JPS6058921A - 抗腫瘍性物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍性物質並びにその製造法に関し、さらに
詳しくはキクムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎ
　−ｔｒｏｔｕｓ　ｎｕｄｕｓ　）の水性溶媒抽出物で
ある新規な抗腫瘍性物質並びにその製造法に関するもの
である。

天然物質からの非細胞毒性の癌化学療法剤として抗腫瘍
性多糖が１９６４年頃より注目されるようになシ、笹か
らのパンフォリン又はサルノコシカケ、シイタケ、シロ
キクラダ、ウラジロコウヤクタケ、チャヒラタケ等の担
子菌類熱水抽出エキス、細菌類、酵母類、地衣類からの
多糖類等が細胞毒に起因せずに顕著な抗腫瘍性を示すこ
とが報告されている。

本発明者らも非細胞毒性の癌化学療法剤の開発全企画し
て研究を行い、一連の高等植物及び微生物からの多糖類
が宿主介在性抗腫瘍性を示すことを発見した。しかしな
がら、それらは抗癌スペクトルが狭く、臨床的利用には
限界があるので、よシ広い抗癌スペクトルを有し、かつ
強力な非細胞栴姓忙睡直寞１４古広イ捺凄ｉ　磐石Ｌ１
イ、仁襟庄物に注目して研究した結果、軟体動物及び鯨
皮動物から得られる高分子画分が抗ｔｈｅ性を有するこ
とを確かめ、先に特許出願した（特開昭５２−１２２６
１２、特願昭５７−３０２４２）。

本発明者らは、鯨皮動物であるキタムラサキウ二の殻の
抽出物中の抗腫瘍活性に注目して研究した結果、そのプ
ロテアーゼ分解物がさらに優れた抗腫瘍活性を有するこ
とを発見し、本発明を完成した。

従って、本発明は、キクムラサキウニの殻から得られる
新規な抗腫瘍性物質並びにその製造法を提供するもので
ある。

本発明の抗腫瘍性物質は、キクムラサキウニの殻の微細
化物を水性溶媒で抽出し、この抽出液を限外済過、ダル
濾過、透析、有機溶媒沈澱、イオン交換樹脂処理、塩析
及び電気泳動からなる群から選ばれた一つ以上の処理と
グロブアーゼ処理に付して分子量５，０００以上の両分
を採取することによシ製造される。

キクムラサキウニは、ストロンギロセントロタス属に属
し、その生殖巣は、生食或は加工用として利用され、生
殖巣を採取した残シの殻（ランタンを含む）および内臓
は廃棄されるか、せいぜい磯釣り等の餌（コマセ）とし
て利用されているにすぎない。本発明の物質は殻に含ま
れるので、上記の廃莱物利用という点から見ても産業上
意味を持つものでおる。

本発明により、キクムラサキウニの穀から抗腫瘍性物質
を得るには、まず殻をチョッパー、ワーリング・プレン
ダー、ポリトロン、超音波処理等によって破砕して微細
化する。

次いでこの微細化物を水性溶媒で抽出する。水性溶媒と
しては、水、各種塩朔溶液、あるいは低級アルコール、
アセトン、ジオキサン等の有機溶媒と水との混合溶媒が
使用される。抽出は通常低温ないし室温で行われる。抽
出液は遠心分離、済過等によって非水溶性区分と分離し
た後、限外濾過、ケ９ルｐ過、透析等によって脱塩し、
必要があれば限外濾過、減圧濃縮等によって濃縮するＯ
上記のごとくして得られた抽出物は必要に応じて分子量
分画してたとえば分子ｆｉ５．’０００以上の両分を採
取する。その方法としては、例えば超遠心分離、限外濾
過、グル濾過、イオン交換体処理、透析、塩析、溶媒沈
澱、電気泳動など高分子複合蛋白質類の分画に使用され
る方法を使用することができる。次いでグロテアーゼ処
理に付し、さらに分子ｆｉ１５，０００以上の両分を採
取する。その方法としては、透析、グル瀝過、限外濾過
、イオン交換処理等があげられ、低分子分解物を除去す
るなど精製することにより、本発明物質が得られる。

かくして得られる本発明の抗腫瘍性物質は以下の物性を
持つ。

■　分子量（透析による） ５．０００以上 ■　塩基性、酸性、中性の区別 中性（ｐ）１６．８〜７．４） ■　物質の色 淡黄色 ■　比旋光度 〔α］　：０（Ｃ＝０．１％、　０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈ）■　溶解性 水にやや難溶 ■　呈色反応 ローリ−反応により蛋白質の呈色を示し、塩酸加水分解
後のニンヒドリン反応においてペプチド結合およびアミ
ノ酸の呈色を示し、フェノール硫酸反応によ多糖類の呈
色を示す。

本発明抗腫瘍性物質は、実施例に示す如く、その一定量
を、ＩＣＲ系マウスに移植したザルコーマ１８０／ＩＩ
瘍に対して局所注射したところ、平均腫瘍抑制率は１０
０．０％、腫瘍完全退縮数は６／６という驚くべき抗腫
瘍性を示した・ 上記のように本発明の物質はいずれも温血動物、たとえ
ば人、家畜、家禽、犬、猫、ウサギ、ラット、マウスな
どの各種の腫瘍特に治療の困難性が指摘されている固型
腫瘍に対してすぐれた抑制作用を示す。

−ｔラウス移植したザルコーマ＋８０１］Ｑｉｉ、ＳＮ
−胞肉腫、エールリッヒ腫瘍などの発育は、本物質を腫
瘍細胞移植前、移植後あるいは移植と同時に腫瘍内、腹
腔内、静脈内もしくは皮下に、あるいは経口的に１回も
しくは繰シ返して、１回当シの投与量が約１〜１，００
０号勺となるように投与することによシ顕著に抑制され
た。

本物質の毒性はきわめて低く、たとえば急性置注試験に
おいてマウスあるいはラットに経口投与および腹腔内投
与した時のＬＤ５ｏ値はそれぞれ５ｇ７ｋｇ以上、２！
Ｖｋｇ以上であシ、人に対しても安全に反復投与するこ
とができる。

投与方法としては腫瘍治療における一般的な方法を適用
できる。そ扛は腫瘍内、皮下、静脈内もしくは必要に応
じて筋肉内への注射、経口投与、直腸内への投与および
外用剤として塗布、点滴などが可能である。投与量およ
び投与スケゾー−ルは患者およびｍＭの種類、症状など
を勘案して適宜選択テキ、一般には一回約０．２〜２，
０００１１１％＜９体重を１日１〜６回投与するのが好
ましい。特に注射剤の場合、１日当り１〜２．０００　
ｍＱＡ１１程度、好ましくけ３〜５００号句程度がよい
。

本物質は他の技師瘍剤と併用することもできる。

免疫学的効果の増強をもたらすような併用は特に効果的
でおる。

本発明の抗腫瘍物質は、上述の如くそれ自体医薬品とし
て使用できるが、更にこれを分画して使用することもで
きる。

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１ 生殖巣を含む全ての内臓を除去したキクムラサキウニの
殻１０ｋｌＩ（湿重量）をチヨッ・や−にかけて砕いて
から、マスコロイダーによシ微粒化したものに、５０１
の蒸留水を加え、冷却ジャケットの付いたステンレス容
器内でポリトロンによシ３分間攪拌抽出した。

抽出液を冷却式遠心分離機によＪ）１５２００Ｇ（０℃
）で１２分遠心分離して得た上清液（４０１）を、）Ｉ
ＩＯＰ−５、ＤＣ−３０型ホロファイツマ−（アミコン
社製）によシ限外濾過して分子１５０００以上の区分に
６１得、これｔ−０，（１１Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で緩衝化したＤＥＡＦセファローズ（５ＥＰｆ
（ＡＲＯ８Ｅ　）　ＣＬ−６Ｂ　（ファルマシアジャノ
ぞンＫＫ＃りを充填したカラム（直径３７副、長さ１５
ｃｍ）に吸着させ、次いで０．３５　Ｍ　ＩＪン酸緩衝
液で溶出される両分を分取し、ＤＣ’−３０型ホロフア
イバー（ＨＩＯＰ−５）　、　ＤＣ−２型ポロフアイバ
ー（ＨＩＰ−５）によシ限外沖過及び濃縮後、濾過され
ない分子量５０００以上の両分（２１）’を凍結乾燥し
て１８ノの乾燥粉末ＳＵＰ　−１を得た。

得られた乾燥粉末１０ｙ−とゾロテアーゼ（プロナーゼ
Ｅ、長瀬産業（株）製）１００■を基質濃度２．５％に
なるように０．０１リン酸緩衝液（ＰＨ７，２）を加え
、３７℃、２３時間反応させ、１２０℃で１５０分加熱
し、反応を停止させた。次いでＶＩ　５Ｋ−ＩＮＧ　Ｃ
ＯＭＰＡＮＹ製透析チー−ブを用い、流水（蒸留水）に
対して４８時間透析した。透析終了後遠心しく　５００
０Ｘノ、１０分）、上清を凍結乾燥し、本発明物質５Ｔ
Ｊｐ　−ｌ　１１８０ｍｐを得た。以下その物性を示す
。

■　分子量 ５０００以上（透析による） ■　塩基性、酸性、中性の区別 中性　（ｐ＋（６，８〜７．４） ■　物質の色 淡黄色 ■　比旋光度 〔α）２０：　Ｏ（Ｃ＝０．１％、　０．１　Ｎ　Ｎａ
ＯＨ）■　呈色反応 ローリ−反応によシ蛋白質の呈色を示し、塩酸加水分解
後、ニンヒドリン反応においてペグチド結合およびアミ
ノ酸の呈色を示し、フェノール硫酸反応により糖類の呈
色を示す。

■　溶解性 水にややｈＪｋ溶 ■　蛋白質、糖含量 蛋白質　４１．０％ 糖　１８．４％ ■　紫外線吸収 第７図参照 ■　赤外部吸収 第１図参照 実施例２ 実施例１と同一の操作によって得られた５ＵＰＩ１１１
をさらに陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーニ付
シ、（カラムＭｏｎｏＱファルマシアファインケミカル
ズ社製：容量８ｍｌ、流速１．　ＯｍＶ分）０．２２Ｍ
　、　０．３２Ｍ　、　０．５Ｍの食塩を含む緩衝液で
段階的に溶出させ、０．３２’Ｍ画分及び０．５Ｍ画分
を得、それぞれＶ　Ｉ　Ｓ　ＫＮＧ　ＣＯＭＰ　ＡＮＹ
ｆｆ透析チー−ブを用い、流水（蒸留水）に対して４８
時間透析した。透析後凍結乾燥し、本発明物質５ＵＰ−
４７及び５ＵＰ−Ｖ　ｉそれぞれ８３ＩｎＩ／、　１０
０ｍ９を得た。

以下その物性を示す。

５ＵＰ−ＩＶ　５ＵＰ−Ｖ ■分子量　５０００以上　５０００以上■以上性、酸性
、中性の区別　中性（ｐＨ６，Ｂ〜７．４）中性（ｐＨ
６，Ｂ〜７．４）■物質の色　淡　黄　色　淡黄色 ■比旋光度　〔α〕２０：０〔α北０：Ｏ■呈色反応・
ローリ−反応　陽　性　陽　性ニンヒドリン反応　陽　
性　陽　性 フェノール硫酸反応　陽　性　陽　性 ■溶解性　水にやや難溶　水にやや難溶■蛋白質・糖含
量蛋白質　１２．１％　８　％糖　１２．６％　７．８
％ ■元素分析　炭素　２５．５９％　２１．７２％水素　
４．３０％　４．２４％ 窒素　６４４％　４．４４％ ［株］紫外部吸収　λｌＮＮａ’ｉ、（ｒｍ）２６ａ　
−ａｘ ■赤外部吸収　第５図参照　第６図参照■構成糖組成 但し表中の百分率は試料中の中性糖の構成百分率である
。

参考例 実施例１に記載のテロテアーゼ処理前の乾燥粉末５ｕｐ
−１１１／　ｋ　、実施例２の記載と同じ陽イオン交換
高速液体クロマトグラフィーに付し、同様の操作によシ
０．２２Ｍ画分、０．３２　Ｍ画分、０．５　Ｍ　１ｉ
ｆｉｉ分Ｋｌ、それぞれ４８時間透析した。透析後凍結
乾燥し、関連物質５ＵＰ−４，５ＵＰ−６，５ＴＪＰ−
８をそれぞれ２４Ｉｒｕｉ１２０ｒｎ＆、２０ｍｇを得
た。これら物質は本発明物質と蛋白・糖含量元素分析・
アミノ酸分析を異にする。それを以下に記す。

■蛋白質・糖含量 ＳＵＰ　−４３ＵＰ　−６８ＵＰ−８ 蛋白質　６８．０　％　７６．０　％　７９．０　％糖
　８．０　％　３．２　％　３．２　％■元素分析 ５ＵＰ−４８ＵＰ’−６８ＵＰ−８ 炭　素　３６．４２％　３３．８８係　３３．２０％水
　素　５．３２％　４．８８％　４．６１％窒　素　１
０．４５％　１０．４８％　９．３０％■アミノ酸分析
（ｎｍｏｌｅ／ｍ２） ■紫外部吸収λｔｎａｘ　（ａｍ）２６７　２６０　２
７４■赤外部吸収　第２図参照第３図参照第４図参照■
構成糖組成 百分率は試料中の中性糖の構成百分率である。

実施例３ 体重的２３ＦのＩＣＲ系マウスの右鼠径部皮下に２Ｘ１
０’個のザルコーマ１８０腫瘍細胞を移植し、移植後４
．６．８口重に１日１回、３日間実施例１及び実施例２
で得た画分８ＵＰ　−ＩＩ　、　ＳＵＰ　＝Ｍ　、Ｓ　
ＵＰ−Ｖまり参考例で得たＳＵＰ　−４、ＳＵＰ　−６
、５ＵＰ−８を腫鳥内に投与した。移植後３５日目の腫
瘍結節を摘出してその重量を測定し、無投与対照群のそ
れと比較して腫瘍阻止率を算出した。

なお試料は注射用蒸留水に懸濁もしくは溶解して投与し
た。各検体の腫瘍阻止率を第１表に示す。

注１） 実施例４ 画分５ＵＰＩＩ　１５０Ｆｌｌｐ 乳糖　４８キ ステアリン酸マグネシウム　２ｑ 計２００ｍｆ 以上を１カプセル尚シの量とする。

上記の割合で５Ｕ−１３０と乳糖とを混合し打錠したの
ち粉砕し、ステアリン酸マグネシウムを混ぜる。混合物
をそれぞれ２号カプセルに充填する。

実施例５ 画分５ＵＰＩＩ　４００ｑ 乳糖　９５■ ＲＰＣ−Ｌ　（オキシグロビルセルローズ）　５■計５
００キ 以上を１用量単位とする。

上記の割合で三者を混合したのち少量の水を加えて練合
機で練合、整粒し、乾燥して再び整粒し、篩過し、上記
の単位毎に分包する。

実施例６ ｒａ）　１ｆｉＡｑＴＴＩ）−１Ｖ　１　ｃｌ　ズー　
ン七　Ｍ　ＦＲ’：ＪＩ　ａ　、し　／　ｄ　ｌ　／　
Ｉ訃　ｔ＆理食塩水）１．０００１ｄに溶解、濾過し、
Ｆ液を５ｍＡずつアンプルに分注、溶閉後常法によシ加
熱滅菌する。

実施例７ 画分５ＵＰ−Ｖ　１６０’ｉク ンルビツト　２００■ カル？キシメチルセルローズ　１０ク ポリソルペート８０　３．２ｍＷ パラオキシ安息香取メチル　４ク パラオキシ安息香酸プロピル　０．４■以上を注射用蒸
留水に混合し、全量を４　ｍｌとする。

【図面の簡単な説明】

第１図から第６図までそれぞれ本発明物質５ＵＰ−■、
関連物質である５ＵＰ−４，５ＵＰ−６，５ＵＰ−８゜
本発明物質５ＵＰ−ＩＶ、　５ＵＰ−Ｖの赤外部吸収ス
被りトルであシ、第７図は５ＵＰ−Ｉｆの紫外部吸収ス
ペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　キクムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｅｅｎ
   ｔｒｏｔｕｓｎｕｄｕｓ　）の殻の水性溶媒ｔｍａｔ物
   のグａテアーゼ分解物から得られる下記の物性を有する
   抗腫瘍性物質Ｏ ■　分子量 ５、０００以上（透析による） ■　塩基性、酸性、中性の区別 中性（ｐｌ−１６，Ｂ〜７．４） ■　物質の色 淡黄色 ■　比旋光度 〔α）：０：　０　（Ｃ＝０．１　％　、　０．１　Ｎ
   　ＮａＯＨ）■　呈色反応 ローリ−反応にょシ蛋白質の呈色全示し、塩酸加水分解
   後ニンヒドリン反応においてペゾチド結合およびアミノ
   酸の呈色をし、フェノール硫酸反応によ多糖類の呈色を
   示す。 ■　溶解性 水にやや難溶 （２）　キクムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎ
   ｔｒｏｔｕｓｎｕｄｕｓ　）の殻の水性溶媒抽出物のグ
   ロテアーゼ分解物から得られる下記の物性を有する特許
   請求の範囲第（１）項記載の抗腫瘍物質。 ■　分子量 ５、　ＯＯ０以上（透析による） ■　塩基性、酸性、中性の区別 中性（ｐＨ６，８〜７．４） ■　物質の色 淡黄色 ■　比旋光度 〔α］　、　０　（Ｃ＝０．１％、　０．１　Ｎ　Ｎａ
   ＯＨ）■　呈色反応 ローリ−反応により蛋白質の呈色を示し、塩酸加水分解
   後、ニンヒドリン反応においてベグチド結合およびアミ
   ノ酸の呈色を示し、フェノール硫酸反応によ勺糖類の呈
   色を示す。 ■　溶解性 水にやや難溶 ■　蛋白質、糖含量 蛋白質　３０〜４５％ 糖　１０〜２０％ （３）　キタムラサキウ＝　（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅ
   ｎｔｒｏｔｕｓｎｕｄｕｓ　）の殻の水性溶媒抽出物の
   プロテアーゼ分解物から得られる下記の物性を有する特
   許請求の範囲第（１）項記載の抗腫瘍性物質。 ■　分子量 ５．０００以上（迫析による） ■　塩基性、酸性、中性の区別 中性（ｐＨ６，８〜７．４） ■　物質の色 淡黄色 ■　比旋光度 〔α］　、　０　（Ｃ＝０．１％、　０．１　Ｎ　Ｎａ
   ＯＨ）■　呈色反応 ｏＱ−反応により蛋白質の呈色を示し、塩酸加水分解後
   ニンヒドリン反応においてペプチド結合およびアミノ酸
   の呈色を示し、フェノール硫酸反応に↓多糖類の呈色を
   示す。 ■　溶解性 水にやや難溶 ■　蛋白質、糖含量 蛋白質　７〜１３％ 糖　７〜１３％ ■　元素分析 炭素２１〜２６％；水素４〜５％；璧素４〜７％ （４）キクムラサキウニの殻の微細化物を水性溶媒で抽
   出し、この抽出液を、限外濾過、ダル涙過、透析、有機
   溶媒沈澱、イオン交換樹脂処理、塩析、電気泳動からな
   る群から選ばれた一つ以上の処理とグロブアーゼ処理か
   らなる分子［５０００以上の両分を採取すること全特徴
   とする抗腫瘍性物質の製造法。