ／Ｃ画分とＭφ画分を含む
ものに本物質を加えた場合に顕著な３Ｈ−チミジンの取
り込みを示した。

（Ｄ）　　毒性試験 リンパ球の幼若化作用を示すものとしては、細胞表面の
ある種の糖鎖残基に特異性をもつレクチン類が知られて
いる。これらレクチンは、サブユニット構造を持つ蛋白
質で、リンパ球表面の糖鎖残基に結合し、リンパ球を幼
若化させるが、赤血球凝集能及び細胞毒性を有し、これ
が実用面での阻害要因となっている。

本物質はリンパ球幼若化反応を示すが、医薬品として障
害となるであろうヒト赤血球凝集を起こさない。

精製した本物質は、蛋白質濃度０．１θ〜５０μｇ／艷
の範囲でヒト赤血球Ａ、　　Ｂ、　　０１ＡＢ型各々の
凝集を示さない（表１）。

表 一方本物質をマウスに静脈投与しても毒性は示さない。

精製した本物質をＩＣＲマウス（日本チャールズリバー
社、オス、６週齢、３０．５ｇ±２　ｇ）に１０　ｍｇ
／Ｋｇ体重で静脈投与しても毒性を示さないことからＬ
Ｄ６１１は１０　ｍｇ／Ｋｇ以上であり、動物実験時の
投与量から判断して毒性は極めて弱い。

以上の結果、本物質は免疫抑制剤として極めて有用な物
質であると考えられる。

本発明の新規な蛋白質は、静脈内投与、皮下注射、皮肉
注射、筋肉注射、経口投与及び直腸内投与が可能である
。その中でも静脈内投与が好ましく、具体的には静脈内
注射或は点滴投与が好ましい。成人の治療に用いる場合
、投与対象者の体格や状態等によって投与量は適宜選択
されるが、数的な投与量は、成人１回当り　ｌμｇ〜２
０　ｍｇ程度が適当である。

静脈内投与用の組成物の形態は、安定剤、緩衝剤、保存
剤などの添加物を含んでもよく、単位投与量を含むアン
プル又は多投与量を含む容器に充填して提供される。又
このような組成物は水溶液、ｐＱ液、溶液、油性又は水
性形態の様な乳液及びリポゾーム形態であってもよい。

一方活性成分は、使用前粉末形態であっても差し支えな
く、例えば発熱物質を含有していない滅菌水で再溶解さ
せて使用できる。

［発明の効果コ 本物質は、全く新規な蛋白質であり、免疫抑制能を有す
る。従って本物質は、免疫抑制が治療に必要なアレルギ
ー全般、即ちＩ〜■型アレルギーの各疾病、例えば■型
アレルギーとしてはアトピー性疾患（気管支喘息、花粉
症等）、■型アレルギーとしては橋本病、自己免疫性溶
血性貧血、アジラン病、インスリン依存性糖尿病等の自
己免疫疾患等、■型アレルギーとしては血清病、膠原病
等、■型アレルギーとしては臓器移植時拒絶反応の細胞
性免疫疾患、■型アレルギーとしてはバセドウ病等のい
ずれのアレルギーにも有効な効果を持ち、有用な免疫抑
制剤として提供されうるちのである。

以下余白 ［実施例コ 以下に実施例を示して具体的に本発明を説明する。

実施例１ 培養・抽出拳精製・同定： 代表例として三角フラスコを用いた振盪培養の例を示す
。

ポテト−デキストロース−寒天培地（０，２４ｇ、　　
ポテト−デキストロ−スーブロース培地（ＤＩＦＣＯ社
）、０．１　ｇ寒天、水１０−）を１２１　′Ｃ，２０
分間滅菌処理し、ｐＨ５，７に調整し、マンネンタケ菌
糸体（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｌｕｍ　Ｎｏ、
ＩＢ、微工研条寄第１８２６号）を接種し、試験管にて
スラント培養を行った。２８°Ｃで７日間培養した後、
得られたマンネンタケ菌糸体を５００−三角フラスコの
２．４％（Ｗ／Ｖ）のポテト−デキストロ−スーブロー
ス培地（ＤＩＦＣＯ社）２００　ｄｌｐＨ５，７に１白
金耳接種し、レシプロシェーカー（Ｂ、Ｂ、Ｍ、社）で
１１０サイクル５３０ｍｍストローク／分でｌ１ｆｆｉ
培養を２８°Ｃで１４日間行い、前培養とした。培養終
了後、菌糸体を含む培養液２−を１０本の５００−三角
フラスコの２．４％（Ｗ／■）のポテト−デキストロ−
スーブロース培地、２００　ｍ、ｐＨ５，７に各々接種
し、レシプロシェーカーで１１０サイクル・３０　ｍｍ
ストローク７分で再度振盪培養を２８°Ｃ１１４日間行
った。

培養終了後、菌糸体を含む全培養液を遠心分離（１３，
０００Ｘ　ｇ１１０分、Ｋｏｎｔｒｏｎ社Ｈ４０１）に
かけて菌糸体を集菌した。湿菌糸体重量は、全量で３３
９．７　ｇであった。

集菌した湿菌糸体約２００ｇを室温のｌｏｍＭ　　Ｔｒ
Ｉｓ−■ＣＱ緩衝液（Ｓｉｇｍａ社）　ｐＨ８，０１３
００艷に対して懸濁させ、ポリトロン（ＫＩｎｅｍａｔ
ｉｃａ社０１１−ＧＯＩＯＫＲＩＥＮＳ−ＬＶ）　ニテ
菌糸体を粉砕し、遠心分離（３５゜０００　Ｘ　ｇ１２
０　ｍ１ｎ）にかけ上清的２４０　＋ｎｇを抽出液とし
た。

この抽出液を１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ１ｌ　　緩
衝液ｐＨ８，０°Ｃ−平衡化した４本のセファデックス
Ｇ−７５カラム（ＰｈａｒｍａＣ１ａ社に５０／　１０
０）によるゲル口過にかけ、活性画分約２９を回収した
。次にこの活性画分を１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ
緩衝液ｐＨ８，０で平衡化したＤＥＡＥセファデックス
Ａ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｌａ社に２Ｇ／４０）にかけ
て吸着させ、０．１　Ｍ　　ＮａＣｌ１　（和光純薬）
を含む１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＨ緩衝液ｐＨ８，０に
て溶出させ、活性画分約４００　ｍ９をプールした。

プールした活性画分を分子ｉ　３，５００カツトオフ透
析膜（ＳＰＥＣＴＲＡ　ＰＯＲ，ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔ
ｕｂｌｎｇ）に入れ、２　ｍＭ　（ＮＨＪ　）２ＣＯ３
溶液にて４８時間透析を行った。

尚、抽出から透析までは、全て４℃の低温で行った。

透析終了後、透析内液を凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃ。

社、スペースセーバデラ、ツクスフ５０３５）にて凍結
乾燥し、５．１　ｍｇの新規な蛋白質を得た。

以上のようにして、精製された本物質が得られた。各段
階の収率を表２に示す。各段階の活性測定は以下に示す
測定法に従った。又、蛋白質量はローリ−法（Ｊ、　Ｂ
ｌｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　１９３．２８５−２７５（
１９５１））によって測定した。尚、標準蛋白質として
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社）を用いた。

（活性測定法） ＤＢＡ／２マウス（４週齢〜７週齢）の牌臓を外科的に
採取し、ＲＰＭＩＩＧ４０培地１０　ｄでこれをほぐし
、同細胞懸濁液を遠心分離（１５０Ｘ　ｇ、　　１０分
）にかけ、上清を除去する。次いで細胞ペレットを２．
５　＋Ｔ１９のへモリシス緩衝液（０，１ｌｌｉ　Ｍ　
ＮＨＪＣｌｌＱ、１７Ｍ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩを含む）
　［７，６５に懸濁し、５分放置し赤血球を溶血させた
後、同液を遠心（１５０Ｘ　ｇ１ｔｏ分）にかけ上清を
除去する。こうして得た細胞ペレットに更に１０　＋ｎ
９　ＲＰＭ１１６４０を加え、再度遠心分離（＋５０　
Ｘ　ｇ１ｔｏ分）にかけて上清を除去し、肺臓細胞ペレ
ットを得る。

この肺臓細胞ペレットをＲＰＭＩＩｅ４０　（１０％Ｆ
Ｃ５含を）で、５×１０６個／艷に調整し測定用の肺臓
細胞とする。この肺臓細胞を、９６ウエルプレー）　（
Ｎｕｎｃ社製）に０．１　ｄ　（５Ｘ　１０６個）づつ
添加し、そこにｏ、ｉ　ｄの本物質溶液を加え、３７℃
、５％ＣＯ２，９５％空気の条件で６４時間インキュベ
ートする。

インキュベート終了後、３Ｈ−チミジン（ＮＥＮＲｅｓ
ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）をＲＰＭ１１６４０
で２５　ｕｃ１／艷に調整し、同液を０．５μ０１　（
２０μＩｆ）／ウェルづつ加え、３７°Ｃ，５％ＣＯ２
，９５％空気の条件で６時間インキュベートする。その
後、セルハーベスタ−（アベ科学）でグラスフィルター
上に細胞を集め、乾燥後、フィルターを切取り、オムニ
バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ社製Ｎｏ、２２５４０２）内
に入れ、２ｍＮのトルエン系シンチレータ−（ＰＰＯ４
、ＯｇｌＤＭ−ＰＯＰＯＰ　Ｏ，１ｇ／　Ｑ　　）ルエ
ン）を加え、液体シンチレーションカウンターＢＥＴＡ
　ｍａｔｌｃＩＩ（Ｋｏｎｔｒｏｎ社製）で放射活性の
測定を行う。

活性測定は３Ｈ−チミジンの取り込みが最大値となる本
物質蛋白質濃度で行った。活性の単位は、ｃｐｍ単位／
μｇ蛋白質−１０５個（ｃｅｌｌｓ）で表示し、１０６
個（ｃｅｌｌｓ）及びμｇ蛋白質当たりの３Ｈ−チミジ
ン取り込み値を比活性値とした。総活性量は、比活性値
に蛋白質量を乗じた値を使用し、単位はｃｐｍ単位／Ｉ
０６個（ｃｅｌｌｓ）で表した。

尚、−本物質溶液を加えずに、代わりにリン酸緩衝液を
加え、上述方法に準じて肺臓細胞を反応させ、３Ｈ−チ
ミジンの取り込みを測定した値をコントロールとした。

表 表２における総蛋白質量の単位はｆｆｌｇｚ　　比活性
の単位は１０’　ｃｐｍ／μｇ蛋白質・１０６個、総活
性量の単位は１０＠ｃｐｍ／　１０’個である。

以上のようにして得た本物質の性状を以下の手法を用い
て測定した。

（分子量） 分子量は、ラエムリらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７
．Ｇ３０８（１９７０））に準じ、１５％アクリルアミ
ドを含むＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって分
離し、得られたゲルをクーマシー染色して測定する方法
と、シャガーら（Ｈ，Ｓｃｂ＋ｔｇｇｅｒ　ａｎｄ　Ｇ
、　Ｊａｇｏｗ、　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、里
、　３８８（１９８７））の方法に準じたトリシン−５
ＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による方法によっ
て測定した。

ラムエリらの方法は以下の通りに行なった。アット社製
スラブディスク電気泳動装置（ＳＪ−１０ＧＯ５ＤＨ型
）を使用し、厚さ　ｌ　ｍｍのポリアクリルアミドゲル
（ランニングゲル及びスタッキングゲル）を以下の組成
に従って、具体的にはランニングゲルを挿入後、スタッ
キングゲルを重層して作製した。尚、ＢＩＳはメチレン
ビスアクリルアミドを、ＴＥＭＥＤはテトラメチルエチ
レンジアミンを意味する。

ランニングゲル且 １５　　ｄ　　アクリルアミド （３０ｇアクリルアミド、０．８　ｇ　ＢＩＳ／　１０
０艷） １．０　　ｍ９　　Ｈ２Ｏ ７，５＋ｎｌｌ　　１．５　Ｍ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＲｌｐ
Ｈ８，８１５μ４１　　ＴＥＭＥＤ ０．３　　ｍ９　５０Ｓ（５０％Ｗ／Ｖ）０．１５−１
０％（ＮＨＪ　）２Ｓ２０８スクッキングゲル■ ｌ　　艷　アクリルアミド （３０ｇアクリルアミド、１．２　ｇ　Ｈ１ｓ／１０θ
−） ７．５　　＋ｎ１２　　Ｈ２Ｏ １，２５＋ｄ　　Ｏ，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｌｌｐＨ
８，８５μＱ　　ＴＥＭＥＤ ０．１　　＋ｄ　　５ＤＳ（５０％Ｗ／Ｖ）０．１　　
ｍｕ　　１０％（ＮＨ４）２Ｓ２０１１本物質のサンプ
ルは、非還元サンプルの場合、３０Ｂ？本物質（０，４
２ｍｇ・蛋白／艷）を以下のサンプル用緩衝液２０μ９
と混和し、そのうち２０μΩを使用した。

サンプル　・　゛ ２５０μ２０．５　Ｍ　Ｔｒｌｓ−ＨＣｌｌ（ｐＨ６，
８）１３０μＱ　　Ｈ２Ｏ ４００μ２５０％グリセロール ２０μ９０．１％　ブロムフェノールブルー４００μＱ
　　１０％ＳＤＳ 還元サンプルは、上述サンプル用緩衝液のうちＨ２Ｏ、
Ｉ００μ２分を２−メルカプトエタノールに置き換えた
緩衝液２０μ９に本物質３０μΩを混和し、次いで９０
°Ｃ１５分間加熱した後、２０μ９をサンプルとして使
用した。

一方泳動装置の上清と下情には、次の緩衝液を添加した
。上槽用緩衝液は、５．１７　ｇ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ１
３．４７　ｇグリシン、１．Ｏｇ　ＳＤＳを含むＩｌｌ
水溶液、４００ｍ１ｌを、下情用緩衝液は、１４．５　
ｇ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＩＩを含むｌＱ水溶液ｐＨ８，６，
３θＯｍ９を使用した。

泳動は、パワーサプライ（アテック社　Ｍｏｄｅｌ−３
１１０）を用いて、スラブキングゲルでの濃縮を２０　
ｍＡで、ランニングゲルでの分離を３０　ｍＡで行った
。

泳動後、ゲルは、クーマシー染色液に３０分浸し、その
後脱色液で過剰染色液を除去した。第１図に結果を示す
。第１図の（りは分子量マーカーを、（２）は本物質を
、（３）は、還元した本物質をそれぞれ示す。０本物質
の分子量は　１７，５００、還元した本物質の分子量は
　１７，１００を示した。

又、トリシン−３ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
は、シャガーらの方法（■、　５ｃｈＡ　ｇｇｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、　ＩＧ
ＩＥ、　３８８−３７９（１９Ｂ？））に従い以下の通
り行った。

アット社製スラブディスク電気泳動装置（ＳＪ−１０Ｇ
Ｏ−６ＤＨ型）を使用し、分離ゲルとスペーサーゲルを
重層した。アクリルアミド　４８％、メチレンビスアク
リルアミド　１．５％を含む溶液（以下Ａ溶液とする）
１０ｄにＢ溶液（３，０Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　　Ｏ
。

３％ＳＤＳ、　　ｐｎ　８．４５）　　１０艷　を加え
４ｇのグリセロールを加えた後、更に蒸留水を加えて全
量を３０−とした溶液を分離ゲルとした。一方スペーサ
ーゲルは、Ａ溶液６．１−にＢ溶液１Ｇ　ＩＩｔｌｌを
加え更に蒸留水を加え全量を３０　ｍ９とした。ついで
分離ゲル溶液、スペーサーゲル溶液のそれぞれに１００
μΩノ１θ％過硫酸アンモニウムと　！０μ９のＴＥＭ
ＥＤを加え、スラブゲル装置にまず分離ゲル溶液を流し
込み、続いてスペーサーゲル溶液を分離ゲル溶液上に重
層した。これら２層の液が重合した後、Ａ溶液ｔ　ｍｉ
、Ｂ溶液３．１艷に蒸留水を加え全量１２．５　ｎｉｌ
とした濃縮タル溶液に　１００μΩの１０％過硫酸アン
モニウムと　ｌθμ９のＴＥＭＥＤを加え、前者２層の
ゲル上に更に重層した。

サンプルは、０．５〜２μｇを４％５Ｄ５１１２％グリ
セロール、５０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＱ、　　２％メ
ルカプトエタノールに　０．Ｏｌ　％５ｅｒｖａ　ｂｌ
ｕｅ　Ｇを加え、ｐＨＥｉ、８に調製した後、４０°Ｃ
１３０分間インキュベートし、電気泳動に供した。

電気泳動装置の上槽と下槽には、次の緩衝液を添加した
。Ａｎｏｄｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（陽極用緩衝液）として
は、　０．２　　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｓ　　ｐＨ８，
９を、　Ｃａｔｈｏｄｅ　ｂｕｆｆｅｒ（陰極用緩衝液
）としては、０．Ｉ　Ｍ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＱ。

０．１　Ｍ　　）リシン、０．１　％　５ＤＳ１ｐＨ８
，２５を用いた。

泳動条件は、ゲルサイズ１０　Ｘ　　１４　Ｘ　Ｏ，０
７ｃｍの場合、９０ｖ定電圧で１６時間泳動する。又泳
動後の固定、染色は、前述したラエムリらの方法（ＳＯ
Ｓポリアクリルアミド法）と同様で行った。

結果を第２図に示す。第２図に示すように本物質の還元
本物質は、１２，８００〜１４，４００付近に分子量を
示した。

（等電点） 本物質をリン酸緩衝液に溶解して３１．１μｇ／ｍＱに
濃度調整し、これをＩμΩのサンプルアプリケーターに
入れた。泳動条件は、先ず　７５　Ｖｈまでプレフォー
カシングし、次いで１５　Ｖｈの間、前述のサンプルア
プリケーターによりサンプルをかけた。サンプルアプリ
ケーターを取り除いた後、４ＩＯｖｈまで泳動を行い、
終了後、２０％　トリクロロ酢酸で２０　’Ｃ，５分間
固定し、洗浄液（メタノール：酢酸：水＝　３　：　ｌ
　：　１ｌｉ）で２分間洗浄し、０．０２％　クーマシ
ー染色溶液（メタノール、１０％酢酸、０．１％Ｃｕ５
Ｏ４）　テ５０″Ｃ１１０分間染色を行い、最後に洗浄
液で脱色した。

この電気泳動及び染色は、プログラム化した自動電気泳
動装置（Ｐｈａｒｍａｃｌａ社Ｐｈａｓｔ　ｓｙｓｔｅ
ｍ）で行った。

その結果等電点は、Ｉ）Ｈ４，４であった。測定の際等
電点マーカーとしては、等電点レンジ３．９５〜５Ｇ５
　（、ＬＫＢ社）を使用した。結果は第３図に示す。

（形状） 凍結乾燥後の本物質は、白色粉末であった。

（溶解性） 水に可溶でエタノールに不溶。

（アミノ酸配列） 本物質の蛋白質の一次構造の全アミノ酸配列を以下のよ
うにして決定した。

本物質を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の逆
相カラム（１５μ、０１８．３００　Ａ、　　Ｗａｔｅ
ｒｓ社製、３．９　Ｘ　３０　ｃｍ）にかけ、４６％（
又は４７％）アセ）　二）す／Ｌ／　−０，１％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）　ノフイソクラティック（Ｉｓｏ
ｃｒａｔｌｃ）法溶出し、２８０　ｎｍと２５０　ｎｍ
の吸光度比が２．０以上を示すポリペプチド画分を得た
。

この両分にトリプシン（ＴＰＣＫ−ｔｒｙｐｓｌｎ；　
Ｗｏｒｔｈｌｎｇｔｏｎ社製）、リジルエンドペプチダ
ーゼ（ｌｌｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｌｄａｓｅ；和光紬
薬社製）、サブマキシラリスプロテアーゼ（ｓｕｂｍａ
ｘｌｌｌａｒｌｓ　ｐｒｏｔｅａｓｅ；　ＰＩｅｒｃｅ
社製）をそれぞれ作用させた後、逆相ＨＰＬＣにかけト
リプシン　フラグメント（ｔｒｙｐｓｉｎ　ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ）　、リジル　エンドペプチダーゼ　フラグメン
）　（ｌｌｓｙｌ　ｅｎｄｏｐｅｐｔｌｄａｓｅ　ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ）或いはサブマキシラリスプロテアーゼ（
ｓｕｂｍａｘｌｌｌａｒｌｓ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ）を得た。

これらの三つの酵素によるフラグメントについてそれぞ
れアミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。

アミノ酸組成分析は前記フラグメントにＧ　Ｎ−ＨＣＲ
を加えそれを減圧下で封管し、１１０″Ｃ，２０時間加
水分解した後、全自動アミノ酸分析システムモデルＡ−
５５００（イリヵインスッルメンツ社製）により行った
。

アミノ酸配列分析は気相プロテインシークエンサー４７
０Ａ型（アプライドバイオシステム社製）を用いて前記
フラグメントを連続エドマン分解（Ｅｄｍａｎ　　ｅｔ
　　ａｔ、Ｅｕｒ、Ｊ、　　旧ｏｃｈｅｍ、、！、８０
　　（１９（ｉ７））Ｌ、、得られたＰＴＨ−アミノ酸
をＨＰＩ、Ｃ逆相カラム（ＴＳＫゲル０ＤＳ−１２０Ｔ
；東洋曹達社製）のアイソクラティック（ｌ５ｏｃｒａ
ｔｒｌｃ）溶出法（０，０１Ｍ酢酸ナトリウム−０，０
２％ドデシル硫酸ナトリウム−３３，５％アセトニトリ
ル）により分析した。

アミノ末端（Ｎ末端）は、アシルアミノ酸−遊離酵素（
ａｃｙｌａｍｌｎｏ−ａｃｉｄ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　
ｅｎｚｙｍｅ；宝酒造社製）をＮ末端由来のトリプシン
　フラグメントに作用させ、逆相ＨＰＬＣ（５μ、Ｃ４
，４，５ｍｍＸ２５０ｍ１ｖｙｄａｃ社製）を用いて、
０．１％トリフルオロ酢酸を含む２０−４０％アセトニ
トリル濃度勾配により反応後により反応後のペプチド分
画を分取し、Ｎ末端領域部分のアミノ酸配列分析を行っ
た。また、Ｎ末端アミノ酸は未処理のＮ末端ペプチドと
のアミノ酸組成分析の比較により同定した。その結果、
Ｎ末端アミノ酸はセリンであり、そのα−アミノ基がア
シル化されていることが確認された。

このアシル基は質量分析の結果、アセチル基と考えられ
る。カルボキシル基末端（Ｃ末端）はカルボキシペプチ
ダーゼＹ　（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｙ；
　シグマ社製）によってＣ末端から遊離したアミノ酸を
アミノ酸自動分析システム８３００Ｅ　（Ｂｅｃｋｍａ
ｎｎ社製）を用いて分析した結果、アスパラギンである
ことが確認された。以上の結果、確認された本物質の蛋
白質の一次構造のアミノ酸配列を以下に示す。

Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　Ｌｅｕ　　ｌｉｅ
　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａｒｐ Ｔｈｒ ｓｎ ａｌ ａｌ ｙｓ ｅｒ ｅｒ １ｅ ｓｎ ５ｐ Ｐｒ。

ｈｅ ｅｕ １ａ Ｐｒ。

ｌｎ ｌｙ ｉｎ ｓｎ ａｔ ｓｎ １ｅ Ｔｈｒ ａｔ ｅｒ ｙｓ ｙｒ ａｌ ｓｐ ｙｓ ｒｐ ｓｐ ｓｐ ｅｒ ｙｒ ａｌ １ｙ ｈｅ ｈｅ ｙｓ ｌｙ Ｔｈｒ ｙｓ ｌｙ ｌａ ｓｎ １ｅ ａｔ ｉｅ ｅｕ ｒｇ ａｔ ｌａ ｒｇ ａｌ ｈｅ ｌａ ａｌ ｉｅ ｅｒ ｌｙ Ｔｈｒ ｙｒ ｓｎ ｌｕ ｅｕ ｓｐ ｓｐ ｌａ ｈｅ ｓｎ ｈｅ Ｔｈｒ ｅｕ ｅｒ ｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒ。

ｉｎ ５ｐ Ｐｒ。

Ｐｒ。

ｙｒ ｌｙ ｓｐ ｙｒ ｓｎ ｓｐ ｒｐ ｙｒ ｓｎ ｙｓ ｒｇ ａｌ １ｙ ｓｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ ｓｎ 以上の結果、上記理化学的性質で特定された本物質は今
まで見いだされていない新規な蛋白質であることが確認
された。

一方、この新規な蛋白質を発現するＤＮＡ配列を次のよ
うにして特定した。

対数増殖期のマンネンタケ菌糸体１３　ｇを液体窒素の
中で細かく粉砕し、２Ｂ艷の抽出用緩衝液（０，５Ｍ　
ＮａＣ１，ｐＨ７，５の０．２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液
、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ１１％５ＤＳ）に懸濁した。す
ぐにこれをフェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２５：２４：１）溶液で５回処理し、水層に含
まれるフェノールをジエチルエーテルで抽出後、エタノ
ール沈澱により粗ＲＮＡ約２０　ｍｇを得た。このうち
約４　ｍｇのＲＮＡをアマージャム社のＲＮＡ抽出キッ
トを使って精製した。精製後のＲＮＡ　２．９　ｍｇか
ら、オリゴ（ｄＴ）セルロース（ＰＬ１　　タイプ７）
カラムを使って、ポＵ　Ａ◆ＲＮＡを精製した。この結
果得られたポリＡ”　ＲＮＡは　４２　μｇであった。

このポリＡ”ＲＮＡ４．２μｇから二本鎖ｃＤＮＡの合
成をアマージャム社のｃＤＮＡ合成キットを使って行な
った。

得られた二本鎖ｃＤＮＡをメチル化し、これにＥｃｏＲ
Ｉリンカ−（ｐｃｃＧＡＡＴＴｃＧＧ；宝酒造社製）を
連結させ、ＥｃｏＲＩニより消化し、４００　ｂｐ　〜
７００　ｂｐ（７）分画を回収した。

次にｃＤＮＡの　１／１０量を、ｌμｇの脱燐酸化され
たλｇｔアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結さ
せ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのパッケージングキット（Ｑ
ｌｇａｐａｃｋ　ｇｏｌｄ）を用いてパッケージングし
た後、大腸菌Ｃ６００ｈｆＬ”″に導入し、約２３．０
００のプラークを得た。　　このプラークをＢＩｏｄｙ
ｎｅＡ　（ボール社製）とニトロセルロース（ＢＡ８５
；ニスアンドニス社製）に移し取り、２ｍのオリゴヌク
レオチドプローブ（５′末端を３２Ｐで標識）、 ｌ）プローブ１ Ｇ ２）プローブ２ とハイブリダイズさせた。この時Ｂｔｏｄｙｎｅｔのフ
ィルターはプローブ１と、ニトロセルロースフィルター
はプローブ２とハイブリダイズさせた。これらのフィル
ターのオートラジオグラムを比較検討し、２種類のプロ
ーブで陽性となったプラークを精製し、蛋白質全体をコ
ードしている５２０塩基からなるｃＤＮＡを含むλクロ
ーンを得た。このクローンのファージからＤＮＡを単離
し、ｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし
、このクローンｐｃＬＺ−８を得た。

次にｐｃｔｚ−ｓ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して得ら
れるｃＤＮＡ全体を旧３ｍｐ１９のＲＦ型Ｊ旧０９のＥ
ｃｏＲＩ部位に連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し
て、入り方の方向が異なる２つのクローンを単離した。

次に、ｐｃＬＺ−８ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＸｈｏ　Ｉで
消化して生ずるｃＤＮＡの半分づつの断片を、Ｍ１３ｍ
ｐ１８のＲＦ型ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位と５ａｌＩ部位
との間に連結した。このＤＮＡを使ってＪ旧０９を形質
転換し、ＬＺ−Ｂ　ｃＤＮＡの前半部分を含むクローン
と後半部分を含むクローンをそれぞれ単離した。これら
の４個の１３クローンの−本鎖ＤＮＡを調製シ、コれを
鋳型としテＴＡＫＡＲＡツアーＤＥＡＺＡシーケンシン
グキットにより本物質をコードする構造遺伝子を含む全
塩基配列を決定した。

クローン化されたｃＤＮＡは、５２０ｂｐの長さであり
、コードされている新規な蛋白質は、翻訳開始のメチオ
ニンを含めて１１１個のアミノ酸からなる。

５′末端には２７塩基の非翻訳領域、３”末端には終止
コドンを含めると、１６０塩基の非翻訳領域があり、こ
の中には３′末端のポリＡ配列（２７塩基）が含まれて
いる。また、ポリＡシグナルに似た塩基配列、ＡＴＡＡ
−がポリＡより４５ｂ上流に存在する。

以上記したように、本発明の新規な蛋白質のアミノ酸配
列の結果とｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列の結果
とは翻訳開始のメチオニンを除いて完全に一致した。結
果を下記に示す。

ＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＣＡ
ＴＣ２７ＡＴＧ　　ＴＣＣＧＡＣＡＣＴ　　ＧＣＣＴＴ
Ｇ　　ＡＴＣＴＴＣＡＧＧ　　ＣＴＣ５７Ｍｅｔ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ
　　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　　　１０ＧＯ’ＣＴＧ’
Ｇ　　ＧＡＣＧＴＧ　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＴＣＴＣ
Ｇ　ＴＴＣＧＡＣ８７Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ
　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　
　　２０ＴＡＣＡＣＣＣＣＧ　ＡＡＣＴＧＧ　ＧＧＣＣ
ＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣ１１７Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ
　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　
Ｐｒｏ　　　３０ＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＡＣ
Ｔ　ＧＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡｓｎ　Ａｓｎ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　Ｐ
ｈｅ　Ｐｒ。

ＡＡＡ　ＧＴＣＴＴＧ　ＡＣＣＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＧ　
ＴＡＣＡＣＧ　ＴＡＣＬｙｓ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ
ＣＧＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＡ　ＣＧＧ　ＡＡ
ＣＣＴＣＧＧＯ２０７Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ
　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　
　　６０ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＣＣＣＴＣＧ　ＴＡＣＧＣＧ
　ＧＴＣＧＡＧ　ＡＧＣＧＡＣ２３７Ｖａｌ　Ｌｙｓ　
Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｈａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　　　７０ＧＧＣＴＣＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ
　ＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＧＡＧ　ＴＡＣ２Ｇ７Ｇｌ
ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　　　８０ＡＡＣＴＣＣＧＧ
Ｇ　ＴＡＴ　ＧＧＣＡＴＡ　ＧＣＧ　ＧＡＣＡＣＧ　Ａ
ＡＣ２９７Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　
Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　　　９０Ａ
ＣＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣＧＴＴ　ＧＴＣＧ
ＡＣＣＣＣＧＡＣ３２７Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｇｌｎ　Ｖａ
ｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ
、　１００ＡＣＣＡＡ、ＣＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡ
ＴＣＧＣＣＣＡＧ　ＴＧＧ　　３５７Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｎ　Ｔｒｐ　　！１０ＡＡＣＴＡＧ　ＧＡＧＧＡＧＧ
ＣＡＧＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＧＣＧＧＴＣＴＡ　
　３９４Ａｓｎ　Ｅｎｄ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ｌ１ｌＡＴＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＣＴＧ
ＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＧＣ
ＴＴＣＣＴＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＣＣＧＴ
ＧＴＡＡＣＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＴ
ＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡ　　５１１ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ このようにして特定された本物質のアミノ酸配列につい
て、ＰＲＩＮＡＳペプチドデータベース（リリース　８
７−２）、ＮＢＲＦ−ＰＤＢデータベース（リリース１
１．０）、及び５ｗ１ｓｓ−Ｐｒｏｔ　（リリース５）
データベースを用いて、合計１万件以上の公知の蛋白質
の一次構造とのホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ；相同性
）検索を行ったところ、いずれのデータベースにも本ア
ミノ酸配列と完全に相同な配列を持つ蛋白質は見当らず
、更には５０％以上相同なアミノ酸配列を持つ蛋白質も
見い出されなかった。

尚、検索はＰＲＩＮＡＳペプチドデータベースについて
はＫｏｒｎら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４゜４４０１−４４０５（１９
７７））のホモロジー拳サーチ・プログラムを用い、Ｎ
ＢＲＦ−ＰＤＢデータベース及び５ｖｌｓｓ−Ｐｒａｔ
データベースについては、Ｌｌｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏ
ｎ法（Ｓｃｌｅｎｃ、ｅ、　２２７．１４３５−１４４
１（１９８１））による高速ボモロジー検索プログラム
を用いた。

以下余白 実施例２ アレルギータイプ■の疾患モデル動物に対する免疫抑制
試験： ＣＦＷマウス（米国チャールスリバー社、メス、５週齢
、２２．８ｇ　ｉ−０，９ｇ）を用いてアナフィラキシ
−反応について試験した。ＣＦＷマウスは、アナフィラ
キシ−反応に比較的感受性の高い実験動物として分類さ
れており（用俣順−他編　疾患モデル動物ハンドブック
　ｐ、６ｏ８）、アレルギー動物実験に用いられる（Ｔ
、　ＨＡＭＡＯＫＡ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ。

！１３．３．９５８−９７３（１９７４）、ＪＵＳＴＵ
Ｓ　Ｄ、Ｅ、、　Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇ
ｙ　Ａｐｐｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　５１．　Ｇ、　６
８７−６９５（１９７６））。

１ｒ！￥　１０匹で３群を作成し、各々をＡ、　　Ｂ、
　　Ｃ群とした。Ａ群は、ポジティブコントロール群ト
し、１回目の感作（センシイティジングインジェクショ
ン）としてアルムアジュバンド（和光紬薬）を含むウシ
血清アルブミン（以下ＢＳＡと称す）　　（ＳＩｇｍａ
社）を皮下注射（１ｍｇ／　ｍｏｕｓｅ）をし、２回目
の感作（ショツキングインジェクション）として、１回
目感作の　１７日後に、ＰＢＳ緩衝液に溶解したＢＳＡ
を静脈内注射をした。Ｂ群はサンプル投与群とし、ＢＳ
Ａによる　１回目感作の１週間前から腹腔内注射で精製
した本物質を２回投与し、８８人による１回目感作をＡ
群と同様に実施した後、本物質を週２回の割合で計５回
投与し、ＢＳＡによる２回目感作をＡ群と同様に実施し
た。本物質の投与回数は、都合７回、投与量は、計８．
９　ｍｇ／　Ｋｇ体重とした。又Ｃ群は、ネガティブコ
ントロールとし、１回目感作をＡ群と同様に行い、２回
目の感作として抗原性の全く違うオボアルブミン（以下
ＯＡと称す）　　（１ｍｇ／　ｍｏｕｓｅ、　Ｓｉｇｍ
ａ社）を１回目感作の１７日後に静脈注射した。

結果を表３、体重変化を第６図に示す。結果の判定は、
死亡したマウスを（＋）、１分以上動けなくなったマウ
スを（±）、変化が認められないマウスを（−）とした
。

表３ Ａ群では、ｌＯ匹中４匹死亡し、残り　６匹も１分以上
動けない状態となり、（＋）と（±）合わせると全例が
反応を示したが、サンプル投与群では全例が（−）であ
りアナフィラキシ−を完全に抑制した。Ｃ群はｌ、　　
２回目の抗原が異なる為アナフィラキシ−は起こさず（
−）であった。

体重変化は、Ａ、　　８１Ｃ群とも標準偏差が重なって
おり有意差は認められなかった。

実施例３ アレルギータイプＨの疾患モデル動物に対する免疫抑制
試験： ＮＯＤマウス（日本タレア社、メス、４週齢、１２゜５
１±２．０３　ｇ）を用いてアレルギータイプ■に分類
されるヒトのタイプＩ糖尿病（インスリン依存性）発症
等に及ぼす本物質の効果について検討した。

ＮＯＤマウスは、糖尿病を自然発症するモデルマウスで
ヒトのタイプ■糖尿病、インスリン依存性糖尿病、若年
型糖尿病あるいはやせ型糖尿病などと呼ばれる疾患に対
応したモデル動物である（用俣順−他編、疾患モデル動
物ハンドブックＮｏ、２、ｐ、１４）。

ＮＯＤマウス　１群５匹で２群を作成し、本物質投与群
と非投与群とした。投与群は、生後４週齢から本物質１
０．３　ｍｇ／　Ｋｇを０．２艷のＰＢＳ緩衝溶液とし
て週２回腹腔内投与し、投与群及び非投与群とも週２回
体重測定を行った。投与開始から　１５週後（生後１９
９週齢でＧ、Ｐ、−プレテスト（和光紬薬社製）を用い
て各々のマウスの尿中グルコース量（尿糖値）を測定し
た。その後各々マウスの体重を測定後、マウスを殺し、
採血し、膵臓重量、肺臓重量及び血中グルコース値（血
糖値）を測定シタ。各マウスの膵臓組織は、１０％ホル
マリン固定後、パラフィンで脱水、包理し、切片を作製
後、ヘマトキシリン・エオシン染色を施し組織学的検討
を行った。結果を表４に示す。

以下余白 本物質投与群と非投与群との体重変化を第７図に示す。

投与群、非投与群とも標準偏差が重なっており有意差は
認められなかった。

膵臓重量は本物質投与群で大きくなる傾向はあるが、統
計学にはを意差はなかった。

一方肺臓重量は本物質投与群で有意に重量が増加し、組
織学的所見では、両群のマウス共基本構造は保たれてお
り有意差は認められなかった。従って本物質の肺臓重量
の増加は、本物質の投与によってリンパ球が活性化され
肺臓内リンパ球の数が増加したためと推定される。

血糖値は、血漿グルコース量としてグルコースオキシダ
ーゼ法により測定した。血糖値２００　ｍｇ／」以上が
糖尿病状態と判断される（森　他、ＮｏＤマウスに対す
るサイクロスポリン治療、糖尿病、２９巻、４号、ｐ　
、　３Ｇ　Ｉ　（１９８Ｇ　））。本物質非投与群では
５匹中３匹が糖尿病状態にあったが、投与群では全くそ
の状態を示さなかった。両群の平均値を比較しても非投
与群では有意に血糖値が高かった。

また尿糖に関しても、非投与群で血糖値２００　ｍｇ／
Ｗ以上であった３匹いずれもが尿糖値１．０％以上とい
う結果が得られ糖尿病状態にあるという結果を示した。

一方、本物質投与群では５匹中５匹共、尿糖値０．１％
以下という結果が得られいずれも血中グルコース量の結
果と一致した結果が得られた。

膵臓の組織学的評価方法については、（−）が正常、　
（±）がほぼ正常だか一部の島でリンパ球浸潤が認めら
れるもの、（＋）がどの島にもリンパ球浸潤が認められ
るもの（５０％以下）、（十＋）が島全体にわたってリ
ンパ球浸潤が認められるもの（５０％以上）、（十＋＋
）がリンパ球浸潤のため既に島全体が小さくなってしま
うか殆ど消失しているものの５段階に分けた。

非投与群では浸潤が一番激しいと思われる（＋＋＋）が
２匹、（＋）評価以上は５匹中４匹であった。一方本物
質投与群では全匹が（±）以下であり、正常であるとい
う結果が得られた。

第８図（Ａ）〜（Ｃ）に膵臓組織の光学写真を示した。

第８図（Ｂ）図は非投与群のランゲルハンス島で多数の
リンパ球浸潤が生じているが、本物質投与群（第８図（
Ｃ））ではリンパ球浸潤が起こっていないと判断される
ほど極端に少ない。

以上の結果本物質はアイルギーのタイプ■であるインス
リン依存性糖尿病に関して完全に有効であることが確認
された。また投与期間中の体重変化及び組織学的所見に
より本物質の副作用等の毒性症状もほとんど認められな
かった。

実施例４ アレルギータイプ■に対する免疫抑制動物試験：アルサ
ス反応は、■型アレルギーに分類される抗原−抗体複合
物（免疫複合体）形成による過敏症反応の１つであるが
、本物質のアレルギータイプ■に対する効果をマウスの
アルサス反応にって確認した。

アルサス反応の反応機構は生体内に、ある抗原に対する
抗体が産生されている場合、新たにその抗原が皮肉注入
されると、抗原−抗体複合対が形成され、これが補体を
活性化し、続いて血小板凝集、血管内皮収縮、肥満細胞
脱顆粒等が起こり、結果的に抗原注射局所における発赤
、腫張が観察されるというものである（ロアット他、多
田富雄監訳、１９８Ｇ、南江堂、ｐ、２５２）。抗原刺
激局所における強度に対する防御を効果の判定基準とし
た。

ＣＦＷマウス（米国チャルズリバー社、メス、５週齢）
を本物質投与群と非投与群各１０匹にわけ、投与群はＢ
ＳＡによる抗原初回感作７日前から、本物質８．５　ｍ
ｇ／Ｋｇ体重をマウス腹腔内に週−２回（ＰＢＳ溶液と
して０．２＋ｄ）、３週間にわたって計８回注射した。

ＢＳＡによる抗原感作は計２回行い、初回感作が７日月
、２回目感作を１４日目間行い、本物質投与群及び非投
与群の両群のマウス全匹に皮下注射した。使用量はアル
ムアジュバンドと一緒に　１ｍｇ／マウス量であった。

２１日ロー両群全マウスにＰＢＳ溶液に完全に溶解させ
たＢＳＡ　（０，５ｍｇ／ｍＱ　）を２０μ＋ずつ、マ
ウス右後肢のフットパッドに皮下注射し、コントロール
としてマウス左後肢のフットパッドにＰＢＳ溶液２０μ
ｌを皮下注射した。注射後２時間、１日、２日、３日の
時点でそれぞれのマウスの左右後肢の厚さをノギスで測
定し、コントロール（ＰＢＳ溶液だけを注射したもの）
と有意差のあるマウス匹数を百分率（％）で表示した。

その結果を第９図に示す。

反応を経時的に追うと本物質投与群、非投与群ともに注
射後２時間で高く、２日、３日目では完全に回復してお
り、この反応が■型アレルギーではないことが確認され
る。

注射後、２時間での反応で非投与群は、９０％のマウス
が反応したが、本物質投与群では４０％の反応にとどま
り、本物質が■型アレルギーに分類されるアルサス反応
を有意に抑制することが示された。

実施例５ アレルギータイプ■に対する抑制試験 混合リンパ球培養系を用いてアレルギータイプ■に対す
る本物質の抑制効果を検討した。

混合リンパ球培養において起こる反応は、臓器移植等の
際の臓器供与者と受容者間の主要組織適合性抗原（ＭＨ
Ａ；　Ｍａｊｏｒ　ｈｌｓｔｏｃｏｍｐａｔｌｂｌｌｌ
ｔｙ　Ａｎｔｉｇｅｎ　）の違い、さらにはマイナーな
抗原の違いも加味して表現されてくることからアレルギ
ータイプ■の反応に分類される臓器移植時の細胞性拒絶
反応の　Ｉｎ　ｙｌｔｒｏのモデルと考えられている（
免疫科学、７巻、　「移植免疫と腫瘍免疫」、東　地組
、ｐ、５２、岩波書店）。

実験詳細は以下の通り。

ＭＨＡの異なるマウスの組合せ（ｔｗｏ　ｗａｙ　；　
ＤＢＡ／２とＣ：１ＪＨ１ｏｎｅ　ｗａｙ　；　Ｇ３）
１とＢＡＬＢ／　Ｃ）で本物質投与による混合リンパ球
反応に及ぼす効果について検討した。

１）　　　ｔｗｏ　　ｗａｙｌ去 ＤＢＡ／２　（オス、６週齢、静岡県実験動物農協）４
匹とＣ３Ｈ（メス、７週齢、静岡県実験動物農協）４匹
を用いて行った。

ＤＢＡ／２２匹、０３）１２匹の計４匹を本物質投与群
とし、本物質１．８８　ｍｇ／　−（ＰＢＳ溶液）を０
．２艷ずつ４日間連日腹腔内投与した（ＤＢＡ／２；　
ＩＧ。

８ｍｇ／Ｋｇ体重、０３Ｈ：　１７．７　ｍｇ／Ｋｇ体
重）。残りのマウスＤＢＡ／２２匹、Ｃ３Ｈ２匹の計４
匹は非投与群とした。

本物質投与開始から５日目に本物質投与群及び非投与群
の計８匹のマウスからそれぞれ外科的に且つ無菌的に肺
臓を取り出し、細胞浮遊液作成器にてシングルセル（ｓ
ｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ）　Ｐ’ｄ濁液とした。

細胞懸詞液は、ＤＢＡ／　２の本物質投与群、非投与群
の２群、Ｃ３Ｈの本物質投与群、非投与群の２群、計４
群で各々分けた。それぞれの細胞懸濁液群を１０　ｄの
ＲＰ旧１６４０培地によく懸濁し、ｔ、ｏｏｏ　ｒ、ｐ
、ｍｌ、１０分間遠心した。得られたセルペレット（ｃ
ｅＩＩ　ｐｅｌｌｅｔ）は２．５−のへモリシス緩衝液
（０，１８Ｍ　ＮＨ，ＣＩ、０．１７　Ｍ　Ｔｒｌｓ−
ＨＣＩを含む）　Ｉ）Ｈ７，Ｇ５に懸濁し、５分間放置
し赤血球を溶血させた後、８ＩｄのＲＰ旧１６４０培地
を加え１．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、１０分間遠心した。そ
の後セルペレットに　１０　ｍ２のＲＰＭＩＩＧ４０培
地を加え再遠心した。この操作を３回繰り返し、ヘモリ
シス緩衝液をよ（取り除いた。

セルペレットにｌＯ−のｌＯ％ＦＣ９添加ＲＰ旧１６４
θ培地を加え、よく懸濁した後トリパンブルー染色法に
より生細胞数カウント（ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｃｏ
ｕｎｔ）を行い（いずれも９０％以上のｖｉａｂｉｌｉ
ｔｙであった）細胞数を　ｌ　Ｘ　　１０６／艷に調整
した。

上記４群の細胞懸濁液をそれぞれ１×１０６細胞／ウエ
ル（ｃｅｌｌ／ｗｅ日）ずつ　ＤＢＡ／２と０３１１の
組合せに成るように９６ウエルプレート（ｗｅｌｌ　ｐ
ｌａｔｅ）にプレイティングした（ｆｉｎａｌ　２　Ｘ
　　１０５ｃｅ１１／ｗｅｌｌ）。ＤＢＡ／　２と０３
Ｈの組合せは、ＤＢＡ／　２の非投与群と０３Ｈの非投
与群同士の組合せ、ＤＢＡ／２の投与群とＣ３１１の非
投与群の組合せ、ＤＢＡ／２の非投与群と０３Ｈの投与
群の組合せ、及びＤＢＡ／２と０３Ｈの投与群同士の組
合せの４組とした。

上記の組合せで３７°Ｃ１５％ＣＯ２，９５％空気の条
件で４日間培養し、その後０．２５μＣ１の３Ｈ−チミ
ジン（ＮＥＮ）を加え更に　１６時間培養して、セルハ
ーベスタで細胞を集めよく洗浄した後、乾燥し、２ｄの
トルエンシンチレータ−を加え液体シンチレーションカ
ウンターで放射活性の測定を行った。

その結果を第１θ図に示す。

本物質非投与のＤＢＡ／　２と本物質非投与の０３Ｈの
組合せでは１９，３４７±２，１４８　ｃｐｍ　（１０
０％）であったものが、本物質投与のＤＢＡ／　２と本
物質非投与のＣ３Ｈとの組合せでは４８６６％に下がり
、本物質非投与のＤＢＡ／２と本物質投与のＣ３Ｈとの
組合せでも５６．７％とほぼ同程度に３Ｈ−チミジンの
取り込み低下が認められた。本物質投与のＤＢＡ／　２
　七Ｃ３Ｈとの組合せでは更に２０．４％まで下がった
。

２）　ｏｎｅ　ｗａｙ法 ＢＡＬＢ／Ｃ，Ｃ３Ｈ（両マウスともオス、４週齢、日
本チャルズリバー）それぞれ１０匹ずつを用いて行った
。

ＢＡＬＢ／　Ｃ及びＣ３Ｈともそれぞれ５匹ずつを本物
質投与群とし、本物質７００μｇ／＋ｄ　（ＰＢＳ溶液
）を０．２　ｍＱずつ１週間の間に３同腹腔内投与した
（ＢＡＬＢ／Ｃ，ＣＧＨとも７．３ｍｇ／Ｋｇ）。残り
のマウスＢＡＬＢ１０５匹、０３Ｈ５匹の計１０匹は非
投与群とした。

本物質投与開始から７日目に本物質投与群及び非投与群
の計２０匹のマウスからそれぞれ外科的に且つ無菌的に
肺臓を取り出し、ｔｗｏ　ｗａｙで行ったのと同様にし
て細胞浮遊液作成器にてシングルセル（ｓｉｎｇｌｅ　
ｃｅｌｌ）　ｉ°Ｉ！！濁液とし、ヘモリシス緩衝液（
０，ｌＧ　Ｍ　ＮＨａＣｌ、　　０．１７　Ｍ　Ｔｒｌ
ｓ−ＨＣＩを含む）　ｐＨ７゜６５にて赤血球を取り除
いた。

本物質非投与のＢＡＬＢ／　Ｃ及びＣ３Ｈのの一部それ
ぞれｌ　Ｘ　１０”個を２ｍ９のＲＰＭＩＩＧ４０培地
に懸濁し、ＭＭＣ（マイトマイシンＣ１シグマ社）　　
４００μｇ／ｄを０　、１２５−ずつ加え、３７°Ｃ１
３０分間インキュベートした。その後ＲＰＭＩＩＧ４０
培地ｌθ−を加え、１１００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、７分間遠
心して洗浄しこれを３回繰り返した。

次いで細胞をｌ　Ｘ　１０７細胞／＋ｕｌｌ　（ｃｅｌ
ｌｓ／　ｍＱ　）に調整し、これを刺激細胞とした。一
方、ＭＭＣ処理していないＢＡＬＭ　Ｃ及びＣ３Ｈの本
物質投与群、非投与群の計４群を反応細胞とし、１ｘ１
０７細胞／艷（ｃｅ　ｌ　ｌ　ｓ／　ｍＱ　）に調整し
た。

上記４群の反応細胞をｌ　Ｘ　１０６細胞／　、ｄ　（
ｃｅ　ｌ　ｌＳ／−）ずツ９６穴ウェル（ｗｅｌｌ　ｐ
ｌａｔｅ）に接種し、刺激細胞（Ｃ３ＨとＢＡＬＢ／Ｃ
由来）２群を同様に加え計８群の組合せをつくった。

上記の組合せで３７°Ｃ１５％ＣＯ２，９５％空気の条
件で４日間培養し、その後０．５μＣｉのａＨ−チミジ
ン（ＮＥＮ）を加え更に１６時間培養して、セルハーベ
スタで細胞を集めてよく洗浄した後、乾燥し、２艷のト
ルエンシンチレータ−を加え液体シンチレーションカウ
ンターでそれぞれの組合せの放射活性の測定を行った。

その結果を表５に示す。

以下余白 Ｃ３Ｈが刺激細胞の場合、本物質非投与のＲＡＬＢ／　
Ｃとの組合せでは、スティミュレーションインデックス
（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ；Ｓｌ）が２．
７％（１００％）であったのに対し、本物質を投与した
ＢＡＬＢ／Ｃとの組合せでは８５％まで反応性が低下し
た。

一方ＢＡＬＢ１０が刺激細胞の場合には、本物質非投与
の０３Ｈとの組合せではＳｌが８．８（１００％）であ
ったのに対し、本物質投与のＣ３Ｈとの組合せでは３．
６（１００％）と、反応性が低下した。

以上のように混合リンパ球培養系を用いたアレルギータ
イプ■に対する本物質の抑制効果が確認された。

実施例６ 毒性試験： 本物質をＩｃＲマウス（日本チャールズリバー社、オス
、６週齢、３０．５　ｇ±２　ｇ）に　ｌ０ｍｇ／Ｋｇ
体重で静脈注射し、毒性を確認した。毒性の判断は、体
重変化、死亡の有無、一般症状の観察、試験後の解剖検
査によった。投与直後、多少の体重の減少がみられたが
すぐに回復し、その他の所見でも毒性は示さなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本物質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分子量測定結果を示す。尚、第１図において
（１）は、分子量測定に用いた標準蛋白質で分子量の高
い方からホスフォリラーゼＢ（Ｍ、Ｗ、　９４，０００
）、ウシ血ｌ青アルブミン（Ｍ、Ｗ、　６７．０００）
、オボアルブミン（Ｍ、Ｗ、　４３，０００）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（Ｍ、Ｗ、　３０，０００）、ソ
イビーントリプシンインヒビター（間、Ｗ、　２０．！
００）、α−ラクトアルブミン 泳動結果、（３）は還元した本物質の泳動結果を示す。 第２図は、　トリシン−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動の結果を示す。 第３図は本物質の等電点電気泳動による等電点測定結果
を示す。１は、等電点マーカー（等電点レンジ２．４〜
５１３５）を示し、２は、本物質の泳動結果を示す。 第４図は、本物質をネイティブポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけた後、ゲルの可視部吸収（ＢＨ　ｎｍ）
をスキャナー（ＢｅｃｋｍａｎｌＤＶ−８　ＳＬＡＢ　
ＧＥＬＳＣＡＮＮＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ）によって測定
した結果を示す。 第５図は、リンパ球各分画と本物質反応後の３Ｈ−チミ
ジンの取り込み量の測定結果を示す。図に使用した各リ
ンパ球の略号は、先に述べた略号通り。 第６図は、ＣＦＷマウスを用いたアナフラキシー実験の
際のマウス体重の経時変化を示す。 第７図は、ＮＯＤマウスを用いたインスリン依存性糖尿
病の抑制実験の際の本物質投与群と非投与群のマウス体
重の経時変化を示す。 第８図は、正常マウスであるＩＣＲマウスと本物質投与
ＮＯＤマウスと非投与ＮＯＤマウスの１３週船齢後光学
写真による膵臓組織を示す。 Ａ群は、ポジイティブコントロールを、Ｂ群は本発明物
質の投与群をそしてＣ群はネガティブコントロールを示
す。 第９図は、ＣＦＷマウスを用いたアレルギー■型のアル
サス反応動物実験の際の、本物質投与群と非投与群マウ
スの抗原注射後の反応マウスの経時変化を示す。 第１Ｏ図は、ＤＢＡ／２及びＣ３１１マウスリンパ球の
本物質処理または未処理群の組合せによるＭＬＣでの３
Ｈ−チミジンの取り込み量を示す。 出 願 人 明 治 乳 業 株 式 第 図 第２図 カルボニックアンヒドラーゼ 移動度（ｃｍ） 第３図 諷 ハ Ｙ−ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｍｍ）−−− →Ｙ−ｓｔａｒｔ　＝５５ Ｙ−ｓｔｏｐ　＝　１４５ Ｙ−ｓｔｅｐ＝５ 葛 ａ 轡 　ｃｅｌｌ ｈｃｅｌｌ Ｔｓ　ｃｅｌｌ Ｅ３”Ｍｐ　Ｔｈ”ＶＩｐ Ｔｓ−ラ 体重（９） 体重（９） 反応したマウス（％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、マンネンタケ属（￥Ｇａｎｏｄｅｒｍａ￥）菌糸体
   由来で、ヒト赤血球を凝集せず、免疫抑制能を有する、
   新規な蛋白質。 ２、蛋白質の一次構造部分のアミノ酸配列が以下の配列
   を持つ請求項１の新規な蛋白質。▲数式、化学式、表等
   があります▼ ３、以下で表される、請求項２記載のアミノ酸配列をコ
   ードする構造遺伝子を含むＤＮＡ配列。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ４、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）の菌糸体を
   培養し、得られた菌糸体を水性溶媒で抽出し、精製する
   ことを特徴とする、請求項１、若しくは２の新規な蛋白
   質の製造法。 ５、マンネンタケ属（￥Ｇａｎｏｄｅｒｍａ￥）の菌糸
   体の培養を静置培養、振盪培養若しくは浮遊攪拌培養で
   行うことを特徴とする請求項３記載の新規な蛋白質の製
   造法。 ６、水性溶媒での抽出を８０℃を越えない温度で、且つ
   ｐＨ６〜８で行うことを特徴とする請求項３記載の新規
   な蛋白質の製造法。 ７、請求項１若しくは２の新規な蛋白質の有効量を含有
   する免疫抑制剤。