KR970011556B1 - 장수버섯 추출물의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1(A)도는 장수버섯 갓의 형태적 특징을 나타내는 사진이다.
제1(B)도는 장수버섯 자실층의 형태적 특징을 나타내는 사진이다.
제2도는 이온교환컬럼 크로마토그래피에 의하여 다당체를 분리한 결과를 나타내는 그래프이다.
제3도는 조다당체의 농도별 항보체 활성효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 버섯으로부터 다당체 추출물을 정제하는 방법 및 다당체 추출물의 용도에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 포미탤라속 장수버섯(Fomitella fraxinea RDAGB 129)의 다당체 추출액과 전기 다당체 및 단백다당체를 주성분으로 하는 추출물을 포함하는 항암제, 면역조절제 및 기능성 식품에 관한 것이다.
버섯에서 분리한 다당체나 암이나 고혈압, 당뇨병등에 사용된다고 하는 것은 이미 널리 알려져 있으며, 일부는 실제 임상적으로 적용되고 있는 것도 있다. 특히, 이들 다당체는 동물이나 인간의 생체에 부작용이 매우 적은 저독성 물질이기 때문에, 약의 투여량이나 기간을 증가하여도 돌연변이나 알레르기 반응에는 영향을 주지 않는 안전한 물질로 알려져 있다.
또한, 일부 다당체는 고등동물의 면역계에 중요한 역활을 하는 보체(complement)들을 활성화함으로써, 궁극적으로 대식세포(macrophage)나 백혈구 세포들을 활성화시켜 외부에서 침입한 항원들을 탐식하거나 세포막을 공격하여 선별적으로 제거하는 면역기능의 증강에 관계한다.
본 발명의 발명자들은 장수버섯으로부터 분리한 추출액과 수종의 다당체들이 항암제나 발암예방제, 면역증강제로서의 탁월한 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 장수버섯으로부터의 다당체 추출물을 정제하는 방법 및 그로부터 정제된 추출물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명은 전기 다당체 추출물을 유효성분으로 하는 항암제, 면역조절제 및 기능성 식품을 제공한다.
이하, 본 발명의 장수버섯으로부터 추출물을 정제하는 방법을 설명한다.
본 발명에서는 담자균류 중에서 포미탤라속(Fomitella genus)에 속하는 장수버섯을 세절하여 증류수를 가하고 95 내지 100℃에서 2시간 3회 추출, 원심분리한 다음, 상층액을 여과하고 이 액에 2배 부피의 에탄올을 가하여 4℃에서 하루밤 방치하여 침전물을 원심분리로 회수하였다. 회수된 침전물을 아세톤으로 현탁 세척하여 여지로 여과한 다음, 풍건하고 동결건조한 침전분말을 버섯의 추출액 시료로 하였다.
아울러, 동결건조된 버섯추출시료를 인산 완충용액에 용해시키고, 여과한 액을 Cl-로 활성화된 DEAE Sephadex A-25에 충진한 다음, 인산 완충용액으로 분획하여 1종의 중성다당체(NP)를 얻고, 2M NaCl로 분획하여 2종의 산성 다당체 AP1 및 AP2를 분리하였다. 분석결과에 의하면, 중성다당체 NP는 소량의 유론산(uronic acid)을 함유하지만 단백질은 거의 존재하지 않았으며, 산성다당체인 AP1과 AP2는 다량의 유론산과 함께 미량의 단백질이 포함되어 있기 때문에 단백다당체라는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명에서는 인간 종양 간(幹)세포주(human tumor stemcell line)를 직접 이용하는 클로노젠 측정(clonogenic assay) 방법을 이용하여 항종양활성의 검출시간을 단축시키고 인체암은 물론 각종 암에 실질적 효과성이 높은 새로운 항암물질의 선발에 사용할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
포미탤라속 장수버섯의 특성 및 전처리
본 발명의 장수버섯(Fomitella fraxinea REAGB-129)은 담자균류, 포미탤라속에 속하는 버섯으로서 한국내에 자생하는 아카시아 나무에서 분리하였다. 전기 장수버섯의 자실체는 반원형 및 부채형이고, 표면은 적갈색-갈적색을 나타내며, 자실층은 관공형, 포자는 유구형이고, 조직은 제3균사형(Trimitic)으로 아카시아 나무에 사물기생 또는 활물기생한다. 제1도는 본 발명의 장수버섯의 형태적 특성을 사진으로 나타낸 것이다.
본 발명에서는 담자균류 중에서 포미탤라속(Fomitella genus)에 속하는 장수버섯을 세절하여 증류수를 가하고 95 내지 100℃에서 2시간 3회 추출, 원심분리한 다음, 상층액을 Whatmann No.1 여지로 여과하고 이액에 2배 부피의 에탄올을 가하여 4℃에서 하루밤 방치하여 그 침전물을 원심분리로 회수하였다. 회수된 침전물은 아세톤으로 현탁 세척하여 여지로 여과한 뒤 풍건하고 동결건조한 침전분말을 버섯의 추출액 시료로 하였다.
[실시예 2]
이온교환컬럼 크로마토그래피에 의한 다당체의 분리
전기 실시예 1에서 수득한 동결건조된 버섯추출시료를 0.1M 인산 완충용액(pH 7.0)에 용해시키고, 여과한 액을 Cl-로 활성화된 DEAE Sephadex A-25에 충진한 다음, 0.1M 인산 완충용액(pH 7.0)으로 분획하여 1종의 중성 다당체(NP)을 얻고, 2M NaCl로 분획하여 2종의 산성 다당체 AP1 및 AP2를 분리하였다.
중성다당체 NP는 소량의 유론산(uronic acid)을 함유하지만 단백질은 거의 존재하지 않았으며[참조 : 제2도], 산성다당체인 AP1과 AP2는 다량의 유론산과 함께 미량의 단백질이 포함되어 있기 때문에 단백다당체라 할 수 있었다. 여기서 탄수화물의 정량은 phenol-sulfuric acid법(Anal, Biochem. 28,350(1956) M.Dubois등), 유론산의 정량은 carbazole-sulfuric acid법(Anal. Biochem. 19, 119(1967) J.T. Galambos), 단백질 정량은 Bradford법에 근거한 단백질 정량 시약(Biorad, Cat. no. 500-0006, U.S.A.)을 가지고 행하였으며, 상대적 흡광도를 측정하여 그래프로 나타내었다. 분리된 각 다당체는 해당 분획들을 집적하여 셀롤로스 투석막에 넣고 증류수로 4시간씩 교환하면서 5일간 투석하여 저분자 물질들을 제거한 다음, 3일간 동결건조하였다. 동결건조된 NP는 백황색, AP1은 황색, AP2는 갈색분말로 얻어졌다.
[실시예 3]
다당체의 당조성 분석
실시예 1에서 수득한 각 다당체 분말 1mg을 4ml의 4% HCl-methoanol과 함께 테프론 튜브(teflon-sealed cap tube)에 넣고 질소 가스를 충진시킨 후 80±5℃에서 20시간 동안 메탄올분해(methanolysis)시켰다. 여과하여 감압농축 후 50㎕의 건조피리딘(dry pyridine)에 녹인 다음, 45㎕의 헥사메틸디실라잔(hexamethyldisilazane)과 5㎕의 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)을 가하고 혼합하고, 35℃에서 30분간 반응시킨 다음, 가스액체크로마토그래피(GLC : gas liquid chromatography)로 분석하였다. 각 표준당 1mg도 동일한 조작으로 GLC를 실시하고 각각의 단당류 성분은 상대적인 유지시간(retention time)으로 동정하였고 정량은 피크(peak)의 면적을 계산하여 구하였다. 이때, 컬럼은 HP1 모세관 컬럼(Hewlett Packard, U.S.A.)를 사용했으며, 주입(injection) 온도는 210℃, 오븐 온도는 176℃, 검출 온도는 176℃-190℃, 10℃/분으로 분석하였다. 각 다당류체의 당조성비는 하기 표 1에 나타낸 바와 같았다.
[표 1]
각 다당체의 구성당 조성비
상기 표1에서 보듯이, 조다당체(CP)는 글루코스 : 갈락토스 : 만노스 : 크실로스 : 리보스의 함량비가 글루코스를 100으로 하였을때 100:50:54:7:14:13:의 백분율로 각 구성당이 함유되었다. 중성다당체 NP는 글루코스에 비해 만노스와 갈락토스의 비가 1.5배이상 존재하였으며, 산성다당체인 AP1과 AP2는 글루코스, 만노스, 갈락토스등의 순으로 함유되었다. 한편, NP와 AP1은 기존 항암성 다당체에 비해 5탄당인 리보스의 함량이 높았고 특히 NP는 푸코스의 함량이 글루코스를 100으로 하였을때, 약 84%가량 존재한 것이 매우 특이하였다.
[실시예 4]
조다당체(CP)의 농도에 따른 항보체 검정
동물의 면역기능에 중요한 역할을 하는 보체들의 활성에 조다당체의 농도에 따른 활성효과를 알아보기 위하여, 항보체 검정을 행하였다. 증류수에 용해시킨 조다당체 50㎕, 정상 인간혈청 50㎕와 젤라틴(GVB : gelation veronal saline, pH 7.4) 완충액 50㎕을 혼합한 다음, 37℃에서 30분간 사전반응시켰다. 반응후 350㎕의 GVB 완충용액과 250㎕의 감작된 면양 적혈구세포(haemolysin sensitized sheep red blood cell, 1×10세포/ml)를 가한 다음, 10에서 160배로 연속 희석하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양 후 인산완충조제액(PBS, pH 7.4)을 25ml 부가하고 원심분리한 상층액을 사용하였다. 일반적으로 다당체의 항보체 활성도(ITCH)는 1mg/ml에서 70% 이상일 경우 유효한 것으로 간주하는데, 제3도에서 보듯이, 본 다당체는 20㎕ g/ml에서도 80% 이상의 항보체 활성을 보여주는 50배 이상의 매우 강력한 보체 활성 유도물질이기 때문에 면역증강제로의 사용가치가 인정될 수 있었다. 제3도에서, 항보체 활성도(ITCH : inhibition of total complement hemolysis of 50%)는 전체 보체 용혈반응(hemolysis)의 50%를 저해하는 수치를 표시한 것이다.
[실시예 5]
조다당체의 항암활성 검정
장수버섯 조다당체의 항암성효과를 검정하기 위하여 사용된 암페소 배양배지는 다음과 같았다 : Hep-2(후두암세포)는 Eagle's MEM 배지에 10% 우태아혈청(fetal calf serum)을 첨가하였고 SF-188(뇌종양세포)는 Eagle's MEM 배지에 10% 우테아혈청과 1% 비필수 아미노산(non essential amino acid) 및 1% 소디움 피루브산(sodium pyruvate)을 첨가하였다. 항암효과측정은 직경 35mm 조직배양용 페트리디쉬(petri dish)에 0.5% 아가를 함유하는 McCoy's 5A 배지 1ml을 주입하여 하층을 만들고, 0.3% 아가를 함유하는 이중 증보된 CMRL1066 배지에 조다당체와 암세포를 섞어 상층을 조제하여 CO2배양기에서 배양하여 14일후 형성된 암세포집락을 계수하였다. 조다당체의 농도를 0.5mg/ml과 0.1mg/ml로 하여 항암검정한 결과는 하기 표 2와 같았다.
[표 2]
조다당체의 처리농도별 항암효과 검정
상기 표 2에서 보듯이, 0.1mg/ml의 경우 S-180, Hep-1, SF-188에서는 유효한 항암효과가 인정되지 않았으나, 0.5mg/ml의 경우엔 Hep-2(후두암세포)와 SF-188(뇌종양세포)의 성장을 70% 이상 저해시킴으로써 항암효과의 유효성이 인정되었다.
한편, 본 발명의 각 다당체는 이미 오랜기간 식용되는 장수버섯으로부터 추출된 것으로, 의약 및 기능성 식품의 유효성분으로 사용되는데 있어서, 독성 등의 부작용에 대한 우려는 배제될 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 다당체들은 면역기능의 증강제나 항암제로의 효과가 인정되므로, 암이나 만성질환의 발생을 효과적으로 예방치유할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 다당체의 자원인 장수버섯을 균사체로 인공배양하여 각종 첨가물을 함유시켜 임의로 제형화하여 의약으로 사용하거나 혹은 기능성 건강음료등의 사용이 가능할 것이다.
Claims (3)
- (i) 장수버섯(Fomitella fraxinea RDAGB-129)을 세절하여 물을 가하고 95 내지 100℃에서 열탕추출하는 공정 ; (ii) 전기에서 수득한 추출액을 원심분리 및 여과하여 얻은 여액에 에탄올을 부피비로 약 2배 가하여 침전시키는 공정 ; 및, (iii) 전기에서 수득한 침전물을 아세톤으로 현탁세척하고 여과 및 동결건조하여, 글루코스 : 갈락토스 : 만노스 : 크실로스 : 푸코스 : 리보스의 중량비가 100 : 50 : 54 : 7 : 14 : 13의 조다당체를 얻는 공정을 포함하는 장수버섯 다당체 추출물의 제조방법.
- 장수버섯(Fomitella fraxinea RDAGB-129)을 95 내지 100℃에서 열수추출하고, 원시분리 및 여과하여 얻은 여액에 에탄올을 부피비로 약 2배 가하여 침전시킨 다음, 그 침전물을 아세톤으로 현탁세척하고 여과 및 동결건조하는 방법에 의해 제조된, 글루코스 : 갈락토스 : 만노스 : 크실로스 : 푸코스 : 리보스의 중량비가 100 : 50 : 54 : 7 : 14 : 13인 다당체 추출물.
- 제1항에 있어서, 글루코스 : 갈락토스 : 만노스 : 크실로스 : 푸코스 : 리보스의 중량비가 100 : 50 : 54 : 7 : 14 : 13인 조다당체 추출물을 음이온 교환수지 칼럼크로마토그래피하여, 전기 단당류의 중량비가 100 : 152 : 166 : 17 : 84 : 25인 중성 다당체와 전기 단당류의 중량비가 100 : 32 : 45 : 3 : 5 : 26 및 100 : 11 : 36 : 5 : 4 : 17인 2종의 산성 다당체를 얻는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장수버섯 다당체 추출물의 제조방법.
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