KR100468649B1

KR100468649B1 - 항보체 활성을 갖는 운지버섯 자실체 유래의 다당체 및 그분리방법

Info

Publication number: KR100468649B1
Application number: KR10-2003-0005797A
Authority: KR
Inventors: 송치현; 양병근; 정상철; 나경수
Original assignee: 학교법인 영광학원
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2003-01-29
Publication date: 2005-01-27
Also published as: KR20040069425A

Abstract

본 발명은 항보체 활성을 갖는 운지버섯 자실체 유래의 다당체 및 그 분리방법에 관한 것으로, 본 발명은 항보체 활성이 뛰어난 운지버섯 자실체 유래의 다당체를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명 다당체는 항보체 활성을 가지며 수용성이고 주요 당은 글루코오스이며 주 아미노산 성분은 글리신, 아르기닌 및 발린으로 이루어져 있으며 이들의 항보체 활성은 주로 당 성분에 달려있으며 보체 활성화를 위한 정규경로뿐만 아니라 대체경로에도 참여하여 보체를 활성화시키는 특징이 있다.

Description

항보체 활성을 갖는 운지버섯 자실체 유래의 다당체 및 그 분리방법{Anti-complementary biopolymer from fruiting body of Coriolus versicolor and method for isolation thereof}

본 발명은 항보체 활성을 갖는 운지버섯 자실체 유래의 다당체 및 그 분리방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 운지버섯 자실체로부터 에탄올 침전물을 분리하고 젤 크로마토그래피를 실시하여 항보체 활성이 있는 다당체를 얻는 방법에 관한 것이다.

운지버섯은 막대한 의학적 가치를 갖는 버섯으로써 중국 명나라때 Li Shi Zhen의 "Compedium of Materia medica"에 이미 기록되어 있다. 이 버섯은 역사적으로 중국뿐만 아니라 세계 여러나라에서 건강식품으로 주의를 끌었다. 상기 버섯에서 다양한 화합물을 분리하였으며, 그들 중 어떤 것은 판매되기도 한다. 상기 버섯 유래의 다당류펩티드(polysaccharopeptide, PSP)는 면역조절, 항암, 간보호 활성을 갖고 있으며, 암환자에게 면역조절제와 항암제로 사용되어 왔다. 상기 다당류펩티드와 매우 유사한 다당류로 운지버섯에서 분리한 크레스틴(PSK, krestin)이 있으며, 면역증강 활성을 갖고 있음이 입증되어 있다. 그러나, 다른 의학적 활성들을 찾기 위한 상기 버섯종에 대한 계속적인 연구들이 시도되고 있다.

보체계는 숙주 방어와 관련하여 체내 면역의 주요 작동기관이다. 다수의 화학물질, 식물 혹은 미생물의 기관이 보체계를 조절한다고 보고되어 있다. 다양한 버섯의 자실체, 균사체 및 배양 침전물로부터 추출한 중합체의 항보체 활성은 이미 연구되어 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 의학적으로 가치가 높은 운지버섯 자실체에서 항보체 활성을 갖는 물질을 분리하고 그것의 구성성분 및 화학적 조성을 분석하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 운지버섯 자실체를 열수추출한 다음 이를 다시 에탄올 침전하여 이들 침전물의 항보체 활성을 조사하고 상기 침전물을 정제하기 위해 젤 크로마토그래피를 실시하여 분획을 얻은 다음 상기 분획의 항보체 활성성분을 조사하고 당과 아미노산의 조성 및 구조를 분석함으로써 달성하였다.

이후, 본 발명의 구체적인 구성을 설명한다.

도 1은 운지버섯 자실체로부터 본 발명 다당체를 얻는 과정을 도식화한 것이다.

도 2는 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 Ca²⁺, Mg²⁺의 첨가 유무에 따른 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 항보체 활성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 Ca²⁺혹은 2가 금속이온을 첨가하지 않는 조건 하에서, 운지버섯 자실체 유래의 에탄올 침전물 CV-S2에 의해 전환된 C3의 교차면역적 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 세파로우즈 CL-6B 컬럼 상에서 운지버섯 자실체 유래의 에탄올 침전물 CV-S2의 젤 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 젤 크로마토그래피로부터 얻은 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 에탄올 침전물 CV-S2의 분획들의 항보체 활성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체를 프로나제로 분해한 후 상기 다당체의 분자량의 변화 여부를 나타낸 것이다.

본 발명은 운지버섯 자실체로부터 수용성 추출물과 에탄올 침전물을 분리하는 단계; 상기 침전물의 항보체 활성 조사단계; 상기 침전물을 젤 크로마토그래피롤 실시하여 정제하는 단계; 상기 분획의 성분조성 및 구조분석단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 제조

본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체를 제조하기 위해, 운지버섯의 자실체를 일반 시장에서 구매하고 이를 잘게 자른 다음 분쇄하고 2시간 동안 고온·고압 하에서 멸균하고 이를 여과하여 얻은 상등액을 동결건조하였다. 이를 운지버섯 자실체의 수용성 추출물 CV-S1으로 명명하였다. 또한, 상기에서 얻은 상등액에 에탄올을 1:4의 비율로 첨가하여 24시간 동안 침전시킨 다음 10,447 x g에서 20분 간 원심분리하였다. 이로부터 얻은 침전물을 동결건조한 다음 증류수를 10 mg/mL의 농도가 되도록 첨가하여 녹인다음 이를 3일 동안 투석하고 10,447 x g에서 5분 간 원심분리하여 다당체인 CV-S2를 얻었다. 상기 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 제조방법은 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 항보체 활성 조사

운지버섯의 균사체로부터 생산된 단백질이 결합되어 있는 다당류가 면역계를 유도함으로써 숙주의 생리반응을 조절할 수 있음이 입증된 바, 상기 실시예 1에서 분리한 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 항보체 활성을 조사하였다. 우선, 항보체 활성은 보체 소비와 잔여 보체에 의한 적혈구의 용해정도를 이용한 보체고정시험으로 측정하였다. 50 ㎕의 다당체 수용액을 500 ㎍의 Mg²⁺와 150 ㎍의 Ca²⁺를 포함한 동량의 정상인간의 혈청과 GVB(젤라틴 베로날 완충식염수, pH 7.4)와 함께 혼합하고, 상기 혼합물을 37℃에서 30분간 배양한 다음, 1 x 10⁸cells/mL의 IgM 헤모글리신에 감작된 양 적혈구(일본 동결건조연구소 (주) 제품)를 사용하여잔여 총 보체 용혈(TCH₅₀)을 측정하였다. 정상인간의 혈청은 건강한 성인에서 얻었으며 이를 대조군으로 사용하였고, 이를 위해 상기 혈청을 물과 GVB⁺⁺와 함께 배양하였다. 본 발명 다당체의 항보체 활성은 대조군의 TCH⁵⁰의 억제율로 나타내었다.

Ca²⁺는 정규경로에 의한 보체의 활성화에는 필요하지만 대체경로에서는 필요하지 않으므로 대체경로를 통한 활성화는 Ca²⁺이 없는 조건 하에서 측정하였다. 보체의 대체경로는 Platt-Mills 및 Ishizaka의 방법을 변형하여 GVB^--에 녹인 2 mM MgCl₂를 포함하는 10 mM EGTA(Mg²⁺-EGTA-GVB^--)에서 측정하였다. 샘플을 Mg²⁺-EGTA-GVB^--및 정상인간의 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였으며, 잔여 보체 혼합물은 Mg²⁺-EGTA-GVB^--에서 배양한 토끼 적혈구(5 x 10⁷cells/mL)의 용혈로 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 운지버섯 자실체의 수용성 추출물(CV-S1) 및 상기 수용성 추출물을 투석하여 얻은 에탄올 침전물(CV-S2)의 수율은 각각 89.9 g/kg, 57.5 g/kg 이었다. 그들의 항보체 활성은 100, 500, 1000 ㎍/mL의 농도에서 비교한 결과, CV-S1 및 CV-S2의 항보체 활성은 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 그러나, CV-S2가 CV-S1 보다 실험 농도 모두에서 더 높은 활성을 나타내었다. 1000 ㎍/mL의 농도에서, CV-S1 및 CV-S2의 항보체 활성은 각각 71.8%, 98.1% 이었다.

실시예 1에서 얻은 본 발명 다당체가 항보체 활성을 가지고 있음을 확인한 바, 조건을 달리한 완충시스템에서 본 발명 다당체의 보체 활성화 경로를 평가하였다. 이미 Mg²⁺와 Ca²⁺둘 다 정규경로의 활성화에 필요한 이온임은 잘 알려져 있지만, 대체경로를 활성화하기 위해서는 Mg²⁺만이 필요하다고 알려져 있다.

따라서, 완충시스템의 조건을 달리하여 정상인간의 혈청에서 C3의 분열을 비교측정하여 다당체에 의한 C3 보체 성분의 특이 활성을 평가하였다. 정상인간의 혈청을 GVB⁺⁺에 녹인 10 mM EDTA를 포함하는 GVB^--(EDTA-GVB^--) 혹은 Mg²⁺-EGTA-GVB^--에서 동량의 다당체와 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 모든 샘플(15 ㎕)을 1% 아가로오스 젤에서 이소일렉트릭 포커싱(등전집속, isoelectric focusing)을 실시하였다. 일차로, 바비탈 완충용액(pH 8.6)으로 1% 아가로오스 젤에서(이온력 0.025) 2시간 동안 진행시키고, 이차로 C3와 C3b(염소에서 얻은 보체 C3 항혈청, 미국 시그마사 제품) 둘 다를 인지하는 안티휴먼 보체 C3를 포함하는 젤 플레이트에서 15시간 동안 진행시켰다(전위차는 플레이트 당 15 mA). 전기영동 후, 플레이트를 고정하고 브로모페놀 블루로 염색하였다. C3와 C3b 피크 높이 간의 비율을 계산하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, GVB⁺⁺조건 하에서, 측정된 항보체 활성은 약 98%이었으며, 이는 보체 활성화 경로 즉 정규경로와 대체경로 모두의 참여로 생긴 결과이다. 그러나, Ca²⁺이 고갈된 환경에서 항보체 활성을 조사한 경우, 단지 대체경로만 작동하게 되어 CV-S2는 단지 28%의 활성만을 나타냈다. EDTA-GVB^--시스템에서는 어떠한 항보체 활성도 검출되지 않았다.

상기 결과로부터, 보체계는 CV-S2에 의한 정규경로와 대체경로 둘 다에 의해 활성화됨을 알 수 있었다. 상기 결과를 확인하기 위해, C3 활성화 여부를 GVB⁺⁺및 Mg²⁺-EGTA-GVB^--에서 CV-S2와 정상인간의 혈청을 배양한 다음 교차면역적 전기영동을 실시하여 알아보았으며 도 4에 그 결과를 나타내었다. 도 4에서 A는 GVB⁺⁺, Ca²⁺및 Mg²⁺포함한 조건 하에서, B는 Mg²⁺-EGTA-GVB^--시스템에서 즉, Mg²⁺는 포함하나 Ca²⁺는 없는 조건 하에서, C는 EDTA-GVB^--즉, Ca²⁺, Mg²⁺둘 다 없는 조건 하에서의 결과를 나타내는 것이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 상기 두 완충액 시스템에서 CV-S2와 함께 배양된 혈청에서 C3 분열산물인 C3b를 얻었으며, GVB⁺⁺에서 C3b 침강선의 높이는 Mg²⁺-EGTA-GVB^--에서 보다 높았다. EDTA-GVB^--완충액 시스템에서는 C3b 침강선은 관찰되지 않았다.

이들 결과로부터 운지버섯 유래의 CV-S2에 의한 보체 활성화 양식은 정규경로뿐만 아니라 그다지 많지는 않지만 대체경로에 의해서도 활성화됨을 알 수 있었다.

실시예 3: 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 정제

상기 실시예 2의 결과, CV-S2는 CV-S1과 비교하여 보다 높은 항보체 활성을 나타내므로 CV-S2를 0.2 M NaCl로 채운 세파로우즈 CL-6B의 컬럼에 넣고 4℃에서 젤 크로마토그래피를 실시하여 분획하였다. 이로부터 3개의 분획 즉, CV-S2-Fr. I, Fr.II, Fr. III분획을 얻었으며 도 5에 그 결과를 나타내었다. 이들 3개의 분획물을 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 항보체 활성을 조사하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, CV-S2-Fr.I의 항보체 활성이 가장 높았고, CV-S2-Fr.II 및 CV-S2-Fr.III 순이었다. CV-S2-Fr.I는 95.92%의 중성당과 4%의 단백질로 구성되어 있다. 100 ㎍/mL의 농도에서 약 66%의 ITCH₅₀의 높은 항보체 활성을 나타내었다. CV-S2-Fr.II는 87.76%의 당을 포함하고 있으며 같은 농도에서 상대적으로 낮은 항보체 활성을 나타내었다(58%의 ITCH₅₀). 이들 두 활성 분획들은 세파로우즈 CL-6B 의 젤 여과 시 1개의 대칭 피크를 나타내었다(미도시됨). 상기 결과는 2개의 분획이 구조적으로 상동한 단일물질임을 제안하는 것이다.

상기 CV-S2-Fr.I과 CV-S2-Fr.II의 분자량을 Shodex GS520 + GS320 + GS220 팩키드 컬럼을 이용하여 HPLC로 측정하였다. 표준 플루란(P1600, 800, 400, 200, 100, 50, 20, 10, 5)을 분자량을 측정하기 위한 표준물질로 사용하였다.

또한, Size exclusion multi-angle laser light scattering(SEC-MALLS)를 사용하여 다당체의 분자량을 확인하였다. 다당체를 0.04% 디아미노 테트라 아세트산 디소듐염(Na₂EDTA), 0.01% 소듐 아자이드를 포함하는 인산/염소계 완충용액(이온력 0.1, pH 6.8)에 녹이고, 0.22 ㎛ 필터 멤브레인(미국 밀리포어사)으로 여과한 다음SEC-MALLS 시스템에 주입하였다. 고성능 펌프(미국 워터사), 가스제거장치(일본 유니플로우사), 주입밸브(미국 레오다이네사)로 구성되어 있는 크로마토그래피 시스템에는 100 ㎕의 샘플 루프, 시리즈로 연결되어 있는 3개의 SEC 컬럼이 장착되어 있고 Dawn-DSP multi-angle laser light scattering 탐지기와 굴절지시탐지기(워터스 410)를 포함하는 컬럼 오븐 안에 들어있다. SEC 컬럼은 구멍 크기가 각각 150, 300, 500 Å인 Shodex PROTEIN KW-802.5, 803, 804(모두 내경이 30 cm X 8 mm임)이다. 크로마토그래피는 실온에서 1분 당 0.8 mL의 유속에서 실시되었다. 주입량은 100 ㎕의 다당체를 포함하여 2 mg/L이었다. 다당체의 dn/dc는 와트 테크놀로지(Wyatt Technology)의 지침을 따랐으며, 당과 단백질 함량을 반영하여 변형 후 자료화하였다. 자료 수집 및 프로세싱은 와트 테크놀로지 소프트웨어 팩키지 아스트라 버전 4.7에서 실시하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체 분획들의 분자량은 각각 약 1,200 kDa, 150 kDa으로 나타났다. 이들 다당체들은 매우 낮은 항보체 활성을 갖는 CV-S2-Fr.III(15 kDa)와 비교하여 보다 큰 분자량을 갖고 있다. 항보체 활성은 관련 화합물의 분자량에 매우 의존적임은 이미 잘 알려져 있다. 따라서, CV-S2-Fr.I 및 CV-S2-Fr.II의 큰 분자량은 상대적으로 높은 항보체 활성과 관련이 있다고 사료된다.

상기 결과로부터 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 당 혹은 단백질 의 함량이 항보체 활성에 필수적인지를 조사하기 위해, CV-S2-Fr.I, CV-S2-Fr.II 및 CV-S2-Fr.III를 소듐 페리오데이트로 산화시키거나 프로나제로 가수분해시켰다.

우선, 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 항보체 활성이 단백질 성분때문인지를 조사하기 위해, 다당체(40 mg)를 10 mM CaCl₂를 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.9) 40 mL에 용해시킨 다음 10 mg의 프로나제를 첨가하였다. 반응 혼합액을 37℃에서 48시간 동안 소량의 톨루엔과 함께 배양하였다. 그 후, 5분 동안 끓여 반응을 종결시키고 다시 2일 동안 물로 투석하고 투석되지 않은 부분을 동결건조하였다.

또한, 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 항보체 활성이 당 성분때문인지를 조사하기 위해, 다당체(40 mg)를 40 mL의 50 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.5)으로 녹인 다음 50 mM NaIO₃(10 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합액을 암조건 하에서 4℃에서 3일 간 반응시켰다. 과다한 페리오데이트를 파괴하기 위해 에틸렌 글리콜을 첨가하고, 상기 혼합액을 다시 2일 동안 물로 투석하였다. 투석되지 않은 용액을 10 mL로 농축한 다음 실온에서 20 mg의 소듐 보로하이드라이드를 첨가하고 12시간 동안 계속 교반하였다. 아세트산으로 반응 혼합액을 중화시킨 후, 샘플에 포함된 붕산을 제거하기 위해 메탄올을 반복 첨가하고 증발시켰다. 마지막으로, 투석 후 동결건조하여 산화된 샘플을 얻었다.

상기 3개의 분획들의 항보체 활성은 페리오데이트 산화 후 극적으로 감소하였고 프로테아제 분해 후에는 약간 감소하였다(미도시됨).

도 8에 나타난 바와 같이, 주 활성 성분(CV-S2-Fr.I 및 CV-S2-Fr.II)들에 프로나제를 처리한 결과, 분해 후 CV-S2-Fr.II의 피크 유형은 본래의 것과 비교하여변하지 않았으며, 또한 당의 피크는 세파로우즈 CL-6B 상의 젤 여과 후 저분자량으로 이동하지도 않았다. 그러나, CV-S2-Fr.I은 분해 후 피크 유형이 변하였으며 당 피크 역시 저분자량으로 이동하였다(도8b). 도 8의 화살표는 분자량의 이동을 나타낸다. CV-S2-Fr.I의 프로나제 분해로 생긴 단편의 분자량은 size exclusion MALLS system 에 따라 대략 160 kDa으로 평가되었다. 상기 분자량은 CV-S2-Fr.II와 유사하다. 이는 이들 분획들의 항보체 활성들은 주로 당 성분에 달려있다는 사실을 입증하는 것이다.

실시예 4: 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체 분획의 성분분석

상기 실시예 3에서 정제한 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 분획들의 성분을 분석하였다.

우선, 다당체의 총 단백질 함량을 표준물질로써 보바인 씨럼 알부민(BSA)을 사용하는 Lowry 법에 따라 정량하였다. 단백질을 가수분해하여 Na-형 컬럼이 장착된 Biochrom 20 아미노산 자동 분석기(미국 파마시아 바이오테크사)에서 아미노산을 분석하였다.

총 당은 반응표준물질로 글루코오스(1:1)를 사용하는 페놀-황산 법에 따라 정량하였다. 당 조성은 가수분해와 아세틸화 방법에 따른 SPTM-2380 캐필러리 컬럼(15 m x 0.25 mm i.d., 0.2-㎛ 필름:SUPELCO)상에 불꽃이온화 탐지기가 장착된 Varian GC3600 가스 크로마토그래피로 분석하였다.

본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체 분획의 당 조성

	CV-S2-Fr. I	CV-S2-Fr. II	CV-S2-Fr. III
총 당(%)	95.92	87.76	81.52
중성당(몰 비)푸코스아라비노오스자일로오스만노오스갈락토오스글루코오스	소량1.00소량소량소량4.30	0.521.00소량소량소량3.32	0.340.19소량0.481.0025.10

표 1에 나타난 바와 같이, CV-S2-Fr.I 및 CV-S2-Fr.II의 총 당 함량은 95.92%, 87.76%이었다. CV-S2-Fr.I 및 CV-S2-Fr.II의 당 조성은 글루코오스로 구성되고 산성당은 포함하고 있지 않다.

본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체 분획의 아미노산 조성

	CV-S2-Fr. I	CV-S2-Fr. II	CV-S2-Fr. III
총 단백질(%)	4.08	12.24	18.48
아미노산(%)AspThrSerGluGlyAlaCysValIleLeuArg	7.08소량8.839.0710.987.486.516.595.33소량18.47	8.43소량7.738.9612.918.436.7211.15소량소량19.53	10.096.778.1811.4411.119.59소량9.34소량5.1510.42

표 2에 나타난 바와 같이, 운지버섯 자실체의 CV-S2-Fr.I 및CV-S2-Fr.II의 총 단백질 함량은 각각 4.08%, 12.24%이었다. 운지버섯 자실체 유래의 다당체의 단백질 함량은 균사체와 유사하였다. CV-S2-Fr.I은 주 아미노산으로 글리신(10.98%)과 아르기닌(18.47%)을 포함하고 있다. CV-S2-Fr.II는 글리신(12.91%), 발린(11.15%) 및 아르기닌(19.53%)이 주를 이루고 있다.

실시예 5: 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체 분획의 구조 분석

본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체 분획의 구조를 분석하기 위해, 상기 다당체의 다당류를 메틸화시켰다. 각 다당류는 Hakomori 법에 따라 메틸화시켰다. 다당체(2 mg)에 디메틸 설폭사이드(0.1 mL)를 넣고 질소조건 하에서 초음파분해를 실시하여 녹였다. 실온에서 4시간 동안 상기 용액에 메틸설피닐 카바니온(0.1 mL)을 처리하고 실온에서 12시간 동안 메틸 아이오다이드(0.1 mL)를 처리하였다. 각 메틸화된 다당체를 Sep-pak C18 카트리지(워터스 어소시에이션사)를 사용하여 정제하였다. 메틸화된 다당체에 2 M 트리플루오로아세트산(1.5 mL)을 첨가하여 121℃에서 1시간 동안 가수분해시킨 다음, 소듐 보로하이드라이드로 환원시켜 아세틸화시켰다. 최종 메틸화된 알디톨(alditol) 아세테이트를 기체-액체 크로마토그래프법(GLC)와 기체-액체 크로마토그래프법-질량분석법(gas liquid chromatography-mass spectrometry, GLC-MS)로 분석하였다. GLC는 SPTM-2380 캐필러리 컬럼(30 m x 0.25 mm i.d., 0.2-㎛ 필름:SUPELCO)상에 불꽃이온화 탐지기가 장착된 Varian model STAR 3600CX 가스 크로마토그래프법에 따라 실시하였다. GLC-MS(70eV)는 동일한 캐필러리 컬럼이 장착된 시마쥬 QP5050 인스트루먼트에서 실시하였다. 피크는 상대 정체시간과 분절유형에 따라 동정하였다. 각 당의 몰%는 피크 면적으로 계산하였다.

본 발명 운지버섯 유래의 CV-S2-Fr. I 및 CV-S2-Fr. II의 메틸화된 알디톨 아세테이트 동정

메틸화된 당	몰 %	결합형
메틸화된 당	Fr. I	결합형	Fr. II
2,3,4,6-테트라-O-Me-D-Glc^b2,4,6-트리-O-Me-D-Glc2,3,4-트리-O-Me-D-Glc2,3,6-트리-O-Me-D-Glc2,4-디-O-Me-D-Glc2,3-디-O-Me-D-Glc	13.117.44.846.712.65.4	7.016.95.751.014.05.4	Glc¹→→³Glc¹→→⁶Glc¹→→⁴Glc¹→→^3,6Glc¹→→^4,6Glc¹→

b : 2,3,4,6-테트라-O-Me-D-Glc 는 2,3,4,6-tetra-O-Me-D-Glucitol 임.

표 3에 나타난 바와 같이, CV-S2-Fr.I 및 CV-S2-Fr.II의 주 피크는 2,3,4,6-테트라-O-메틸-D-글루시톨, 2,4,6-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,3,4-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,3,6-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,4-디-O-메틸-D-글루시톨 및 2,3-디-O-메틸-D-글루시톨이 다른 비율로 나타났다. CV-S2-Fr.I 및 CV-S2-Fr.II는 비환원성, (1→3)결합, (1→6)결합, (1→4)결합의 글루코피라노실 잔기와 3.6-치환성 및 4,6-치환성 글루코피라노실 잔기를 포함하지만, CV-S2-Fr.I는 CV-S2-Fr.II 보다는 보다 가지가 많은 지점을 갖고 있다.

영지버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 균핵동충하초의 자실체 혹은 균사체로부터 분리한 생물학적으로 불용성인 다당류는 주로 측쇄로써 β-D-(1→6)결합의 글루코피라노실 잔기와 β-D-(1→3)결합의 글루코피라노실 잔기로 구성되지만, 구름버섯의 균사체 유래의 항암성 당단백질은 α,β(1→3), α,β((1→4) 및 α,β(1→6) 글루코시딕 결합으로 구성되어 있다. 또한, 구멍장이버섯의 열수추출로부터 얻은 항암성 글루칸은 3,6- 및 4,6-가지형 글루코시딕 결합을 포함하여 (1→3), ((1→4) 및 (1→6) 결합의 글루코시딕 결합을 포함하고 있다.

따라서, 상기 CV-S2-Fr.I 및 CV-S2-Fr.II는 물에 매우 잘 녹으며, 구멍장이버섯의 글루칸과 매우 유사한 구조로 구성되어 있는 것으로 보인다. 상기 구조는 상기에서 토론된 바와 같이 항보체 작용에 관여할 것으로 사료된다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 항보체 활성이 뛰어난 운지버섯 자실체 유래의 다당체를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명 다당체는 항보체 활성을 가지며 수용성이고 주요 당은 글루코오스와 우론산이고 주 아미노산 성분은 글리신, 아르기닌 및 발린으로 이루어져 있으며 이들의 항보체 활성은 주로 당 성분에 달려있으며 보체 활성화를 위한 정규경로뿐만 아니라 대체경로에도 참여하여 보체를 활성화시키는 특징이 있다. 따라서, 본 발명 운지버섯 자실체 유래의 다당체는 항보체 활성을 가지고 있어 이를 유효성분으로 하는 면역증강용 조성물로 제조할 수 있어 약학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

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운지버섯의 자실체를 잘게 자른 다음 분쇄하고 2시간 동안 고온·고압 하에서 멸균한 다음 여과하고,

상기에서 얻은 상등액에 에탄올을 1:4의 비율로 첨가하여 24시간 동안 침전시킨 다음 10,447 x g에서 20분 간 원심분리하고,

원심분리 후 얻은 침전물을 동결건조한 다음 증류수를 10 mg/mL의 농도가 되도록 첨가한 다음 3일 동안 투석하고 이를 10,447 x g에서 5분간 원심분리하고,

이로부터 얻은 침전물을 0.2 M NaCl로 채운 세파로우즈 CL-6B의 컬럼에 넣고 4℃에서 젤 크로마토그래피를 실시하는 것을 포함하는 분리방법에 의해 분리되며,

수용성이며 주요 당은 글루코오스와 우론산이고 주 아미노산 성분은 글리신과 아르기닌이며 분자량이 1,200 kDa이고,

상기 다당체의 구조는 2,3,4,6-테트라-O-메틸-D-글루시톨, 2,4,6-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,3,4-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,3,6-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,4-디-O-메틸-D-글루시톨 및 2,3-디-O-메틸-D-글루시톨임을 특징으로 하는 항보체 활성을 갖는 운지버섯 자실체 유래의 다당체.
운지버섯의 자실체를 잘게 자른 다음 분쇄하고 2시간 동안 고온·고압 하에서 멸균한 다음 여과하고,

상기에서 얻은 상등액에 에탄올을 1:4의 비율로 첨가하여 24시간 동안 침전시킨 다음 10,447 x g에서 20분 간 원심분리하고,

원심분리 후 얻은 침전물을 동결건조한 다음 증류수를 10 mg/mL의 농도가 되도록 첨가한 다음 3일 동안 투석하고 이를 10,447 x g에서 5분간 원심분리하고,

이로부터 얻은 침전물을 0.2 M NaCl로 채운 세파로우즈 CL-6B의 컬럼에 넣고 4℃에서 젤 크로마토그래피를 실시하는 것을 포함하는 분리방법에 의해 분리되며,

수용성이며 주요 당은 글루코오스와 우론산이고 주 아미노산 성분은 글리신, 발린 및 아르기닌이며 분자량이 150 kDa이고,

상기 다당체의 구조는 2,3,4,6-테트라-O-메틸-D-글루시톨, 2,4,6-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,3,4-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,3,6-트리-O-메틸-D-글루시톨, 2,4-디-O-메틸-D-글루시톨 및 2,3-디-O-메틸-D-글루시톨임을 특징으로 하는 항보체 활성을 갖는 운지버섯 자실체 유래의 다당체.
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