RU2189825C1 - Иммуностимулирующий препарат и способ его получения - Google Patents
Иммуностимулирующий препарат и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2189825C1 RU2189825C1 RU2001125515A RU2001125515A RU2189825C1 RU 2189825 C1 RU2189825 C1 RU 2189825C1 RU 2001125515 A RU2001125515 A RU 2001125515A RU 2001125515 A RU2001125515 A RU 2001125515A RU 2189825 C1 RU2189825 C1 RU 2189825C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- drug
- polysaccharides
- immunostimulating
- active principle
- alcohol
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается лекарственных препаратов иммуностимулирующего действия из растительного сырья и способа их получения. Сущностью изобретения является лекарственный препарат иммуностимулирующего действия, содержащий в качестве активного начала полисахариды из Pleurotus ostreatus с молекулярной массой 10 - 420 кД. Способ получения препарата заключается в предварительном высушивании фрагментов грибов, измельчении, удалении липидов экстракцией спиртосодержащим раствором, выделении активного начала из осадка экстракцией кипящей водой, концентрировании, осаждении полисахаридов обработкой спиртосодержащим раствором и диализе. Техническим результатом является получение нового препарата, обладающего иммуностимулирующим действием. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к лекарственным препаратам иммуностимулирующего действия, в частности препаратам из растительного сырья и способам их получения.
Известен ряд биохимических иммуностимуляторов, в частности, тималин, нуклеинат натрия, продигиозан и т.п. Препараты выпускают в виде порошка, который либо принимается перорально, либо разводится, например физиологическим раствором, и используется внутримышечно (Земсков Ф.М. и др. Иммунология, 1981, 1, с. 52-55, Морозов В.Г. и др. ДАН СССР, 1977, т.233, 3, с. 491-494, Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., Медицина, 1993, т.2, с. 169-177).
Недостатком этих препаратов является, как правило, низкая эффективность при пероральном применении, наличие негативных воздействий на человека, возникающих в результате побочных биохимических процессов, возникающих в организме в ходе превращений химических соединений, входящих в лекарственный препарат.
Известно использование в качестве иммуностимуляторов растворов и настоек различных растений - женьшеня, элеутерококка, облепихи, котовника, мумие, прополиса и т.п. (В.И. Машанов, А.А. Покровский. Пряно-ароматические растения. М. , Агропромиздат, 1991; И.С. Соколова и др. Дикорастущие и культурные растения. М., Медицина, 1990).
Для всех указанных препаратов характерны относительно невысокая активность, наличие значительного числа противопоказаний.
Одной из перспективных групп растений, чьи свойства изучены в настоящее время недостаточно, являются высшие грибы (Basidiomycetes). Известно около 200 видов грибов (Auricularia auricula, Tremella fuciformis, Hericium erinaceus, Lentinus edodes и др.), компоненты которых оказывают иммуномодулирующее, противоопухолевое, противовирусное, антидиабетическое воздействие на организм человека. Однако большинство таких препаратов не имеет коммерческого интереса в связи с нестандартностью сырья и отсутствием достаточно стабильных его источников (S.Р. Wasser, A.L. Weis, Int. J Med. Mushrooms, v.1, 1999, p. 31-62).
Прототипом заявляемой группы изобретений является препарат на основе грибов рода Pleurotaceae - Lentinus edodes (S.P. Wasser, A.L. Weis. Int. J Med. Mushrooms, v.1, 1999, p. 31-36).
Препарат представляет фракцию полисахаридов, обладающую иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами.
Препарат получают кипячением свежих грибов Lentinus edodes в воде в течение 8-16 часов, обработкой экстракта спиртом, отделением выпавшего осадка (320 г из 200 кг грибов), его переосаждением с последующим освобождением от примесей экстракцией 20% и 50% водным раствором этанола, растворением осадка 6% едким натром и осаждением активного начала этанолом и депротеинизация по методу Sevag. Недостатком препарата является отсутствие в России достаточных ресурсов сырья.
Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание нового препарата, обладающего иммуностимулирующим действием на основе грибов рода Pleurotaceae, имеющих достаточную сырьевую базу и способов его получения.
В основу решения задачи было положено исследование возможности применения в качестве перспективного сырья для получения иммуномодуляторов распространенного на территории России гриба "Вешенка устричная" (ВУ) - Pleurotus ostreatus. Выбор данного гриба обусловлен его высокой пищевой ценностью, нетоксичностью и несложностью культивирования. В настоящее время ВУ широко используется в пищевых целях. Сообщений об исследовании медицинского применения данного гриба в качестве иммуностимулятора в просмотренной литературе не обнаружено.
В ходе исследований было найдено, что иммуностимулирующими свойствами обладает фракция полисахаридов с молекулярной массой от 10 до 420 кД, выделенная из плодовых тел и/или стром вешенки.
Указанная фракция может использоваться самостоятельно или в смеси с углеводами (глюкозой, галактозой и т.п.) в соотношении (масс.) 5-35:95-65 или в смеси с углеводами и белками ВУ при соотношении (масс.) 5-9:60-71:20-35.
Более выгодно получать данную фракцию из стром гриба, являющихся побочными продуктами их переработки. Препарат получают из отобранных фрагментов гриба (плодовых тел и/или стром), которые предварительно высушивали при температуре 60oС и измельчали, а затем из нее удаляли липиды экстракцией спиртсодержащим раствором, а активное начало выделяли из осадка экстракцией кипящей водой, раствор концентрировали, осаждали полисахариды обработкой спиртсодержащим раствором и подвергали диализу. Полученный продукт при необходимости подвергался дополнительной очистке, например, методами гель-фильтрации с последующей лиофилизацией, а стандартизовали полученный продукт, добавляя недостающие ингредиенты до заданного состава. В качестве спиртсодержащего раствора использовали, как правило, раствор, содержащий 85% этилового спирта.
Технология получения продукта и его свойства описаны в следующих примерах.
Пример 1. 500 г плодовых тел и стром вешенки высушивали при 60oС и измельчали в шаровой мельнице. Было получено 180 г порошка.
100 г полученного порошка дважды экстрагировали в аппарате Сокслета 500 мл 85% этанола в течение 4 часов для отделения липидов. Из осадка выделяли полисахаридную фракцию двукратной обработкой 350 мл кипящей дистиллированной водой в течение 3-х часов.
Полученный экстракт фильтровали и упаривали под вакуумом и обрабатывали 85% этанолом в течение 8 часов. Полученный осадок подвергали диализу, гель-фильтрации и лиофилизации. В результате было получено 5,8 г порошка светло-желтого цвета, содержащего биологически активные полисахариды из стром вешенки с молекулярной массой 10-420 кД (Препарат 1). Основным компонентом фракции являлись бета-Д-глюканы, в частности, бета-(1,6)-Д-глюкопиранозил и разветвленный бета-(1,3)-Д-глюкопиран.
Пример 2. Исследование иммуностимулирующих свойств препарата по примеру 1 осуществляли следующим образом. На первом этапе исследований получали мононуклеарную и полинуклеарную взвеси компонентов крови. Выделение клеток крови проводили по стандартному методу, описанному Boyum [Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by centrifugation. // Scanol J. of Clinical and Laboratory Investigation.- 1968. - v. 41, p. 77 - 89] на градиенте фиколл-пака (уд. плотность 1078).
Плазму крови доноров наслаивали на градиент фиколл-пака и центрифугировали в течение 40 минут при 400 g. Для получения мононуклеаров собирали клетки в интерфазе на границе плазмы и фиколл-пака, дважды отмывали физиологическим раствором. В реакции использовали клетки в концентрации 5 млн кл/мл в среде 199, содержащей 10% сыворотки плодов коров.
Нейтрофилы получали из осадка после фракционирования на градиенте фиколл-пака. Примесь эритроцитов удаляли гипотоническим шоком дистиллированной водой в течение 40 секунд. Полученную клеточную взвесь дважды отмывали в физиологическом растворе.
Влияние препарата 1 на хемотаксис нейтрофилов проводили в тесте миграции под агарозой по Нельсону [Nelson К.D. Chemotaxis under agarose // J. Immunol. - 1975. - v. 115.- p. 1650 и 1656]. Для этого готовили 1% раствор агарозы в среде 199, содержащей 10% сыворотки плодов коров. Агарозный гель разливали по 4 мл в пластиковые чашки Петри фирмы "Медполимер" диаметром 40 мм. После застывания геля в нем пробойником пробивали отверстия диаметром 2,2 мм. Отверстия располагали триплетами на расстоянии 3 мм. В реакции использовали нейтрофилы (концентрация клеток 35 млн. клеток/мл) в среде 199 с добавлением 10% сыворотки плодов коров. Клеточную взвесь вносили по 0,01 мл в среднюю лунку. В тех же количествах в левую лунку вносили среду 199, а в правую - исследуемый препарат. Чашки Петри помещали в СO2-инкубатор (концентрация СО2 5%, температура 37oС) на 90 минут. По окончании реакции в чашки наливали по 1 мл 10% раствора формалина и оставляли на 12 часов. Затем снимали агарозный диск, клетки дофиксировали в течение 10 минут 70% этанолом и окрашивали по Романовскому-Гимзе [Бейер В.А. Краткое пособие по гематологии. - Л., 1973, с. 43-44.]. Результат учитывали с помощью проектора, измеряя линейкой длину пробега клеток к опытному образцу (справа от края лунки) и к контрольному (слева от края лунки). Результат реакции выражали в индексах миграции, являющихся отношением длины пробега клеток в опыте к длине пробега в контроле. Изучали как собственные хемотактические свойства препарата, так и способность препарата активировать сыворотку крови человека с образованием сильного хемоаттрактанта для нейтрофилов - С5а. Для этого сыворотку крови донора инкубировали с препаратом в течение 30 минут при 37oС, затем центрифугированием осаждали препарат, а сыворотку использовали в экспериментах.
Влияние препарата на образование активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами периферической крови человека изучали методом люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ), а также в НСТ-тесте, основанном на способности образующегося при активации клеток супероксид-радикала восстанавливать соли тетразолия.
Влияние препарата на люминолзависимую ХЛ цельной крови исследовали на хемилюминометре (модель 1251 LKB, Швеция). Маточный раствор люминола (0,01 М) готовили растворением 1,77 мг люминола в 1 мл диметилсульфоксида. Эксперимент проводили следующим образом: для определения фонового уровня ХЛ в полистироловые виалы вносили по 0,7 мл раствора Хенкса; 0,1 мл цельной крови; 0,2 мл люминола в концентрации 10-4 М. Уровень индуцированной ХЛ (положительный контроль) изучали в пробах, в которые вносили: 0,6 мл раствора Хенкса, 0,1 мл цельной крови; 0,2 мл люминола в рабочем разведении, 0,1 мл ФМА в конечной концентрации 10 нг/мл. Для изучения влияния изучаемых экстрактов на ХЛ цельной крови в виалы вносили по 0,6 мл раствора Хенкса, 0,1 мл цельной крови, 0,2 мл люминола и по 0,1 мл препарата из вешенки в соответствующих разведениях. Хемилюминесценцию оценивали по величине пика ответа (максимум ответа в мВ) и по интегральной интенсивности хемилюминесценции за 30 минут (светосумма в мВ /мин). Люминолзависимая ХЛ позволяет судить обо всем спектре кислородных метаболитов, продуцируемых клетками в течение респираторного взрыва.
Для проведения НСТ-теста приготовляли 0,1% раствор нитросинего тетразолия (НСТ) в растворе Хенкса (рН раствора 7,2). Нейтрофилы ресуспендировали в концентрации 2 млн кл/мл в растворе НСТ и вносили по 0,1 мл в 96-луночные платы. Раствор испытуемого препарата вносили по 0,01 мл. Платы помещали в СО2-инкубатор. Через 1 час из плат сливали раствор НСТ, осадок клеток высушивали и фиксировали 70% этанолом. Образовавшийся в клетках в результате реакции восстановления НСТ диформазан элюировали 0,12 мл 2М КОН и 0,14 мл диметилсульфоксидом (ДМСО). Результат учитывали на мультискане при длине волны 640 нм. Положительным контролем в реакции являлся форболмиристат ацетат (ФМА) в конечной концентрации 10 нг/мл. Результаты реакции выражали в единицах экстинции.
Для изучения продукции цитокинов клеточную взвесь мононуклеаров по 0,1 мл помещали в 96-луночные платы и добавляли по 0.01 мл исследуемого препарата, платы помещали в СО2-инкубатор на 18-20 часов. По окончании инкубации собирали кондиционную среду и анализировали в ней содержание цитокинов иммуноферментным методом. Препараты исследовались в виде гомогенной взвеси в физиологическом растворе. Результаты проведенных испытаний приведены в таблицах 1-6.
Как следует из данных, представленных в таблицах 1-4, препарат обладает способностью вызывать респираторный взрыв в нейтрофилах, вызывает усиление НСТ-реакции в концентрации 1-0,1 мг/мл, является хемоат-трактантом для нейтрофилов крови человека, способствует накоплению С5а компонента комплемента, индуцирует синтез провоспалительного цитокина - интерлейкина 1 (ИЛ-1).
Т. е. заявляемый препарат относится к группе препаратов, обладающих иммуномодулирующим, в частности иммуностимулирующим, действием.
Пример 3. По схеме примера 1 проводили получение полисахаридсодержащих фракций с модифицированием условий получения активного начала и создание композиций на их основе. Полученные результаты приведены в таблице 5. Активность некоторых препаратов была исследована на основе их влияния на люминолзависимую ХЛ цельной крови человека (мв за 30 мин) по методике примера 2. Полученные результаты приведены в таблице 6.
Как следует из приведенных данных, при использовании смесей появляется возможность сократить расход наиболее ценного компонента - полисахаридов, а также создать различные препараты с более широким спектром применения.
Claims (4)
1. Иммуностимулирующий препарат на основе биологически активных веществ грибов рода Pleurotaceae, отличающийся тем, что в качестве активного начала он содержит полисахариды из Pleurotus ostreatus с молекулярной массой 10 - 420 кД.
2. Иммуностимулирующий препарат по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит углеводы при следующем соотношении ингредиентов в активном начале, мас. %:
Полисахариды - 5 - 35
Углеводы - 95 - 65
3. Иммуностимулирующий препарат по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что он дополнительно содержит белки при следующем соотношении ингредиентов в активном начале, мас. %:
Полисахариды - 5 - 9
Углеводы - 60 - 71
Белки - 20 - 35
4. Способ получения иммуностимулирующего препарата из грибов рода Pleurotaceae, включающий в себя их обработку кипящей водой, осаждение активного начала спиртосодержащим раствором и его очистку, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют стромы Pleurotus ostreatus, которые предварительно высушивают при 60oС и очищают от липидов обработкой спиртосодержащим раствором, а выделение активного начала из осадка осуществляют диализом.
Полисахариды - 5 - 35
Углеводы - 95 - 65
3. Иммуностимулирующий препарат по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что он дополнительно содержит белки при следующем соотношении ингредиентов в активном начале, мас. %:
Полисахариды - 5 - 9
Углеводы - 60 - 71
Белки - 20 - 35
4. Способ получения иммуностимулирующего препарата из грибов рода Pleurotaceae, включающий в себя их обработку кипящей водой, осаждение активного начала спиртосодержащим раствором и его очистку, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют стромы Pleurotus ostreatus, которые предварительно высушивают при 60oС и очищают от липидов обработкой спиртосодержащим раствором, а выделение активного начала из осадка осуществляют диализом.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что после диализа препарат подвергают гель-фильтрации с последующей лиофилизацией.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что к полученному препарату добавляют углеводы и белки и стандартизуют.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001125515A RU2189825C1 (ru) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | Иммуностимулирующий препарат и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001125515A RU2189825C1 (ru) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | Иммуностимулирующий препарат и способ его получения |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2189825C1 true RU2189825C1 (ru) | 2002-09-27 |
Family
ID=20253220
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001125515A RU2189825C1 (ru) | 2001-09-19 | 2001-09-19 | Иммуностимулирующий препарат и способ его получения |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2189825C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2657431C1 (ru) * | 2017-01-23 | 2018-06-13 | Общество с ограниченной ответственностью "Микопро" (ООО "Микопро") | Способ получения биологически активных веществ из грибов |
-
2001
- 2001-09-19 RU RU2001125515A patent/RU2189825C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PAULIK S. et al. The immunomodulatory effect of the soluble fungal glucan (Pleurotus ostreatus) on delayed hypersensitivity and phagocytic ability of blood leucocytes in mice. Zentralbl Veterinarmed. - l996, May, 43(3), p.129-135. CHENGHUA D. et al. A beta-D-glucan from the sclerotia of Pleurotus tuber-regium. Carbohydr Res. - 2000, Oct., 6; 328(4), p.629 - 633. KURASHIGE S. et al. Effects of Lentinus edodes, Grifola frondosa and Pleurotus ostreatus administration on cancer outbreak, and activities of macrophages and lymphocytes in mice treated with a carcinogen, N-butyl-N-butanolnitrosoamine Immunopharmacol Immunotoxicol. - 1997, May, 19(2), p. 175-183. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2657431C1 (ru) * | 2017-01-23 | 2018-06-13 | Общество с ограниченной ответственностью "Микопро" (ООО "Микопро") | Способ получения биологически активных веществ из грибов |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kumari et al. | Invitro anti-inflammatory and anti-artheritic property of Rhizopora mucronata leaves | |
CN102145022B (zh) | 一种具有增强免疫力和抗辐射作用的灵芝组合物及其制备方法 | |
Meng et al. | Water-soluble polysaccharides from Grifola Frondosa fruiting bodies protect against immunosuppression in cyclophosphamide-induced mice via JAK2/STAT3/SOCS signal transduction pathways | |
KR100252194B1 (ko) | 참당귀에서분리한신규한펙틴질다당류와그분리정제방법및그의면역증강제로서의용도 | |
CN108047343B (zh) | 伊贝母总多糖的制备方法及其应用 | |
Ademola et al. | Anthelmintic efficacy of cashew (Anarcadium occidentale L.) on in vitro susceptibility of the ova and larvae of Haemonchus contortus | |
RU2040932C1 (ru) | Препарат, влияющий на тканевой обмен и применение штамма гриба fusarium sambucinum fuckel var ossicolum (berk.et curf) bilai для его получения | |
Sipping et al. | Antioxidant and anti-inflammatory activities of Ganoderma resinaceum (Boud) fruiting bodies extracts | |
CN109336987B (zh) | 一种羊肚菌和牛肝菌复方粗多糖及制备方法和医用用途 | |
KR100519720B1 (ko) | 유해활성산소 및 방사선에 의한 생체손상 억제효과와면역활성 증진효과를 갖는 프로폴리스 함유 복합조성물 및그의 제조방법 | |
JPS5939411B2 (ja) | 抗動物ウイルス剤 | |
CN114190561A (zh) | 一种微胶囊化蜂王浆酶解多肽、其制备方法以及包含其的固体粉剂 | |
Manayi et al. | Immunomodulation effect of aqueous extract of the artist's conk medicinal mushroom, Ganoderma applanatum (Agaricomycetes), on the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) | |
CA2035948A1 (en) | Polysaccharides with immunomodulating properties from astragalus membranaceus and pharmaceutical compositions containing them | |
WO1997004791A1 (en) | Antiviral agent and process for preparing the same | |
RU2189825C1 (ru) | Иммуностимулирующий препарат и способ его получения | |
FI74475C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya, ur klebsiella pneumoniae extraherade glykoproteiner. | |
CA2305825A1 (en) | Novel bioactivating substance | |
US4861761A (en) | Aloeferon isolation, manufacturing and its applications | |
CN110698567B (zh) | 阿魏菇中抗氧化多糖提取物及其制备方法和应用 | |
JPS61233627A (ja) | 肥満細胞脱顆粒抑制剤 | |
Necib et al. | Comparative study of a new lectin extracted from roots of plants: Cyperus rotundus, Pistacia lentiscus and Ruta graveolens | |
RU2195308C1 (ru) | Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью, вещество, полученое этим способом, и фармацевтическая композиция на его основе | |
CN1793165A (zh) | 一种芦笋皂甙的生产方法 | |
Aldhafiri et al. | Hepatoprotective studies of methanolic leaf extract of Barringtonia acutangula (L) against carbon tetrachloride induced liver injury in wistar rats |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120920 |