FI74474C - Foerfarande foer framstaellning av nya, ur klebsiella pneumoniae extraherade glykoproteiner. - Google Patents

Description

i 74474

Menetelmä Klebsiella Pneumoniaesta uutettujen uusien glyko-proteiinien valmistamiseksi

Keksintö koskee Klebsiella Pneumoniaesta uutettujen 5 vesiliukoisten, immuunivastetta stimuloivien, uusien glyko-proteiinien valmistusmenetelmää.

Tietyissä FR-patenteissa on jo kuvattu Klebsiella Pneumoniaesta uutettuja glykoproteiineja, niitä ovat esimerkiksi FR-patentit 2 043 475, 2 088 112 ja 2 171 907.

10 Glykoproteiinien seos tunnetaan FR-patentista .

2 171 907, josta esillä oleva keksintö on valintakeksintö, ja koskee tarkemmin määriteltyjen uusien, vesiliukoisten, immuunivastetta stimuloivien glykoproteiinien valmistusta, jotka on uutettu Klebsiella Pneumoniaesta ja jotka sisältä-15 vät 30-45 % proteiineja, 30-40 neutraalimonosakkarideja, vähintään 4 % glukuronihappoa, 2-5 % sokerien amiineja ja joiden molekyylipaino on noin 350 000 daltonia.

Keksinnön mukaisesti valmistetut glykoproteiinit ovat aktiivisempi kun FR-patentista 2 171 907 tunnetut kysymyk-20 sen ollessa solunsisäisten taudinsiementen aiheuttamista infektioista annettaessa lääkeainetta intraperitoneaalisesti tai oraalisesti; ne ovat myös aktiivisempia rakkulamaisten makrofagien fagosyyttisolujen aktivointikokeessa sekä aktiviteetin "Natural Killer (NK)" in vivo stimuloinnissa.

25 Neutraalimonosakkarideilla tarkoitetaan etenkin sel laisia neutraaliheksooseja kuten glukoosi, mannoosi tai ga-laktoosi.

Tämän vaatimuksen mukaan valmistettujen glykoproteiinien molekyylipainot on määritetty ultrasentrifugoinnilla. 30 Keksinnön mukaiset glykoproteiinit on voitu uuttaa eri Klebsiella Pneumoniae lähteistä; kuitenkin aivan erityisesti käytetään sellaisia, jotka ovat peräisin PASTEUR-Instituutin tallettamasta kannasta numerolla 52 145.

Glykoproteiinien rakennetutkimukset ovat tehneet mah-35 dolliseksi määritellä niiden koodstumuksen ja rakenteen käyttämällä erilaisia kemiallisia tekniikoita, etenkin uro-nihappotähteiden pelkistämistä karbodi-imidillä, permety- 2 74474 lointia, uronihappojen degradointia, perjodaattihapetusta tai kromioksidihapetusta.

Keksinnön mukaan tehdyt glykoproteiinit ovat muodostuneet yhdestä proteiiniketjusta, johon polysakkaridiosa 5 on kiinnittynyt.

Parhaat keksinnön mukaan valmistetut glykoproteiinit ovat sellaisia, joissa proteiiniosassa on noin 30 % happamia aminohappoja. Happamat aminohapot tarkoittavat sellaisia aminohappoja kuin asparagiinihappo ja glutamiinihappo.

10 Parhaat keksinnön mukaan valmistetut glykoproteiinit ovat myös sellaisia, joissa polysakkaridiosassa on keskimäärin yksi glukoosimolekyyli neljää galaktoosimolekyyliä kohti.

Näiden joukosta käytetään aivan erityisesti niitä, 15 joissa polysakkaridiosa on muodostunut olennaisesti seuraavanalaisen rakenteen mukaisista toistuvista polysakkaridi-yksiköistä: _-?galaktoosi^-L--ga laktoosi—--glukoosi"*·- —

20 - ' J

jossa m on yhtä kuin kokonaisluku 3, 4 tai 5. On voitu määritellä, että tässä rakenteessa n on kokonaisluku 94 tai siitä, hieman eroava, kun m on 5.

Tässä kuvatussa uusien vesiliukoisten glykproteiinien 25 valmistusmenetelmässä käsitellään kvaternäärisellä ammonium-yhdisteellä glykoproteiiniliuosta, joka on saatu Klebsiella Pneumoniae -viljelmän lysaattiuutetta ultrafiltroimalla, erotetaan supernatantti poistamalla saatu sakka, käsitellään supernatanttia, joka on glykoproteiinien suolaliuos, kyl-30 mällä, molekyylipainoltaan pienellä alkoholilla, jolloin saadaan uusi saostuma, joka liuotetaan veteen, dialysoi-daan, lyofilisoidaan, liuotetaan uudestaan, geelisuodate-taan ja sitten kerätään ensimmäinen eluoitu fraktio, konsentroidaan ja haluttaessa kuivataan.

35 Menetelmän alussa voidaan käyttää erilaisia gly- 3 74474 koproteiiniliuoksia, jotka on saatu ultrasuodattamalla Klebsiella Pneumoniae -viljelmien lysaatteja kalibroiduilla^ huokoisilla kalvoilla, jotka pystyvät pidättämään näille kalvoilla annetun vakioisen molekyyli-5 painorajan ylittävät molekyylit.

Käytetyt kalvot ovat esimerkiksi kauppanimillä AMICON XM50, PM30 tai UM2 myytävät kalvot, mutta on parempi käyttää kalvoja, joiden pidätyskynnys on 100 000 daltonia, kuten esimerkiksi AMICON-yhtiön 10 kaupalliset kalvot merkinnällä XM100 tai Hl P100; kal vot, jotka ovat erityisen suositeltavia, pidättävät molekyylipainoltaan 300 000 daltonia suuremmat molekyylit; tällaisia on saatavissa kaupallisina kalvoina AMICON ja ROMICON-yhtiöiden valmistamina merkinnäl-15 lä XM300.

Ultrafiltraatiolla on mahdollista valikoida liuoksesta molekyylit, joiden molekyylipaino on tiettyä molekyylipainoa suurempi, kuten edellä sanottiin, valitsemalla kalvo, jolla on haluttu pidätyskynnys.

20 Asiantuntijalle on selvää, että on aivan mahdollista käyttää ominaisuuksiltaan muita samanlaisia liuoksia, jotka on saatu muilla tavoilla, kuten hydrofiilisellä, polymeroidulla geelikromatografialla.

Ennen tätä valikointitoimenpidettä lysaatista 25 voidaan hyvin mielellään poistaa lipidit ja nukleiini hapot .

Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamisolo-suhteissa, jotka ovat erityisen suositeltavia, glyko-proteiinien kantaliuos on saatu menetelmän mukaan, joka 30 on kuvattu toisessa lisäselvityksessä no. 2 171 907 ranskalaisessa patenttihakemuksessa no. 2 043 475.

Tässä lisäselvityksessä glykoproteiinien molekyylipaino on määritetty geeliekskluusiotekniikalla.

Kvaternäärinen ammoniumyhdiste, jota käytetään 35 glykoproteiinien kantaliuoksen käsittelemiseen, voi olla esimerkiksi setyylipyridyyliammoniumkloridi, mutta erityisesti setyylitrimetyyliammoniumbromidi eli Cetavlon.

4 74474

Kvaternäärisen ammoniumyhdistekäsittelyn jälkeen saatu sakka voidaan erottaa supernatantista klassisilla menetelmillä, kuten dekantoimalla tai suodattamalla, mutta mieluiten erotetaan sentrifugoimalla. Saatua 5 liuosta sitten käsitellään kylmässä noin +4°C:ssa käyttämällä molekyylipainoltaan pientä alkoholia, kuten metanolia, etanolia, n-propanolia tai isopropanolia.

Mieluiten käytetään etanolia.

Mielenkiintoisimmat tulokset on saatu käyttämäl-10 lä kuusi tilavuutta etanolia yhtä suolaliuostalavuutta kohti, yön yli +4°C:een lämpötilassa.

Sakka liuotetaan uudestaan veteen ja dialysoidaan sen puhdistamiseksi. Dialyysi suoritetaan klassisen, kalvon sulkeman kammion avulla, esimerkiksi kollodiumis-15 ta tai selluloosasta valmistetun kalvon läpi. Muistet takoon etenkin kammiot, joiden kalvo on regeneroitua selluloosaa, huokosten läpimitta keskimäärin noin 24 A, jolloin molekyylipainoltaan 12-14 000 daltonia suuremmat molekyylit jäävät kalvon sisäpuolelle. Dialyy-20 sikammioiden joukosta mainittakoon erityisesti VISKING- putket.

Tämän dialyysin avulla voidaan poistaa glykopro-teiiniliuoksesta jäljelle jääneet pienimolekulaariset epäpuhtaudet kuten alkoholijäämät.

25 Konsentrointi kuiviin voidaan tehdä klassisella tekniikalla, esimerkiksi sumuttamalla tai lyofilisoin-nilla.

Lyofilisointi tehdään klassisella tavalla, esimerkiksi keskikokoisissa jäädytys-tiivistys-laitteissa 30 kuten kaupallisen yhtiön Soci§t§ Usifroid'n malleissa SMU tai SMRG, tai suurikokoisissa lyofilisaattoreissa kuten esimerkiksi laitteessa, johon kuuluu jäädyttäjä CAI ja tiivistäjä SMIRS, joita kumpaakin valmistaa kaupallisesti Usifroid.

35 Pienempiä laboratoriomalleja voidaan myös käyt tää, samoin kuin muitten kaupallisten yhtiöiden malleja kuten Serail'n.

5 74474

Lyofilisointivaiheet ovat valinnaisia, mutta kuitenkin suositeltavia.

Geelisuodatus tehdään suoraan veteen liuotetusta lyofilisaatista tai sitten käyttämällä glykoprote-5 iinien vesiliuosta. On kuitenkin parempi puskuroida suodatettava liuos ja suorittaa eluutio samalla liuoksella; puskuri tehdään mieluiten ammoniumkarbonaatista siten, että suodatettava glykoproteiiniliuos on 0,1M puskurissa.

10 Käytettävät geelit voivat olla esimerkiksi kau pallisella nimellä saatavaa Sephadexiä; on parempi käyttää kauppanimillä SSphacryl S 300 tai Ultragel ACA 34 olevia geelejä, etenkin jälkimmäistä.

Suodatusta voidaan seurata klassisten menetel-15 mien mukaan, etenkin käyttämällä UV-spektrofotomet- riaa 238 nmrssä.

Parhaissa toteuttamistavoissa jäljempänä kuvatussa menetelmässä on olennaista se, että - käytetty kvaternäärinen ammoniumyhdiste on setyyli- 20 trimetyyliammoniumbromidi; - supernatantti erotetaan sentrifugoimalla; - pienen molekyylipainon omaava alkoholi on etanoli; - käytetty geeli on Ultragel ACA34 - eluoitu fraktio kuivataan lyofilisoimalla 25 Tällä menetelmällä saaduilla glykoproteiineil- la, joita tämä keksintö koskee, on hyvin mielenkiintoisia farmakologisia ominaisuuksia; ne stimuloivat huomattavasti immunivastetta, ja ovat hyvin tolerantteja.

Näitä ominaisuuksia on kuvattu edempänä kokeel- 30 lisessa osassa.

Nämä ominaisuudet oikeuttavat käyttämään tämän hakemuksen mukaisia glykoproteiineja lääkkeinä.

Näillä lääkkeillä on käyttöä esimerkiksi ihmisellä ja eläimellä bakteerien tai virusten aiheutta-35 mien infektiotautien hoidossa tai torjunnassa, lois- 6 74474 tautien hoidossa, myrkkyjen aiheuttamissa infektioissa, sairaalainfektioiden ja leikkausinfektioiden hoidossa .

Tavallinen annos, joka vaihtelee kulloinkin käy-5 tetyn tuotteen, hoidettavan kohteen ja vaikutuksen mu kaan, voi olla esimerkiksi ihmisellä 1-15 mg päivässä suun kautta nautittuna, 1-15 mg päivässä rektaalises-ti ja 0,25-5 mg päivässä parenteraalisesti annosteltuna.

Keksinnön mukaan saatuja uusia glykoproteiineja 10 voidaan siis käyttää farmaseuttisten valmisteiden teke miseen ne mukaanlukien vaikuttavina aineosina.

Tämän hakemuksen mukaisella menetelmällä valmistettuja glykoproteiineja voidaan lääkkeinä antaa ruuansulatuskanavan kautta, parenteraalisesti tai paikal-15 lisesti.

Vastaavat farmaseuttiset valmisteet voivat olla esimerkiksi kiinteitä tai nesteitä tai olla sellaisessa farmaseuttisessa muodossa, jota usein käytetään ihmis-lääketieteessä, kuten esimerkiksi pillereinä, yksin-20 kertaisina tai rakeina, geeleinä, jyväsinä, liuoksina, siirappina, suppoina, injektoitavina valmisteina lyo-filisoituna tai ei, soikioina, salvoina, voiteina, liuoksina, tippoina, silmävoiteina, aerosoleina; ne on valmistettu tavanomaisilla menetelmillä. Vaikuttava(t) 25 aineosa(t) voidaan sekoittaa täyteaineeseen, joita yleisesti käytetään lääkevalmisteissa, kuten talkkiin, arabikumiin, laktoosiin, tärkkelykseen magnesiumstea-raattiin, kaakaovoihin, vesiliukoisiin tai liukenemattomiin kantajiin, eläin- tai kasvirasvoihin, parafiini-30 johdannaisiin, glykole.ihin, erilaisiin vaahtoaviin, dispergoiviin tai emulgoiviin aineisiin, säilytysainei-siin.

Nyt annetaan keksinnön toteuttamistavasta esimerkkejä.

7 74474

Esimerkki 1 20 g sellaista tuotetta kuin ranskalaisen patenttihakemuksen no. 2 171 907 esimerkissä 1 oli saatu liuotetaan kahteen litraan deionisoitua vettä.

5 Lisätään hitaasti noin 1,6 litraa 3 %:sta CStavlonia, seosta ravistellaan yhden tunnin ajan, sitten sentrifugoi-daan 10 000 kierrosta minuutissa 15 minuutin ajan. Sakka poistetaan, erotettuun supernatanttiin lisätään sitten 3 litraa 95 %:sta etanolia 15 minuutin aikana. Tunnin ravis-10 telun jälkeen sentrifugoidaan 10 000 kierrosta minuutissa 15 minuutin ajan, näin saatu supernatantti heitetään pois ja sakka liuotetaan 1 litraan vettä ja dialysoidaan 48 tuntia Visking-putkissa deionisoitua vettä vastaan +4°C:ssa. Tämän dialyysin päätyttyä liuos lyofilisoidaan. Saadaan 15 6,2 g glykoproteiineja, joista 1 g liuotetaan 10 ml:aan 0,1 M ammoniumkarbonaattia. Liuos pannaan pylvääseen, jonka halkaisija on 2,5 cm ja jossa on noin 1 litra Ultragel ACA34:ää (eluantti: 0,1 M ammoniumkarbonaatti), ensimmäisen eluutiohuipun fraktiot (mitattu UVrllä 280 nm:ssä) yhdis-20 tetään ja lyofilisoidaan ja saadaan 0,51 g haluttua puhdistettua proteiinia, joiden koostumus on: neutraalimonosakkarideja 35,3 % uronihappoja 0 % oksamiineja 3,5 % 25 aminohappoja 39,4 % vettä 7 %

Esimerkki 2 20 g sellaista tuotetta kuin ranskalaisen patenttihakemuksen no. 2 171 907 esimerkissä 1 oli saatu, liuote-30 taan 1 litraan deionisoitua vettä. Lisätään sekoittaen 0,800 litraa 3 %:sta C£tavlonia. Tunnin sekoituksen jälkeen, sentrifugoidaan 10 000 kierrosta/min 15 minuutin ajan. Sakka heitetään pois, erotettuun supernatanttiin lisätään 1,5 litraa 95 %:sta etanolia. Tunnin sekoituksen jälkeen 35 sentrifugoidaan 15 minuuttia 10 000 kierrosta/min. Supernatantti heitetään pois, ja sakka liuotetaan uudestaan 0,5 8 74474 litraan vettä ja dialysoidaan 48 tuntia Visking-putkissa deionisoitua vettä vastaan -4°C:ssa.

Tämän dialyysin loputtua liuos lyofilisoidaan ja saadaan 6,5 g haluttuja glykoproteiineja, joita puhdiste-5 taan geelisuodatuksella Ultragel ACA34:n läpi esimerkissä 1 kuvatulla tekniikalla, ja saadaan 3,28 g haluttuja glykoproteiine ja, joiden koostumus on: neutraalimonosakkarideja 34,0% uronihappoja 0 % 10 oksamiineja 3,1% aminohappoja 38 % vettä 7 % 15 Farmakologinen tutkimus A) Immunivastetta stimuloiva ja mitogeeninen vaikutus 10:lie hiirelle injektoidaan jalkapohjiin 40,ug 20 tutkittavaa tuotetta ja 40^ug naudan albumiinia eläintä kohti. Kuusi päivää myöhemmin niihin ruiskutetaan laskimonsisäisesti sellainen annos seerumin albumiinia, joka ei tapa eikä aiheuta shokkia (lOO^ug eläintä kohti).

Kontrollieläimet eivät saa kuin seerumin albumiinia 25 ensimmäisestä injektiosta lähtien.

Immuunivastetta stimuloiva vaikutus mitataan vasteen lisääntymisenä seerumin aiheuttamassa anafylakti-sessa shokissa ja mitogeeninen vaikutus injektiokohtaan muodostuvien solmukkeiden painon lisääntymisenä.

30 9 74474 1) Immunivastetta stimuloiva vaikutus:

Lasketaan niiden eläinten lukumäärä, joilla on shokkitila (hengenahdistusta, johon liittyy kuonon sinisyyttä, ja johtaa takaruumiin halvaantumiseen, 5 kouristuksiin ja kuolemaan), samoin kuolleisuus kaksi tuntia laskimonsisäisen seerumin albumiiniruiskeen antamisen jälkeen.

Tulokset:

Tuote esimerkisä no. % shokin saaneita % kuolleita 10 __eläimiä_ 1 60 40 2 100 50 kontrollit 0 0 2) Mitogeeninen vaikutus: 15 Kuusi tuntia laskimonsisäisen seerumin albumii niruiskeen jälkeen uhrataan eloonjääneet, poistetaan solmukkeet, jotka ovat muodostuneet pistoskohtaan tai sen käpälän taipeeseen, johon ruiske on annettu, ja punnitaan ne.

20 Mitogeeninen vaikutus ilmaistaan indeksin avul la, joka ilmaisee tutkitulla tuotteella käsiteltyjen eläinten solmukkeiden keskimääräisen painon suhteen sellaisten kontrollieläinten solmukkeiden painoihin, jotka eivät ole saaneet kuin seerumin albumiinia.

25 Tulokset:

Tuote esimerkistä no._Indeksi _ 1 9,1 2 7,2

Esimerkkien 1 ja 2 tuotteet osoittavat hyvin 30 suurta immuunivastetta stimuloivaa ja mitogeenista vaikutusta.

74474 ίο B - Epäspesifisten puolustusmekanismien stimulaatio Tätä stimulaatiota on tutkittu hiilen 'Clearance'-kokeella hiirillä käyttämällä hyväksi HALPERNin aloittamaa tekniikkaa, jossa injektoidaan eläimen silmä-5 kuoppaan kolloidinen hiilisuspensio, ja määritetään ajan funktiona hiilen häviämisen kinetiikka verestä mittaamalla optista tiheyttä.

Tuotteet annetaan eläimelle vatsaontelon kautta kaksikymmentäneljä tai neljäkymmentäkahdeksan tuntia 10 ennen koetta. Tulokset ilmaistaan prosentteina hiili-partikkelien poistumisessa verrattuna kontrolleihin, jotka ovat saaneet vain kolloidisen hiili-injektion ja joiden hiilipartikkelien lukumäärä on 100 %.

Tuote 15 Esimerkistä no. Annokset % va^uskesto^uollein verrattuna 8 minuuttia 30 min. infektion injektion jälkeen _jälkeen_.

1 0,25 mg/kg 50 % 70 % 2 0,25 mg/kg 50 % 70 % 20 Näiden tulosten tarkastelun perusteella voidaan huomioida näiden kahden tuotteen aiheuttama voimakas stimulaatio organismin puolustusmekanismeihin.

c) Akuutti myrkyllisyys 50 %:sti tappava annos (LD^0) vatsaontelon kaut- 25 ta annettuna on määritetty hiirille BEHRENSin ja KARBERin mukaan.

Se on 30 mg/kg esimerkkien 1 ja 2 mukaisille glykoproteiineille.

D) Toleranssi 30 0,2 ml esimerkkien 1 ja 2 mukaisia glykoprote- iineja ihonsisäisenä pistoksena 1000 /"/kg hiirellä ei aiheuta paikallista eikä yleistä toleranssia.

Claims (6)

1. Menetelmä uusien vesiliukoisten, immunivastetta stimuloivien glykoproteiinien valmistamiseksi uuttamalla

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että - käytetty kvaternäärinen ammoniumyhdiste on setyylitrime-tyyliammoniumbromidi; - supernatantti erotetaan sentrifugoimalla; - pienimolekulaarinen alkoholi on etanoli; 25. käytetty geeli on Ultragel ACA34; - eluoitu fraktio kuivataan lyofilisoimalla.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykoproteiinit on uutettu PASTEUR-Instituutin numerolla 52 145 tallettamasta kan- 30 nasta.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiiniosassa on noin 30% happamia aminohappoja.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että polysakkaridiosassa on suunnilleen yksi glukoosimolekyyli neljää galaktoosimolekyyliä kohti. 12 74474

5 Klebsiella Pneumoniaesta glykoproteiinit, jotka sisältävät 30-45% proteiineja, 30-40% neutraalimonosakkarideja, vähintäin 4% glukuronihappoa, 2-5% monosakkaridien amiineja ja joiden molekyylipaino on noin 350 000, tunnettu siitä, että käsitellään kvaternäärisellä ammoniumyhdisteel-10 lä glykoproteiiniliuosta, joka on saatu ultasuodattamalla Klebsiella Pneumoniae -viljelmän lysaattiuute, supernatant-ti erotetaan poistamalla sakka ja supernatanttia, joka on glykoproteiinien suolaliuos, käsitellään kylmällä pieni-molekulaarisella alkoholilla uuden saostuman saamiseksi, 15 joka liuotetaan uudelleen veteen, dialysoidaan, lyofili-soidaan, liuotetaan uudestaan, geelisuodatetaan, minkä jälkeen kerätään ensimmäisenä eluoitu fraktio, konsentroidaan ja mahdollisesti kuivataan.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysakkaridiosa on muodostu-nutperäkkäin toistuvista polysakkaridiyksiköistä, joiden rakenne on 5 /3 1» 3 14 1 -4—galaktoosi1 \ m-galaktoosi--glukoosi--- jossa m on kokonaisluku 3, 4 tai 5. 10 13 7 4 4 7 4