KR100510429B1

KR100510429B1 - 면역활성 증진 및 항암 효과를 갖는 혼합물의 물추출물 및그의 제조방법

Info

Publication number: KR100510429B1
Application number: KR10-2002-0016859A
Authority: KR
Inventors: 박부규
Original assignee: 박부규
Priority date: 2002-03-27
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2005-08-30
Also published as: KR20030077889A

Abstract

본 발명은 해바라기의 잎 및 씨 20 ∼ 40 중량%, 어성초 20 ∼ 30 중량%, 갈근 10 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 20 중량%, 쑥 1 ∼ 5 중량% 및 대추 1 ∼ 5 중량%로 구성된 혼합물의 물추출물에 관한 것으로서, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 무독성의 식물소재 또는 생약제제에서 선택된 천연물로서 구성되어 종래의 생물화학적 면역증강 제제 혹은 항암 화학물질보다 부작용과 독성이 적고 안전성이 보강된 것으로서 저하된 면역활성을 증진시킬 뿐만 아니라 암세포의 생장을 억제하여 항암 치료보조제 또는 건강 보조식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

면역활성 증진 및 항암 효과를 갖는 혼합물의 물추출물 및 그의 제조방법{A MIXTURE EXTRACT WITH IMMUNOMODULATION AND ANTI-CANCER ACTIVITY AND ITS PREPARATION}

본 발명은 해바라기의 잎 및 씨 20 ∼ 40 중량%, 어성초 20 ∼ 30 중량%, 갈근 10 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 20 중량%, 쑥 1 ∼ 5 중량% 및 대추 1 ∼ 5 중량%로 구성된 혼합물의 물추출물에 관한 것이다.

면역기능이 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어한다는 것은 이미 알려졌으며, 이러한 면역기능은 질병을 예방하고 치료하는 방법으로 이용되고 있으며 그의 대표적으로는 예방접종(vaccination), 항독소 이용방법 등이 있다.

최근에는 상기 면역기능의 작용기작이 알려지면서 면역기능을 조절할 수 있는 면역조절 물질을 직접 이용하려는 시도가 진행되고 있다.

상기 면역조절물질은 비특이적으로 면역 세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진시킴으로써, 질병요인으로부터 생체의 방어력을 증강시키는 것이다. 이러한 면역조절 물질로는 화학 합성물질, 미생물 조성물, 생물제제 등을 활용하고 있다.

그러나 상기의 면역조절 물질의 대부분은 부작용 또는 독성으로 인하여 실제 생체에 적용하기에는 한계가 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 노력으로, 최근에는 면역조절물질에 대한 연구가 독성이 없는 식품소재 또는 천연물로부터 추출한 유효성분과 기존의 한방제의 이용 및 효능검증을 통해 수행되고 있으며, 실제로 이러한 연구는 노인성 또는 퇴행성 질환에 효과가 높은 것으로 입증되고 있다. 또한 이러한 효능에 대한 영양생리 및 약리기전의 연구도 활발히 진행되고 있다.

이러한 천연물로부터 생체 조절 및 생체 방어계를 항진시키는 생리활성물질 탐색이 활발히 진행되면서, 대체의학의 치료제 또는 건강 보조식품으로서 실용화 단계로 접어들고 있다.

현재, 면역기능 활성화를 위한 천연물은 인삼, 가시오가피, 만삼을 포함하는 생약재 또는 기존의 한방제에서 선택된 액제가 있다.

이에 본 발명자들은 면역기능 증진으로 항암효과를 나타낼 수 있는 물질을 탐색하는 과정에서, 무독성의 식품소재, 천연물 또는 종래의 한방제에서 효능을 검증하여 해바라기의 잎 및 씨, 어성초, 갈근, 감초, 쑥 및 대추를 포함하는 혼합물의 물추출물을 제조하였고, 상기 혼합물의 물추출물이 높은 면역세포 활성화 효과를 보이고, 생체내에서 암세포의 파괴능이 우수하고 암세포의 생장을 효과적으로 억제하여 생존기간을 연장시킬 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 해바라기의 잎 및 씨 20 ∼ 40 중량%, 어성초 20 ∼ 30 중량%, 갈근 10 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 20 중량%, 쑥 1 ∼ 5 중량% 및 대추 1 ∼ 5 중량%로 구성된 혼합물의 물추출물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 혼합물의 물추출물을 함유하는 면역기능 증강 및 항암 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혼합물의 물추출물을 함유하는 건강 보조식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 해바라기의 잎 및 씨 20 ∼ 40 중량%, 어성초 20 ∼ 30 중량%, 갈근 10 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 20 중량%, 쑥 1 ∼ 5 중량% 및 대추 1 ∼ 5 중량%로 구성된 혼합물의 물추출물 및 그의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

상기 혼합물의 물추출물이 식품공전에 등재되어 있는 무독성의 식물소재 또는 종래 한방제인 생약제제에서 선택된 천연물로 구성된다.

상기 해바라기의 잎 및 씨 20 ∼ 40 중량%, 어성초 20 ∼ 30 중량%, 갈근 10 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 20 중량%, 쑥 1 ∼ 5 중량% 및 대추 1 ∼ 5 중량%로 구성된 혼합물의 물추출물은 최종 제품의 상품성 및 소비자 기호도에 따라 상기 조성비를 변형시킬 수 있으나, 더욱 바람직하게는 해바라기의 잎 및 씨 25 ∼ 35 중량%, 어성초 20 ∼ 25 중량%, 갈근 15 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 15 중량%, 쑥 3 ∼ 5 중량% 및 대추 3 ∼ 5 중량%를 포함하는 것이다. 가장 바람직하기로는 해바라기의 잎 및 씨 30 중량%, 어성초 25 중량%, 갈근 20 중량%, 감초 15 중량%, 쑥 5 중량% 및 대추 5 중량%이다. 여기에서 혼합비는 건조 중량을 기준으로 한다.

이때, 종래의 한방제 중의 생약제제에서 선택된 갈근 및 감초는 식품공전에 식품원재료로 등재되어 있어 식품의 제조ㆍ가공 시에 제한없이 사용 가능하도록 승인된 원료이며, 어성초는 식품공전에 부원료로 등재되어 있어 식품의 제조ㆍ가공 시에 최소량(원료배합시 50% 미만)을 사용할 수 있도록 검토된 원료이다. 여기에서, 어성초, 갈근 및 감초는 항염증 및 면역증진 기능을 하며, 상기 제시된 것보다 초과 또는 미만의 중량%를 포함할 경우는 효과가 미약하므로, 바람직하게는 어성초 20 ∼ 25 중량%, 갈근 15 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 15 중량%, 더욱 바람직하게는 어성초 25 중량%, 갈근 20 중량%, 감초 15 중량%를 함유하는 것이다.

또한, 식품공전에 원재료로 등재되어 있는 무독성의 식물소재로서 선택된 해바라기의 잎 및 씨, 쑥 및 대추는 강장보혈 효과를 보이며, 특히 해바라기는 항암 효과를 보인다. 상기 범위에서 해바라기의 잎 및 씨가 20 중량% 이하면 항암효과가 미약하고, 40 중량% 이상이면 면역증진 기능이 미약하다.

본 발명의 혼합물의 물추출물은 92℃ 이상의 온도에서 열탕 추출된 것이고, 최종 형태가 농축된 자체인 엑기스 또는 농축된 여액을 건조한 분말 형태도 가능하다.

또한, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 1) 상기 건조 재료의 혼합물에 상기 혼합물 총 무게의 5 ∼ 50 배의 물을 가하여 혼합물을 얻고; 2) 상기 혼합물을 열탕 추출하고; 및 3) 상기 추출된 혼합물을 여과 후 여액을 농축시키는 것으로 제조된다.

또한, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 여액을 농축시킨 엑기스 상태 또는 상기 단계 3의 여과된 여액을 농축시키고 건조하여 분말 상태로 제조하는 것을 포함한다.

상기 열탕 추출이 92℃ 이상의 온도에서 8 ∼ 10 시간동안 수행되는 것이다. 또한, 상기 건조는 통상적인 모든 방법이 사용될 수 있으나 바람직하게는 동결건조 방법으로 수행된다.

도 1은 본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 시험관내에서의 면역세포 활성화를 나타낸 결과로서, 종래 사용된 한방제 보다 4 배의 탁월한 면역세포 활성화 효과를 보이고 있다. 양성대조군으로서 사용된 PHA(phytohemagglutinin) 및 LPS(lipopolysaccharide)의 경우는 본 발명의 혼합물의 물추출물보다 높은 면역세포 활성화 효과를 보였으나, 상기 PHA 및 LPS는 심한 독성으로 인하여 생체적용에 문제가 있다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 높은 면역세포 활성화 효과를 보일 뿐만 아니라 식용가능하고 무독성의 식물소재로 선택됨으로서, 생체 적용에 적합하다.

본 발명은 상기 혼합물의 물추출물을 함유하는 면역기능 증강 및 항암 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 혼합물의 물추출물이 식품공전에 식품원재료로 등재되어 있는 무독성의 식물소재 또는 종래 한방제인 생약제제 중에서 식품부원료로 등재되어있는 천연물로 구성된 것으로서, 독성의 문제가 없고 식용 가능하며 면역기능을 증진할 수 있을 뿐 아니라 동시에 우수한 항암 효과를 나타낸다.

도 2는 생체내 면역기능 중 항암 효과를 나타내는 주요 면역반응인 세포 매개성 면역반응을 실험용 생쥐를 대상으로 측정한 결과, 음성대조군이 보인 암세포 파괴능보다 본 발명의 혼합물의 물추출물을 투여한 시험군이 높은 암세포 파괴능을 보이고 있다. 따라서, 본 발명의 식물 혼합물의 물추출물은 세포 매개성 면역반응을 증가시킴으로써 항암 치료에 유용할 것이다.

또한, 본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 생체내에서 항암 효과를 평가하기 위하여, 암세포가 이식된 생쥐에서 암세포 생장 억제효과 및 생쥐의 생존기간 연장효과를 실험한 결과, 본 발명의 혼합물의 물추출물을 투여하지 않고 실시한 대조군에 비하여, 암세포의 생장이 현저히 억제됨(도 3)으로써, 생쥐의 생존기간도 연장됨을 알 수 있다(도 4). 그러므로, 본 발명의 혼합물의 물추출물을 함유하는 약학적 조성물은 면역기능을 활성화시켜 항암 효과를 나타냄으로써, 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 면역기능 증진에 광범위하게 활용되고, 암의 치료보조제로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명은 상기 혼합물의 물추출물을 함유하는 건강 보조식품을 제공한다.

이 때, 본 발명의 혼합물의 물추출물을 함유하는 건강 식품으로는 차, 젤리, 즙, 쥬스, 엑기스, 분말, 음료로 사용될 수 있고, 감기 예방 및 증상 개선을 목적으로 하는 민간요법제등의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 혼합물의 물추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 혼합물의 물추출물은 각종의 투여 경로를 통하여 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용도는 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 보다 구체적으로 약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용될 수 있는 표준의 약제학적 담체라면 어느 것이든 가능하다. 통상적으로 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함할 수 있으며 또한 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명의 혼합물의 물추출물을 유효성분으로 함유한 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 방법으로 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여의 방법에 의해 투여할 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다. 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 혼합물의 물추출물의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제가 포함될 수 있다. 바람직하게는 정제, 캅셀 또는 드링크제로 만들어 의약품 내지는 건강보조 식품의 형태로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 혼합물의 물추출물을 포함하여 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 3 회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 10 ∼ 500 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 30 ∼ 300 mg/kg의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에서 혼합물의 물추출물은 실험용 생쥐를 대상으로 한 급성독성검사 결과, 경구투여 또는 복강내 주사 시 반치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/㎏ 이상으로 전혀 독성효과를 나타내지 않음으로써 생체 안전성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 혼합물의 추출물은 생체에 대해 안전하게 투여될 수 있다. 또한, 시험관 내 유전독성 시험에서도 돌연변이원성(突然變異原性)을 나타내지 않았다.

이하, 본 발명을 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 혼합물의 물추출물을 포함하는 엑기스의 제조

각 식물 소재는 건조 중량을 기준으로 해바라기(잎 90% 및 씨 10%) 30%, 어성초 25%, 갈근 20%, 감초 15%, 쑥 5%, 대추 5% 무게 비율로 혼합한 다음, 상기 혼합물의 총 무게에 대하여 증류수 10 배를 가하여 92℃ 이상에서 8 ∼ 10 시간동안 열탕 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고, 상기 여과 후 여액을 감압농축하여 엑기스로 제조하였다.

<실시예 2> 혼합물의 물추출물을 포함하는 분말의 제조

식물 소재 해바라기(잎 90% 및 씨 10%) 30%, 어성초 25%, 갈근 20%, 감초 15%, 쑥 5%, 대추 5% 무게 비율로 혼합한 다음, 상기 혼합물의 총 무게에 대하여 증류수 10 배를 가하여 92℃ 이상에서 8 ∼ 10 시간동안 열탕 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고, 상기 여과 후 여액을 감압농축하고, 동결건조 방법으로 분말을 제조하였다.

본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 면역기능 증강 및 항암 효과를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

<실험예 1> 면역기능 증강효과

<1-1> 시험관 내에서 면역세포 활성화 효과(Lymphocyte proliferation)

면역세포의 활성화 정도를 측정하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 혼합물의 물추출물 및 대조 물질, 사물탕, 사군자탕, 보중익기탕, 삼령백출산, 십전대보탕, 양성대조 물질로써 PHA 및 LPS를 면역세포와 함께 시험관에 넣고 배양하여 면역세포 증식 정도를 측정하였다.

면역세포는 활성화되면 세포대사가 증폭되고, 세포가 분열되어 유전자(DNA)를 복제하게 되는데, 이때 배양액에 DNA의 전구물질의 하나인 티미딘(thymidine)에 동위원소(³H)를 표지하여 세포가 흡수한 동위원소의 양을 측정하여 면역세포의 활성화 정도를 산정하는 방법을 이용하였다.

면역세포로는 실험용 생쥐의 비장 림프구를 사용하였다.

실험에 사용한 생쥐(C57BL/6 mouse)는 실험에 사용하기 전까지 온도가 22 ±2℃, 습도가 55 ∼ 60%로 유지되며 명암이 12 시간씩 조절되는 표준사육 환경에서 생육하고, 고형사료와 물을 제한없이 공급하였다.

상기 생쥐의 비장 림프구를 얻기 위하여, 생쥐(C57BL/6 mouse)를 경추 탈구법으로 희생시킨 뒤, 복부를 절개하여 비장을 무균적으로 적출하고 멸균된 핀셋과 수술용 칼로 지분거려 생리식염수(HBSS)에 세포를 부유시켰다. 상기 비장세포 부유액을 2 분간 방치하여 부유되지 않은 세포 덩어리를 제거한 후, 암모늄 완충용액(Tris-NH₄Cl용액)을 가하여 적혈구를 제거하고 HBSS로 2 회 세척하여 비장 림프구를 얻었다. 상기에서 얻은 비장 림프구를 트라이판 블루(Trypan blue) 염색법으로 세포수를 측정한 후, 배양액으로 적정하게 희석하여 실험에 사용하였다.

상기 실시예 2에서 제조된 혼합물의 물추출물의 건조분말을 증류수에 10 ∼ 100 mg/ml 농도로 녹이고, 무균 상태로 적용하기 위하여 0.45 ㎛의 밀리포아 멤브레인(Millipore membrane)의 무균 여과지로 여과하여 실험에 사용하였다.

면역세포의 활성화 정도를 측정하기 위하여(lymphocyte proliferation test), 먼저 생쥐의 비장 림프구를 소액 배양용 시험관(96-well microplate)에 2×10⁵ 개/웰의 농도로 분주하고, 상기 실시예 2에서 제조된 혼합물의 물추출물 또는 대조 물질들을 첨가한 다음 세포배양기(CO₂-incubater)에서 2 일 또는 3 일동안 배양하였다. 배양 후, 웰당 1.5 μCi의 트리티움티미딘(³H-thymidine)을 첨가한 다음 4 시간 추가로 배양하였고, 세포수집기(cell harvester)로 세포를 수거하였다. 신틸레이션 칵테일(Scintillation cocktail)을 2.5 ㎖씩 첨가하여, 베타-신틸레이션 카운터(β-scintillation counter)로 세포가 흡수한 트리티움티미딘(³H-thymidine) 양을 분당 카운트 수(cpm)으로 측정하였다.

도 1은 상기 방법에 따른 면역세포 활성화 정도를 나타낸 결과로서, 상기 실시예에서 제조된 본 발명의 혼합물의 물추출물은 시료를 첨가하지 않고 실시한 대조군과 종래의 보기 및 보혈 한방제인 사물탕(Si-Wu-Tang), 사군자탕(Si-Jun-Zi-Tang), 보중익기탕(Bu-Zhong-Yi-Qi-Tang), 삼령백출산(San-Ling-Bai-Shu-San) 및 십전대보탕(Shi-Quan-Dai- Bu-Tang)보다 월등히 높은 면역세포 활성화 효과를 보였다.

또한, 양성대조군으로 측정된 파이토헴아글루티닌(phytohemagglutinin, PHA) 및 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)은 본 발명의 혼합물의 물추출물보다 높은 면역세포 활성화 효과를 보였으나, 상기 PHA 및 LPS는 생체내에 적용하면 독성이 심하여 실용화되지 못한다. 반면에, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 높은 면역세포 활성화 효과를 보일 뿐만 아니라 식용가능한 식물소재를 선택함으로서, 독성의 문제가 없고 생체내에 직접 적용할 수 있다.

<1-2> 생체내의 세포 매개성 면역반응(cell-mediated cytotoxicity) 증진효과

본 발명의 혼합물의 물추출물이 세포 매개성 면역반응(cell-mediated cytotoxicity)에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같이 실험하여 생쥐 비장 림프구의 암세포 파괴능을 측정하였다.

상기 세포 매개성 면역반응은 생체내 면역기능 중 항암 효과를 나타내는 주요 면역반응이며, 이때 사용된 생쥐(C57BL/6 mouse)는 상기와 동일한 표준 사육조건에서 사육하였다.

생쥐에 4 일간 5 ㎎/mouse의 시료를 주사한 다음, 생쥐의 비장으로부터 분리한 림프구를 작동세포(effector cells)로 하여, 시험관 내에서 암세포를 표적세포(target cell)로 하여 암세포 파괴능(cytotoxicity)을 크롬유리법(⁵¹Cr-release assay)으로 측정하였다.

상기 세포 매개성 암세포 파괴능(cytotoxicity) 측정을 위하여, 방사선 동위원소 크롬(⁵¹Cr)을 표지시킨 표적세포 및 림프구를 혼합하여 반응시킨 다음 그 상층액에 유리된 ⁵¹Cr의 양을 측정하여 암세포 파괴능(cytotoxicity)을 산출하였다.

표적세포(target cells)로 사용된 림프종 세포는 세포 배양용 플라스크에서 배양하였다. 상기 림프종 세포는 YAC-1 세포주로서, A/Sn 계통 생쥐에서 Moloney leukemia virus(몰로니 백혈병 바이러스)에 의해 유발된 T 세포(cell) 림프종으로부터 유래된 세포주이다.

표적세포인 림프종 세포(YAC-1세포)를 현탁액에 소디움크로메이트(Na₂ ⁵¹CrO₄: NEN, U.S.A) 200 μCi/10⁷ cells의 농도로 37℃에서 45 분간 표지하여 사용하였다. ⁵¹Cr이 표지된 표적세포(1 ×10⁵ cells/㎖) 100 ㎕ 및 필요한 농도로 조정된 작동 세포 100 ㎕를 96-웰 플레이트(96 well round bottom plate)에 혼합한 후 배양기에서 4 시간동안 배양하였다. 그 후 플레이트를 500 ×g에서 10 분간 원심한 후 상층액 100 ㎕씩을 취하여, 표적세포(암세포)의 사멸에 따라 상층액에 유리되어 나온 크롬의 양을 감마카운터(γ- counter)에서 분당 방사능 카운트 수(cpm; count per minute)로 측정하였다.

각 실험은 3 배수로 실시하였으며 작동세포의 암세포 파괴능(% cytotoxicity)을 하기 수학식 1에 의하여 산출하였다.

상기 수학식에서, ER(Experimental Release)은 시험군의 크롬 유리정도이며, SR(Spontaneous Release)은 음성대조군에서 자연적으로 유리되는 정도이고, MR(Maximal Release)은 최대 유리량이다.

상기 SR은 작동세포가 들어 있지 않고 표적세포만 들어 있는 대조군의 상층액 100 ㎕의 방사선량이고, MR은 표적세포에 트리톤(Triton X-100) 1% 용액 100 ㎕를 가하여 얻었으며 표지된 방사능의 95% 이상이 되도록 하였다. SR은 MR의 10% 이내가 되게 하였다.

도 2의 결과로부터, 혼합물의 물추출물 대신에 생리식염수를 투여하여 실시한 음성대조군 생쥐의 면역세포는 14%의 암세포 파괴능(% cytotoxicity)을 보임으로써, 상기 음성대조군에서도 암세포에 대한 면역반응이 미약하나마 관찰되었다. 그러나, 본 발명의 혼합물의 물추출물을 투여하여 실시한 경우, 면역세포의 암세포 파괴능이 24%로 관찰됨으로써, 세포 매개성 면역반응의 정도가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 그러므로, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 세포 매개성 면역반응을 증가시킴으로써, 항암 효과에 유용하게 이용될 수 있다.

<실험예 2> 생쥐에 이식된 암세포 생장억제 효과

본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 생체내에서 항암 효과를 평가하기 위하여, 암세포가 이식된 생쥐에서 암세포의 생장 억제 효과 및 생쥐의 생존기간 연장효과를 하기와 같이 실험하였다.

<2-1> 암세포가 이식된 생쥐에서 암세포 생장 억제 효과

생후 10 주령의 생쥐(DBA/2)의 대퇴부에 림프구성 백혈병 세포(L1210: lympocyte leukemia, ATCC #CCL-219)를 10⁶ 개씩 이식하였다. 상기 암세포를 이식한 후 10 일동안 시료를 복강으로 주사하여 이식 12 일째에 종양의 크기를 관찰하였다.

도 3a는 본 발명의 혼합물의 물추출물 대신에 생리식염수를 투여하여 실시한 대조군이며, 도 3b는 본 발명의 혼합물의 물추출물을 투여하여 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 본 발명의 혼합물의 물추출물을 투여한 경우(도 3b) 종양의 크기가 대조군(도 3a)에 비해 현저하게 작은 것을 관찰함으로써, 본 발명의 혼합물의 물추출물이 암세포의 생장을 현저히 억제시켰음을 알 수 있었다.

<2-2> 암세포가 이식된 생쥐의 생존기간 연장 효과

상기 실험예 <2-1>과 같이, 암세포를 생쥐에게 이식한 후, 시료를 투여하고, 시간 경과에 따른 생존율을 관찰하였다.

도 4의 결과로부터, 본 발명의 혼합물의 물추출물 대신에 생리식염수를 투여하여 실시한 대조군이 암세포 이식 후 15 일까지 100%의 생본율을 보이다가 15 일 경과 직후부터 생존율이 떨어져서 투여 19 일만에 생존율 0%를 보였다.

반면에, 본 발명의 혼합물의 물추출물을 투여한 경우 상기 대조군에 비하여, 13%의 생존일수 증가 효과를 보였다. 보다 구체적으로, 상기 본 발명의 혼합물의 물추출물을 투여한 경우 암세포 이식 후 16 일까지 100%의 생존율을 보이고 떨어지는 경향은 동일하게 관찰되지만 최대 22 일까지 생존 기간을 연장할 수 있음을 확인하였다.

<실험예 3> 시험관내에서 유전 독성학적 안전성 검증

본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 유전 독성학적 안전성을 평가하기 위하여, 살모넬라(Salmonella typhimurium)을 이용한 복귀 돌연변이 실험을 하기와 같이 수행하였다.

실험에 사용된 균주는 살모넬라(Salmonella typhimurium) TA98 및 TA100을 사용하였으며 유전형질을 확인한 후 실험에 적용하였다.

실험은 대사를 활성화시키지 않는 직접법 및 대사를 활성화시키는 간접법을 이용하여 수행하였다.

직접법은 시험관에 인산완충용액 0.5 ㎖, 시료 0.1 ㎖ 및 12 시간 배양된 균 배양액 0.1 ㎖을 가볍게 혼합하고, 상기의 혼합액에 히스티딘/바이오틴이 첨가된 0.6%의 저농도 한천 수용액(45℃)을 2 ㎖ 추가로 첨가하고 3 초간 혼합 후, 최소 포도당 한천배지 상에 부어 평판화시켰다. 37℃에서 48 시간 배양하여 복귀 돌연변이 집락수를 계수하였다.

또한, 실험조건의 적합성 여부를 판정하기 위하여, 양성대조물질로서 4-나이트로-o-페닐렌디아민(4-nitro-o-phenylenediamine; NPD) 또는 소디움아자이드(sodium azide)를 실험 균주의 특성에 따라 사용하였다.

간접법은 시험관에 간효소 혼합물(S9 mix) 0.5 ㎖, 시료 0.1 ㎖ 및 12 시간 배양된 균 배양액 0.1 ㎖을 가볍게 혼합하고, 상기의 혼합액을 37℃에서 30 분간 예비 배양한 후, 히스티딘/바이오틴이 첨가된 0.6%의 저농도 한천 수용액(45℃)을 2 ㎖ 추가로 첨가하고 3 초간 혼합하여 최소 포도당 한천배지 상에 부어 평판화시켰다. 37℃에서 48 시간 배양하여 복귀 돌연변이 집락수를 계수하였다.

또한, 실험조건의 적합성 여부를 판정하기 위하여, 양성대조물질로서 2-아미노플루오린(2-aminofluorene; 2-AF)을 사용하였다. 상기의 실험 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

본 발명의 혼합물의 물추출물의 유전 독성 안전성 평가 실험(복귀 돌연변이 실험)

시료	간효소 혼합물(S9 mix)	용량(㎍/plate)	균주의 복귀 돌연변이(his+) 집락수/plate
시료	간효소 혼합물(S9 mix)	용량(㎍/plate)	TA98	TA100
H₂O	-		23 ±1.5	161 ±14.9
실시예 1	-	5000	26 ±2.1	167 ±14.1
	-	1650	21 ±2.4	163 ±7.8
	-	550	23 ±2.4	150 ±3.5
	-	180	17 ±2.8	145 ±5.1
	-	61	17 ±1.4	132 ±4.9
NPD	-	20	1995 ±37.5
Na-Azide	-	1.5		1195 ±104.5
H₂O	+		40 ±6.3	153 ±7.8
실시예 1	+	5000	45 ±3.5	177 ±9.6
	+	1650	41 ±4.2	155 ±4.9
	+	550	43 ±0.7	150 ±7.1
	+	180	36 ±2.1	149 ±3.5
	+	61	41 ±0.3	143 ±0.7
2-AF	+	10	762 ±42.4	2324 ±168.9

상기 표 1의 결과로부터, 증류수를 첨가하여 실시한 음성대조군에 비해 상기 실시예 1의 혼합물의 물추출물이 각 용량 단계에서 복귀돌연변이 집락수를 유의적으로 증가시키지 않는 결과를 관찰함으로써, 돌연변이원성을 나타내지 않음을 알았다. 이러한 결과로부터 본 발명의 혼합물의 물추출물이 유전 독성학적으로 안전함이 입증되었다.

<실험예 4> 생쥐에 대한 경구 또는 복강 투여 급성 독성실험

본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 생체내 급성 독성실험을 하기와 같이 실시하였다.

실험군 당 생쥐(C57BL/6 mouse) 6 마리씩 사용하여, 본 발명의 혼합물의 물추출물을 최대 2,000 ㎎/kg의 용량으로 각 용량 단계별로 경구투여 또는 복강 내 주사하였다. 경구투여군은 2 주간 관찰하였으며, 복강내 투여군은 1 주간 관찰하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하고 현미경검사를 실시하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 생쥐에서 경구투여 또는 복강내 주사 시 반치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/㎏ 이상으로 전혀 독성효과를 나타내지 않음으로써 생체 안전성이 매우 높다는 것을 알 수 있었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 해바라기의 잎 및 씨, 어성초, 갈근, 감초, 쑥 및 대추를 포함하는 혼합물의 물추출물을 제조하였고, 본 발명의 혼합물의 물추출물은 무독성의 식물소재 또는 생약제제에서 선택된 천연물 소재를 원료로 함으로써, 종래의 생물화학적 면역증강 제제 혹은 항암 화학물질보다 부작용과 독성이 적고 안전성이 보강되었으며, 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 면역기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 암 치료 보조제로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 면역기능 증진 및 항암효과가 높음으로써 건강 보조식품으로도 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 시험관내에서의 면역세포 활성화 효과를 나타낸 결과이고,

1: 대조군 2 : 본 발명의 혼합물의 물추출물

3: 사물탕 4 : 사군자탕

5: 보중익기탕 6 : 삼령백출산

7: 십전대보탕 8 : PHA (양성대조물질)

9: LPS (양성대조물질)

도 2는 본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 생체내에서의 세포 매개성 면역반응 증진 효과를 나타낸 결과이고,

1: 대조군 2: 본 발명의 혼합물의 물추출물 투여군

도 3a는 생리식염수를 투여하여 실시한 대조군에서 암세포 생장 정도를 나타낸 결과이고,

도 3b는 본 발명의 혼합물의 물추출물 투여군에서 암세포 생장 억제효과를 나타낸 결과이고,

도 4는 본 발명의 혼합물의 물추출물에 대한 암세포 이식 생쥐의 생존일 연장효과를 나타낸 결과이다.

1: 대조군 2: 본 발명의 혼합물의 물추출물 투여군

Claims

해바라기의 잎 및 씨 20 ∼ 40 중량%, 어성초 20 ∼ 30 중량%, 갈근 10 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 20 중량%, 쑥 1 ∼ 5 중량% 및 대추 1 ∼ 5 중량%로 구성된 것을 특징으로 하는 혼합물의 물추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강 및 항암용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 혼합물의 물추출물이 해바라기의 잎 및 씨 25 ∼ 35 중량%, 어성초 20 ∼ 25 중량%, 갈근 15 ∼ 20 중량%, 감초 10 ∼ 15 중량%, 쑥 3 ∼ 5 중량% 및 대추 3 ∼ 5 중량%로 구성된 것을 특징으로 하는 면역기능 증강 및 항암용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 혼합물의 물추출물이 해바라기의 잎 및 씨 30 중량%, 어성초 25 중량%, 갈근 20 중량%, 감초 15 중량%, 쑥 5 중량% 및 대추 5 중량%로 구성된 것을 특징으로 하는 면역기능 증강 및 항암용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 혼합물의 물추출물이 엑기스 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는 면역기능 증강 및 항암용 조성물.
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