KR100401955B1

KR100401955B1 - 면역, 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약조성물 및그의 제조방법

Info

Publication number: KR100401955B1
Application number: KR10-2000-0023772A
Authority: KR
Inventors: 조성기; 김성호; 이성태; 박혜란; 유영법; 변명우
Original assignee: 한국원자력연구소
Priority date: 2000-05-03
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2003-10-17
Also published as: KR20010100551A

Abstract

본 발명은 면역, 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약 조성물과 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 당귀, 천궁 및 작약을 동일 무게 비율로 혼합하고, 열탕 추출하여 제조한 생약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생약 조성물은 기존의 생물화학적 면역증강제제들보다 부작용(side effect)과 독성이 작고 안전성을 보강한 것으로, 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 면역 및 조혈기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선 치료시 또는 방사선 작업에 따른 방사선 장해의 예방 및 극복에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역, 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약조성물 및 그의 제조방법{The pharmaceutical composition and its preparation method of herb mixture for immunomodulation, heamatopoiesis augmentation and protection from radiation}

면역기능이 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어한다는 사실은 이미 오래 전에 알려졌다. 이에 따라 질병의 예방 및 치료를 위하여 면역기능을 이용하는 예방접종(vaccination) 및 항독소이용 방법 등이 개발되었으며, 최근에는 면역기능의 작용기작이 알려짐에 따라 면역조절물질을 이용하려는 많은 시도가 있었다.

면역조절물질은 비특이적으로 면역세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진시킴으로써 질병요인에 대한 생체의 방어력을 증강시킨다. 이와 같은 비특이적 면역조절물질로서 화학합성물질, 미생물 조성물, 생물제제 등을 활용하려는 시도가 계속되어 왔다. 그러나 대부분이 독성 또는 부작용 때문에 실제 적용에는 한계를 보이고 있다.

조혈기능은 골수의 혈액모세포로부터 면역세포를 포함한 여러 가지 혈액세포를 생성하는 기능으로서 면역기능과 마찬가지로 생체의 방어력과 밀접한 관계가 있다. 최근 혈액모세포로부터 혈액세포로 분화하는 단계와 각 단계에 작용하는 인자들(cytokines)이 알려지면서 이 인자들을 유전공학적으로 대량생산하여 질병치료에 이용하려는 연구가 활발히 진행되었다. 그러나, 효과를 얻을 수 있을 정도의 대량으로 인체에 투여할 경우 대부분이 심한 독성을 나타내기 때문에 일부 제한적인 용도에만 활용되고 있는 실정이다.

한편, 방사선에 의한 생체 장해의 방호에 있어서도 면역기능과 조혈기능 장해 극복이 중요한 문제로 알려져 있다. 방사선에 의한 장해는 피폭된 선량에 따라 다르게 나타난다. 즉, 초고선량(100∼300 Gy) 피폭 시에는 중추신경계 장해로 인하여 수시간 내지 1∼2일 안에 대부분 사망하게 되고, 고선량(10∼30 Gy) 피폭 시에는 위장관장해(위장관 점막 손상)로 1∼2주 안에 많은 수가 사망하게 되며, 중간선량(4∼8 Gy) 피폭 시에는 골수장해로 조혈 및 면역기능 저하를 초래하게 되어 30일 안에 일부가 사망하게 되고, 저선량(1∼2 Gy) 피폭 시에는 저선량장해가 만성적으로 나타나게 된다. 중추신경계 장해 시에는 지금까지 알려진 대응방법이 거의 없으며, 그 이하 선량의 방사선에 의한 장해를 방호하기 위해서는 위장관 장해 억제와 면역 및 조혈기능 장해 개선이 관건이다.

방사선 장해 방호 물질에 대한 연구는 1949년 치올기를 함유한 치올(thiol) 복합제가 방사선 방호효과를 갖는다는 보고가 있은 후에, 치올기를 함유한 유기합성물인 WR시리즈의 방호효과에 관한 연구에 집중되었으나 그 독성 때문에 실제 응용에는 한계를 보였다. 1990년 이후에는 미국, 이스라엘, 일본 등에서 디피리다몰(dipyridamole), 아데노신모노포스페이트(adenosine monophosphate), 테트라사클로데카옥사이드(tetracychlorodecaoxide), 아데투론(adeturon), 데옥시스퍼구알린(deoxyspergualin) 등 화학합성제의 효과를 연구하였으나 자체의 심각한 독성 때문에 역시 실제 적용에는 한계를 보였다. 한편으로, 면역반응에 관련된 생체내 인자들과 조혈세포의 분화 및 증식에 관련된 인자들이 밝혀지면서 이들의 일부를 이용하려는 시도가 있었다. 즉, 인터루킨-1(interleukin-1)을 비롯한 면역 자극제, 종양 괴사인자(tumor necrosis factor, TNF), 과립구 집락형성 촉진인자(granulocyte colony-stimulating factor, GM-CSF)와 같은 조혈세포 증식 유도제 또는 호르몬 등에 의한 방사선 방호 효과를 얻고자 하였으나, 이역시 독성 때문에 극히 제한적으로 시도되고 있다.

최근에는 식품과 생약제제를 중심으로 한 천연물들이 노인성, 퇴행성 질환들에 높은 효능을 보이는 것으로 입증되고 있으며, 이에 따라 이들의 영양생리 및 약리기전에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 이들 천연물로부터 생체조절 및 생체방어계를 항진시키는 생리활성물질 탐색이 활발히 진행되어 건강보조식품이나 치료제로서의 실용화 단계에 이르고 있다.

면역조절물질에 대한 연구는 일부 천연물로부터 추출한 유효성분 또는 기존의 한방제의 효과 검증을 중심으로 수행되어 왔으며, 방사선에 의한 조혈기능 장해개선을 위한 천연물의 효능에 관한 연구로는 1988년 프랑스에서 가시오가피의 효능을 검색한 보고외에, 주로 일본, 대만, 중국을 중심으로 인삼, 천연안료, 만삼, 천궁, 영지와 몇 가지 기존의 한방제에 대한 연구가 최근까지도 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 방사선에 의한 장해가 면역기능 장해, 조혈기능 장해 및 원줄기 세포 손상 등이 복합적으로 일어나는 현상임을 감안하여 각각에 유효한 생약재를 검색하여 당귀, 천궁 및 작약을 동일 무게 비율로 혼합하고, 열탕 추출하여 생약조성물을 제조하였으며, 상기 생약조성물이 기존의 생물화학적 면역증강제제들보다 안전성이 높고, 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 면역 및 조혈기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선 장해를 종합적으로 방호할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 면역, 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약 조성물로서, 당귀, 천궁 및 작약을 동일 무게 비율로 혼합하고, 열탕 추출하여 제조한 생약 조성물 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 생약조성물의 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 생약조성물의 면역세포 활성화 효과를 나타낸 그래프이고,

혼합추출물-1 : 당귀, 천궁, 작약, 오가피

혼합추출물-2 : 당귀, 천궁, 작약, 어성초

도 2는 실험용 생쥐에서 본 발명의 생약조성물의 항체 생성 증진 효과를 나타낸 그래프이고,

도 3은 실험용 생쥐에서 본 발명의 생약조성물의 세포성 면역반응 증강 효과를 나타낸 그래프이고,

도 4는 골수세포 배양에서 본 발명의 생약조성물의 조혈전구세포 증식 촉진 효과를 나타낸 그래프이고,

혼합추출물-1 : 당귀, 천궁, 작약, 오가피

혼합추출물-2 : 당귀, 천궁, 작약, 어성초

도 5는 골수 간질세포 배양에서 본 발명의 생약조성물의 세포 증식 촉진 효과를 나타낸 그래프이고,

도 6은 골수 간질세포 배양에서 세포의 면역 및 조혈조절 인자 생산에 미치는 본 발명의 생약조성물의 영향을 나타낸 그래프이고,

도 7은 방사선(8 혹은 4 Gy)을 조사한 생쥐에서 분리한 골수세포의 증식에 미치는 본 발명의 생약조성물의 영향을 나타낸 그래프이고,

도 8은 방사선(12 Gy)을 조사한 생쥐에서 소장 움의 생존에 미치는 본 발명의 생약조성물의 영향을 나타낸 그래프이고,

혼합추출물-1 : 당귀, 천궁, 작약, 오가피

혼합추출물-2 : 당귀, 천궁, 작약, 어성초

도 9는 방사선(6.5 Gy)을 조사한 생쥐에서 조혈모세포의 생존에 미치는 본 발명의 생약조성물의 영향을 비장내 조혈세포 집락 형성 수로 나타낸 그래프이고,

혼합추출물-1 : 당귀, 천궁, 작약, 오가피

혼합추출물-2 : 당귀, 천궁, 작약, 어성초

도 10은 방사선(2 Gy)을 조사한 생쥐에서 소장 움 세포의 자사(自死)에 미치는 본 발명의 생약조성물의 영향(억제효과)을 나타낸 그래프이다.

혼합추출물-1 : 당귀, 천궁, 작약, 오가피

혼합추출물-2 : 당귀, 천궁, 작약, 어성초

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 기존의 수종 한방제들 및 그 구성 생약재와 기존의 처방들을 변형한 제제들을 대상으로 면역증진, 조혈증진 및 방사선 방호 효과를 비교 검색한 결과를 바탕으로, 면역 및 조혈 증진과 동시에 방사선 방호 효과의 더 높은 활성을 나타내는 당귀, 천궁 및 작약으로 구성된 혼합 생약조성물 및 그의 제조방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명에서는 식품소재로 이용할 수 있도록 고시되어 있는 생약재 3가지 즉 당귀, 천궁 및 작약을 동일 무게 비율로 혼합하고 열탕 추출하여 혼합조성물을 제조한다. 이때 열탕 추출물은 혼합 생약재 총 무게의 5 내지 20배, 바람직하게는 10배 량의 물을 가하여, 3시간씩 3회 약탕기에서 끓여 추출한 것을 감압 농축기로 농축하고, 동결 건조시켜 분말로 제조하거나 엑스분 그 자체를 이용할 수 있다.

본 발명의 생약조성물은 정상 생쥐의 면역세포(비장 림프구)를 시험관내 실험에서 활성화시키고, 항원으로서 면양적혈구(sheep red blood cell, SRBC)를 주사한 생쥐에서 항체생산 세포수를 증가시키며, 동종이계(同種異系, allogeneic) 면역세포를 이식하였을 때의 반응(GraftversusHost Reaction), 즉 T-세포매개 세포성 면역반응을 증가시키는데, 이는 상기 생약조성물이 면역증진 효과를 나타냄을 의미한다.

또한, 본 발명의 생약조성물은 조혈기능 증진 효과를 나타낸다. 혈액세포는 림프구, 적혈구, 과립구, 대식세포 등과 같은 여러 종류의 세포로 구성되어 있는데, 이러한 세포들은 수명이 한정되어 있으며, 자기복제능력을 가진 공통의 원줄기 세포(stem cells)로부터 계속적으로 만들어져 혈액 내로 공급된다. 이러한 혈액 원줄기 세포가 여러 종류의 성숙세포로 증식 분화하는 과정에는 아직도 불확실한 점들이 많으나, 최근에는 혈액 원줄기 세포의 증식과 분화에 관여하는 다양한 조혈인자가 밝혀졌다. 즉, 다양한 단백질인자(사이토카인 등)가 관여할 뿐만 아니라, 혈액 원줄기 세포 주위에 존재하는 간질세포(stromal cells)와의 접촉작용이 매우 중요하다고 생각되고 있다. 조혈조직인 골수(bone marrow) 내에는 내피세포, 지방세포, 섬유아세포, 망상세포, 그리고 대식세포 등이 존재하며 세포 사이에는 파이브로넥틴 등과 같은 세포외 메트릭스가 형성되어 있다. 이러한 세포들과 세포외 메트릭스 등이 혈구의 분화 증식에 적합한 조혈미세환경을 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 조혈미세환경을 조절할 수 있는 물질이 조혈기능을 조절할 수 있을 것으로 생각하고, 실제적으로 본 발명의 생약조성물이 시험관 내에서 골수 간질세포 및 조혈 전구세포를 증식시킬 뿐만 아니라, 골수 간질세포의 사이토카인 생산을 증대시키고 조혈 전구세포의 분화·증식을 촉진시킨다는 것을 확인하여, 상기 생약조성물이 조혈 미세환경에서의 조혈인자의 생성에 영향을 미침으로써 조혈계의 기능증진을 유도함을 밝혔다.

상기의 조혈기능 증진효과는 방사선 조사된 생쥐에서도 효과적으로 나타나는데, 이는 본 발명의 생약조성물이 방사선 방호에도 효과적임을 의미한다. 본 발명자들은 하기와 같은 사실에 근거하여 본 발명에서 제공하는 생약조성물의 방사선 방효효과를 구체적으로 확인하였다.

생체를 구성하고 있는 조직 또는 세포에는 방사선에 피폭되는 경우 장해를 받기 쉬운 방사선에 민감한 조직과 상대적으로 저항성을 보이는 조직이 있다. 따라서, 방사선에 의한 장해는 피폭된 방사선량에 따라 다르게 나타나는데, 초고선량(100∼300 Gy) 피폭 시에는 중추신경계 장해, 고선량(10∼30 Gy) 피폭 시에는 위장관장해(위장관 점막 손상), 중간선량(4∼8 Gy) 피폭 시에는 골수장해(조혈 및 면역기능 장해), 저선량(1∼2 Gy) 피폭 시에는 저선량장해(만성장해)로 나타나게 된다. 중추신경계 장해 시에는 수시간 내지 1∼2일 안에 대부분 사망하게 되어 대응방법이 거의 없으므로, 방사선 장해 방호는 위장관장해를 나타내는 선량 이하의 방사선에 피폭된 경우를 주 대상으로 하고 있다. 결국, 방사선에 의한 장해를 방호함에 있어서는 위장관장해 억제와 면역 및 조혈기능 장해 개선이 관건이다. 따라서 본 발명자들은 상기 생약조성물을 생쥐에 투여하고 위장관장해 억제와 면역 및 조혈기능 장해개선 여부를 확인하였다. 본 발명의 생약조성물은 고선량의 방사선을 조사한 경우 소장의 움을 방사선으로부터 방호하여 생존 움의 수를 증가시키고, 중간 선량의 방사선을 조사한 생쥐에서 조혈모세포를 방호하며, 저선량의 방사선을 조사한 생쥐에서는 소장 움 세포의 사멸(apoptosis) 정도를 억제하는 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 본 발명의 생약조성물이 방사선 방호에 효과적임을 의미한다.

결국, 본 발명의 생약조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물로서 여러 가지 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 면역 및 조혈 기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선 치료 시 또는 방사선 작업에 따른 방사선 장해의 예방 및 장해 극복에 활용될 수 있다. 또한 상기 생약재 조합의 배합비를 최종제품의 상품성과 소비자 기호도에 따라서 변형시키거나, 다른 식품소재를 첨가하여 기능성 식품으로 제조할 수 있다.

본 발명의 생약조성물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 생약조성물의 유효용량은 10∼800 mg/kg 이고, 바람직하기로는 40∼400 mg/kg 이며, 하루 1 내지 3 회 투여될 수 있다.

상기 생약조성물은 생쥐를 대상으로 한 급성독성검사 결과 경구투여 및 복강내 주사 시 50% 치사량이 공히 체중 kg 당 2 g 이상으로서 전혀 독성효과를 나타내지 않았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 당귀, 천궁 및 작약을 포함한 생약조성물의 제조

당귀, 천궁 및 작약의 생약재 3가지를 음건하고 세절하여 같은 무게 비율로 혼합하였다. 총 무게의 10배 량의 증류수를 가하여 3시간씩 3회 약탕기에서 끓여 추출한 다음, 여과한 후 감압 농축기로 농축한 다음 동결건조하였다. 실험에 사용하기 위하여 증류수에 10 내지 100 mg/㎖의 농도로 녹이고, 무균 상태로 적용하기 위하여 무균 여과지(Millipore membrane, 0.45 ㎛)로 여과하였다.

<실험예 1> 면역기능 증강효과

<1-1> 면역세포 활성화 효과 (Lymphocyte proliferation)

면역세포를 분리하여 시험관 내에서 배양하는 시험계에 상기실시예 1에서 제조한 생약조성물 및 여러가지 시료를 첨가하고, 면역세포가 활성화되는 정도를 측정하였다. 면역세포로는 실험용 생쥐의 비장 림프구를 사용하였다. 면역세포가 활성화되면 세포대사가 증폭되고 세포가 분열하게 되기 때문에 유전자(DNA)를 복제하게 되는데, 이 때 배양액에 DNA의 전구물질의 하나인 티미딘(thymidine)에 표지자로 동위원소(H³)를 붙인 것을 첨가하여 세포가 흡수한 동위원소의 양을 측정하여 면역세포의 활성화 정도를 산정하였다.

실험에 사용한 생쥐(C57BL/6 mouse)는 실험에 사용하기 전까지 온도가 22±2℃, 습도가 55-60%로 유지되며 명암이 12시간씩 조절되는 표준사육 환경에서 생육하고, 고형사료와 물을 제한 없이 공급하였다.

비장림프구를 얻기 위하여, 생쥐(C57BL/6 mouse)를 경추 탈구법으로 희생시킨 뒤, 복부를 절개하여 비장을 무균적으로 적출하고 멸균된 핀셋과 수술용 칼로 지분거려 생리식염수(HBSS)에 세포를 부유시켰다. 상기 비장세포 부유액을 2분간 정치시켜 부유되지 않은 세포 덩어리를 제거한 후, 암모니움 완충용액(Tris-NH₄Cl용액)을 가하여 적혈구를 제거하고 HBSS로 2회 세척하여 비장 림프구를 얻었다. 이를 트라이판블루(Trypan blue) 염색법으로 세포수를 측정한 후 배양액으로 적정하게 희석하여 실험에 사용하였다.

면역세포의 활성화 정도를 측정하기 위하여(lymphocyte proliferation test), 먼저 생쥐의 비장 림프구를 소액 배양용 시험관(96-well microplate)에 2×10⁵개/웰의 농도로 분주하고 시료를 첨가한 다음 세포배양기(CO₂-incubater)에서 2일 또는 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 웰당 1.5 μCi의 트리티움티미딘(³H-thymidine)을 첨가한 다음 4시간 더 배양하고, 세포수집기(cell harvester)로 세포를 수거하였다. 신틸레이션 칵테일(Scintillation cocktail)을 2.5 ㎖씩 첨가하여, 베타-신틸레이션 카운터(β-scintillation counter)로 세포가 흡수한 트리티움티미딘(³H-thymidine) 양을 분당 카운트 수(cpm)으로 측정하였다.

그 결과,도 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 생약 조성물은 기존의 보기, 보혈 한방제인 사물탕(Si-Wu-Tang), 사군자탕(Si-Jun-Zi-Tang), 보중익기탕(Bu- Zhong-Yi-Qi-Tang), 삼령백출산(San-Ling-Bai-Shu-San), 십전대보탕(Shi-Quan-Dai- Bu-Tang)에 비해 훨씬 높은 면역세포 활성화 효과를 보였다. 또한, 당귀, 천궁, 작약, 오가피의 혼합추출물-1 및 당귀, 천궁, 작약, 어성초의 혼합추출물-2에 비하여도 본 발명의 생약조성물은 뛰어난 면역세포 활성화 효과를 나타내었다. 여기에서 양성대조군으로 사용한 파이토헴아글루티닌(phytohemagglutinin, PHA)과 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)는 생체내에 적용시 독성이 심하여 실용화 되지 못하고, 시험관내 실험시 대조물질로 사용되는 것이다.

<1-2> 생체내의 항체생성 증강 효과

생체내 면역기능 중 체액성 면역반응인 항체생성능에 미치는 상기 생약 조성물의 효과를 알아보기 위하여, 생쥐에 추출물을 투여하고 항원으로 면양적혈구(Sheep Red Blood Cell, SRBC)를 주사한 후 초기 면역반응에서 면양적혈구에 대한 항체를 생성하는 세포 수를 측정하였다.

실험에 사용한 생쥐(C57BL/6 mouse)는실험예 1-1와 동일한 표준 사육조건에서 사육하였다.

항체생성 세포수 측정(Hemolytic plaque forming cell assay)을 위하여, 먼저 본 발명의 생약 조성물의 최적용량을 정하여 생쥐 마리당(25 g) 0.25 ㎖씩 복강주사하였다. 다음날, 면양적혈구(SRBC)를 생쥐 마리당 2×10⁸개씩 정맥주사하고 생약 조성물을 복강주사한 후, 2일간 계속 복강주사 하였다. 면양적혈구 주사후, 3일째에 마우스를 경추탈골로 희생시키고 무균적으로 비장세포를 분리하고, 비장세포(7×10⁵세포/ 0.1 ㎖), 20% 면양적혈구(SRBC) 0.1 ㎖ 및 0.5% 아가로즈(agarose) 1.6 ㎖을 시험관에서 혼합하여 배양접시(dish)에 부은(pour)후 2시간 동안 세포배양기(CO₂-incubator)에서 배양하였다. 이후 보체(GPC,1/70)를 첨가하여 2시간 더 배양한 후 항체를 생산하는 림프구 주변에 형성된 용혈 플라크(plaque)를 계수하고 희석 배수를 고려하여 비장세포 전체 중 항체를 생산하는 세포수(plaque forming cells/spleen, PFC/spleen)을 산출하였다.

그 결과, 생약 조성물의 투여에 의하여 항체생성 세포 수가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다(도 2).

<1-3> 생체내 세포성 면역반응의 증강효과

생체내 면역기능 중 세포성 면역반응에 미치는 본 발명의 생약조성물의 효과를 확인하기 위하여, 생쥐에 동종이계(同種異系, allogeneic)의 면역세포(allogeneic immune cells)를 이식하여 이식된 면역세포에 의한 세포성 면역반응(Graft verus Host Reaction, GVH)을 유발시키고 본 생약조성물을 투여하였다.

실험에 사용한 생쥐 2종은 C57BL/6와 DBA/2이었으며, 잡종 생쥐인 BDF1(C57BL/6×DBA/2)은 C57BL/6 암컷과 DBA/2 숫컷을 교배시켜 얻었다.

세포성 면역반응(Graftvs.Host Reaction, GVH)을 측정하기 위하여, 먼저BDF1(C57BL/6×DBA/2) 마우스를 수용체로 하였으며, 동종이계(同種異系, allogeneic)의 이식 세포(graft)로는 C57BL/6 생쥐의 비장림프구를 사용하였다. 비장세포를 생쥐 마리당 1×10⁷개(0.2 ㎖)씩 꼬리정맥으로 주사하여 이식하였으며, 생약 조성물의 투여는 적정용량이 되도록 조정하여 이식시키는 날로부터 7일간 복강주사(0.2 ㎖/마리)로 실시하였다. 7일 후 비장을 적출하여 무게를 재고 체중으로 나누어 아래 수식에 의하여 비장지표(spleen index)를 산출하였다.

산출된 비장지표의 분석결과, 세포성 면역반응(GVH)이 생약조성물의 투여에 의하여 현저하게 증폭되는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

<실험예 2> 조혈기능 증강효과

<2-1> 조혈전구세포(골수간세포)의 증식효과

골수세포 배양계에 본 발명의 생약 조성물을 첨가하여 조혈전구세포의 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 골수세포는 생쥐의 대퇴골을 분리한 다음, 주사기를 이용하여 대퇴골 내부의 골수를 씻어내어 분리하였다. 골수세포를 장기간 배양하면, 배양접시에 부착하는 간질세포(stromal cells)와 부착하지 않고 배양액 내로 분화 증식되어 나오는 비부착성 세포(nonadherent cells)를 관찰할 수 있다. 간질세포와의 접촉작용을 통해 증식하는 비부착성 세포는 단구/대식세포, 혈소판, 적혈구 등으로 분화가 가능한 조혈전구세포로서 이들의 증식에 미치는 생약조성물의 효과를 확인하였다. 이러한 세포들을 배양 상층액과 같이 회수하여 혈구계수판으로 비부착성 세포수를 계수하였다.

그 결과, 골수세포 배양계에 본 추출물을 첨가하였을 때 분화 증식되는 비부착성 세포(nonadherent cells) 즉, 조혈전구세포가 대조군보다 훨씬 많이 증식되는것을 확인하였다(도 4).

<2-2> 골수 간질세포(Bone marrow stromal cells)의 증식 효과

골수간질세포 배양계에 본 발명의 생약조성물을 첨가하여 증식 효과를 확인하기 위하여, 먼저 골수세포를 배양하여 배양접시에 부착하는 간질세포만을 분리하여 준비하였다. 분리된 골수 간질세포를 장기간 배양하면서, 일주일에 한번씩 배지의 1/2을 새로운 배지로 교환하고, 생약 조성물을 첨가하여 2-3 주일 정도 계속 배양한 후 증식한 간질세포 수를 세어서 증식 정도를 측정하였다.

그 결과, 본 추출물에 의한 간질세포의 현저한 증식 효과를 확인할 수 있었다(도 5).

<2-3> 골수 간질세포(stromal cells)의 조혈 및 면역조절인자(사이토카인, cytokine) 생성 증진 효과

조혈 전구세포의 분화 증식을 촉진하는 본 발명의 생약조성물이 골수간질세포의 사이토카인(cytokine) 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 생약 조성물을 첨가하여 배양한 간질세포를 수거하여 세포 내에 발현된 사이토카인 mRNA를 역전사효소를 이용한 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 조사한 결과, 상기 생약조성물을 첨가하여 배양한 지지세포는 대조군과는 다른 양상의 사이토카인을 발현한다는 것을 확인하였다(도 6). 즉, 대조군에서는 발현되지 않는 면역 및 조혈 인자인 인터루킨-4(IL-4)와 종양괴사인자(TNF-α)가 발현되고, 대조군에서 미약하게 발현되는 인터루킨-7(IL-7) 및 간세포인자(stem cell factor, SCF)의 발현이 증가됨을 확인하였는데, 이러한 결과는 본 발명의 생약조성물이 조혈 미세환경에서의 조혈인자의 생성에 영향을 미침으로써 조혈계의 기능증진을 유도함을 의미한다.

<2-4> 방사선 조사에 대한 조혈기능 회복 효과

상기 생약조성물이 방사선 조사로 인하여 저하된 조혈기능을 회복시킬 수 있는지를 알아보기 위하여, 감마선 조사를 한 생쥐의 골수세포를 분리하여 본 생약조성물을 첨가한 배지에서 일정기간 배양한 다음, 회복되는 정도를 세포수로 비교하였다.

그 결과, 감마선 조사를 하지 않은 대조군에서도 생약 조성물의 첨가에 의해 약 1.5배 정도로 세포수가 증가되었다. 50% 치사량의 감마선인 8 Gray을 조사한 생쥐에서 분리한 골수세포는 그 생존정도가 약 7% 정도밖에 되지 않았으나, 본 생약조성물첨가에 의해 약 1.7배 정도로 생존 세포수가 증가되었다. 또한, 감마선 4 Gray를 조사한 생쥐에서 분리한 골수세포는 약 10% 정도밖에 생존하지 않았으나, 본 생약조성물 첨가에 의해 약 2배 정도로 생존 세포수가 증가됨을 확인하였다(도 7). 이는 본 발명의 생약조성물이 방사선에 피폭된 생쥐에서 골수세포수의 회복을 유도함을 의미한다.

<실험예 3> 방사선 방호효과

<3-1> 위장관장해 방호 효과

본 발명의 생약조성물이 고선량 방사선에 의한 위장관장해를 방호할 수 있는가를 확인하기 위하여 소장 움 생존 증가 효과(Intestinal crypt survival)을 관찰하였다.

먼저, 소장 움 생존 증가 효과를 확인하기 위하여, 생쥐를 방사선에 피폭시키기 전에 생약조성물을 주사한 다음, 방사선(감마선, 12 그레이(Gy))에 노출시켰다. 상기 생약조성물의 투여는 생쥐 마리 당 1 ㎎의 용량으로 방사선 조사 전 36 및 12시간 전에 복강 내로 2회 주사하였다. 그 후 3.5일째에 생쥐를 희생시켜 소장부위를 채취하고, 각 생쥐 당 8-10개의 소장편을 통상적인 방법에 따라 파라핀 포매하여 절편을 제작하였다. 각 생쥐 당 8개의 종절된 소장표본의 가장자리에 위치하는 소장 움을 광학현미경으로 관찰하고 그 수를 계수하였다.

그 결과, 생존 소장 움의 수가 정상 대조군에서는 평균 157.3개, 방사선 피폭 대조군에서는 21.3개, 본 생약조성물 투여군에서는 35.1개로 나타나, 본 발명의 생약조성물이 생존 소장 움의 수를 유의하게(p<0.05) 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 8). 이는 당귀, 천궁, 작약, 오가피의 혼합추출물-1 및 당귀, 천궁, 작약, 어성초의 혼합추출물-2에 비하여도 높은 수치로 상기 생약조성물이 방사선에 의한 위장관장해를 방호할 수 있음을 의미한다.

<3-2> 조혈모세포 방호효과

본 발명의 생약조성물이 중간선량의 방사선에 의한 조혈계 장해를 방호할 수 있는가를 확인하기 위하여, 비장내 조혈세포집락 형성 증가 효과(Endogenousspleen colony formation)를 조사하여 골수의 조혈모세포를 방호할 수 있는지를 관찰하였다. 생물체가 방사선에 피폭되면 혈액 내의 혈구세포가 급격히 소멸되며, 그 후 서서히 골수의 조혈모세포로부터 재생성되어 나온다. 이 때 비장에서 혈구세포가 빠르게 증식하면서 조혈세포 집락을 형성하게 되는데 이러한 원리에 근거하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 생쥐를 방사선에 피폭시키기 전에 생약조성물을 주사한 다음, 방사선(감마선, 6.5 그레이(Gy))에 노출시켰다. 실험군은 각 군당 8∼9 마리의 생쥐로 하였으며, 생약조성물의 투여는 생쥐 마리 당 1 ㎎의 용량으로 방사선 조사 전 36 및 12시간 전에 복강 내로 2회 주사하였다. 방사선 조사후, 9일째에 각 실험군의 생쥐를 희생시키고 비장을 채취하여 Bouin 고정액으로 고정한 후 비장 표면에 형성된 조혈세포집락을 실체현미경으로 관찰하고 계수하였다.

그 결과, 비장 표면에 형성된 조혈세포집락의 수가 방사선 피폭 대조군에서는 평균 2.67개, 본 추출물 투여군에서는 8.22개로 나타나, 상기의 생약조성물이 조혈모세포의 생존수를 현저하게(p<0.05) 증가시킴을 알 수 있었다(도 9). 따라서, 본 발명의 생약조성물이 방사선에 의한 조혈계 장해를 방호할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<3-3> 재생조직의 원줄기세포 자사(自死) 억제 효과

본 발명의 생약조성물이 저선량의 방사선에 의한 장해의 하나인 세포자사(細胞自死, apoptosis)를 억제시킬 수 있는가를 확인하기 위하여 소장 움세포(intestinal crypt cells)의 자사(自死)를 억제하는지를 관찰하였다.

실험은 각 군당 4마리씩의 생쥐를 대상으로 하였으며, 생약조성물의 투여는 생쥐 마리 당 1 ㎎의 용량으로 방사선 조사 전 36 및 12시간 전에 복강 내로 2회 주사하였다. 방사선(2 그레이(Gy)) 조사 후 6시간에 마우스를 희생시키고 소장을 채취하여 최소 30분간 카노이(Carnoy's) 고정액에 고정시킨 뒤, 각 마우스당 8-10개의 소장편을 통상적인 방법에 따라 파라핀 포매하여 횡단절편을 제작하였다. 절편내 소장 움의 세포를 관찰하기 위하여 헤마톡실린-에오진(hematoxylin-eosin)으로 염색하거나, 세포자사 과정에서 생성된 DNA 분절(fragments) 측정을 위하여 원발부위 자사(自死) 검출 킷트(in situapoptosis detection kit; APOPTAG TM, Oncor, Gaithersburg, MD, U.S.A.)를 사용한 원발부위 DNA 말단 표지법(in situDNA end-labeling ; ISEL)을 실시하였다. ISEL 기법은 표본 슬라이드에 말단 데옥시 뉴클레오티딜 전달효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 첨가하여, 분절된 DNA에 디곡시제닌-뉴클레오타이드(digoxigenin-nucleotides)를 부착시키고 항 디곡시제닌 항체-퍼옥시다제(anti-digoxigenin-peroxidase antibody)를 결합시킨 후 디아미노벤지딘(diaminobenzidine ; Sigma Chemical Co.)을 사용하는 통상적인 방법으로 퍼옥시다제(peroxidase) 부위를 발색시켰다. 생쥐 마리당 40개의 소장움을 광학현미경으로 관찰하였으며, 측정에 사용된 소장움은 움의 편측세포수가 17개 이상으로 파네쓰 세포(Paneth cell)와 내강이 확연히 나타나는 정확히 종절된 움만을 선택하고, 소장움의 파네쓰 세포(Painted cell)를 제외한 4번째 세포까지를 기저부(base)로 하여 자사세포(自死細胞, apoptotic cell)를 기저부와 전체 소장움에서 관찰되는 총수(total)로 구분하여 계수하였다. 여러 개의 자사체(自死體, apoptotic body)가 그 크기와 형태를 고려할 때, 한 세포의 잔유물로 나타날 때는 한 개의 세포로 계수하였다.

그 결과,도 10에서 보듯이 소장 움의 기저부에서의 자사 세포 수는 정상 대조군에서는 움 당 평균 0.071개, 방사선 피폭 대조군에서는 2.875개, 생약조성물 투여군에서는 2.250개로 나타났으며, 소장 움 전체에서의 자사 세포 수는 정상 대조군에서는 움 당 평균 0.091개, 방사선 피폭 대조군에서는 3.138개, 생약조성물 투여군에서는 2.438개로 나타났다. 상기 결과로 보아 본 발명의 생약조성물이 방사선에 의한 세포자사를 억제함을 알 수 있었으며, 나아가 방사선에 의한 재생조직의 세포 장해를 방호할 수 있음을 알 수 있었다.

<실험예 4> 마우스에 대한 경구투여 급성 독성실험

마우스(C57BL/6 mouse)를 사용하여 본 발명의 생약조성물의 급성독성실험을 실시하였다. 실험군당 6 마리씩의 생쥐에 실시예 1의 생약조성물을 최대 2 g/kg의 용량으로 하여 각 용량단계별로 경구투여 및 복강내 주사하였다. 경구투여군은 2주간 관찰하였으며, 복강내주사군은 1주간 관찰하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하고 현미경검사를 실시하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 생약 조성물은 생쥐에서 경구 투여 및 복강내 주사시 공히 2 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며, 50% 치사량(LD₅₀)이 2 g/kg 이상으로 나타나 안전한 물질로 판단되었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 당귀, 천궁 및 작약을 포함한 면역, 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약조성물과 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생약조성물은 기존의 생물화학적 면역증강제제들보다 부작용(side effect)과 독성이 작고 안전성을 보강한 것으로, 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 면역 및 조혈기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선 치료시 또는 방사선 작업에 따른 방사선 장해의 예방 및 극복에 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 혼합물은 독성이 없는 천연물이므로 본 시료를 바탕으로 한 효능이 높은 면역과 조혈기능 증진 기능성 식품 제조의 핵심이 될 것이다.

Claims

당귀, 천궁 및 작약을 동일 무게 비율로 열탕 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 증진, 조혈기능 증진 또는 방사선에 대한 생체 방호용 생약조성물.
삭제
제 1항의 생약조성물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강을 위한 약학적 조성물.
제 1항의 생약조성물을 유효성분으로 포함하는 조혈기능 증진을 위한 약학적 조성물.
제 1항의 생약조성물을 유효성분으로 포함하는 방사선 방호를 위한 약학적 조성물.
제 1항의 생약조성물을 포함하는 면역, 조혈기능 증진 또는 방사선 방호를 위한 기능성 식품.
1) 당귀, 천궁 및 작약으로 이루어진 혼합 생약재 총 무게의 5 내지 20배의 물을 가하는 단계;

2) 상기 혼합물을 열탕 추출하는 단계; 및

3) 상기 추출물을 감압농축기로 농축시키는 단계를 포함하는 제 1항의 생약조성물의 제조방법.