CN104936583A - 具有抗球虫活性的植物部分及提取物 - Google Patents
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Abstract
已经发现含有诸如五倍子酸、五倍子酸衍生物、没食子鞣质和可水解单宁的化合物的天然植物部分或植物提取物控制家禽的球虫病，更具体地控制由艾美球虫属引起的球虫病，所述植物选自没食子树(Quercus infectoria)、盐肤木(Rhus chinensis)和诃子(Terminalia chebula)。所述植物部分和天然提取物致使损伤分数降低、粪便的每克卵囊数降低和死亡率降低。
Description
本申请要求于2012年6月27日提交的第61/664795号美国专利申请及于2013年1月23日提交的第177/DEL/2013号印度申请的优先权，所述两个申请均通过援引加入本文。
发明背景
本发明一般涉及对球虫病的控制，更具体地，涉及用于控制家禽及其他动物的球虫病的植物部分、植物提取物及化合物的施用。
球虫病是养禽业中的主要疾病，并且根据最近的调查，估计每年全球影响大于三十亿美元(worldpoultry.net/Broilers/Health/2009/9/In-ovo-vaccination-against-coccidiosis-WP006949W/-2013年6月18日访问)。球虫病由原生动物寄生虫、即艾美球虫(Eimeria)导致，其属于顶复门(phylum Apicomplexa)和艾美虫科(family Eimeriidae)(Clare,R.A和Danforth,H.D(1989).Major histocompatibility complex control ofimmunity elicited by genetically engineered Eimeria tenella(Apicomplexa)antigen in chickens.Infection and immunity,57(3):701–705)。该寄生虫入侵肠细胞并且在肠中引起坏死，这导致吸收障碍、腹泻、发病、增重降低、饲料转化不良，并且在严重的情况中，引起死亡(Williams,R.B(2005).Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens:Rational,integrated disease management by maintenance of gut integrity.AvianPathology,34(3),159-180)。已知七种不同的艾美球虫物种，即堆型艾美球虫(E.acervulina)、布氏艾美球虫(E.brunetti)、巨型艾美球虫(E.maxima)、和缓艾美球虫(E.mitis)、毒害艾美球虫(E.necatrix)、早熟艾美球虫(E.praecox)和禽艾美球虫(E.tenella))，在家禽中引起球虫病(Williams,2005)，并且所述物种是高度宿主和位点特异性的。禽艾美球虫是在家禽中引起球虫病的主要物种之一，并且其感染位点是盲肠(Khazandi,M and Tivey,D(2010).Developing an in vitro method forEimeria tenella attachment to its preferred and non-preferred intestinal sites.Experimental Parasitology,125(2),137-140)。球虫病目前通过药物来控制，但艾美球虫的耐药株的不断出现需要开发可替代的控制策略。因为已知植物由于存在酚类化合物而具有抗寄生虫和抗球虫活性(Tipu,M.A.,Akhtar,M.S.,Anjum,M.I和Raja,M.L(2006).New dimension ofmedicinal plants as animal feed.Pakistan vet.J.,26(3):144-148)，所以它们能够成为抗家禽球虫病的生物活性分子的潜在来源。
其他人已尝试将植物部分或植物提取物用于治疗球虫病。例如，McCann等人试验了甜栗木(Sweet Chestnut Wood)单宁对接种活球虫疫苗的肉鸡的行为的作用(M.E.E.McCann,E.Newell,C.Preston和K.Forbes.The Use of Mannan-Oligosaccharides and/or Tannin in Broiler Diets.Intl.J.of Poultry Sci.5(9):873-879,2006)。他们报道了独立地或组合地补充甘露聚糖-低聚糖或单宁未降低球虫病的影响。
Wang等人教导了对球虫病使用葡萄籽原花色素提取物(Wang等人,Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract in Broiler Chickens:Effect on Chicken Coccidiosis and Antioxidant Status.Poultry Science.87:2273-2280,2008)。他们将活性归于原花色素(缩合单宁而非可水解单宁)的抗炎和抗氧化性质。
Naidoo等人教导了使用基于其抗氧化活性而选择的四种植物的体内研究(Naidoo等人,The value of plant extracts with antioxidant activity inattenuating coccidiosis in broiler chickens.Veterinary Parasitology.153:214-219；2008)。他们观察到所述植物之一(紫娇花(Tulbaghiaviolacea))降低鸡排泄物中的艾美球虫卵囊数，并且他们推测该作用可归因于抗氧化剂化合物S(甲硫基甲基)半胱氨酸亚砜。
McDougald等人描述了使用圆叶葡萄果渣来提高对肉鸡的球虫病的抵抗(McDougald等人,Enhancement of Resistance to Coccidiosis andNecrotic Enteritis in Broiler Chickens by Dietary Muscadine Pomace.AvianDiseases.52:646-651；2008)。圆叶葡萄果渣是葡萄酒生产中所用的葡萄的副产物。他们未提及果渣中任何具体化合物的功效。所提议的抗球虫活性与Wang等人和Naidoo等人所提议的活性明显不同。
发明概述
本发明包括在控制动物、特别是家禽的球虫病方面有效的植物部分和植物提取物的鉴定和使用。具体地，已发现没食子树(Quercus infectoria)五倍子、盐肤木(Rhus chinensis)五倍子、诃子(Terminalia chebula)果实的植物部分和天然提取物控制家禽的球虫病，更具体地控制由艾美球虫属引起的球虫病。更具体地，植物部分或提取物包含有效量的选自五倍子酸、没食子鞣质和可水解单宁的化合物。
没食子树五倍子、盐肤木五倍子和诃子果实的植物部分和天然提取物导致损伤分数、粪便的每克卵囊数和死亡率的降低。还发现所述植物部分/提取物对艾美球虫的子孢子具有直接抑制作用，如在体外MTT测定中所观察到的。还发现选自五倍子酸、没食子鞣质和可水解单宁的化合物降低损伤分数、粪便的每克卵囊数和死亡率。还发现所述化合物对艾美球虫的子孢子具有直接抑制作用，如在体外MTT测定中所观察到的。
本发明还包括通过给药组合物来控制家禽及其他动物的球虫病的方法，所述组合物包含植物部分或植物提取物，所述植物部分或植物提取物含有有效量的没食子树五倍子、盐肤木五倍子、诃子果实和/或诸如五倍子酸、没食子鞣质和可水解单宁的化合物。
附图简述
图1是用没食子树治疗的禽类的盲肠损伤的图像。
图2是在感染后第7天用没食子树治疗的禽类的排泄物的每克卵囊数(OPG)的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图3是用没食子树治疗的禽类的盲肠的HE染色切片的微缩照相图像。
图4是在感染后第5天用没食子树水提取物治疗的禽类的堆型艾美球虫、巨型艾美球虫和禽艾美球虫的损伤分数的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图5是在感染后第7天用没食子树水提取物治疗的禽类的排泄物的每克卵囊数(OPG)的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图6是为评价不同剂量水平的没食子树以及作为阳性对照的球虫抑制剂(盐霉素)而进行的MTT测定；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图7是在用子孢子和不同浓度的没食子树入侵MDBK宿主细胞之后的PCR结果的图表。
图8是在一次治疗之内不同时点的艾美球虫DNA的倍数变化对T4的图表。
图9是在用不同浓度的没食子树预治疗的MDBK宿主细胞用子孢子入侵之后的PCR结果的图表。
图10是在一次治疗之内不同时点的艾美球虫DNA的倍数变化对T20的图表。
图11是没食子树的不同级分的抗子孢子活性的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图12是没食子树的水级分(water fraction)的高效液相色谱(HPLC)的色谱图。
图13是没食子树的四个主峰的抗子孢子活性的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图14是没食子树的峰1的LC/MS/MS色谱图。
图15是描述五倍子酸浓度与没食子树的抗子孢子活性之间的相关性的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图16是用10ppm五倍子酸预治疗并用子孢子入侵的MDBK宿主细胞的PCR结果的图表。
图17是在一次治疗之内不同时点的艾美球虫DNA的倍数变化对T20的图表。
图18是在用不同浓度的五倍子酸预治疗的MDBK宿主细胞用子孢子入侵之后的PCR结果的图表。
图19是在一次治疗之内不同时点的艾美球虫DNA的倍数变化对T20的图表。
图20是在用不同浓度的五倍子酸治疗的禽类在感染后第5天的损伤分数的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图21是在用不同浓度的五倍子酸治疗的禽类在感染后第7天的OPG的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图22是盐肤木和诃子的抗子孢子活性的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图23是在用不同浓度的诃子预治疗的MDBK宿主细胞用子孢子入侵之后的PCR结果的图表。
图24是在一次治疗之内不同时点的艾美球虫DNA的倍数变化对T20的图表。
图25是在用盐肤木和诃子治疗的禽类在感染后第5天的损伤分数的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
图21是在用盐肤木和诃子治疗的禽类在感染后第7天的OPG的图表；具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
发明内容
对没食子树五倍子的粗制粉末(100-800微米粒径，从Pooja Herbs,Mumbai,India获得)在100g/吨饲料的剂量下控制球虫病的初步体内评价给出了有前途的结果的一些指示，其促使在更高剂量下进行进一步评价。在用禽艾美球虫的卵囊感染的肉用禽类中进行的35天的体内试验表明，没食子树五倍子使损伤分数降低至0并且使死亡率降低至0％，与阳性对照(0％)相当，而阴性对照显示4的分数和17％的死亡率。盲肠样本的组织病理学分析表明，用没食子树治疗的禽类显示更小的被寄生虫感染的面积、更低的单核细胞浸润和盲肠出血。
通常，在本说明书中，如果植物部分、提取物或化合物可以引起禽类的损伤分数、脱落在排泄物中的卵囊数(每克卵囊数(OPG))或死亡率与未治疗的受感染的对照相比在统计学上显著的降低，所述植物部分、提取物或化合物就被认为是有效的。通常，五倍子酸或含五倍子酸的制剂的给药以这样的制剂来描述，所述制剂通过饲料或水提供0.1ppm至50ppm、优选2ppm至20ppm且最优选3ppm至10pmm的剂量或者通过其他途径提供等同的补充。所述的植物、植物部分和/或提取物包含大约0.1％五倍子酸的最小量。
评价了没食子树粗制粉末控制肉用禽类的艾美球虫混合感染的功效。结果表明，与受感染的对照相比，甚至与阳性对照盐霉素相比，禽艾美球虫和堆型艾美球虫的损伤分数显著降低。然而，对于巨型艾美球虫，与受感染的对照和盐霉素相比，观察到损伤分数的数值降低。经治疗的组的每克卵囊数显著低于受感染的对照和盐霉素组，然而，在包括受感染的对照在内的任何治疗组中未观察到死亡。这证明了没食子树控制由其他艾美球虫物种引起的球虫病的功效。此外，为了测定没食子树的作用方式，开发了基于3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)还原测定的体外方法以评价植物提取物的抗子孢子活性，作为子孢子生存力的量度。没食子树五倍子对禽艾美球虫子孢子的研究表明与子孢子对照相比子孢子的生存力显著降低。在使用不同剂量的没食子树进行的研究中观察到剂量依赖性功效，并且通过独立进行多次实验验证了该结果。因此，没食子树的直接抗子孢子活性可能是作用方式之一，其归因于提取物体内控制球虫病的功效。
类似地，为测定没食子树控制宿主细胞系中的艾美球虫的作用方式，开发了基于宿主细胞和艾美球虫寄生虫的共培养的体外测定。在测定中，将细胞和寄生虫与阳性对照和不同的受试物合并。通过使用实时PCR检测艾美球虫DNA来测量艾美球虫寄生虫的入侵和增殖。为此，选择了特定引物，并且优化了PCR条件。以三种不同方式向所述体外测定添加阳性对照和有潜力的抗球虫化合物：
将受试物与艾美球虫寄生物合并，并添加到宿主细胞中。
将受试物添加到子孢子中，保持特定时间，然后去除，之后将所述子孢子添加到宿主细胞中。
将受试物添加到宿主细胞中，保持特定时间，然后去除，之后向所述宿主细胞中添加子孢子。
在体外测定中评价没食子树的效力。
实施例1-没食子树控制盲肠球虫病的功效
实验设施和研究设计。在位于印度Gummidipundi的家禽农场设施处进行筛选试验。将正规商购的(Straight run commercial)杂交肉鸡乌骨鸡(Gallus domesticus)(Var.Vencobb 400)用于研究。获得初生公雏，单独称重，绑扎翅膀，并且随机分入各组。表1详述了实验设计。
表1.研究设计
农场管理。在试验期间遵循良好农场管理实践。在鸡到达之前，将用于研究的整个农场和设备清洗并消毒。将禽类置于在混凝土地板上有序编排的笼子中，并在笼子的底部设置托盘以有利于粪便样本的收集。连续监测农场的温度和湿度。
疫苗接种方案。对禽类接种以预防新城鸡瘟病毒(NDV)和传染性腔上囊病(IBD)。
饲料配制。配制基于玉米大豆的麦芽浆饮食。饲料成分从Ponni feeds,Tamil Nadu,India获得。在整个研究期间，向禽类随意喂食麦芽浆饲料。根据禽类的生活期来制备三种饲料配制物；幼仔前期(Prestarter)饲料(第1-10天)、育成期(starter)饲料(第11-20天)和育肥期(Finisher)饲料(第21-42天)。在饲料配制物中不使用抗菌剂和补充剂。
治疗组的详细说明。在表2中示出各组及治疗。经治疗的禽类从第1天便喂食掺入饲料中的植物提取物(表2)。没食子树五倍子的粗制粉末从Pooja herbs,Mumbai,India获得。
表2.治疗组和饲料的详细说明
*Coxistac是来自Pfizer的含12％浓度的盐霉素的产品。因此，以上述500g/吨饲料的剂量添加Coxistac能够在饲料中以60ppm水平递送盐霉素，这是对肉鸡所推荐的预防剂量。在该实验中的剂量是所推荐浓度的两倍。
球虫病的诱导。在14、15和16日龄时，通过以1×105个卵囊/禽/天的剂量灌胃向每只禽类经口给予禽艾美球虫的孢子化卵囊(霍顿虫株[Chapman,H.D.and Shirley,M.W.2003.The Houghton strain of Eimeriatenella:A review of the type strain selected from genome sequencing.AvianPathol.,32:115-127]-繁殖的)。在接种日，在接种之前停止喂食2小时并在接种之后停止喂食2小时。
所分析的参数。选择进行分析的参数是发病机制的指标，即，排泄物外观、死亡率、球虫病的盲肠损伤计分以及排泄物的每克卵囊数(OPG)。方法在下文详述。
排泄物的检查。从感染后第1天至第10天，每天监测禽类排泄物的稠度，血液、粘液、未消化的饲料及橙色的存在。基于出血的严重性来进行排泄物计分。
死亡率。每天记录禽类的死亡数，并且进行死后检查(post mortem)以确认死因。
盲肠损伤计分。在感染后第5天和第7天，通过颈椎脱臼处死来自每一组的2只禽类，并且将肠切开。对禽类的盲肠进行球虫病损伤计分。基于盲肠损伤的严重性和血液存在的严重性来完成计分(Johnson,J.K.,和W.M.Reid.(1970).Anticoccidial drugs:lesion scoring techniques inbattery and floor-pen experiments with chickens.Experimental Parasitology28:30–36)。盲肠球虫病的分数是0-4级。
排泄物的OPG。从保持在笼子之下的托盘随机收集禽类排泄物的一式三份的样本，并且评价每克卵囊数。
结果
发病机制指标。对禽类排泄物的观察表明，受感染的组从感染后第4天开始出血，并且严重性在第5天达到峰值。在表3中给出排泄物计分的结果。在感染后第7天，发现排泄物正常，没有血液。在第5天，阳性对照(C3，表3)的分数为3，与之相比，阴性对照(C2，表3)则为4。用没食子树治疗的禽类具有为2的较低分数，并且比阳性对照更好。
表3.在感染后第5天的排泄物计分
+-表示失血的严重性及在排泄物中的血量。
盲肠的损伤计分。感染后第5天和第7天的盲肠损伤计分表明，损伤在第5天是严重的，并且禽类在感染后第7天开始恢复，这由盲肠栓(caecal plug)的形成来指示。这遵循能够从盲肠去除卵囊的正常感染模式。损伤分数的结果表明，阳性对照(盐霉素对照)与阴性对照相比，由于无法说明的原因而未表现出任何分数差异。使用没食子树的治疗与阴性对照相比，降低了损伤分数(表4)。降低的损伤分数与降低的排泄物分数和不存在死亡相关。
表4.在感染后第5天的盲肠损伤分数
在感染后第7天禽类排泄物的OPG。在表5中示出感染后第7天禽类排泄物的OPG的计数。出乎意料地，抗球虫盐霉素治疗的禽类(C3，表5)与C2(表5)相比未表现出任何卵囊数降低的指示。所呈现的值是三次重复的平均值。
表5.感染后第7天排泄物的每克卵囊数
死亡率。在对照2(受感染的阴性对照)中死亡率为17％。在其他组中没有死亡。阳性对照的损伤分数和OPG数据未表现出与阴性对照的任何差异。
尽管在该试验中未充分进行阳性对照，但使用没食子树的植物提取物治疗的禽类的损伤分数低于受感染的阴性对照，这表明它们可以成为进一步研究的候选物。然而，它们没有表现出OPG的降低。
实施例2-没食子树控制盲肠球虫病的功效
在用禽艾美球虫感染的肉用禽类中进行了35天的体内感染(challenge)试验。治疗组包括：1)对照，未感染的正常禽类；2)阴性对照，用禽艾美球虫感染并喂食不含任何抗球虫化合物的饮食的禽类；3)阳性对照，受感染并喂食包含500g/吨的推荐剂量的Coxistac(抗球虫剂，盐霉素)的饮食的禽类；以及4)治疗组，包括给予含有500g/吨剂量的没食子树五倍子的饮食的受感染的禽类。在阳性对照组和补充了没食子树五倍子的粗制粉末的治疗组中未观察到死亡。盲肠损伤表明，阴性对照禽类是高度感染的且平均分数为4，而阳性对照的分数为0。用没食子树治疗的禽类表现出与阳性对照(0)相似的结果。没食子树表现出与阳性对照相当的OPG计数的降低。盲肠样本的组织病理学分析表明，用没食子树治疗的禽类具有更小的受艾美球虫影响的面积、没有出血以及最小的直至粘膜的单核细胞浸润。
第二次体内实验包括以下治疗组。
表6.治疗组的说明
*Coxistac是来自Pfizer的含12％浓度的盐霉素的产品。因此，以上述500g/吨饲料的剂量添加Coxistac能够在饲料中以60ppm水平递送盐霉素，这是对肉鸡所推荐的预防剂量。
结果
在感染后第5天的盲肠损伤。基于以前的计分标准，在感染后第5天进行盲肠球虫病的损伤计分。计分的结果表明，与受感染的阴性对照相比，阳性对照完全减轻盲肠球虫病的作用。没食子树治疗的禽类在盲肠中未表现出损伤，并且与阳性对照和未感染的对照C1(表7，图1)相当。
表7.在感染后第5天的损伤计分
具有不同上标的柱是统计学显著的(p<0.05)。
排泄物的卵囊计数。在感染后第7天评估排泄物的OPG以评价卵囊的脱落。研究结果表明，与受感染的阴性对照相比，阳性对照没食子树具有显著更低的排泄物卵囊计数(p<0.05)。没食子树治疗与阳性对照同样地有效(图2)。这与损伤分数的结果相关。
死亡率。在实验期间记录死亡率，并且在表8中给出数据。如所预期的，在未感染的对照组(C1)和阳性对照组(C3)中不存在死亡。补充没食子树的组未表现出死亡。
表8.在试验期间的死亡率
| 治疗组 | 死亡率(％) |
| C1-未感染的对照 | 0 |
| C2-受感染的阴性对照 | 33.33 |
| C3-阳性对照 | 0 |
| T–没食子树 | 0 |
盲肠样本的组织病理学分析。没食子树表现出所测试的所有参数的阳性降低，所述参数例如损伤分数、OPG和死亡率，并且数据与阳性对照盐霉素相当。因此，进行了对来自该组的禽类盲肠样本的组织病理学分析，与未感染的对照(C1)、阴性对照(C2)和阳性对照(C3)比较。盲肠中损伤的严重性和分布基于表9所提供的分级。
表9.不同组的盲肠中的损伤的严重性和分布
表10.禽类盲肠组织的组织病理学结果
组织病理学结果表明，用没食子树治疗的禽类具有更少的被禽艾美球虫感染的盲肠区域，并且单核细胞浸润仅局限于粘膜，且分数为1，表明轻度浸润(图3)。粘膜下层和肌肉层没有浸润(表10)。在阴性对照中，在粘膜层、粘膜下层中，甚至在肌层中，观察到单核细胞浸润。与阴性对照相比(2)，在用没食子树治疗的禽类的盲肠中未观察到出血。这表明用没食子树治疗的禽类的盲肠与阳性对照相比感染程度更小。
植物提取物的体内筛选揭示了没食子树是控制肉用禽类中由禽艾美球虫引起的盲肠球虫病的有效候选物。发现该提取物的功效在降低损伤分数、OPG和死亡率方面等同于阳性对照。
实施例3-没食子树水提取物控制球虫病混合感染的功效
评价了没食子树粗制粉末控制肉用禽类中球虫病混合感染的功效。进行了35天体内试验，其中用物种禽艾美球虫、堆型艾美球虫和巨型艾美球虫的卵囊的混合培养物的野生虫株来感染禽类。由Department ofparasitology,Tamil Nadu Veterinary Research Institute,Namakkal,India提供卵囊的混合培养物。卵囊培养物是从具有临床球虫病感染的禽类的粪便分离的禽艾美球虫、堆型艾美球虫和巨型艾美球虫的混合物。在肉用禽类中评价所获得的卵囊的毒力，并且基于对所有试验的卵囊(禽艾美球虫、巨型艾美球虫和堆型艾美球虫)产生为3及更高的损伤分数的浓度，使卵囊的剂量最终为5×105。
a.在位于印度Gummidipundi的Kemin内部R&D家禽农场设施处进行筛选试验。将正规商购的杂交肉鸡乌骨鸡(Var.Vencobb 400)用于研究。获得初生公雏鸡，单独称重，绑扎翅膀，并且随机分入各组。表11详述了实验设计。在如实施例1所提及的第三次体内试验期间遵循良好农场管理实践和疫苗接种方案。
表11.研究设计
对禽类接种以预防新城鸡瘟病毒(NDV)和传染性腔上囊病(IBD)。将基于玉米大豆的麦芽浆饮食用于该研究。禽类从第1天开始喂食掺入饲料中的没食子树五倍子提取物。表12给出治疗组。
表12.试验的治疗组的详细说明
| 组 | 饮食 |
| 对照1 | 未感染+普通饲料 |
| 对照2 | 球虫病诱导+不含抗球虫剂的普通饲料 |
| 对照3 | 球虫病诱导+具有Coxistac 12％预混物(500g/吨)的普通饲料 |
| 治疗 | 球虫病诱导+具有100g/吨的没食子树水提取物的普通饲料 |
通过以1:2的比例将粗制粉末(100-800微米粒径)在蒸馏水中混合，然后在搅拌的情况下于80-90℃提取一个半小时，从而制备没食子树五倍子提取物。将提取物过滤，并且再次将残余物以相似方式在水中提取。将此再重复约2次，并且冷冻干燥总的液体提取物。
结果表明，与受感染的对照、甚至阳性对照盐霉素相比，禽艾美球虫和堆型艾美球虫的损伤分数显著降低。然而，对于巨型艾美球虫，与受感染的对照和盐霉素相比，观察到损伤分数的数值降低(图4)。经治疗的组的每克卵囊数显著低于受感染的对照和盐霉素组(图5)，然而，在包括感染的对照在内的任何治疗组中未观察到死亡。这证明了没食子树控制由其他艾美球虫物种引起的球虫病的功效。
实施例4-通过MTT测定没食子树的体外抗子孢子活性
此外，开发了基于3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)的体外方法以评价植物提取物的抗子孢子活性，作为子孢子生存力的量度。经优化的方法包括子孢子的制备、消毒和纯化，然后将子孢子悬浮液(最小为105个细胞/ml)与所需浓度的植物提取物一起孵育。通过将粗制粉末混入已知体积的蒸馏水中以实现特定ppm，涡旋2min，并通过0.2μ针筒式过滤器过滤，来制备植物样本。在与植物提取物一起孵育24h之后，彻底洗涤子孢子，然后进行MTT测定。将MTT-PMS溶液(各自为0.2微摩)与子孢子悬浮液(以1:10的比例)在41℃下一起孵育2小时。在孵育之后，将内含物以800g离心5min，并且小心地去除上清液。将紫色染料甲溶解在200μl DMSO中，并且针对630nm参考波长，在530nm测量吸光率。
进行MTT测定以评价不同剂量水平的没食子树以及作为阳性对照的球虫抑制剂(盐霉素)(图6)。与对照相比，在没食子树治疗的样本中出现子孢子生存力的剂量依赖性降低。
实施例5-没食子树对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细胞中增殖的
体外效力
进行实验以评价没食子树对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细胞中增殖的体外效力。
在玻璃小球研磨和酶脱囊之后，从孢子化卵囊获得子孢子。选择Madin-Darby Bovine Kidney(MDBK)细胞作为宿主细胞。在四小时内，向MDBK宿主细胞以50ppm和100ppm添加子孢子和没食子树。之后，去除培养基，洗涤细胞并添加新鲜的培养基。在4(T4)、24(T24)、48(T48)和72(T72)小时之后，收集培养基和MDBK细胞，并在-20℃储存。
阴性对照(neg ctrl)是被艾美球虫子孢子感染的、在细胞培养基中孵育的MDBK细胞。阳性对照(pos ctrl)是被艾美球虫子孢子感染的、用5μg/ml盐霉素溶液孵育的MDBK细胞。
在不同收集时点，从受感染的MDBK细胞提取DNA。对不同时点和不同治疗的样本进行检测艾美球虫DNA的实时PCR。图7呈现了PCR结果。
实时PCR分析
计算在一次治疗内每一时点对T4的Ct值之差(ΔCt)。使用以下等式计算每一时点对T4的倍数变化。
倍数变化＝2-ΔCt
在图8中呈现这些结果。
阴性对照表现出明显的艾美球虫增殖，因为与在4小时的起始相比，72小时的艾美球虫DNA增加15倍。阳性对照能够完全抑制增殖。对于没食子树治疗，相对于4小时的起始，观察到剂量依赖性方式的明显的增殖抑制。
实施例6-没食子树对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细胞中增殖的
体外效力
进行实验以评价没食子树对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细胞中增殖的体外效力。
在玻璃小球研磨和酶脱囊之后，从孢子化卵囊获得子孢子。选择Madin-Darby Bovine Kidney(MDBK)细胞作为宿主细胞。用50ppm、100ppm和250ppm的没食子树预治疗子孢子3小时。之后，洗涤子孢子悬浮液，并且放在MDBK细胞培养物上，保持20小时。在孵育之后，去除培养基，洗涤细胞并添加新鲜的培养基。在20、72和96小时之后，收集培养基和MDBK细胞，并且在-20℃储存。
阴性对照是被艾美球虫子孢子感染的、在细胞培养基中孵育的MDBK细胞。阳性对照是被艾美球虫子孢子感染的、用5μg/ml盐霉素溶液孵育的MDBK细胞。
在不同收集时点，从MDBK细胞提取DNA。对不同时点和不同治疗的样本进行检测禽艾美球虫DNA的实时PCR。图9呈现了PCR结果。
实时PCR分析
计算在一次治疗内每一时点对T20的Ct值之差(ΔCt)。使用以下等式计算每一时点对T20的倍数变化。
倍数变化＝2-ΔCt
在图10中呈现没食子树的这些结果。
阴性对照表现出明显的艾美球虫增殖，因为与在20小时的起始相比，96小时的艾美球虫DNA增加20倍。阳性对照能够完全抑制增殖。此外，不同剂量的没食子树均抑制艾美球虫增殖。对于50ppm没食子树可见稍微较低的效力。但这与阴性对照的增加相比是可忽略不计的。
实施例7-没食子树的活性成分的鉴定
进一步使用改良MTT还原测定作为生物测定来进行没食子树五倍子的生物测定引导的分级测定(BGFA)，因为我们已鉴定粗制提取物具有抗子孢子活性并且这可能是其能够控制球虫病的作用方式之一。使用不同溶剂通过柱色谱法来分级没食子树五倍子粗制粉末。评价来自每一级分的样本的抗子孢子活性。没食子树的甲醇级分和水级分与其他级分相比表现出更好的子孢子生存力降低，并且与盐霉素对照相当(图11)。
通过高效液相色谱法(HPLC)进行活性级分的植物化学分析以鉴定作为抗子孢子活性成因的活性成分。在甲醇级分和水级分二者的HPLC色谱图中观察到四个主峰，并且一个峰对应于五倍子酸标准物的停留时间(图12)。已知除了存在约7％的游离五倍子酸之外，没食子树五倍子还具有60-70％可水解单宁，其可经水解以释放五倍子酸。
通过半制备型HPLC分离这四种化合物，并且评价抗子孢子活性，将其与等同浓度的粗制粉末相比较。这些化合物的抗子孢子活性表明峰1的化合物具有最佳抗子孢子活性。其他化合物表现出对子孢子的最低活性。然而，粗制粉末表现出比峰1更好的活性，表明来自提取物的化合物的协同活性(图13)。
HPLC色谱图的不同峰的LC/MS/MS分析确认了峰1是五倍子酸(图14)，而其他峰是高分子量化合物，其可能是可水解单宁的降解产物。假设这些化合物可以进一步分解以释放五倍子酸。
此外，为了获得五倍子酸％和抗子孢子活性之间的相关性，在水中将没食子树提取5分钟、2小时和12小时，并且评价其抗子孢子活性。研究表明在五倍子酸浓度与抗子孢子活性之间存在明显的相关性(相关系数＝-0.982226)(图15)。这些结果表明五倍子酸是作为没食子树抗子孢子活性成因的活性成分。
实施例8-五倍子酸的体外保护作用
进行实验以评价五倍子酸一水合物对用禽艾美球虫子孢子感染的宿主细胞的体外保护作用。
在玻璃小球研磨和酶脱囊之后，从孢子化卵囊获得子孢子。选择Madin-Darby Bovine Kidney(MDBK)细胞作为宿主细胞。将MDBK细胞与10ppm五倍子酸一起孵育7小时。之后，将培养基移除并且向MDBK细胞添加子孢子悬浮液，保持20小时。在孵育之后，去除培养基，洗涤细胞并添加新鲜的培养基。在20、72和96小时之后，收集培养基和MDBK细胞，并且在-20℃储存。
阴性对照是被艾美球虫子孢子感染的、在细胞培养基中孵育的MDBK细胞。阳性对照是被艾美球虫子孢子感染的、用5μg/ml盐霉素溶液孵育的MDBK细胞。
在不同收集时点，从MDBK细胞提取DNA。对不同时点和不同治疗的样本进行检测艾美球虫DNA的实时PCR。图16呈现了PCR结果。
实时PCR分析
计算在一次治疗内每一时点对T20的Ct值之差(ΔCt)。使用以下等式计算每一时点对T20的倍数变化。
倍数变化＝2-ΔCt
在图17中呈现这些结果。
阴性对照表现出明显的艾美球虫增殖，因为与在20小时的起始相比，96小时的艾美球虫DNA增加60倍。阳性对照能够几乎完全抑制增殖。此外，对于10ppm五倍子酸治疗，观察到剂量依赖性方式的明显的增殖抑制。这表明针对艾美球虫增殖，10ppm的低剂量的五倍子酸能够在一定程度上保护宿主细胞。
实施例9-五倍子酸对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细胞中增殖的
体外效力
进行实验以评价五倍子酸一水合物对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细胞中增殖的体外作用。
在玻璃小球研磨和酶脱囊之后，从孢子化卵囊获得子孢子。选择Madin-Darby Bovine Kidney(MDBK)细胞作为宿主细胞。用10ppm、25ppm和50ppm的五倍子酸一水合物预治疗子孢子3小时。之后，洗涤子孢子悬浮液，并且放在MDBK细胞培养物上，保持20小时。在孵育之后，去除培养基，洗涤细胞并添加新鲜的培养基。在20、72和96小时之后，收集培养基和MDBK细胞，并且在-20℃储存。
阴性对照是被艾美球虫子孢子感染的、在细胞培养基中孵育的MDBK细胞。阳性对照是被艾美球虫子孢子感染的、用5μg/ml盐霉素溶液孵育的MDBK细胞。
在不同收集时点，从MDBK细胞提取DNA。对不同时点和不同治疗的样本进行检测艾美球虫DNA的实时PCR。图18呈现了PCR结果。
实时PCR分析
计算在一次治疗内每一时点对T20的Ct值之差(ΔCt)。使用以下等式计算每一时点对T20的倍数变化。
倍数变化＝2-ΔCt
在图19中呈现这些结果。
阴性对照表现出明显的艾美球虫增殖，因为与在20小时的起始相比，96小时的艾美球虫DNA增加20倍。阳性对照以及不同剂量的五倍子酸抑制了艾美球虫增殖。对于10ppm五倍子酸可见稍微较低的效力。但这与阴性对照的增加相比是可忽略不计的。
实施例10-五倍子酸控制球虫病的功效
通过体内感染试验来评价11ppm、22ppm和33ppm的三种不同剂量的五倍子酸控制肉用禽类的球虫病的功效。使用禽艾美球虫、巨型艾美球虫和堆型艾美球虫的卵囊使该禽类诱发艾美球虫的混合感染。从确认有临床球虫病的禽类分离这些卵囊。试验设计、卵囊剂量、疫苗接种方案、农场维护与实施例3相同。损伤计分表明，与受感染的对照、甚至阳性对照盐霉素相比，对所有三种艾美球虫受试物种均存在显著的分数降低(图20)。每克卵囊数表现出类似的趋势(图21)，然而，在包括受感染的对照在内的任何治疗组中未观察到死亡。观察到剂量依赖性反应，并且在22ppm和55ppm的五倍子酸之间没有显著的差异。这表明五倍子酸能够控制肉用禽类中混合球虫病感染。还明显的是，五倍子酸是作为没食子树抗球虫活性成因的活性成分。
实施例11-含五倍子酸的植物的抗子孢子活性
此外，还评价了含五倍子酸的其他植物在肉用禽类中的抗子孢子活性和抗球虫病活性。所选的植物是盐肤木(中国五倍子)和诃子(印度五倍子)。盐肤木含约70％可水解单宁，而诃子含约0.28％的游离五倍子酸。然而，诃子含25-40％可水解单宁，其可以经降解以释放五倍子酸。已报道了这些植物的抗氧化活性、抗炎活性、抗菌活性、抗真菌活性、抗诱变活性和抗癌活性。
分别从Natural Remedies,Bangalore,India和中国新疆获得诃子果的粗制粉末和盐肤木五倍子。利用MTT测定的抗子孢子测定表明两种受试植物与对照相比均能够降低子孢子活性，并且均比阳性对照盐霉素更好(图22)。
实施例12-含五倍子酸的植物对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细
胞中增殖的体外作用
进行实验以评价含五倍子酸的其他来源对禽艾美球虫子孢子入侵和在宿主细胞中增殖的体外作用。
在玻璃小球研磨和酶脱囊之后，从孢子化卵囊获得子孢子。选择Madin-Darby Bovine Kidney(MDBK)细胞作为宿主细胞。用50ppm、100ppm和250ppm的诃子预治疗子孢子3小时。之后，洗涤子孢子悬浮液，并且放在MDBK细胞培养物上，保持20小时。在孵育之后，去除培养基，洗涤细胞并添加新鲜的培养基。在20、72和96小时之后，收集培养基和MDBK细胞，并且在-20℃储存。
阴性对照是被艾美球虫子孢子感染的、在细胞培养基中孵育的MDBK细胞。阳性对照是被艾美球虫子孢子感染的、用5μg/ml盐霉素溶液孵育的MDBK细胞。
在不同收集时点，从MDBK细胞提取DNA。对不同时点和不同治疗的样本进行检测禽艾美球虫DNA的实时PCR。图23呈现了PCR结果。
实时PCR分析
计算在一次治疗内每一时点对T20的Ct值之差(ΔCt)。使用以下等式计算每一时点对T20的倍数变化。
倍数变化＝2-ΔCt
在图24中呈现诃子的这些结果。
阴性对照表现出明显的艾美球虫增殖，因为与在20小时的起始相比，96小时的艾美球虫DNA增加20倍。阳性对照以及250ppm诃子完全抑制艾美球虫增殖。存在明显的剂量-反应效应，但100ppm诃子的较低效力与阴性对照的增加相比可忽略不计。
实施例13-含五倍子酸的植物控制球虫病的功效
通过体内感染试验来评价含五倍子酸的植物(即诃子和盐肤木)控制肉用禽类的球虫病的功效。使用从确认有临床球虫病的禽类分离的禽艾美球虫、巨型艾美球虫和堆型艾美球虫的卵囊，使禽类诱发艾美球虫的混合感染。试验设计、卵囊剂量、疫苗接种方案、农场维护与实施例3相同。损伤计分表明，与受感染的对照、甚至阳性对照盐霉素相比，200ppm和500ppm的盐肤木及1000ppm的诃子对所有三种艾美球虫受试物种均能显著降低分数(图25)。每克卵囊数表现出类似的趋势(图26)，然而，在包括受感染的对照在内的任何治疗组中未观察到死亡。对盐肤木观察到剂量依赖性反应。
前述描述和附图包括本发明的示例性实施方案。前述实施方案和本文所述的方法可以根据本领域技术人员的能力、经验和偏好而变化。仅以某一顺序的列举方法步骤不对该方法的步骤顺序构成任何限制。前述描述和附图仅解释和例示本发明，而本发明不限于此，除非如此限定权利要求。已获得公开内容的本领域技术人员能够在不背离本发明的范围的情况下做出修改和改变。
Claims (16)
1.用于控制动物的球虫病的组合物，其包含植物部分或植物提取物，所述植物部分或植物提取物含有有效量的选自五倍子酸、五倍子酸衍生物、没食子鞣质和可水解单宁的化合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述植物选自没食子树(Quercus infectoria)、盐肤木(Rhus chinensis)和诃子(Terminalia chebula)。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述提取物是天然提取物。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述球虫病由艾美球虫属引起。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述艾美球虫属选自禽艾美球虫(E.tenella)、巨型艾美球虫(E.maxima)和堆型艾美球虫(E.acervulina)。
6.如权利要求1所述的组合物，其中控制球虫病包括在家禽中的盲肠损伤分数降低、粪便的每克卵囊数降低和死亡率降低。
7.控制动物的球虫病的方法，其包括给药有效量的植物部分或植物提取物的步骤，所述植物选自没食子树、盐肤木和诃子。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述植物部分或植物提取物含有有效量的选自五倍子酸、五倍子酸衍生物、没食子鞣质和可水解单宁的化合物。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述提取物是天然提取物。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述球虫病由艾美球虫属引起。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述艾美球虫属选自禽艾美球虫、巨型艾美球虫和堆型艾美球虫。
12.如权利要求7所述的方法，其中控制球虫病包括损伤分数降低、粪便的每克卵囊数降低和死亡率降低。
13.降低受艾美球虫属感染的动物中的子孢子的活性的方法，其包括向所述动物给药植物部分或植物提取物的步骤，所述植物部分或植物提取物含有有效量的选自五倍子酸、五倍子酸衍生物、没食子鞣质和可水解单宁的至少一种化合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述提取物是天然提取物。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述艾美球虫属选自禽艾美球虫、巨型艾美球虫和堆型艾美球虫。
16.如权利要求13所述的方法，其中子孢子的活性降低致使家禽中的盲肠损伤分数降低、粪便的每克卵囊数降低和死亡率降低。
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| CN106107194A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-11-16 | 北京中农华正兽药有限责任公司 | 净化肉鸡小肠球虫病的组合物及使用方法 |
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