KR100519720B1 - 유해활성산소 및 방사선에 의한 생체손상 억제효과와면역활성 증진효과를 갖는 프로폴리스 함유 복합조성물 및그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유해활성산소 및 방사선에 의한 생체손상 억제효과와 면역활성 증진효과를 갖는 프로폴리스 함유 복합조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 프로폴리스, 키토산, 식물혼합 발효추출물, 키토올리고당, 당귀 추출물 및 어성초 추출물로 이루어진 복합조성물, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다. 상기 복합조성물은 무독성의 식물소재 또는 생약제제에서 선택된 천연물로 이루어져 있어 종래의 생물화학적 면역증강 제제 또는 생체보호 화학물질보다 부작용과 독성이 적고 안전성이 우수하며, 화학물질 및 방사선 등에 의한 산화적 생체 손상을 억제할 뿐만 아니라 저하된 면역활성을 증진시켜 항암 치료보조제 또는 건강 보조식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유해활성산소 및 방사선에 의한 생체손상 억제효과와 면역활성 증진효과를 갖는 프로폴리스 함유 복합조성물 및 그의 제조방법{A PROPOLIS-CONTAINING MIXTURE REDUCING DAMAGES INDUCED BY REACTIVE OXYGEN AND RADIATION AND ENHANCING IMMUNE ACTIVITY, AND ITS PREPARATION}

본 발명은 유해활성산소 및 방사선에 의한 생체손상 억제효과와 면역활성 증진효과를 갖는 프로폴리스 함유 복합조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 프로폴리스, 키토산, 식물혼합 발효추출물, 키토올리고당, 당귀 추출물 및 어성초 추출물로 이루어진 복합조성물, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

산화적 스트레스 즉, 유해활성산소 또는 방사선 등에 의하여 유발되는 생체의 산화적 손상이 노화 및 암발생 등 각종 질병의 원인들 중의 하나임이 밝혀졌으며, 이에 따라 여러 가지 항산화 물질 또는 식품소재들을 탐색하여 활용하려는 연구가 활발히 수행되고 있다. 특히 양배추, 당근, 마늘, 양파 등 식용 식물소재 및 야생 식물 뿐만 아니라 동물의 부산물로부터 유효성분을 추출해 내려는 다양한 연구가 진행되어 왔다. 그러나 단일 유효성분 만으로는 다양한 산화적 스트레스에 의한 생체손상을 방어하는 데에 한계를 보이고 있다.

한편, 면역기능이 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어한다는 것은 이미 알려졌으며, 이러한 면역기능은 질병을 예방하고 치료하는 방법으로 이용되고 있고, 예방접종(vaccination) 및 항독소 이용방법 등이 가장 대표적인 방법이다.

최근에는 상기 면역기능의 작용기작이 알려지면서 면역기능을 조절할 수 있는 면역조절 물질을 직접 이용하려는 시도가 진행되고 있다. 상기 면역조절물질은 비특이적으로 면역 세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진시킴으로써, 질병요인으로부터 생체의 방어력을 증강시키는 것이다. 이러한 면역조절 물질로는 화학 합성물질, 미생물 조성물 또는 생물제제 등을 활용하고 있다. 그러나 상기의 면역조절 물질의 대부분은 부작용 또는 독성으로 인하여 실제 생체에 적용하기에는 한계가 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 노력으로, 최근에는 면역조절물질에 대한 연구가 독성이 없는 식품소재 또는 천연물로부터 추출한 유효성분과 기존의 한방제의 이용 및 효능검증을 통해 수행되고 있으며, 실제로 이러한 연구는 노인성 또는 퇴행성 질환에 효과가 높은 것으로 입증되고 있다. 또한 이러한 효능에 대한 영양생리 및 약리기전의 연구도 활발히 진행되고 있다.

이러한 천연물로부터 생체 손상 방지 및 생체 방어계를 항진시키는 생리활성물질 탐색이 활발히 진행되면서, 대체의학의 치료제 또는 건강 보조식품으로서 실용화 단계로 접어들고 있다.

현재, 항산화를 위한 천연물로는 식물소재로부터 추출한 플라보노이드, 페놀류 및 카로테노이드 등이 있다. 또한, 면역기능 활성화를 위한 천연물은 인삼, 가시오가피, 만삼을 포함하는 생약재 또는 기존의 한방제에서 선택된 액제가 있다.

이에 본 발명자들은 산화적 생체손상 억제와 면역기능 증진으로 생체 방어 효과를 나타낼 수 있는 물질을 탐색하는 과정에서, 무독성의 식품소재, 천연물 또는 종래의 한방제에서 효능을 검증하여 프로폴리스, 키토산, 야채혼합 발효추출물, 당귀 추출물, 어성초 추출물을 포함하는 복합조성물을 제조하였고, 상기 복합조성물이 산화적 생체 손상에 대한 높은 억제 효과를 보이고, 산화적 스트레스에 대해 면역계를 보호하며 면역반응을 증강시켜 생체의 방어력을 증강시킬 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 프로폴리스, 키토산, 식물혼합 발효추출물, 키토올리고당, 당귀 추출물 및 어성초 추출물로 이루어진 복합조성물, 그의 제조방법 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로폴리스, 키토산, 식물혼합 발효추출물, 키토올리고당, 당귀 추출물 및 어성초 추출물로 이루어진 복합조성물, 그의 제조방법 및 그의 용도를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명의 복합조성물은 식품공전에 등재되어 있는 무독성의 식물소재 또는 종래 한방제인 생약제제에서 선택된 천연물로 이루어져 있다.

구체적으로, 본 발명의 복합조성물은 프로폴리스 3∼10 중량%, 키토산 15∼25 중량%, 식물혼합 발효추출물 50∼70 중량%, 키토올리고당 3∼5 중량%, 당귀 추출물 3∼7 중량% 및 어성초 추출물 3∼7 중량%로 이루어져 있다.

바람직하게는 프로폴리스 5∼10 중량%, 키토산 15∼20 중량%, 식물혼합 발효추출물 55∼65 중량%, 키토올리고당 3∼5 중량%, 당귀 추출물 5∼7 중량% 및 어성초 추출물 5∼7 중량%으로 이루어져 있다.

가장 바람직하게는 프로폴리스 5 중량%, 키토산 20 중량%, 식물혼합 발효추출물 62 중량%, 키토올리고당 3 중량%, 당귀 추출물 5 중량% 및 어성초 추출물 5 중량%으로 이루어져 있다.

상기에서 혼합비는 건조 중량을 기준으로 한다.

상기 복합조성물 중 프로폴리스는 양봉(養蜂)에서 벌들이 벌집 앞면의 틈새를 막기 위해 각종 꽃가루 및 나무 진과 벌의 타액으로 조성된 혼합물질로부터 추출해 낸 것으로서 여러 가지 플라보노이드 및 레진(lesin)을 포함하고 있는 것으로, 항산화 작용을 통한 항염증 및 생체보호 기능을 한다. 본 발명에서 복합조성물에 대해 3∼10 중량%를 함유하며, 바람직하게 5∼10 중량%, 가장 바람직하게 5 중량%을 함유한다. 상기 범위 미만인 경우 그 효과가 미약하게 나타나며 상기 범위를 초과할 경우 용해도가 낮아진다.

키토산 및 키토올리고당은 게 껍질 등의 주성분인 키틴으로부터 추출된 것으로, 키토산은 면역활성 증진효과를 나타내며, 키토올리고당은 면역활성증진, 항균작용 및 칼슘 촉진작용을 나타낸다. 본 발명에서 복합조성물에 대하여 키토산은 15∼25 중량%를 함유하며, 바람직하게 15∼20 중량%, 가장 바람직하게 20 중량%를 함유한다. 또한 키토올리고당은 3∼5 중량% 함유하며, 가장 바람직하게 3 중량%를 함유한다. 기틴·키토산 및 키토올리고당은 상기 범위 미만인 경우 그 효과가 미약하게 나타나며, 상기 범위를 초과한 경우 용해도가 낮아진다.

식물혼합 발효추출물은 항산화 효과를 나타내는 것으로 통상적인 야채 및 과일을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 매실, 마늘, 당근, 케일, 샐러리, 다시마, 알로에, 무화과, 마, 가지, 미역, 우엉, 부추, 파래, 표고버섯, 생강, 쑥, 연뿌리, 파, 양배추, 밀감, 사과, 다래, 포도, 대추, 복숭아, 배, 밤, 토란, 감자, 양파, 고구마, 미나리, 호박, 자두 및 무우 등과 같은 야채 및 과일을 혼합하고 통상적인 방법으로 발효시켜 추출한 혼합 발효추출물을 사용한다. 일예로 상기 혼합 발효추출물은 여과 방법으로 얻는다. 상기 식물혼합 발효추출물은 복합조성물에 대하여 50∼70 중량% 함유하며, 바람직하게 55∼65 중량%, 가장 바람직하게 62 중량%를 함유한다. 상기 범위 미만인 경우 프로폴리스 및 키토산의 용해도가 낮아지고 그 효과도 미약하게 나타나며 상기 범위를 초과한 경우 프로폴리스 및 키토산의 함량이 낮아져 전체적으로 효과가 미약하게 나타난다.

또한, 당귀는 종래의 한방제 중의 생약재에서 사용되는 것으로 식품공전에 식품원재료로 등재되어 있어 식품의 제조·가공 시에 제한없이 사용 가능하도록 승인된 원료이며, 어성초는 식품공전에 부원료로 등재되어 있어 식품의 제조·가공 시에 최소량(원료배합시 50%미만)을 사용할 수 있도록 검토된 원료로서, 보혈작용을 통하여 면역조혈 기능증진 효과를 나타낸다. 상기 당귀추출물 및 어성초 추출물은 통상적인 방법으로 얻을 수 있으며, 일예로 95℃에서 8∼10 시간 동안 열탕추출 방법으로 얻는다. 함량은 복합조성물에 대하여 3∼7 중량% 함유하며, 바람직하게 5∼7 중량%, 가장 바람직하게 5 중량% 함유한다. 상기 범위 미만인 경우 면역조혈 증진효과가 미약하고, 상기 범위를 초과한 경우 산화적 생체손상 억제 기능이 미약하게 나타난다.

또한, 본 발명은 상기 복합조성물의 제조방법을 포함한다.

본 발명의 복합조성물은 식물 소재 즉 야채 및 과일의 혼합 발효 추출물을 숙성시키며, 구체적으로 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 36가지의 식물소재 즉 야채 및 과일의 혼합 발효 추출물을 숙성시킨 것에 수용화된 키토산과 프로폴리스, 키토올리고당 및 당귀와 어성초 추출물을 첨가하여 다시 숙성시키고, 최종 형태가 농축된 자체인 엑기스 또는 농축된 여액을 건조한 분말 형태도 가능하다.

식물혼합 발효추출물 제조의 원료 조성

원재료명	함량(%)	원재료명	함량(%)
매 실	3.0	파	3.0
마 늘	3.5	양배추	3.0
당 근	4.0	밀 감	2.0
케 일	2.0	사 과	3.0
샐러리	3.0	다 래	3.0
다시마	3.0	포 도	3.0
알로에	3.0	대 추	2.0
무화과	2.5	복숭아	3.0
마	2.0	배	3.0
가 지	3.0	밤	3.0
미 역	3.0	토 란	2.0
우 엉	3.0	감 자	3.0
부 추	3.0	양 파	2.5
파 래	3.0	고구마	2.5
표고버섯	3.0	미나리	3.0
생 강	3.0	호 박	2.0
쑥	3.0	자 두	2.0
연뿌리	3.0	무 우	2.0

구체적으로 본 발명의 복합조성물은

야채 및 과일의 혼합물과 혼합물에 대하여 20∼200 중량%의 물을 혼합하고 발효시킨 후 여과하여 발효추출물을 얻는 단계(단계 1);

상기 발효추출물을 숙성시키는 단계(단계 2);

상기 숙성된 발효추출물에 키토산, 프로폴리스, 키토올리고당 및 당귀와 어성초 추출물을 첨가하여 다시 숙성시키는 단계(단계 3); 및

상기 발효·숙성된 추출물을 여과 후 여액을 농축시키는 단계(단계 4)로 이루어진 제조방법을 포함한다.

추가로 상기 복합조성물은 여액을 농축시킨 후 엑기스 상태 또는 상기 단계 4의 여과된 여액을 농축시키고 건조하여 분말 상태로 제조하는 것을 포함한다. 상기 건조 방법은 통상적인 방법을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 동결건조방법을 사용한다.

단계 1은 야채 및 과일의 혼합물에 물을 가하고 발효시켜 발효추출물을 얻는 것으로, 야채 및 과일은 통상적인 것을 사용할 수 있으나, 유기농법으로 재배·생산된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 첨가되는 야채 및 과일의 종류 및 함량의 일예로 상기 표 1에 나타낸 것을 사용한다. 혼합물의 발효는 15∼25℃의 온도에서 4∼10개월동안 수행하며, 바람직하게는 상기 온도에서 6개월동안 수행한다.

단계 2는 상기 발효 추출물을 숙성시키는 것으로, 숙성은 10∼20℃ 온도에서 1.5∼3년동안 수행하며, 바람직하게는 상기 온도에서 2년동안 수행한다.

단계 3은 숙성된 야채발효 추출물에 키토산, 프로폴리스, 키토올리고당 및 당귀와 어성초 추출물을 첨가한 후 숙성시키는 것으로, 숙성은 10∼20℃에서 3.5∼5개월동안 수행하며, 바람직하게는 상기 온도에서 4개월동안 수행한다.

또한 본 발명은 상기 복합조성물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물 또는 건강식품을 포함한다.

구체적으로 본 발명은 상기 복합조성물을 유효성분으로 하는 조혈계 보호와 재생촉진 및 생체조직의 산화적 손상 방지에 유용한 약학적 조성물을 포함한다.

본 발명의 복합조성물은 본 발명의 첨부된 도면에 나타낸 바와 같다.

도 1은 본 발명의 복합조성물에 대한 방사선 조사 생쥐에서의 조혈모세포 보호 및 재생촉진 효과를 나타낸 결과로서, 프로폴리스 단독 투여군 보다 2 배 이상의 탁월한 효과를 보이고 있다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 복합조성물은 방사선 등 산화적 스트레스에 대해 높은 조혈세포 보호 효과를 보일 뿐만 아니라 식용가능하고 무독성의 식물소재로 선택됨으로서, 생체내 적용이 적합하다.

도 2 및 도 3은 각각 과산화수소수 처리 및 방사선 조사로 인한 산화적 스트레스에 의해 유발되는 세포 DNA 손상에 대한 억제효과를 면역세포를 대상으로 측정한 결과, 과산화수소수 및 방사선 처리에 의한 DNA 손상은 본 발명의 복합조성물 투여에 의해 현저하게 감소됨을 보이고 있다.

도 4 및 도 5은 생쥐에 방사선을 조사하여 유발시킨 산화적 스트레스에 의해 일어나는 조직 내 지질 및 단백질의 산화적 손상에 대한 억제효과를 간 조직을 대상으로 측정한 결과, 방사선 처리에 의한 생체조직 내 지질 및 단백질의 손상은 본 발명의 복합조성물 투여에 의해 현저하게 감소됨을 보이고 있다.

도 6은 시험관 내에서 산화적 스트레스에 의해 유발되는 자유라디칼(free radical)을 소거하는 효과를 DPPH를 이용하여 측정한 결과, 본 발명의 복합조성물은 DPPH 분자 내에 전자를 공여함으로써 자유라디칼 생성을 현저하게 감소시킴을 보이고 있다.

따라서, 본 발명의 복합조성물은 산화적 스트레스에 의해 유발되어 생체구성 분자를 손상시키는 자유라디칼을 소거시켜, 세포 DNA 손상의 감소와 생체조직의 지질 및 단백질의 산화적 손상을 억제시킴으로써 산화적 스트레스에 대해 세포 및 조직 보호작용을 하므로 생체보호에 유용할 것이다.

또한, 본 발명의 복합조성물에 대한 면역증진 효과를 평가하기 위하여, 생쥐에서 동종이계(同種異系) 이식편(移植片)에 대한 세포성 면역반응을 측정한 결과, 본 발명의 복합조성물 대신 생리식염수를 투여하여 실시한 대조군에 비하여, 본 발명의 복합조성물 투여군에서 세포성 면역반응이 현저히 증진되며(도 7), 암세포를 살해하는 자연살해세포(Natural Killer Cells; NK 세포) 활성도를 측정한 결과 본 발명의 복합조성물 투여 생쥐의 면역세포의 암세포 살해능이 현저히 증강되고(도 8), 대식세포의 탐식작용 정도를 측정한 결과 본 발명의 복합조성물 처리로 대식세포의 탐식작용이 증진됨을 알 수 있다(표 2). 그러므로, 본 발명의 복합조성물을 함유하는 약학적 조성물은 면역기능을 활성화시킴으로써, 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 면역기능 증진에 광범위하게 활용되고, 암의 치료보조제로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 복합조성물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 복합조성물은 각종의 투여 경로를 통하여 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용도는 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 보다 구체적으로 약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용될 수 있는 표준의 약제학적 담체라면 어느 것이든 가능하다. 통상적으로 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함할 수 있으며 또한 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명의 복합조성물을 유효성분으로 함유한 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 방법으로 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여의 방법에 의해 투여할 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다. 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 복합조성물의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제가 포함될 수 있다. 바람직하게는 정제, 캅셀 또는 드링크제로 만들어 의약품 내지는 건강보조 식품의 형태로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 복합조성물을 포함하여 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 3 회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 10∼500 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 30∼200 ㎎/kg의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에서 복합조성물은 실험용 생쥐를 대상으로 한 급성독성검사 결과, 경구투여 또는 복강내 주사 시 반치사량 (LD₅₀)은 2,000 ㎎/㎏ 이상으로 전혀 독성효과를 나타내지 않음으로써 생체 안전성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 복합조성물은 생체에 대해 안전하게 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 복합조성물을 유효성분으로 하는 기능성 식품, 건강보조 식품 또는 특수영양식품을 제공한다.

본 명세서에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 상기 복합조성물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다.

기능성 식품과 구별하여, 본 명세서에서 '건강보조식품 또는 '특수영양식품'이란, 상기 복합조성물을 주성분으로 하여 일반식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 건강식품 또는 감기 예방 및 증상 개선을 목적으로 하는 민간요법제로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하는 것으로 해석된다. 즉, 건강보조식품은 특정의 약리기능을 가지는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명에 따른 복합조성물을 함유하는 기능성 식품, 건강보조식품 및 특수건강식품의 함량은 사용되는 식품군에 따라 다양하게 변화시킬 수 있으며, 그 함량은 상기 약학적 조성물로의 용도시 측정된 독성 범위내에서만 수행한다.

이하, 본 발명을 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 프로폴리스를 함유한 복합조성물의 엑기스 제조

상기 표 1에 따라 36가지의 야채 및 과일의 신선한 재료 혼합물에 상기 혼합물 총 무게에 대해 100 %의 물을 가하고 20 ℃의 온도에서 6개월 동안 발효시킨 후 여과하여 야채 발효추출물을 얻었다.

상기 발효추출물을 15℃ 온도에서 2년 동안 숙성시켰다.

상기 숙성된 야채 발효추출물 62 중량%, 키토산 20 중량%, 프로폴리스 5 중량%, 키토올리고당 3 중량%, 당귀 추출물 5 중량% 및 어성초 추출물 5 중량%로 혼합하여 다시 15℃ 온도에서 4개월 동안 숙성시켰다.

상기 발효·숙성된 복합물을 여과 후 여액을 농축시켜 엑기스로 제조하였다. 이때, 야채발효 원료인 야채 및 과일은 유기농법으로 재배된 것만을 선별하여 사용하였다.

<실시예 2> 복합조성물을 포함하는 분말의 제조

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조된 발효·숙성 추출물을 여과하고, 상기와 같은 방법으로 여과한 후 여액을 감압농축하고, 동결건조 방법으로 분말을 제조하였다.

본 발명의 프로폴리스 함유 복합조성물에 대한 면역조혈계 보호효과, 생체조직 방어효과 및 면역증진 효과를 알아보기 위하여 하기와 같이 프로폴리스와 비교 실험하였다.

<실험예 1> 면역조혈계 보호효과

(1) 방사선 조사 생쥐에서 조혈모세포 보호 및 면역세포 재생촉진 효과

방사선에 대한 상기 제조된 복합조성물의 조혈계 보호효과를 알아보기 위하여, 생쥐에 시료를 투여하고 방사선(6.5 Gy)을 조사한 후 11 일째에 비장내에 형성된 조혈세포 집락 수를 측정하였다.

생쥐에 조혈계의 손상을 유발할 수 있는 적합한 양의 방사선을 조사하면, 방사선에 의해 유발된 자유라디칼 등 산화적 손상으로 인하여 말초혈액 내의 면역세포는 급격히 소멸되어 백혈구 감소증이 나타난다. 이 부족한 백혈구를 보충하기 위하여 골수 내에 살아남은 조혈모세포가 비장으로 이동하여 급속히 증식함으로써 조혈세포 집락(endogenous spleen colony)을 형성하게 된다.

실험에 사용한 생쥐(C57BL/6 mouse)는 실험에 사용하기 전까지 온도가 22 ±2℃, 습도가 55∼60%로 유지되며 명암이 12 시간씩 조절되는 표준사육 환경에서 생육하고, 고형사료와 물을 제한없이 공급하였다.

상기 실시예 2에서 제조된 프로폴리스 함유 복합조성물의 건조분말을 증류수에 10∼100 ㎎/㎖ 농도로 녹이고, 무균 상태로 적용하기 위하여 0.45 ㎛의 밀리포아 멤브레인(Millipore membrane)의 무균 여과지로 여과하여 실험에 사용하였다. 프로폴리스는 에탄올 추출물로서 농축하고 동결건조된 분말을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 1∼10 ㎎/㎖ 농도로 녹이고 상기와 같은 방법으로 무균 여과지로 여과하여 실험에 사용하였다.

시료투여는 프로폴리스(0.1 ㎎/mouse) 및 본 발명의 프로폴리스 함유 복합조성물(1∼2 ㎎/mouse)를 방사선 조사 전 36일 12시간 전에 복강내 주사로 하였다.

방사선 조사는 코발트-60(Co-60) 감마선 조사시설(Nordion, Canada)을 이용하여 수행하였다.

상기 비장내 집락(endogenous spleen colony) 형성시험을 이용하여, 생쥐에 시료를 투여한 다음 방사선(6.5 Gy)을 조사한 후 비장에 형성된 조혈세포 집락을 측정하였다.

도 1은 상기 방법에 따라 골수내에 생존된 조혈모세포 수 및 면역세포 재생정도에 비례하여 형성된 비장내 조혈세포 집락수를 나타낸 결과로서, 상기 실시예에서 제조된 본 발명의 복합조성물은 시료를 투여하지 않고 실시한 대조군은 물론 프로폴리스 투여군 보다도 월등히 높은 비장내 집락형성 수의 증가효과를 보였다. 상기 결과로부터 본 발명의 복합조성물은 방사선에 대하여 조혈모세포 보호 및 면역세포 재생 촉진효과를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 2> 산화적 스트레스에 의한 생체손상 억제효과

생체내의 산화적 스트레스는 여러 가지 요인에 의해 발생될 수 있다. 화학적 요인에 의한 모델로서 과산화수소수(H₂O₂)를 100 μM로 첨가하여 실험하였다. 물리적 요인에 의한 모델로서는 방사선을 조사하여 실험하였다.

(1) 활성산소 및 방사선에 의한 세포 DNA 손상 억제효과

산화적 스트레스에 의한 면역세포의 DNA 손상을 본 발명의 복합조성물이 어느 정도 억제하는 지를 알아보기 위하여, 혈액 림프구에 시료를 첨가하고 과산화수소수(H₂O₂) 또는 감마선을 처리한 후 세포내 DNA의 절단(breakage) 정도를 단세포 전기영동법으로 측정하였다.

혈액은 생쥐의 말초혈관으로부터 채취하였으며, 이때 사용된 생쥐는 상기와 동일한 표준 사육조건에서 사육하였다.

채취한 혈액을 시험관에 담아 시료를 첨가하여 3 시간 동안 배양하고 과산화수소수(H₂O₂) 100 μM 또는 감마선 3 Gy를 처리한 후 세포를 수거하고 세척하여 실험에 사용하였다.

단세포전기영동법(Single Cell Gel Electrophoresis; Comet assay) 특히, 알칼리(alkali) 조건의 단세포전기영동법은 DNA 외가닥절단과 알칼리에 민감한 부위를 예민하게 측정할 수 있기 때문에 DNA의 손상을 감지하기 위한 생물학적 지표로 각광을 받고 있다.

세포를 아가로즈(agarose)와 혼합하고 이를 유리 슬라이드(slide)에 떨어뜨린 후 세포용해 완충액(lysis buffer)에서 4℃로 1 시간동안 용해시켰다. 용해시킨 슬라이드는 전기영동 완충액(electrophoretic buffer)을 이용 22V, 300 ㎃에서 25 분간 전기영동을 수행하였다. 60 ㎕의 에티디움 브로마이드(ethidium bromide; 20 ㎍/㎖)로 염색하였다. CCD 카메라가 부착된 형광현미경을 사용하여 이미지분석 프로그램(Komet 4.0, Kinetic inaging, Ltd., Great Britain)을 통해 60 개의 세포를 선택하여 분석하였다. DNA 손상정도는 하기 수학식 1과 같이 정의되는 절단된 DNA 가닥의 이동정도(tail movement)로 나타내었다. 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.

(상기식에서, tail mean은 DNA 절편의 이동정도 즉, 이동거리와 절단된 DNA양의 곱의 평균값이며,

head mean은 절단되지 않은 DNA 의 이동정도 즉, 이동거리와 절단되지 않은 DNA양의 곱의 평균값이며,

tail%DNA은 전체 DNA양에 대한 절단되어 이동한 DNA양의 비율(%)이다.)

도 2에서 보는 바와 같이, 과산화수소수 처리에 의한 세포 DNA 손상은 대조군에 비해 본 발명의 복합조성물 100 ㎍/㎖ 투여군에서 현저하게 (41.2% 정도) 억제됨을 알 수 있다.

도 3에서 보는 바와 같이, 방사선 조사에 의한 DNA 손상도 본 발명의 복합조성물 100 ㎍/㎖ 투여군에서 현저하게 (50% 정도) 억제됨을 알 수 있었다. 또한, 프로폴리스(P) 15 ㎍/㎖ 투여군에서도 비슷한 정도의 억제효과가 관찰되었다.

그러므로, 본 발명의 복합조성물은 화학적 및 물리적 요인에 의한 산화적 손상에 대하여 세포 DNA를 방호함으로써, 산화적 스트레스에 대한 생체 보호에 유용하게 이용될 수 있다.

(2) 방사선에 의한 생체조직의 지질 및 단백질 산화 억제효과

방사선 조사에 따른 산화적 스트레스에 의한 생체조직의 지질 및 단백질의 산화적 손상을 본 발명의 복합조성물이 어느 정도 억제하는 지를 알아보기 위하여, 생쥐에 시료를 투여하고 방사선(8 Gy)를 조사한 다음 간(liver)을 적출하여, 조직내 지질 및 단백질의 산화정도를 측정하였다.

이때 사용된 생쥐는 상기와 동일한 표준 사육조건에서 사육하였으며, 방사선 조사는 상기와 같은 방법으로 수행하였다.

생체조직의 지질과 단백질은 주요 구성 성분이며, 특히 단백질은 세포의 생리활성에 중요한 성분이다

생체막의 주성분인 지질은 X-ray, gamma-ray 같은 이온화 방사선에 의해 산화된다. 이러한 지질 산화는 불포화 지방산에서 주로 일어나며 산화의 이차 부산물로써 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)를 만들어낸다. MDA는 티오바비투릭산(thiobarbituric acid, TBA)와 반응하여 발색을 나타내는데 이를 자외선분광계측기(UV-spectrophotometer)로 측정하였다.

지질 과산화 정도 측정을 위하여, 각 실험군 당 4마리의 마우스를 공시하였으며 방사선은 8 Gy를 조사하였다. 시료투여는 방사선 조사전 36시간, 12시간에 복강내 주사로 하였다. 조사 후 2시간 후 일정양의 간(liver) 조직을 호모게나이져(homogenizer)를 이용해 균질화시킨 다음 원심분리를 통해 단백질을 분리하고, 정량하여 3 ㎎되게 취한 후 여기에 8.1% 나트륨도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 0.2 ㎖, 20% 초산(acetic acid, pH 3.0) 1.5 ㎖, 0.8% TBA solution 1.5 ㎖을 넣어 고루 섞은 후 최종 부피가 4 ㎖되게 증류수를 넣어 주었다. 95℃에서 30분 동안 중탕을 한 후, 상온에서 냉각하였다. 여기에 증류수 1 ㎖과 부탄올피리딘(n-butanol·pyridine, 15:1. v/v) 5 ㎖을 넣어 골고루 섞은 다음 원심분리(4000 g, 10 분)를 하였다. 상층액을 취하여 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 방사선 조사에 의한 생체조직 내 지질의 산화적 손상은 본 발명의 복합조성물 1∼2 ㎎/mouse 투여군에서 대조군에 비해 현저하게 (63.7% 정도) 억제됨을 관찰할 수 있었다. 또한, 프로폴리스 0.5 ㎎/mouse 투여군에서도 비슷한 정도의 억제효과가 관찰되었다.

단백질의 산화 과정 중 나타나는 아미노산 잔기 내 카보닐그룹(carbonyl group)의 이입은 이러한 단백질 산화의 지표로 사용된다. 노란색을 띠는 디니트로페닐하이드라진(2,4-dinitro-phenylhydrazine, DNPH)은 일반적인 카보닐 시약(carbonyl reagent)으로 산화된 단백질과 결합하여 산화된 단백질을 염색시킨다. 염색된 단백질에 6 M 농도의 구아니딘-염산(guanidine·HCl)을 넣어 DNPH를 추출한 후 자외선분광계측기(UV-spectrophotometer)로 측정하면 단백질의 산화 정도를 알 수 있다.

단백질의 산화 정도 측정을 위하여, 각 실험군 당 4 마리의 마우스를 공시하였으며 방사선은 8 Gy를 조사하였다. 시료투여는 방사선 조사전 36시간, 12시간에 복강내 주사로 하였다. 조사 2시간 후 일정양의 간(liver) 조직을 호모게나이져( homogenizer)를 이용해 균질화시킨 다음 원심분리를 통해 단백질을 분리한 후 정량하여 건 당 4 ㎎되게 소 원심분리 시험관(microcentrif㎍e tube)에 넣어준다. 동량의 부피만큼 20% 트리클로로아세틱산 수용액(TCA solution)을 넣어 단백질을 침전시킨 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. 각각의 시험관에 10mM DNPH 500 ㎕를 넣고 10∼15 분 간격으로 섞으면서 1시간 동안 반응시킨 후 동량의 부피만큼 20% TCA 용액을 넣어 원심분리 시켰다. 상층액을 제거한 후 에탄올-에틸아세테이트 용액(ethanol-ethyl acetate (1:1)) 1㎖을 넣어 침전물(pallet)을 3번 수세한 다음 6 M 농도의 구아니딘-염산 용액(guanidine·HCl) 1.2 ㎖을 넣어 다시 원심분리를 시켰다. 상층액을 따내어 360 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 방사선 조사에 의한 생체조직 내 단백질의 산화적 손상은 본 발명의 복합조성물 1∼2 ㎎/mouse 투여군에서 대조군에 비해 현저하게 억제되었으며, 프로폴리스 0.5 ㎎/mouse 투여군 보다도 높은 억제효과가 관찰되었다.

생체조직의 지질과 단백질은 세포의 주요 구성성분이며, 특히 단백질은 세포의 생리활성에 중요한 성분이므로, 도 4 및 도 5에서 나타난 바와 같이 본 발명의 복합조성물이 지질 및 단백질의 산화적 손상을 억제시킨 결과로 보아, 본 발명의 복합조성물은 산화적 스트레스로부터 생체를 보호하는데에 유용한 물질로 이용될 수 있다.

(3) 자유라디칼 소거 효과

산화적 생체 손상에 있어서 여러 가지 요인에 의해 생성된 자유라디칼(free radical)이 직접적인 매개체가 된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 전자공여 작용은 생체내에 생성된 활성 라디칼에 전자를 공여하여 안정된 화합물로 변환시킴으로써 활성 라디칼에 의한 생체손상을 억제하는 작용의 척도로 이용되고 있다.

그러므로 특정 물질의 자유 라디칼 소거 효과를 평가하기 위해서는, 그 물질이 디페닐피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH; Sigma) 분자에 전자를 공여하는 능력을 측정한다. DPPH는 매우 안정한 자유 라디칼 화합물로서 분자내의 비공유 전자에 의해 520 ㎚에서 빛을 흡수하여 진한 보라색을 띠는 물질이다. 외부에서 전자를 제공할 수 있는 물질이 가해져 DPPH의 비공유전자가 쌍을 이루게 되면 진한 보라색이 없어지므로 그 흡광도 차이를 이용하여 항산화 효과를 측정할 수 있어 항산화 활성 검정에 많이 이용되고 있다.

본 발명의 복합조성물의 전자공여능을 측정하기 위하여, 블로시(Blosi)의 방법에 따라 1.5×10^-4 M DPPH 600 ㎕에 시료의 농도가 100, 50, 25 및 12.5 ㎕/㎖가 되도록 각각 가한 후 메탄올(methanol) 용액을 가하여 최종 부피를 3 ㎖로 만들었다. 이를 10초간 진탕하여 잘 섞은 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 하기 수학식 2에 의해 DPPH 자유기의 소거 활성(Radical scavenging activity)을 산정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.

(상기식에서,

OD_control은 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도(OD)이고,

OD_sample은 시료를 처리한 시험군의 흡광도(OD)이다.)

도 6에 나타낸 바와 같이, 상기한 방법으로 본 발명의 프로폴리스 함유 복합조성물의 자유라디칼 소거 효과를 평가하기 위하여, 프로폴리스의 DPPH 자유라디칼 소거 정도를 측정한 결과, 프로폴리스(P)를 25 ㎍/㎖ 처리시 40%, 50 ㎍/㎖ 처리시 74%, 100 ㎍/㎖ 처리시 88%의 매우 높은 자유라디칼 소거 효과를 나타냈다. 상기 결과로 보아, 프로폴리스는 아주 낮은 농도에서도 높은 자유라디칼 소거 효과를 나타내며, 따라서 본 발명의 복합조성물이 산화적 생체손상을 억제하는 효과를 나타내는 데에 본 조성물에 5 % 함유된 프로폴리스의 라디칼 소거능이 크게 작용한다.

<실험예 3> 면역증진 효과

(1) T세포의 활성 증강효과

본 발명의 복합조성물의 세포성 면역증진 효과를 알아보기 위하여, 생쥐에 동종이계(同種異系, allogenic) 면역세포를 정맥 내로 주사한 후 시료를 투여한 다음, 이식편(graft)에 대한 T 세포의 면역반응의 결과로 나타나는 비장종대(splenomegaly)를 측정하였다.

동종이계 이식편에 대한 면역반응(Graft vs Host (GVH) Reaction)은 면역세포 중 T 세포의 반응정도를 측정하는 대표적인 지표이다. 실험에서, BDF1(C57BL/6×DBA/2) 생쥐를 수용체(recipient)로 사용하였으며, 이식편(graft)은 C57BL/6 생쥐의 비장세포를 사용하였다. 비장세포를 1×10⁷ cells/0.2㎖/mouse씩 꼬리정맥으로 주사하여 이식하였으며, 본 발명의 복합조성물(2㎎/mouse)의 투여는 이식시키는 날로부터 7일간 복강주사(0.2㎖/mouse)로 행하였다. 7일 후 비장을 꺼내어 무게를 재고 체중과의 비율을 고려하여 비장종대의 지표(spleen index)를 하기 수학식 3을 이용하여 계산하였다.

(상기식에서,

Spleen index는 동종동계(syngeneic) 비장세포를 이식한 경우에 비하여 동종이계(allogenic) 비장세포를 이식한 시험군에서의 비장종대의 비율이며,

syngeneic(spleen weight/body weight)은 동종동계 면역세포를 이식한 경우 체중(body weight)에 대한 비장무게 (spleen weight)의 비율이고,

allogenic(spleen weight/body weight)은 동종이계 면역세포를 이식한 경우 체중에 대한 비장무게의 비율이다.)

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 복합조성물(2㎎/mouse) 투여군의 T세포 면역활성이 대조군에 비해 152% 증가되었다. 또한, 프로폴리스(0.1㎎/mouse) 투여군에서는 68%의 증가효과가 관찰되어, 본 발명의 복합조성물이 프로폴리스 보다 더 높은 효과를 나타내었다.

(2) NK세포의 활성 증강효과

비특이적인 면역반응의 하나인 자연살해세포(natural killer(NK) cell)의 활성도에 미치는 본 발명의 복합조성물의 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같이 실험하여 생쥐 비장 림프구의 암세포 살해능을 측정하였다.

NK 세포는 비특이적인 세포성 면역반응(cell-mediated cytotoxicity)을 통하여 바이러스 감염 세포 혹은 암세포를 살해하는 것으로 알려져 있다.

상기 세포 매개성 면역반응은 생체내 면역기능 중 항암 효과를 나타내는 주요 면역반응이며, 이때 사용된 생쥐(C57BL/6 mouse)는 상기와 동일한 표준 사육조건에서 사육하였다.

상기 생쥐의 비장 림프구를 얻기 위하여, 생쥐(C57BL/6 mouse)를 경추 탈구법으로 희생시킨 뒤, 복부를 절개하여 비장을 무균적으로 적출하고 멸균된 핀셋과 수술용 칼로 지분거려 생리식염수(HBSS)에 세포를 부유시켰다. 상기 비장세포 부유액을 2 분간 방치하여 부유되지 않은 세포 덩어리를 제거한 후, 암모늄 완충용액(Tris-NH₄Cl용액)을 가하여 적혈구를 제거하고 HBSS로 2 회 세척하여 비장 림프구를 얻었다. 상기에서 얻은 비장 림프구를 트라이판 블루(Trypan blue) 염색법으로 세포수를 측정한 후, 배양액으로 적정하게 희석하여 실험에 사용하였다.

생쥐에 4 일간 2 ㎎/mouse의 시료를 주사한 다음, 생쥐의 비장으로부터 분리한 림프구를 작동세포(effector cells)로 하고, 시험관 내에서 암세포를 표적세포(target cell)로 하여 암세포 살해능(cytotoxicity)을 크롬유리법(⁵¹Cr-release assay)으로 측정하였다.

상기 세포 매개성 암세포 살해능(cytotoxicity) 측정을 위하여, 방사선 동위원소 크롬(⁵¹Cr)을 표지시킨 표적세포와 림프구를 혼합하여 반응시킨 다음 그 상층액에 유리된 ⁵¹Cr의 양을 측정하여 암세포 살해능(cytotoxicity)을 산출하였다. 이때, 림프구(작동세포; effector cells)와 표적세포(target cells)의 혼합 비율은 50:1 및 100:1로 하였다.

표적세포(target cells)로 사용된 림프종 세포는 세포 배양용 플라스크에서 배양하였다. 상기 림프종 세포는 YAC-1 세포주로서, A/Sn 계통 생쥐에서 Moloney leukemia virus(몰로니 백혈병 바이러스)에 의해 유발된 T 세포(cell) 림프종으로부터 유래된 세포주이다.

표적세포인 림프종 세포(YAC-1세포)를 현탁액에 소디움크로메이트(Na₂ ⁵¹CrO₄: NEN, U.S.A) 200 μCi/10⁷ cells의 농도로 37℃에서 45 분간 표지하여 사용하였다. ⁵¹Cr이 표지된 표적세포(1 ×10⁵ cells/㎖) 100 ㎕ 및 필요한 농도로 조정된 작동 세포 100 ㎕를 96-웰 플레이트(96 well round bottom plate)에 혼합한 후 배양기에서 4 시간동안 배양하였다. 그 후 플레이트를 500 ×g에서 10 분간 원심한 후 상층액 100 ㎕씩을 취하여, 표적세포(암세포)의 사멸에 따라 상층액에 유리되어 나온 크롬의 양을 감마카운터(γ- counter)에서 분당 방사능 카운트 수(cpm; count per minute)로 측정하였다.

각 실험은 3 배수로 실시하였으며 작동세포의 암세포 살해능(% cytotoxicity)을 하기 수학식 4에 의하여 산출하였다.

(상기 수학식에서,

ER(Experimental Release)은 시험군의 크롬 유리정도이며,

SR(Spontaneous Release)은 음성대조군에서 자연적으로 유리되는 정도이고,

MR(Maximal Release)은 최대 유리량이다.)

상기 SR은 작동세포가 들어 있지 않고 표적세포만 들어 있는 대조군의 상층액 100 ㎕의 방사선량이고, MR은 표적세포에 트리톤(Triton X-100) 1% 용액 100 ㎕를 가하여 얻었으며 표지된 방사능의 95% 이상이 되도록 하였다. SR은 MR의 10% 이내가 되게 하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 복합조성물 대신에 생리식염수를 투여하여 실시한 음성대조군 생쥐의 면역세포는 E:T=50:1에서 13.2 %, E:T=50:1에서 19.5%의 암세포 살해능(% cytotoxicity)을 보인 반면에, 본 발명의 복합조성물을 투여하여 실시한 경우, 면역세포의 암세포 파괴능이 E:T=50:1에서 28.1 %, E:T=50:1에서 33.8 %로 관찰됨으로써, 세포 매개성 면역반응의 정도가 현저히(73∼113 %) 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 프로폴리스(0.1 ㎎/mouse) 투여군에서는 NK 세포활성이 13∼25 % 증가되는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 복합조성물이 더 높은 효과를 보였다. 그러므로, 본 발명의 복합조성물은 세포 매개성 면역반응을 증가시킴으로써, 항암 효과에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 음성대조군의 경우, 본 발명의 복합조성물 대신에 생리식염수를 투여하여 실시한 생쥐의 면역세포의 암세포 살해능으로서, 대조군에서도 약하나마 암세포에 대한 면역반응을 나타내고 있음을 알 수 있다.

(3) 대식세포의 탐식작용 증강 효과

면역계의 1차 방어기전으로서 병인자가 생체에 침입하면 우선 탐식함으로써 세포성 면역반응과 체액성 면역반응의 가교 역할을 하는 대식세포의 활성에 대한 본 시료의 효과를 알아보고자 하였다. 생쥐의 복강으로부터 대식세포를 분리하여 시료를 첨가하고 배양한 후 미세입자(microbead)를 넣어 준 다음 탐식정도를 측정하였다.

생쥐 복강으로부터 수집한 대식세포를 계수하여 배양접시에 본 발명의 복합조성물(0.1 ㎎/㎖)와 함께 배양하였다. 배양 2일 후 배양접시에 부착하지 않은 세포는 생리식염수로 2회 세척하여 버리고, 1×10⁶ 세포 당 5×10⁷ 개의 형광표지 미세입자(fluorescent microbeads; 1um, Polysciences)를 넣고 45분간 배양하였다. 배양 후, 탐식되지 않은 부유 미세입자(microbead)를 생리식염수로 3번 세척하여 제거하고 세포 표면에 붙은 비탐식 부유입자를 세척하기 위하여 트립신(trypsin)을 1분간 처리하고 3번을 세척하였다. 그 후 부착하여 있는 세포를 떼어서 형광현미경을 통하여 미세입자를 탐식한 세포수를 계수하였다.

본 발명의 복합조성물에 대한 대식세포 활성 증강 효과

시료	전체탐식능(%)	n개의 탐식 입자를 갖는 세포수
		0(%)	1∼5(%)	6∼10(%)	10∼20(%)	20∼(%)
대조군	40.5 ± 9.6	59.5±9.6	31.1±6.8	5.5±2	3.5±0.5	0.6±0.2
복합조성물	51.2 ± 10	48.8±10	39.2±7	7.8±3	2.7±1	1.7±0.5

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 복합조성물 (0.1 ㎎/㎖)의 첨가군에서 대조군에 비해 탐식작용이 26% 증가하는 것을 관찰하였다. 이 결과로 보아 본 발명의 복합조성물은 대식세포의 활성을 증강시키는 것으로 사료된다.

<실험예 4> 생쥐에 대한 경구 또는 복강 투여 급성 독성실험

본 발명의 복합조성물에 대한 생체내 급성 독성실험을 하기와 같이 실시하였다.

실험군 당 생쥐(C57BL/6 mouse) 6 마리씩 사용하여, 본 발명의 복합조성물을 최대 2,000 ㎎/kg의 용량으로 각 용량 단계별로 경구투여 또는 복강 내 주사하였다. 경구투여군은 2 주간 관찰하였으며, 복강내 투여군은 1 주간 관찰하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하고 현미경검사를 실시하였다.

실험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성학적 변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 복합조성물은 생쥐에서 경구투여 또는 복강내 주사 시 반치사량 (LD₅₀)은 2,000 ㎎/㎏ 이상으로 전혀 독성효과를 나타내지 않음으로써 생체 안전성이 매우 높다는 것을 알 수 있었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 프로폴리스, 키토산, 식물혼합 발효추출물, 키토올리고당, 당귀 추출물 및 어성초 추출물로 구성된 복합조성물을 제조하였다. 상기 복합조성물은 무독성의 식물소재 또는 생약제제에서 선택된 천연물 소재를 원료로 함으로써, 종래의 생물화학적 면역증강 제제 혹은 항암 화학물질보다 부작용과 독성이 적고 안전성이 우수하며, 화학물질 및 방사선 등에 의한 산화적 생체 손상을 억제할 뿐만 아니라 저하된 면역활성을 증진시켜 생체보호 또는 건강 보조식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 복합조성물에 대한 방사선조사 생쥐에서의 조혈모세포 보호 및 재생 촉진 효과를 나타낸 그래프이고,

도 2는 본 발명의 복합조성물에 대한 과산화수소수 처리 혈액림프구 DNA 손상억제 효과를 나타낸 그래프이고,

도 3은 본 발명의 복합조성물에 대한 방사선 조사 혈액 림프구 DNA 손상억제 효과를 나타낸 그래프이고,

도 4는 본 발명의 복합조성물에 대한 방사선 조사 생쥐의 간조직에서 지질 과산화 억제 효과를 나타낸 그래프이고,

도 5는 본 발명의 복합조성물에 대한 방사선 조사 생쥐의 간조직에서 단백질 산화 억제 효과를 나타낸 그래프이고,

도 6은 본 발명의 복합조성물의 구성성분인 프로폴리스에 대한 자유라디칼 소거 효과를 나타낸 그래프이고,

도 7은 본 발명의 복합조성물에 대한 세포성 면역계 T 세포 활성 증강 효과를 나타낸 그래프이고,

도 8은 본 발명의 복합조성물에 대한 자연살해세포 활성도 증강 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims (11)

1. 프로폴리스 3∼10 중량%, 키토산 15∼25 중량%, 식물혼합 발효추출물 50∼70 중량%, 키토올리고당 3∼5 중량%, 당귀 추출물 3∼7 중량% 및 어성초 추출물 3∼7 중량%로 이루어진 복합조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 복합조성물이 프로폴리스 5∼10 중량%, 키토산 15∼20 중량%, 식물혼합 발효추출물 55∼65 중량%, 키토올리고당 3∼5 중량%, 당귀 추출물 5∼7 중량% 및 어성초 추출물 5∼7 중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 복합조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 복합조성물이 프로폴리스 5 중량%, 키토산 20 중량%, 식물혼합 발효추출물 62 중량%, 키토올리고당 3 중량%, 당귀 추출물 5 중량% 및 어성초 추출물 5 중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 복합조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 식물혼합 발효추출물이 매실, 마늘, 당근, 케일, 샐러리, 다시마, 알로에, 무화과, 마, 가지, 미역, 우엉, 부추, 파래, 표고버섯, 생강, 쑥, 연뿌리, 파, 양배추, 밀감, 사과, 다래, 포도, 대추, 복숭아, 배, 밤, 토란, 감자, 양파, 고구마, 미나리, 호박, 자두 및 무우로 이루어진 야채 및 과일의 혼합 발효추출물인 것을 특징으로 하는 복합조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 당귀추출물 및 어성초추출물이 95℃에서 8∼10 시간 동안 열탕추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 복합조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 복합조성물이 엑기스 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는 복합조성물.
7. 청구항 1항의 복합조성물의 제조방법에 있어서,

   매실, 마늘, 당근, 케일, 샐러리, 다시마, 알로에, 무화과, 마, 가지, 미역, 우엉, 부추, 파래, 표고버섯, 생강, 쑥, 연뿌리, 파, 양배추, 밀감, 사과, 다래, 포도, 대추, 복숭아, 배, 밤, 토란, 감자, 양파, 고구마, 미나리, 호박, 자두 및 무우로 이루어진 야채 및 과일의 혼합물과 상기 혼합물에 대하여 20∼200 중량%의 물을 첨가하고 15~25℃에서 4~8개월 간 발효시키는 단계(단계 1);

   상기 발효추출물을 10~20℃에서 1.5~3년 간 숙성시키는 단계(단계 2);

   상기 숙성된 발효추출물에 키토산, 프로폴리스, 키토올리고당, 당귀추출물 및 어성초추출물을 첨가하고 다시 10~20℃에서 3.5~5개월 간 숙성시키는 단계(단계 3); 및

   상기 발효·숙성된 추출물을 여과 후 여액을 농축시키는 단계(단계 4)로 이루어진 복합조성물의 제조방법.
8. 제 7항에 있어서, 추가로 단계 4에서 농축된 여액을 동결건조 방법으로 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 단계 2의 숙성 시간이 1.5∼3 년인 것을 특징으로 제조방법.
10. 청구항 1의 복합조성물을 유효성분으로 함유하는 생체보호 및 면역기능 증진용 약학적 조성물.
11. 청구항 1의 복합조성물을 유효성분으로 함유하는 생체보호 및 면역기능 증진용 기능성 식품, 건강보조 식품 또는 특수영양식품.